KR102011182B1

KR102011182B1 - 익상편 과발현 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102011182B1
Application number: KR1020160130097A
Authority: KR
Inventors: 오충훈; 반주연; 조경진; 방만석
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2019-08-16
Also published as: KR20180039229A

Abstract

본 발명은 익상편 과발현 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자 및 이를 이용한 익상편 진단용 조성물, 익상편 진단용 키트, 익상편 진단을 위한 정보의 제공 방법, 익상편의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 익상편의 예방 또는 치료 방법, 및 익상편 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 CFH, C2, C1QB, C1QC 및/또는 MASP1 유전자는 익상편의 발병 단계에 따라 그 발현량이 변화하므로, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 본 발명의 진단용 조성물은 익상편의 초기 진단 및 예후 예측 진단에 적극 활용될 수 있다.

Description

익상편 과발현 유전자 및 이의 용도{Up-regulated genes in pterygium and use thereof}

본 발명은 익상편 과발현 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자; 및 이를 이용한 익상편 진단용 조성물, 익상편 진단용 키트, 익상편 진단을 위한 정보의 제공 방법, 익상편의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 익상편의 예방 또는 치료 방법 및 익상편 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

익상편(pterygium)은 결막의 퇴행성 변화로 보통 눈의 안쪽 결막으로부터 시작해 혈관이 풍부한 섬유조직이 결막과 각막의 경계 부위를 넘어 각막의 중심부를 향해 삼각형 모양으로 자라나는 질환이다. 섬유혈관 조직의 비정상적인 성장에 의해 나타나는 질병으로, 상피 및 섬유혈관 세포의 비정상적인 증식, 침입, 기질 리모델링으로 특징지어진다(Chui J, et al., The ocular surface 2008; 6(1):24-43.). 익상편은 면역학적 기전, 감염, 자외선 노출, 노화 등을 포함한 여러 요인에 의해 발병한다고 알려져 있다. 구체적으로, 면역학적 기전 중에서 타입 1, 3 및 4 과민증이 익상편을 발병시킬 것으로 예측되며, 실제로 많은 양의 침윤성 림프구, 대부분의 T 세포(CD3+)가 익상편 샘플의 각막 기질에서 발견됨이 보고된 바 있다(Liu L, et al., Chinese Academy of Medical Sciences 1993; 8(2):84-8.). 또한, 익상편은 40대부터 나타나 50대 이후 발병률이 0.1%씩 증가하며, 야외에서 일하는 시간이 많아 자외선이나 먼지 노출이 심한 농촌의 경우, 도시에 비해 3배 가까이 높은 것으로 조사되었다.

초기 익상편은 혈관수축제, 비스테로이드 항염제, 또는 스테로이드제 등과 같은 염증 조절제를 사용하여 진행을 늦출 수 있다. 그러나, 익상편 조직이 비대해지면 사시가 발생하거나, 점차 난시가 증가하여 시력저하를 일으키기도 하는데, 이러한 경우에는 수술을 통해 익상편 조직을 제거하더라도 재발의 확률이 높아지게 된다. 그럼에도 불구하고, 익상편은 대개 증상이 없어 방치하는 경우가 대부분으로, 익상편을 초기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다. 이에 따라, 익상편과 같은 비정상적인 혈관구조의 진단 및 치료에 텍사피린(texaphyrin)이 사용될 수 있음이 공지된바 있으나(한국 공개특허공보 제10-2000-0057532호), 익상편의 조기 진단 방법에 대하여는 여전히 개발되지 않은 상태이다.

한편, 보체(complement) 시스템은 항체와 식세포가 미생물이나 손상된 세포를 처리하는 능력을 향상시키는 면역 시스템의 일종으로, 보체 활성화 물질은 염증 사이토카인의 면역 반응과 발현을 매개한다(Yang IH, et al., Investigative ophthalmology & visual science 2015; 56(2):761-9.; Fukuoka Y, et al., Clinical and experimental immunology 2003; 131(2):248-53.). 보체 pathway는 많은 질병의 발병에 관련되어 있다고 알려져 있는데, 최근 보체 pathway 단백질을 암호화하고 있는 CFH(complement H), CFB(complement factor B), C2(complement component 2) 및 C3(complement component 3) 등의 유전자의 변이가 황반변성의 발병에 관련됨이 밝혀졌다(Kubicka-Trzaska A, et al., Klinika oczna 2015; 117(2):130-5.).

이러한 배경하에, 본 발명자들은 익상편의 효과적인 진단 및 치료 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, CFH, C2, C1QB, C1QC 및 MASP1 유전자가 익상편 조직에서 과발현됨을 확인하고, 상기 유전자는 익상편의 진단 및 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 익상편 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 익상편 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 익상편 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 익상편 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는, 익상편의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 익상편을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 시료에 익상편 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 익상편 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 익상편 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "익상편"은 결막주름이나 섬유혈관성 조직이 날개 모양으로 각막을 덮으며 자라나는 질환을 의미한다. 충혈, 이물감, 난시 및 시력 저하, 눈 운동 제한 등의 증상을 나타내며, 확실한 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 유전적 요인과 자외선 등의 환경적인 요인이 작용할 것으로 생각되고 있다.

본 발명에서는, 익상편 조직에는 CFH, C2, C1QB, C1QC 및 MASP1의 유전자의 발현이 증가하며, 익상편 조직의 크기가 클수록 상기 유전자의 발현량이 증가함을 확인하였다. 이처럼 익상편의 발병 원인 규명 및 이에 따른 진단 또는 치료 방법에 활용될 수 있는 상기 메커니즘은 종래에 전혀 공지된바 없으며, 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다.

본 발명의 용어, "CFH(Complement factor H)"는 보체(complement) 활성화 조절 단백질의 일종인 Complement factor H를 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 Complement factor H는 약 155 kDa 크기의 인간 혈장을 순환하는 수용성 당단백질로서, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. CAA30403.1, AAI42700.1, AAI42700.1, AAH37285.1, ABB02180.1 등). 구체적으로, 상기 CFH는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "C2(complement component 2)"는 C2 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 단백질은 보체 시스템의 고전경로(classical pathway)에 관여하고 있으며, 다중 도메인 세린 프로테아제로서 역할을 수행한다. 상기 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며(예: GenBank Accession No. AAB67975.1, AAB97607.1 등), 구체적으로 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "C1QB(complement C1q B chain)"는 보체 시스템에 관여하는 C1q 복합체 중에서 B-체인을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 C1q 복합체는 6개의 A-체인, 6개의 B-체인 및 6개의 C-체인으로 이루어진 18개의 폴리펩티드 체인으로 구성되어 있으며, 혈청 보체 시스템의 첫 번째 구성요소인 C1 복합체를 생산하기 위하여 C1r 및 C1s와 결합한다. 상기 C1QB는 complement C1q subcomponent subunit B 또는 Chain B; Globular Head Of The Complement System Protein C1q로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. AAH08983.1 등). 구체적으로, 상기 C1QB는 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "C1QC(complement C1q C chain)"는 보체 시스템에 관여하는 C1q 복합체 중에서 C-체인을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 C1q 복합체는 6개의 A-체인, 6개의 B-체인 및 6개의 C-체인으로 이루어진 18개의 폴리펩티드 체인으로 구성되어 있으며, 혈청 보체 시스템의 첫 번째 구성요소인 C1 복합체를 생산하기 위하여 C1r 및 C1s와 결합한다. 상기 C1QC는 complement C1q subcomponent subunit C 또는 Chain C; Globular Head Of The Complement System Protein C1q로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. NP_001107573.1, NP_758957.2 등). 구체적으로, 상기 C1QC는 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1)"는 만노스-결합 렉틴(MBL)-연관 세린 프로테아제 1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1)을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 보체 시스템의 렉틴 경로(lectin pathway)와 연관되어 있으며, C4 및 C2를 분해하여 각각 C4b2a 및 C3-컨버타제(C3-convertase)로 형성하는 역할을 수행한다. 상기 MASP1는 mannose-associated serine protease 1로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. AAH39724.1 등). 구체적으로, 상기 MASP1은 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제"는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 mRNA 또는 단백질을 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적인 예로, 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 프로브일 수 있다.

상기 제제는 상기 유전자의 발현 수준 측정을 위해 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지에는 리간드, 비드(bead), 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광물질(fluorescer), 화학발광물질, 자성 입자, 합텐 및 염료 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 예로, 상기 리간드에는 바이오틴, 아비딘 및 스트렙토아비딘 등이 포함되고, 상기 효소에는 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제 및 베타 갈락토시다아제 등이 포함되며, 상기 형광물질에는 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 피코에리트린 및 설포로다민산 클로라이드(텍사스 레드: Texas red) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 검출 가능한 표지물로 공지의 표지물 대부분이 사용될 수 있고, 당업자라면 발명의 목적에 맞게 적절한 표지물을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서, 상기 유전자의 mRNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 유전자의 mRNA의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

구체적으로, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 중 CFH에 대한 프라이머는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, C2에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, C1QB에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, C1QC에 대한 프라이머는 서열번호 7 및 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 MASP1에 대한 프라이머는 서열번호 9 및 10로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 이용되는 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

따라서, 상기 서열번호 1 내지 15로 표시되는 염기서열과 높은 상동성을 갖는 염기서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90%이상의 높은 상동성을 갖는 염기서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 가지는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 항원의 수용체 역할을 수행하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 디설파이드(disulfide) 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.

본 발명의 용어, "프로브"는 mRNA 또는 단백질과 특이적 결합을 이룰 수 있는, 라벨링(labeling)된 핵산 단편 또는 펩타이드를 의미한다. 구체적인 예로, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, 올리고펩타이드(oligonucleotide peptide) 프로브, 폴리펩타이드 프로브(polypeptide) 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 CFH, C2, C1QB, C1QC 및 MASP1 유전자의 mRNA 발현량은 정상 조직에 비하여, 익상편 조직에서 1 내지 6배 증가함을 확인하였고, 익상편 조직의 크기가 클수록 상기 유전자의 발현량이 증가함을 확인하였다(도 1 및 2).

이는, 상기 유전자의 발현 수준은 익상편의 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.

다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는, 익상편 진단용 키트를 제공한다.

이때, 상기 "익상편"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 키트는, 상기 익상편 진단용 조성물을 이용하여 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 익상편을 진단할 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 익상편 진단용 DNA 칩 키트일 수 있다. 본 발명의 용어, "DNA 칩"은 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

또 다른 예로, 상기 키트는 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 익상편 진단용 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩은 상기 유전자의 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 것일 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인함으로써, 익상편의 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 하나의 양태는 (a) 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 익상편 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 익상편 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

이때, 상기 "CFH", "C2", "C1QB", "C1QC", "MASP1" 및 "익상편"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "시료"는 결막 또는 각막 유래의 조직 또는 세포일 수 있으며, CFH, C2, C1QB, C1QC 및/또는 MASP1 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 상기 (a) 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 (a)의 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계 (b)를 수행한 후, 상기 단계 (a)의 mRNA 수준이 정상 대조구 시료의 mRNA 수준보다 증가하는 경우에 익상편으로 진단하는 (c) 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 CFH, C2, C1QB, C1QC 및 MASP1 유전자의 mRNA 발현은 정상 조직에 비하여, 익상편 조직에서 1 내지 6배 증가함을 확인하였고, 익상편 조직의 크기가 클수록 상기 유전자의 발현량이 증가함을 확인하였다(도 1 및 2).

이는, 상기 유전자의 발현 수준은 익상편의 진단에 유용하게 이용될 수 있으며, 상기 발현 수준이 증가하는 경우에 익상편인 것으로 판단할 수 있음을 시사하는 것이다.

또 다른 하나의 양태는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는, 익상편의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적상, 상기 유전자의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 상기 유전자의 발현 또는 활성을 억제함으로써 익상편을 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 약학 조성물의 유효성분인 것일 수 있는데, 상기 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리코뉴클레오티드 또는 이들의 조합; 또는 상기 유전자의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 안타고니스트 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "miRNA", "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 miRNA, siRNA 및 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명의 목적상, CFH, C2, C1QB, C1QC 또는 MASP1 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 효과를 나타내며, 본 발명의 목적상, CFH, C2, C1QB, C1QC 또는 MASP1 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 항체는 익상편의 발병이 의심되는 개체의 활성화된 CFH, C2, C1QB, C1QC 또는 MASP1 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 단백질에 특이적으로 결합될 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어, "앱타머(aptamer)"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다. 본 발명의 목적상, 상기 앱타머는 활성화된 CFH, C2, C1QB, C1QC 또는 MASP1 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "안타고니스트(antagonist)"는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 수용체의 리간드와 함께 사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 안타고니스트는 활성화된 CFH, C2, C1QB, C1QC 또는 MASP1 단백질의 활성을 억제하는 분자라면 제한 없이 포함하며, 구체적인 예로 상기 안타고니스트는 활성화된 CFH, C2, C1QB, C1QC 또는 MASP1 단백질에 결합하여 활성을 억제하는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 익상편의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 익상편의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 익상편 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 안구 외용제형일 수 있으며, 더욱 구체적으로 안연고, 점안제, 및 스프레이를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나로 제형화되는 것일 수 있으나, 당업계에서 안구에 투여하기 위하여 사용되는 제형이라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 구체적인 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(PCL; polycaprolactone), 폴리락틱액시드(PLA; Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(PLLA; poly- L -lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당 되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 유전자의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어, '약제학적으로 유효한 양'은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 익상편 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 구체적으로 약 1 ng/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태는 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 익상편을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 "익상편", "예방, 및 "치료" 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "개체"는 익상편이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명의 익상편의 예방 또는 치료 방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물이 도달할 수 있는 한, 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.

구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 안구, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 이에 제한되지 않지만, 본 발명의 약학 조성물이 익상편의 예방 또는 치료에 효과가 있는 특성상, 조성물의 투여 경로는 안구를 통하여 투여될 수 있다.

또 다른 하나의 양태는 (a) 시료에 익상편 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H), 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진 C2(complement component 2), 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QB(complement C1q B chain), 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 이루어진 C1QC(complement C1q C chain) 및 서열번호 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 MASP1(mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 익상편 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이때, 상기 "CFH", "C2", "C1QB", "C1QC", "MASP1", "시료" 및 "익상편"의 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "익상편 치료제의 후보물질"은 익상편을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 익상편을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능 예상물질을 모두 포함한다.

본 발명에서, 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 상기 (b) 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA), 웨스턴블롯(Western blot), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR, 전기영동, 조직 면역염색(immunostaining) 및 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 단계 (b)의 mRNA 또는 단백질 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료의 mRNA 또는 단백질 수준보다 감소하는 경우, 상기 (a)단계에서 처리한 후보물질을 익상편 치료제로 판단하는 (c) 단계를 추가로 포함할 수 있다.

CFH, C2, C1QB, C1QC 및/또는 MASP1 유전자는 익상편의 발병 단계에 따라 그 발현량이 변화하므로, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 본 발명의 진단용 조성물은 익상편의 초기 진단 및 예후 예측 진단에 적극 활용될 수 있다.

도 1은 정상 결막 조직에 비하여, 익상편에서 발현이 증가된 보체 인자 관련 유전자의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과이다. *, ** 또는 ***는 대조군(Control; CRTL)에 대해 p<0.05, p<0.01 또는 p<0.001인 경우를 의미한다. 이때, CFH는 Complement factor H, C2는 complement 2, C1QB는 complement C1q B chain, C1QC는 complement C1q C chain, MASP1는 mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1을 의미한다.
도 2는 익상편의 크기 관련 표현형과 보체 인자의 발현량 사이의 상관관계를 보여준다. A는 54세의 남성 환자로서, 익상편 초발 환자이다. 익상편의 크기가 크며, 보체 인자가 과발현되었음을 확인할 수 있다. B는 66세의 남성 환자로서, 익상편의 크기는 상대적으로 작으며, 보체 인자의 발현량 또한 상대적으로 낮음을 확인할 수 있다. 크기(Size, %)는 결막에서 익상편 영역을 퍼센트로 계산한 결과이다. 이때, CFH는 Complement factor H, C2는 complement component 2, C1QB는 complement C1q B chain, C1QC는 complement C1q C chain, MASP1는 mannose-binding lectin(MBL)-associated serine proteases 1을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 익상편 조직 샘플의 준비 및 분석

헬싱키 선언의 원칙에 따라 서면 동의를 받은 환자로부터, 결막(conjunctiva) 자가이식과 동시에 익상편 절제술이 수행되는 상황에서 한 쌍의 익상편 조직 및 정상 결막 조직을 채취하였다. 구체적으로, 익상편 절제 및 결막 자가 이식수술을 받은 19명의 환자로부터 20개의 익상편 조직 샘플과 20개의 정상 결막 샘플을 얻었다. 이중, 1명의 환자의 경우에는 양쪽 눈(오른쪽/왼쪽) 모두에서 익상편 조직과 정상 조직을 수집하였다. 본 실험은 단국대학교병원의 임상시험 심사 위원회의 동의 및 감독하에 수행하였다(code: 2016-04-016).

익상편 및 정상 결막 샘플을 채취한 19명의 환자(10명의 여성, 9명의 남성)의 평균나이±SD는 59.9±7.4였다. 19개의 수집된 익상편 샘플 중에서, 17개는 초발이었고, 나머지 2개는 재발된 것이었다.

상기 샘플에 대하여, 전장 유전체 RNA(Genome-wide RNA) 발현 프로파일링(profiling) 및 qRT-PCR(정량적 실시간 PCR; Quantitative real time polymerase chain reaction)을 수행하였다.

실시예 2. RNA 염기서열 분석의 방법 및 결과

실시예 2-1. RNA 분리 및 이의 염기 서열 분석 방법

익상편 및 정상 결막 조직으로부터 총 RNA는 RNeasy Micro kit를 이용하여 수득하였다. 상기 RNA의 품질 및 함량은 NanoDrop 2000 분광기(Thermo Scientific)와 Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)을 통해 확인하였다. 상기 총 RNA에 상보적인 라이브러리를 제작하기 위해, TruSeq RNA 라이브러리 제조 키트(Illumina)를 사용하였다.

이후, PCR 증폭을 통해 제조된 상기 라이브러리를 qPCR(정량적 PCR; quantitative PCR을 이용하여 정량하였고, Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)을 통해 품질을 확인하였으며, HiSeq™ 2000 platform(illumina)을 이용하여 염기서열을 분석하였다.

실시예 2-2. 인간 표준 게놈에 대한 여과(Raw reads filtering) 및 정렬 방법

Trim Galore를 사용한 Raw reads filtering은 기본 값에 따라 사용하였다.

구체적으로, 서열 아답터(adaptor)를 갖는 조각(read)과 낮은 품질의 조각을 제거하였다. 모든 결과물을 명료한 조각(clean reads)에 기초하여 분석하였다.

표준 서열을 UCSC genome browser(version hg19)으로부터 다운받았고, RNA- STAR를 이용하여 Trimming reads를 각각 표준 게놈에 정렬하였다.

실시예 2-3. 발현량의 차이 및 기능적 주석(annotation)의 분석 방법

유전자에 특징적으로 매핑된 조각(mapped reads)를 cufflink package를 통해 기본값에 따라 계산하였다. 유전자 발현 수준은 백만개의 매핑될 수 있는 조각 당 엑손 영역의 킬로베이스(kilobase) 당 특징적으로 매핑된 단편(fragments)의 수(FPKM; the number of uniquely mapped fragments per kilobase of exon region per million mappable reads)로 표시하였다. p-값(p-value) ≤ 0.05; 및 발현량의 차이(fold change) ≥ 2인 경우를 익상편과 정상 샘플 사이에서 발현량이 다른 유전자로 판단하였다.

익상편의 생물학적 시스템을 규명하기 위해, 발현량이 다른 유전자를 기능적으로 어노테이션한 유의적인 유전자의 목록은 DAVID(Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery), GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)를 이용하여 구성하였다.

실시예 2-4. RNA 염기서열 분석의 결과

상기 실시예 2-1 내지 2-3을 통해 수행한 RNA 염기서열 분석을 통해, 8개의 익상편 샘플 및 이에 상응하는 정상 결막 조직 샘플에서 서로 다른 발현량을 보이는 유전자를 찾아내었다. 55,550,533(범위: 43439664 - 80389513) 조각의 평균을 만들었고, 인간 게놈 UCSC hg19에 대한 조각의 매핑은 STAR(Spliced Transcripts Alignment to a Reference)를 사용하였다(평균 93%).

결과적으로, 익상편과 정상 결막 조직 사이의 전사체 서열을 비교하기 위하여, 발현량이 다른 여러 전사체를 규명한 결과, 총 917개의 유전자가 상기 두 샘플 (익상편 조직 샘플 및 정상 결막 샘플) 사이에서 발현량이 다름을 확인하였고, 그 중에서 발현량이 증가된 유전자는 641개, 감소된 유전자는 276개임을 확인하였다.

또한, 하기 표 1에서 볼 수 있듯이, 상기 641개의 유전자 중에서, CFH, C2, C3, CQ1A, CQ1B, CQ1C 및 MASP1 유전자에서 발현량의 증가가 월등함을 확인하였다.

유전자	Log2FC	발현량 변화 (Fold Change)	p-값
CFH	1.12	2.17	0.00
C2	0.53	1.44	0.21
C3	0.06	1.04	0.87
C1QA	1.17	2.25	0.03
C1QB	1.41	2.66	0.01
C1QC	1.23	2.34	0.01
MASP1	0.34	1.27	0.53
CFH = Complement factor H C2, C3 = complement components 2, 3 C1QA, C1QB, C1QC = complement C1q A, B, C chain (C1-complexs) MASP1 = mannose-binding lectin (MBL)-associated serine proteases

아울러, DAVID, GeneMania, Gene Set Enrichment Assay, 및 KEGG pathway를 이용하여 발현량이 서로 다른 유전자의 기능을 추가적으로 분석하였다.

그 결과, 하기 표 2 내지 4에서 볼 수 있듯이, DAVID 분석을 통해 발현량이 증가하는 CFH, C1QA, C1QB 및 C1QC 등의 유전자는 보체 시스템에 반복적으로 군집화됨을 확인하였으며, 또한 GSEA 및 GeneMania 분석을 통해도 상기 유전자들은 익상편 조직의 보체시스템에 군집화됨을 확인하였다.

DAVID 분석 결과

데이터베이스	용어	p-값	유전자
KEGG_PATHWAY	Complement and coagulation cascades	0.0041	C1QA, C1QB, , CFH, BDKRB1, BDKRB2, C1QC, F2R
INTERPRO	Complement C1q protein	4.51E-04	C1QA, C1QTNF7, C1QB, COL8A1, C1QC, COL8A2
GOTERM_BP_FAT	complement activation	0.0487	C1QA, C1QB, CFH, VSIG4, C1QC
PIR_SUPERFAMILY	complement subcomponent C1q chain A	0.0035	C1QA, C1QB, C1QTNF5, C1QC

GSEA 분석 결과

순서	기능	ES	NES	FDR q-값	FWER p-값
1	IL6_JAK_STAT3_SIGNALING	-0.973	-1.400	0.503	0.382
2	ESTROGEN_RESPONSE_EARLY	-0.947	-1.351	0.768	0.771
3	ADIPOGENESIS	-0.906	-1.294	0.737	0.941
4	TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB	-0.887	-1.277	0.688	0.969
5	COMPLEMENT SYSTEM	-0.886	-1.265	0.639	0.982
6	INFLAMMATORY_RESPONSE	-0.829	-1.197	0.861	1.000
7	INTERFERON_GAMMA_RESPONSE	-0.822	-1.175	0.846	1.000
8	XENOBIOTIC_METABOLISM	-0.822	-1.166	0.789	1.000
9	ANDROGEN_RESPONSE	-0.817	-1.165	0.714	1.000
10	COAGULATION	-0.811	-1.154	0.686	1.000
11	APOPTOSIS	-0.790	-1.138	0.682	1.000
12	P53_PATHWAY	-0.755	-1.079	0.809	1.000
13	KRAS_SIGNALING_UP	-0.756	-1.071	0.772	1.000
14	EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION	-0.750	-1.018	0.858	1.000
15	ALLOGRAFT_REJECTION	-0.716	-1.016	0.809	1.000
16	MYOGENESIS	-0.717	-1.002	0.796	1.000
17	APICAL_JUNCTION	-0.673	-0.963	0.835	1.000
18	HYPOXIA	-0.667	-0.953	0.810	1.000
19	E2F_TARGETS	-0.644	-0.921	0.827	1.000
20	UV_RESPONSE_DN	-0.631	-0.906	0.813	1.000
21	KRAS_SIGNALING_DN	-0.580	-0.828	0.889	1.000
22	G2M_CHECKPOINT	-0.556	-0.789	0.900	1.000
23	MITOTIC_SPINDLE	-0.504	-0.718	0.936	1.000
24	IL2_STAT5_SIGNALING	-0.467	-0.665	0.939	1.000
25	FATTY_ACID_METABOLISM	-0.343	-0.487	0.987	1.000
ES: Enrichment Score NES: Normalized Enrichment Score FDR: False Discovery Rate FWER: Familywise error rate

GeneMania 기능 분석 결과

#	기능	FDR
1	humoral immune response mediated by circulating immunoglobulin	1.47E-07
2	MHC class II receptor activity	7.04274E-06
3	extracellular structure organization	7.04274E-06
4	T cell costimulation	7.04274E-06
5	lymphocyte costimulation	7.04274E-06
6	extracellular matrix organization	7.04274E-06
7	protein activation cascade	7.04274E-06
8	clathrin-coated endocytic vesicle	7.04274E-06
9	clathrin-coated endocytic vesicle membrane	7.04274E-06
10	extracellular matrix	7.19262E-06
11	complement activation	9.81566E -06
12	endocytic vesicle	1.13487E-05
13	lumenal side of membrane	1.27338E-05
14	integral component of lumenal side of endoplasmic reticulum membrane	1.27338E-05
15	lumenal side of endoplasmic reticulum membrane	1.27338E-05

실시예 3. 보체 인자의 과발현 여부 검증

상기 실시예 2를 통해 확인한 유전자의 발현량 차이를 검증하기 위하여, 보체 인자인 상기 유전자(CLHF, C2, C1QB, C1QC, MASP1)의 RNA 수준을 정량적 RT-PCR(real-time PCR)을 통해 확인하였다.

구체적으로, cDNA합성은 iScriptTM cDNA synthesis 키트(Bio-Rad)를 이용하여 수행하였고, 실시간 PCR은 SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)을 사용한 StepOne Plus real-time PCR system(Applied Biosystems)을 이용하여 수행하였다. 프라이머는 Bioneer(Korea)로부터 구매하였고, 이의 서열 목록은 하기 표 5에 기재하였다.

보체 인자의 증폭을 위한 프라이머 및 이의 서열

유전자	방향	구분	서열(5'-> 3')	Tm(℃)	생성물의 크기 (bp)
CFH	F	서열번호 1	TTGTCTCCTGACCTCCCAA	56.4	122
CFH	R	서열번호 2	TCCACCACTTCACTGTGTC	56	122
C2	F	서열번호 3	TCGAATCTTGTGCTCACGG	56.9	113
C2	R	서열번호 4	ACGTCCTCAGGGAAGTCATAA	57.2	113
C1QB	F	서열번호 5	GACCCCAGGGATAAAAGGAGA	57.5	110
C1QB	R	서열번호 6	GGCCGACTTTTCCTGGATT	56.8	110
C1QC	F	서열번호 7	ATGGGTACGACGGACTGC	58.2	125
C1QC	R	서열번호 8	GGGGCCATTTTTCCCAGG	57.3	125
MASP1	F	서열번호 9	GGGACGTGGAGTAACAAGAT	56	118
MASP1	R	서열번호 10	CAGACTTGTATGTGGTGAGGT	56.3	118
CFH Complement factor H C2 = complement component 2 C1QB, C1QC = complement C1q B, C chain (C1-complexs) MASP1 = mannose -binding lectin ( MBL )-associated serine proteases 1

아울러, SPSS 23.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용한 대응표본 T-검정(paired T-test)을 통해 통계학적 분석을 수행하였으며, p-값 < 0.05 (2-tailed)일 경우, 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 상기 유전자들의 발현은 정상 결막에 비하여 모두 증가함을 확인하였다. 구체적으로, 익상편 샘플에서 CFH, C2, C1QB, C1QC 및 MASP1의 발현은 각각 3.15±2.6(p-값=0.0008), 3.21±4.6(p-값=0.0225), 3.03±1.83(p-값= 0.0001), 4.28±6.12(p-값=0.0136) 및 4.96±1.89(p-값= 0.0178)임을 확인하였다.

이를 통해, 상기 5개의 유전자가 정상 조직에 비하여, 익상편에서 발현량이 증가하는 유전자임을 알 수 있었다.

실시예 4. 익상편 크기와 보체 유전자 발현과의 상관관계 분석

익상편 크기와 보체 유전자 발현과의 상관관계 분석하기 위해, Adobe Photoshop을 통해 20명 환자의 각막(cornea)으로부터 익상편 영역을 픽셀 단위로 측정하였다.

구체적으로, 각막 전방 부분의 사진은 Adobe Photoshop CS5(Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)를 이용하여 작업하였다. 익상편과 각막의 경계를 표시하였고, 'pixel counter' 도구를 이용하여 디지털 이미지에서 픽셀을 정량화하고 비교하였다. 익상편의 크기는 원형의 표준 마커(circular reference marker)인 각막에 대한 익상편의 픽셀 비율에 근거하여 계산하였으며, 이를 퍼센트로 변환하였다.

아울러, SPSS 23.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용한 피어슨 상관관계 분석(Pearson correlation analysis)을 통해 통계학적 분석을 수행하였으며, p-값 < 0.05 (2-tailed)일 경우, 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 보체 인자의 발현량이 높을수록 익상편의 크기가 커짐을 확인하였다. 이를 통해, 익상편의 크기는 CFH, C1QB, C1QC 및 MASP1 유전자의 발현량과 관련이 있음을 확인하였으며, 익상편의 크기가 클수록, 상기 유전자의 발현량이 증가함을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Up-regulated genes in pterygium and use thereof <130> KPA161273-KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH F primer <400> 1 ttgtctcctg acctcccaa 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH R primer <400> 2 tccaccactt cactgtgtc 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 F primer <400> 3 tcgaatcttg tgctcacgg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 R primer <400> 4 acgtcctcag ggaagtcata a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1QB F primer <400> 5 gaccccaggg ataaaaggag a 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1QB R primer <400> 6 ggccgacttt tcctggatt 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1QC F primer <400> 7 atgggtacga cggactgc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1QC R primer <400> 8 ggggccattt ttcccagg 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MASP1 F primer <400> 9 gggacgtgga gtaacaagat 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MASP1 R primer <400> 10 cagacttgta tgtggtgagg t 21 <210> 11 <211> 4200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement DNA sequence of CFH <400> 11 acagcattaa catttagtgg gagtgcagtg agaattgggt ttaacttctg gcatttctgg 60 gcttgtggct tgtggttgat tttttattta ctttgcaaaa gtttctgata ggcggagcat 120 ctagtttcaa cttccttttg cagcaagttc tttcctgcac taatcacaat tcttggaaga 180 ggagaactgg acgttgtgaa cagagttagc tggtaaatgt cctcttaaaa gatccaaaaa 240 atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 300 tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 360 acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 420 aatgtaataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 480 cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 540 ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 600 ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 660 tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 720 gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 780 ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 840 gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 900 atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 960 tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 1020 tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 1080 aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 1140 gcaacccggg gaaatacagc aaaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 1200 accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 1260 cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 1320 tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 1380 ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 1440 aatcatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 1500 gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 1560 agatgcatcc gtgtcaaaac atgttccaaa tcaagtatag atattgagaa tgggtttatt 1620 tctgaatctc agtatacata tgccttaaaa gaaaaagcga aatatcaatg caaactagga 1680 tatgtaacag cagatggtga aacatcagga tcaattacat gtgggaaaga tggatggtca 1740 gctcaaccca cgtgcattaa atcttgtgat atcccagtat ttatgaatgc cagaactaaa 1800 aatgacttca catggtttaa gctgaatgac acattggact atgaatgcca tgatggttat 1860 gaaagcaata ctggaagcac cactggttcc atagtgtgtg gttacaatgg ttggtctgat 1920 ttacccatat gttatgaaag agaatgcgaa cttcctaaaa tagatgtaca cttagttcct 1980 gatcgcaaga aagaccagta taaagttgga gaggtgttga aattctcctg caaaccagga 2040 tttacaatag ttggacctaa ttccgttcag tgctaccact ttggattgtc tcctgacctc 2100 ccaatatgta aagagcaagt acaatcatgt ggtccacctc ctgaactcct caatgggaat 2160 gttaaggaaa aaacgaaaga agaatatgga cacagtgaag tggtggaata ttattgcaat 2220 cctagatttc taatgaaggg acctaataaa attcaatgtg ttgatggaga gtggacaact 2280 ttaccagtgt gtattgtgga ggagagtacc tgtggagata tacctgaact tgaacatggc 2340 tgggcccagc tttcttcccc tccttattac tatggagatt cagtggaatt caattgctca 2400 gaatcattta caatgattgg acacagatca attacgtgta ttcatggagt atggacccaa 2460 cttccccagt gtgtggcaat agataaactt aagaagtgca aatcatcaaa tttaattata 2520 cttgaggaac atttaaaaaa caagaaggaa ttcgatcata attctaacat aaggtacaga 2580 tgtagaggaa aagaaggatg gatacacaca gtctgcataa atggaagatg ggatccagaa 2640 gtgaactgct caatggcaca aatacaatta tgcccacctc cacctcagat tcccaattct 2700 cacaatatga caaccacact gaattatcgg gatggagaaa aagtatctgt tctttgccaa 2760 gaaaattatc taattcagga aggagaagaa attacatgca aagatggaag atggcagtca 2820 ataccactct gtgttgaaaa aattccatgt tcacaaccac ctcagataga acacggaacc 2880 attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2940 tgtgagggtg gtttcaggat atctgaagaa aatgaaacaa catgctacat gggaaaatgg 3000 agttctccac ctcagtgtga aggccttcct tgtaaatctc cacctgagat ttctcatggt 3060 gttgtagctc acatgtcaga cagttatcag tatggagaag aagttacgta caaatgtttt 3120 gaaggttttg gaattgatgg gcctgcaatt gcaaaatgct taggagaaaa atggtctcac 3180 cctccatcat gcataaaaac agattgtctc agtttaccta gctttgaaaa tgccataccc 3240 atgggagaga agaaggatgt gtataaggcg ggtgagcaag tgacttacac ttgtgcaaca 3300 tattacaaaa tggatggagc cagtaatgta acatgcatta atagcagatg gacaggaagg 3360 ccaacatgca gagacacctc ctgtgtgaat ccgcccacag tacaaaatgc ttatatagtg 3420 tcgagacaga tgagtaaata tccatctggt gagagagtac gttatcaatg taggagccct 3480 tatgaaatgt ttggggatga agaagtgatg tgtttaaatg gaaactggac ggaaccacct 3540 caatgcaaag attctacagg aaaatgtggg ccccctccac ctattgacaa tggggacatt 3600 acttcattcc cgttgtcagt atatgctcca gcttcatcag ttgagtacca atgccagaac 3660 ttgtatcaac ttgagggtaa caagcgaata acatgtagaa atggacaatg gtcagaacca 3720 ccaaaatgct tacatccgtg tgtaatatcc cgagaaatta tggaaaatta taacatagca 3780 ttaaggtgga cagccaaaca gaagctttat tcgagaacag gtgaatcagt tgaatttgtg 3840 tgtaaacggg gatatcgtct ttcatcacgt tctcacacat tgcgaacaac atgttgggat 3900 gggaaactgg agtatccaac ttgtgcaaaa agatagaatc aatcataaag tgcacacctt 3960 tattcagaac tttagtatta aatcagttct caatttcatt ttttatgtat tgttttactc 4020 ctttttattc atacgtaaaa ttttggatta atttgtgaaa atgtaattat aagctgagac 4080 cggtggctct cttcttaaaa gcaccatatt aaatcctgga aaactaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 4200 <210> 12 <211> 2466 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement DNA sequence of C2 <400> 12 gagcgtgggg gcagtacaca aagcctgtgg gggagatcta ttgaccctat agatatatta 60 gcatcaggga gacagggcaa aggtttcacc cttcagttca gtccccaatc cctgcttatt 120 atttccctaa cagaagacca tcccccttgc cactccctgg tttttcttct ctggcagcaa 180 tgaagcagct gctgacccag ctctagtttt cgggaagtca gatgaccttt tccctcccgc 240 ggctctctac ctctcgccgc ccctagggag gacaccatgg gcccactgat ggttcttttt 300 tgcctgctgt tcctgtaccc agctggccac tgccccaacc caggcatttc actgggcgca 360 gtgcggacag gcttccgctt tggtcatggg gacaaggtcc gctatcgctg ctcctcgaat 420 cttgtgctca cggggtcttc ggagcgggag tgccagggca acggggtctg gagtggaacg 480 gagcccatct gccgccaacc ctactcttat gacttccctg aggacgtggc ccctgccctg 540 ggcacttcct tctcccacat gcttggggcc accaatccca cccagaagac aaaggaaagc 600 ctgggccgta aaatccaaat ccagcgctct ggtcatctga acctctacct gctcctggac 660 tgttcgcaga gtgtgtcgga aaatgacttt ctcatcttca aggagagcgc ctccctcatg 720 gtggacagga tcttcagctt tgagatcaat gtgagcgttg ccattatcac ctttgcctca 780 gagcccaaag tcctcatgtc tgtcctgaac gacaactccc gggatatgac tgaggtgatc 840 agcagcctgg aaaatgccaa ctataaagat catgaaaatg gaactgggac taacacctat 900 gcggccttaa acagtgtcta tctcatgatg aacaaccaaa tgcgactcct cggcatggaa 960 acgatggcct ggcaggaaat ccgacatgcc atcatccttc tgacagatgg aaagtccaat 1020 atgggtggct ctcccaagac agctgttgac catatcagag agatcctgaa catcaaccag 1080 aagaggaatg actatctgga catctatgcc atcggggtgg gcaagctgga tgtggactgg 1140 agagaactga atgagctagg gtccaagaag gatggtgaga ggcatgcctt cattctgcag 1200 gacacaaagg ctctgcacca ggtctttgaa catatgctgg atgtctccaa gctcacagac 1260 accatctgcg gggtggggaa catgtcagca aacgcctctg accaggagag gacaccctgg 1320 catgtcacta ttaagcccaa gagccaagag acctgccggg gggccctcat ctccgaccaa 1380 tgggtcctga cagcagctca ttgcttccgc gatggcaacg accactccct gtggagggtc 1440 aatgtgggag accccaaatc ccagtggggc aaagaattcc ttattgagaa ggcggtgatc 1500 tccccagggt ttgatgtctt tgccaaaaag aaccagggaa tcctggagtt ctatggtgat 1560 gacatagctc tgctgaagct ggcccagaaa gtaaagatgt ccacccatgc caggcccatc 1620 tgccttccct gcacgatgga ggccaatctg gctctgcgga gacctcaagg cagcacctgt 1680 agggaccatg agaatgaact gctgaacaaa cagagtgttc ctgctcattt tgtcgccttg 1740 aatgggagca aactgaacat taaccttaag atgggagtgg agtggacaag ctgtgccgag 1800 gttgtctccc aagaaaaaac catgttcccc aacttgacag atgtcaggga ggtggtgaca 1860 gaccagttcc tatgcagtgg gacccaggag gatgagagtc cctgcaaggg agaatctggg 1920 ggagcagttt tccttgagcg gagattcagg ttttttcagg tgggtctggt gagctggggt 1980 ctttacaacc cctgccttgg ctctgctgac aaaaactccc gcaaaagggc ccctcgtagc 2040 aaggtcccgc cgccacgaga ctttcacatc aatctcttcc gcatgcagcc ctggctgagg 2100 cagcacctgg gggatgtcct gaatttttta cccctctagc catggccact gagccctctg 2160 ctgccctgcc agaatctgcc gcccctccat cttctacctc tgaatggcca cccttagacc 2220 ctgtgatcca tcctctctcc tagctgagta aatccgggtc tctaggatgc cagaggcagc 2280 gcacacaagc tgggaaatcc tcagggctcc taccagcagg actgcctcgc tgccccacct 2340 cccgctcctt ggcctgtccc cagattcctt ccctggttga cttgactcat gcttgtttca 2400 ctttcacatg gaatttccca gttatgaaat taataaaaat caatggtttc cacatcaaaa 2460 aaaaaa 2466 <210> 13 <211> 1044 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement DNA sequence of C1QB <400> 13 gcccttcccg cctctgggga agggaacttc cgcttcggac cgagggcagt aggctctcgg 60 ctcctggtcc cactgctgct cagcccagtg gcctcacagg acaccagctt cccaggaggc 120 gtctgacaca gtatgatgat gaagatccca tggggcagca tcccagtact gatgttgctc 180 ctgctcctgg gcctaatcga tatctcccag gcccagctca gctgcaccgg gcccccagcc 240 atccctggca tcccgggtat ccctgggaca cctggccccg atggccaacc tgggacccca 300 gggataaaag gagagaaagg gcttccaggg ctggctggag accatggtga gttcggagag 360 aagggagacc cagggattcc tgggaatcca ggaaaagtcg gccccaaggg ccccatgggc 420 cctaaaggtg gcccaggggc ccctggagcc ccaggcccca aaggtgaatc gggagactac 480 aaggccaccc agaaaatcgc cttctctgcc acaagaacca tcaacgtccc cctgcgccgg 540 gaccagacca tccgcttcga ccacgtgatc accaacatga acaacaatta tgagccccgc 600 agtggcaagt tcacctgcaa ggtgcccggt ctctactact tcacctacca cgccagctct 660 cgagggaacc tgtgcgtgaa cctcatgcgt ggccgggagc gtgcacagaa ggtggtcacc 720 ttctgtgact atgcctacaa caccttccag gtcaccaccg gtggcatggt cctcaagctg 780 gagcaggggg agaacgtctt cctgcaggcc accgacaaga actcactact gggcatggag 840 ggtgccaaca gcatcttttc cgggttcctg ctctttccag atatggaggc ctgacctgtg 900 ggctgcttca catccacccc ggctccccct gccagcaacg ctcactctac ccccaacacc 960 accccttgcc caaccaatgc acacagtagg gcttggtgaa tgctgctgag tgaatgagta 1020 aataaactct tcaaggccaa ggga 1044 <210> 14 <211> 1182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement DNA sequence of C1QC <400> 14 gaccactcag acaccgtgtc ctcttgcctg ggagagggga agcagatctg aggacatctc 60 tgtgccaggc cagaaaccgc ccacctgcag ttccttctcc gggatggacg tggggcccag 120 ctccctgccc caccttgggc tgaagctgct gctgctcctg ctgctgctgc ccctcagggg 180 ccaagccaac acaggctgct acgggatccc agggatgccc ggcctgcccg gggcaccagg 240 gaaggatggg tacgacggac tgccggggcc caagggggag ccaggaatcc cagccattcc 300 cgggatccga ggacccaaag ggcagaaggg agaacccggc ttacccggcc atcctgggaa 360 aaatggcccc atgggacccc ctgggatgcc aggggtgccc ggccccatgg gcatccctgg 420 agagccaggt gaggagggca gatacaagca gaaattccag tcagtgttca cggtcactcg 480 gcagacccac cagccccctg cacccaacag cctgatcaga ttcaacgcgg tcctcaccaa 540 cccgcaggga gattatgaca cgagcactgg caagttcacc tgcaaagtcc ccggcctcta 600 ctactttgtc taccacgcgt cgcatacagc caacctgtgc gtgctgctgt accgcagcgg 660 cgtcaaagtg gtcaccttct gtggccacac gtccaaaacc aatcaggtca actcgggcgg 720 tgtgctgctg aggttgcagg tgggcgagga ggtgtggctg gctgtcaatg actactacga 780 catggtgggc atccagggct ctgacagcgt cttctccggc ttcctgctct tccccgacta 840 gggcgggcag atgcgctcga gccccacggg ccttccacct ccctcagctt cctgcatgga 900 cccaccttac tggccagtct gcatccttgc ctagaccatt ctccccacca gatggacttc 960 tcctccaggg agcccaccct gacccacccc cactgcaccc cctccccatg ggttctctcc 1020 ttcctctgaa cttctttagg agtcactgct tgtgtggttc ctgggacact taaccaatgc 1080 cttctggtac tgccattctt tttttttttt ttttcaagta ttggaagggg tggggagata 1140 tataaataaa tcatgaaatc aatacataaa aaaaaaaaaa aa 1182 <210> 15 <211> 6476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement DNA sequence of MASP1 <400> 15 acacacagag tgatacaaat acctgcttga gcccctcagt tattttctct caagggctga 60 agtcagccac acaggataaa ggagggaagg gaaggagcag atcttttcgg taggaagaca 120 gattttgttg tcaggttcct gggagtgcaa gagcaagtca aaggagagag agaggagaga 180 ggaaaagcca gagggagaga gggggagagg ggatctgttg caggcagggg aaggcgtgac 240 ctgaatggag aatgccagcc aattccagag acacacaggg acctcagaac aaagataagg 300 catcacggac accacaccgg gcacgagctc acaggcaagt caagctggga ggaccaaggc 360 cgggcagccg ggagcaccca aggcaggaaa atgaggtggc tgcttctcta ttatgctctg 420 tgcttctccc tgtcaaaggc ttcagcccac accgtggagc taaacaatat gtttggccag 480 atccagtcgc ctggttatcc agactcctat cccagtgatt cagaggtgac ttggaatatc 540 actgtcccag atgggtttcg gatcaagctt tacttcatgc acttcaactt ggaatcctcc 600 tacctttgtg aatatgacta tgtgaaggta gaaactgagg accaggtgct ggcaaccttc 660 tgtggcaggg agaccacaga cacagagcag actcccggcc aggaggtggt cctctcccct 720 ggctccttca tgtccatcac tttccggtca gatttctcca atgaggagcg tttcacaggc 780 tttgatgccc actacatggc tgtggatgtg gacgagtgca aggagaggga ggacgaggag 840 ctgtcctgtg accactactg ccacaactac attggcggct actactgctc ctgccgcttc 900 ggctacatcc tccacacaga caacaggacc tgccgagtgg agtgcagtga caacctcttc 960 actcaaagga ctggggtgat caccagccct gacttcccaa acccttaccc caagagctct 1020 gaatgcctgt ataccatcga gctggaggag ggtttcatgg tcaacctgca gtttgaggac 1080 atatttgaca ttgaggacca tcctgaggtg ccctgcccct atgactacat caagatcaaa 1140 gttggtccaa aagttttggg gcctttctgt ggagagaaag ccccagaacc catcagcacc 1200 cagagccaca gtgtcctgat cctgttccat agtgacaact cgggagagaa ccggggctgg 1260 aggctctcat acagggctgc aggaaatgag tgcccagagc tacagcctcc tgtccatggg 1320 aaaatcgagc cctcccaagc caagtatttc ttcaaagacc aagtgctcgt cagctgtgac 1380 acaggctaca aagtgctgaa ggataatgtg gagatggaca cattccagat tgagtgtctg 1440 aaggatggga cgtggagtaa caagattccc acctgtaaaa ttgtagactg tagagcccca 1500 ggagagctgg aacacgggct gatcaccttc tctacaagga acaacctcac cacatacaag 1560 tctgagatca aatactcctg tcaggagccc tattacaaga tgctcaacaa taacacaggt 1620 atatatacct gttctgccca aggagtctgg atgaataaag tattggggag aagcctaccc 1680 acctgccttc cagtgtgtgg gctccccaag ttctcccgga agctgatggc caggatcttc 1740 aatggacgcc cagcccagaa aggcaccact ccctggattg ccatgctgtc acacctgaat 1800 gggcagccct tctgcggagg ctcccttcta ggctccagct ggatcgtgac cgccgcacac 1860 tgcctccacc agtcactcga tccggaagat ccgaccctac gtgattcaga cttgctcagc 1920 ccttctgact tcaaaatcat cctgggcaag cattggaggc tccggtcaga tgaaaatgaa 1980 cagcatctcg gcgtcaaaca caccactctc cacccccagt atgatcccaa cacattcgag 2040 aatgacgtgg ctctggtgga gctgttggag agcccagtgc tgaatgcctt cgtgatgccc 2100 atctgtctgc ctgagggacc ccagcaggaa ggagccatgg tcatcgtcag cggctggggg 2160 aagcagttct tgcaaaggtt cccagagacc ctgatggaga ttgaaatccc gattgttgac 2220 cacagcacct gccagaaggc ttatgccccg ctgaagaaga aagtgaccag ggacatgatc 2280 tgtgctgggg agaaggaagg gggaaaggac gcctgtgcgg gtgactctgg aggccccatg 2340 gtgaccctga atagagaaag aggccagtgg tacctggtgg gcactgtgtc ctggggtgat 2400 gactgtggga agaaggaccg ctacggagta tactcttaca tccaccacaa caaggactgg 2460 atccagaggg tcaccggagt gaggaactga atttggctcc tcagccccag caccaccagc 2520 tgtgggcagt cagtagcaga ggacgatcct ccgatgaaag cagccatttc tcctttcctt 2580 cctcccatcc cccctccttc ggcctatcca ttactgggca atagagcagg tatcttcacc 2640 cccttttcac tctctttaaa gagatggagc aagagagtgg tcagaacaca ggccgaatcc 2700 aggctctatc acttactagt ttgcagtgct gggcaggtga cttcatctct tcgaacttca 2760 gtttcttcat aagatggaaa tgctatacct tacctacctc gtaaaagtct gatgaggaaa 2820 agattaacta atagatgcat agcacttaac agagtgcata gcatacactg ttttcaataa 2880 atgcacctta gcagaaggtc gatgtgtcta ccaggcagac gaagctctct tacaaacccc 2940 tgcctgggtc ttagcattga tcagtgacac acctctcccc tcaaccttga ccatctccat 3000 ctgcccttaa atgctgtatg cttttttgcc accgtgcaac ttgcccaaca tcaatcttca 3060 ccctcatccc taaaaaagta aaacagacaa ggttctgagt cctgtggtat gtcccctagc 3120 aaatgtaact aggaacatgc actagatgac agattgcggg agggcctgag agaagcaggg 3180 acaggaggga gcctggggat tgtggtttgg gaaggcagac acctggttct agaactagct 3240 ctgcccttag ccccctgtat gaccctatgc aagtcctcct ccctcatctc aaagggtcct 3300 caaagctctg acgatctaag atacaatgaa gccattttcc ccctgataag atgaggtaaa 3360 gccaatgtaa ccaaaaggca aaaattacaa tcggttcaaa ggaactttga tgcagacaaa 3420 atgctgctgc tgctgctcct gaaataccca cccctttcca ctacgggtgg gttcccaagg 3480 acatgggaca ggcaaagtgt gagccaaagg atccttcctt attcctaagc agagcatctg 3540 ctctgggccc tggcctcctt cccttcttgg gaaactgggc tgcatgaggt gggccctggt 3600 agtttgtacc ccaggcccct atactcttcc ttcctatgtc cacagctgac cccaagcagc 3660 cgttccccga ctcctcaccc ctgagcctca ccctgaactc cctcatcttg caaggccata 3720 agtgttttcc aagcaaaatg cctctcccat cctctctcag gaagcttcta gagactttat 3780 gccctccaga gctccaagat ataagccctc caagggatca gaagctccaa gttcctgtct 3840 tctgttttat agaaattgat cttccctggg ggactttaac tcttgacctg tatgcagctg 3900 ttggagtaat tccaggtctc ttgaaaaaaa agaggaagat aatggagaat gagaacatat 3960 atatatatat attaagcccc aggctgaata ctcagggaca gcaattcaca gcctgcctct 4020 ggttctataa acaagtcatt ctacctcttt gtgccctgct gtttattctg taaggggaag 4080 gtggcaatgg gacccagctc catcagacac ttgtcaagct agcagaaact ccattttcaa 4140 tgccaaagaa gaactgtaat gctgttttgg aatcatccca aggcatccca agacaccata 4200 tcttcccatt tcaagcactg cctgggcaca ccccaacatc ccaggctgtg gtggctcctg 4260 tgggaactac ctagatgaag agagtatcat ttataccttc taggagctcc tattgggaga 4320 catgaaacat atgtaattga ctaccatgta atagaacaaa ccctgccaag tgctgctttg 4380 gaaagtcatg gaggtaaaag aaagaccatt ctggtatgaa ggttttgggg gaggagatat 4440 caatcaagaa ggcttcccag aagaggtgac tggaccagag ccttgtccac aggtaagacg 4500 gaggaggcct tccacatgga gggagaacaa tagtaaatgt ccactcaaga tgtcctttat 4560 tataccagct cctcccacaa aaacacatgt ccagtggact ctttttctgg gatcagaacc 4620 aacaccaaaa agagcttttc tccttaaagt tagaattcta aacaggactt gaaatggcct 4680 caaggtttgt gcacaaatac tgacttctgg ctggacccag cttattctgt ttatttctcc 4740 aattgcaatt tcatccttat cctgagaaaa tgtctaaata ggccatggaa cccaggcttc 4800 cccgtgacct acaagcactt attagctgtg ccagctcctg cactgctgct aaggtccaag 4860 aaacccagat ctctcacaga gccatagaag cagagggctg gagtatctgt gaggacaaca 4920 accttgtcta acttcgcgac ctcattcttg agcatttcta ctgatgagaa actcactacc 4980 cccaattgca gctcattcaa ctttaaaatt gctgcttttt gaatcactga ttgtgaatat 5040 taatttaaaa aaataagtaa gaaaatgttt taaatgtgct gcctctttaa aaggtctcct 5100 ctttgtgcaa ccaaaaccca cctctctaga atacagtttg tataactgaa gctataattt 5160 cataccatga gtgctgctgt tagcaataat aatcatgccc ggattttatt aacaacagaa 5220 gctgttgctc gtatgaaaaa acaaacatta gttctaataa acatctgcat tgagtcaaag 5280 ctccctgttt gtttgtatgt cttttatgca ctgatgatta tagtgagttg ctttcattta 5340 ccaacatttt gttgtattcg tgtaggatca ctgtaccatg aagggagaga gactatgatg 5400 ggaagattgt tgtagataca aaagcatgtc ttaggttttt gggtcagttc tgtttaaata 5460 cctgtcctat tattcctgta aattatcaaa atatcccaga atgtcaatgt ttctgcatcc 5520 acattacaat tattaaatgc cactcattta ttaaatttac tattatcagt ggcatttaat 5580 aaatttgaat catatgttca gtgtttggtt tagaaaatat ggtgccatgt ctatgagtgg 5640 cctgttctgg attggagtac atgccttctt tctgccttga gttaatctta ctcaatggag 5700 aacaagaatc aaagaaacac caccaccaag aagcccttca agctagagtt gggcaagagt 5760 cagggagggg aatgtagacc actcatatga cagaggtgga aaccaatctt ggtctagaat 5820 aagtctcaaa atcaaaagac ttgaattcta gtgcagcgta ggttgactcc cttatttatt 5880 taattttccc atctctacac cgctagaata acctctctcc tgaggctgtt gaatctgatg 5940 aattagcaga taggaaagaa cttagaaaat tataagttca ctcaaatgta aaaggttata 6000 tgggaaataa tcaccactaa catttttgag tacttactat ctgcttgtta tacacattct 6060 ctaatttaat tttcacaaga aaattcatga aaggactata cttatccccc ttttacaggt 6120 gagcaacctg gagtgcagtg aagtgtaaaa tgtgggccga cttaggagca caaatacccc 6180 agcaacaatg agcactctta gtacacaggt cttggtttct aaaatatcat catccgataa 6240 aaggaacaca ggctctttga agaaatgact gattccggga ttggggcaag aaacacacaa 6300 gctgagactg gagcatcttg cagtcccaga aagtgaagaa acgctgagga tatgtcaaag 6360 ggacacagga gccaaatgaa agagcttcca ctggccaaag ctggaatgtt gagcaacaaa 6420 gcaacatagc attggataat aacccaaagt ataaaataaa tattcatgag tacata 6476

Claims

서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H) 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 익상편 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 익상편 진단용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 중 CFH에 대한 프라이머는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 프로브를 포함하는 것인, 익상편 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 익상편 진단용 키트.
제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 익상편 진단용 키트.
(a) 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 익상편 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 익상편 진단을 위한 정보의 제공 방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 (a)의 mRNA 수준이 정상 대조구 시료의 mRNA 수준보다 증가하는 경우, 익상편으로 진단하는 (c) 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H) 유전자의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는, 익상편의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 유전자의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리코뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 유전자의 활성을 억제할 수 있는 제제는 상기 유전자의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 안타고니스트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 익상편을 예방 또는 치료하는 방법.
(a) 시료에 익상편 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 CFH(Complement factor H) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 익상편 치료제의 스크리닝 방법.
제13항에 있어서, 상기 시료는 결막 또는 각막 유래의 조직 또는 세포인 것인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 단계 (b)의 mRNA 또는 단백질 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료의 mRNA 또는 단백질 수준보다 감소하는 경우, 상기 (a)단계에서 처리한 후보물질을 익상편 치료제로 판단하는 (c) 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.