CN108752452B

CN108752452B - Sars及其突变体的应用

Info

Publication number: CN108752452B
Application number: CN201810598828.XA
Authority: CN
Inventors: 吴南; 王坤; 杨新健; 赵森; 吴志宏
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; Beijing Neurosurgical Institute
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; Beijing Neurosurgical Institute
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2038-06-12
Also published as: CN108752452A

Abstract

本发明公开了SARS及其突变体的应用，本发明首次在BAVM患者中发现了SARS新突变c.971T>C，且通过实验证明该突变为致病突变，当存在该突变时可以诊断该患者为BAVM；本发明同时发现了敲低SARS，可以引起BAVM，而增加SARS的表达水平可以缓解BAVM的症状，提示SARS可以应用于BAVM的诊疗。

Description

SARS及其突变体的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及SARS及其突变体的应用，具体的涉及在BAVM中的应用。

背景技术

脑动静脉畸形(Brain arteriovenous malformations，BAVM)是一种严重致残、致死的先天性疾病，是造成青少年(≤18岁)颅内出血的重要原因之一(The ArteriovenousMalformation Study Group.Arteriovenous malformations of the brain in adults.NEngl J Med 1999；340:1812–1818)。动静脉畸形是扭曲的血管畸形团，动静脉之间短路，导致动脉直接与静脉相通、毛细血管床缺失，患者可表现为出血性卒中、癫痫、局部神经功能缺陷以及其他临床症状。颅内出血是BAVM的最常见症状，约占52％-77％，可造成患者瘫痪甚至死亡，尤其是未成年人颅内出血，会给家庭和社会造成极大负担。流行病学研究表明BAVM的发病率为10-18/10万人，亦有尸检研究表明总的人群发生率约为0.15％(Choi JH1,Mohr JP.Brain arteriovenous malformations in adults.Lancet Neurol.2005May；4(5):299-308)，在患者人群中，每年约2-4％的患者发生自发性颅内出血，且青少年患者的颅内出血风险要远大于成年人59％vs.41％，这是我们非常关注的重要临床问题。

目前，虽然已有对于引发颅内出血的临床相关因素研究，如年龄、畸形团大小及位置、出血史、是否合并动脉瘤以及Spetzler-Martin分级高低等，但尚无统一定论(Hashimoto T,Lawton MT,Wen G,Yang GY,Chaly T Jr,Stewart CL,Dressman HK,Barbaro NM,Marchuk DA,Young WL.Gene microarray analysis of human brainarteriovenous malformations.Neurosurgery 2004；54:410–423.[PubMed:14744289]discussion 423-415)。BAVM患者多在出现颅内出血、癫痫发作以及其他神经功能严重受损症状时才被发现，虽然BAVM可由数字减影血管造影(Digital Subtraction Angiography,DSA)确诊，但其为有创性检查，且带有辐射性，并不为所有青少年患者接受，另外，仅根据影像学检查并不能准确判断出血风险，如有的患者影像学表现血管畸形程度较轻(并不具备所谓的“风险因素”)，但仍发生了破裂严重颅内出血；相反，畸形团较大，血管紊乱(甚至合并动脉瘤)的患者却并未发生颅内出血(Zhu Y,Lawton MT,Du R,Shwe Y,Chen Y,Shen F,Young WL,Yang GY.Expression of hypoxia-inducible factor-1and vascularendothelial growth factor in response to venoushypertension.Neurosurgery2006；59:687–696.discussion 687–696.)。

临床上，未出血患者的未来出血风险以及出血患者的再出血风险评估，尤其是对于青少年来讲，对于临床治疗方法选择及预后，意义重大，但目前尚无确切证据表明某种因素与青少年BAVM破裂出血相关。BAVM的发生发展机制以及引发青少年患者出血的病因尚未明确，对于发病机理的认识不足，导致了目前治疗、随访等问题存在一定程度的盲目性，因此临床亟需明确其发病机理及预测出血风险。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与BAVM相关的基因及其突变体。

本发明的目的之二在于提供一种构建BAVM斑马鱼模型及其构建方法。

本发明的目的之三在于提供与BAVM相关的基因及其突变体在BAVM诊治中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了突变的SARS蛋白，所述蛋白的氨基酸序列除324位外，其他部分与SEQ ID NO.1相同，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比，具有p.Ile324Thr突变，其中，所述的蛋白突变为错义突变。

进一步，所述突变的SARS蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面提供了一种编码SARS基因突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列除第971位外，其他部分与SEQ ID NO.3所示，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.3相比，具有c.T971C突变。

进一步，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三方面提供了一种诊断BAVM的产品，所述产品包括SARS的检测试剂，其中，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述试剂选自：

检测SARS表达水平的试剂；或

检测SARS蛋白第324位氨基酸位点的试剂；或

检测SARS基因第971位核苷酸位点的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别SARS基因的探针，或

特异性扩增SARS基因的引物，或

特异性结合SARS蛋白的抗体或配体。

本发明的第四方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括SARS的促进剂。

进一步，所述促进剂为含有野生型SARS基因的试剂。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括(但不限于)稀释剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂。

本发明的第五方面提供了一种构建BAVM斑马鱼模型的方法，将SARS抑制剂注射入斑马鱼胚胎中。

进一步，所述SARS抑制剂为吗啉反义寡核苷酸。

进一步，所述吗啉反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.5和6所示。

进一步，所述斑马鱼胚胎为单细胞期至二细胞期的胚胎。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的蛋白在制备诊断BAVM的产品中的应用；

b.本发明第二方面所述的核苷酸序列在制备诊断BAVM的产品中的应用；

c.SARS在制备诊断BAVM的产品中的应用；

d.本发明第三方面所述的产品在制备诊断BAVM的工具中的应用；

e.SARS在制备治疗BAVM的药物中的应用；

f.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗BAVM的产品中的应用。

进一步，a中所述的产品包括检测蛋白突变位点的试剂，所述突变为p.Ile324Thr。

b中所述的产品包括检测核苷酸突变位点的试剂，所述突变为c.T971C；

c中所述的产品包括检测SARS的试剂，所述试剂是检测SARS表达水平的试剂；或是检测其突变位点和突变体的试剂。

本发明的有益效果和优点：

本发明首次发现了SARS的突变与BAVM相关，通过检测SARS是否发生突变可以判断患者是否患有BAVM。

本发明首次发现了SARS的表达水平与BAVM相关，通过检测SARS的表达水平可以判断患者是否患有BAVM。

本发明提供了一种构建BAVM模型的方法，为临床上BAVM的研究以及药物的筛选提供了新的手段。

附图说明

图1是携带SARS突变的患者的Sanger测序验证以及临床影像学诊断；其中，图Asanger测序图，图B临床影像学诊断图。

图2是斑马鱼脑血管的共聚焦显微镜荧光图。

图3是斑马鱼突变体的BAVM样表型模式图。

图4是斑马鱼突变体的生长和RT-PCR验证图；其中图A是生长图，图B是吗啉反义寡核苷酸的作用位点和上下游引物的结合位点图；图C是突变体的RT-PCR验证图。

图5是斑马鱼BAVM表型数量统计图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，利用全外显子组测序，通过核心家系与散发病例以及健康人群的对比研究，从病因学和基因学角度对BAVM的出血风险、发展转归进行预测，有助于实现早期精准、个体化治疗。同时，为复杂多基因脑血管先天性疾病的病因学研究提供了新方法和经验。

在本发明中，术语“外显子”一词是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA对应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。

检测方法

本发明可以利用本领域内已知的任何方法对基因及其编码的蛋白进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因的手段不是本发明的重要方面。本发明中的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。

检测基因表达水平的方法包括(但不限于)：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)、原位杂交(ISH)、微阵列、Southern或Northern印迹、夹心ELISA、放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

检测基因突变或蛋白突变的方法包括(但不限于)：PCR-SSCP法、异源双链分析法、变性梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶链反应、等位基因特异性扩增法、直接测序法。

PCR-SSCP法是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出不同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于基因突变的检测。

异源双链分析法(HA)，该方法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。

变性梯度凝胶电泳法(DGGE)，DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程而被分离。

化学切割错配法(CCM)，CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混和变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C、T能被切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变，该法检出率很高。

等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO)，ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表明样品中存在与该ASO探针相应的点突变。

DNA芯片技术，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高。

等位基因特异性扩增法(ASA)，通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸。

在本发明中，术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括(但不限于)：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸

术语“芯片”、“阵列”、“生物芯片”可互换使用，而且指在共同基片上排列的多种探针、标志物的集合，该基片可以是硅片、尼龙带、塑料带、或玻璃载片。

“阵列”、“宏阵列”或“微阵列”指有意创建的物质(诸如分子、标志物、开口、微线圈、检测仪和/或传感器)集合，其附着至基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)或在基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)上装配。阵列可用于同时测量大量(例如数十、数千或数百万)反应或组合的水平。阵列也可含有少量物质，例如一个、少数或一打。阵列中的物质可以彼此相同或不同。阵列可以采取多种形式，例如可溶性分子的文库、固定化分子的文库、固定化抗体的文库、拴系至树脂珠、硅片、或其它固体支持物的化合物的文库。阵列可以是宏阵列或微阵列，取决于阵列上的垫的大小。宏阵列一般含有约300微米或更大的垫大小，而且能容易地通过凝胶和印迹扫描仪来成像。微阵列一般会含有小于300微米的垫大小。

“固体支持物”指不溶性、官能化、聚合材料，可以对其附着或共价结合(常常经由接头)文库成员或试剂，从而固定化或容许它们易于与过量的试剂、可溶性反应副产物、或溶剂分开(通过过滤、离心、清洗等)。

本发明中，试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。

术语“DNA文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的DNA片段混合物。

DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括(但不局限于)步骤：

1.提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；

2.在双链核酸片段的末端添加接头连接序列；通过所述接头连接序列，在所述双链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接互补区与所述的接头连接序列互补；两侧3’端和5’端的接头的引物结合区序列不同。

3.对上一步骤获得的带有接头的DNA双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行扩增，从而获得PCR扩增产物的混合物，其中所述引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。

在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。

术语“外显子捕获”，“芯片杂交”可互换使用，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。

DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。

抑制剂

在本发明中，SARS的抑制剂包括但不限于抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。所述的SARS基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低SARS蛋白的活性、降低SARS基因或蛋白的稳定性、下调SARS蛋白的表达、减少SARS蛋白有效作用时间、或抑制SARS基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调SARS蛋白或其编码基因的表达。

作为本发明的一种选择方式，所述的SARS的抑制剂是一种特异性与SARS结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与SARS蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体

作为本发明的一种可选择的实施方式，所述SARS的抑制剂是一种SARS特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

作为本发明的一种可选方式，所述的SARS的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

作为本发明的一种优选的实施方式，所述SARS的抑制剂为一种反义寡核苷酸，反义寡核苷酸是指与体内某RNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响转录或翻译过程的RNA或DNA片段。更为优选的，所述的抑制剂为吗啉反义寡核苷酸，吗啉反义寡核苷酸(morpholinooligomers，即MO)因其核苷酸骨架上的吗啉环而得名，吗啉环取代了RNA中的核糖核苷酸环或者DNA中的脱氧核糖核苷酸环。吗啉反义寡核苷酸是一种新型反义寡核苷酸，能抑制细胞内mRNA的剪接过程，从而抑制基因的表达；同时具有良好的稳定性、溶解度和细胞渗透性。

药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括SARS的促进剂。所述促进剂包括提高SARS基因或其表达产物稳定性、上调SARS基因或其表达产物的表达水平、增加SARS基因或其表达产物有效作用时间的物质。

作为本发明的一种可选择的实施方式，所述的SARS的促进剂是一种含有SARS的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗BAVM的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将SARS的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带SARS的促进剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的SARS促进剂，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与BAVM相关的基因

1、样品收集

收集了2015年11月至2016年11月期间在北京天坛医院被确诊为BAVM的患者123名(患者及其生物学父母血液被留取，患者+生物学父母＝核心家系)。脑动静脉畸形(BAVM)的诊断通过数字减影血管造影(DSA)、磁共振成像/血管摄影或计算机断层摄影证实，所有的父母都进行了体格检查以排除严重的血管问题。

排除标准为：(1)已知的遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagictelangiectasis，HHT)、毛细血管性畸形-AVM(Capillary malformation-arteriovenousmalformation syndrome，CM-AVM)、Sturge-Weber综合征或其他孟德尔遗传血管疾病；或(2)不完整的临床数据。

经排除之后，符合标准的有100名，患者及其临床表型正常的生物学父母均进行了WES。

本研究经北京天坛医院伦理委员会批准。患者或其父母签署知情同意。斑马鱼实验经北京大学动物保护和应用委员会(IACUC)批准。

2、全外显子测序及突变注释

1)提取DNA

使用Axygen的血基因组DNA提取试剂盒提取患者及父母外周血全基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计进行DNA定量检测。

2)构建DNA文库

采用超声打断仪(Covaris s2，Massachusetts，USA)将基因组DNA随机打断成主带200-300bp的片段，取500ng提纯的DNA片段进行末端修复并连接上标记性接头，构建DNA测序文库。按照illumina标准建库方法进行3步酶促反应：通过末端修复，加“A”和连接Illumina测序接头(通过PCR反应，将一个8bp的barcode连接至DNA片段上)，形成样本文库。

3)外显子捕获

使用SureSelect Human All Exon V6+UTR r2core design(91Mb,Agilent)完成外显子捕获，具体操作参见使用说明。

4)测序及分析

使用Illumina HiSeq 4000平台进行测序，使用Genome Analysis Toolkit 3.4.0以及HaplotypeCaller检测SNP位点和插入缺失标记，采用PUMCH进行注释，新发突变、复合杂合突变和隐形遗传突变运用Gemini(version 0.19.1)来计算。利用生物信息学预测工具预测候选变异的保守性和致病性。所有变异均对比公用数据库1000Genomes Project(http://www.internationalgenome.org/),Exome variant server,NHLBI GO ExomeSequencing Project(ESP)(http://evs.gs.washington.edu/EVS/),和ExomeAggregation Consortium(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org/)，筛选致病性的变异。

3、结果

结果显示，与参考转录本(NM_006513.3)相比，患者的SARS基因出现了突变c.971T>C(p.Ile324Thr)。

实施例2使用sanger测序对突变位点进行验证

1、将从患者和父母获得的基因组DNA，并使用Axygen-AP-GX-50套件试剂盒进行纯化，在ABI3730测序仪上进行Sanger测序。

2、结果

结果如图1所示，测序结果显示，患者中的SARS第971位的核苷酸由T变成了C。

实施例3斑马鱼验证

1、斑马鱼品系

利用Tg(kdrl.4:mCherry)^pku6转基因斑马鱼进行实验其体内mCherry红色荧光的表达是由kdrl.4(一种内皮细胞特异性基因)调控。斑马鱼和胚胎按照标准进行培育。为了避免真菌感染，胚胎在0.5g/L亚甲基蓝中进行孵化。1-苯基2-硫脲(0.003％)被用来抑制色素生成。

2、体外转录和胚胎注射

为了体内验证针对斑马鱼同源的SARS的设计了反义吗啉反义寡核苷酸，MO1(针对外显子8-内含子8的剪切区)，MO2(针对AUG位点)，具体序列如下：

MO1：5'-AGGAGAATGTGAACAAACCTGACAC-3'(SEQ ID NO.5)

MO2：5'-GTCTAAATCGAGCACCATTATGCCT-3'(SEQ ID NO.6)

对照MO：5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'(SEQ ID NO.7)

将基因敲低试剂Morpholino 5ng注射入斑马鱼胚胎单细胞期至二细胞期的细胞。

将SARS野生型和突变型的cDNA序列克隆进pCS2+质粒，使用限制性内切酶消化，并使用Ambion mMESSAGE mMACHINE试剂盒转录出mRNA，以200pg的剂量与Morpholino(吗啉反义寡核苷酸)进行共同注射。

3、荧光观察

将48h的斑马鱼使用镊子剥去卵膜，使用Tricane麻醉。将胚胎在低熔点胶中固定，使用共聚焦显微镜进行拍照，由两位研究者使用盲法评估斑马鱼脑血管表型。

4、RNA提取

使用Trizol法提取24h胚胎的总RNA，将组织或细胞匀浆后，加入1.5ml离心管。加入0.2倍相同体积的氯仿，振荡混匀30s。室温离心15000g 3min。将上清液转移到另一干净离心管中。在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均30s。室温离心15000g5min，RNA沉淀将在离心底的侧面形成，小心吸弃上清液。清洗：在含RNA沉淀的离心管中加入1ml 75％乙醇,振荡器上振荡混均30s。室温15000g离心1min。小心吸弃上清液。重复清洗步骤。将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA。

5、逆转录

将RNA产物使用OneScript Reverse Transcriptase kit试剂盒进行逆转录，将逆转录产物进行PCR扩增。引物序列如下：

SARS的引物序列如下：

正向引物：5’-TCTCCACCTGCTTCAGACAG-3’(SEQ ID NO.8)

反向引物：5’-AAACCAAGCCTCTAAATCCAGC-3’(SEQ ID NO.9)

PCR反应条件如下：

6、统计分析

利用SPSS 15.0软件进行统计分析，所有的实验进行了至少三次重复，有统计学意义的定义为P<0.05。利用t检验分析斑马鱼表型比例数据。

7、结果

结果如图2所示，斑马鱼脑血管的免疫荧光分析显示一系列BAVM特征：(1)异常的后循环连接血管节段(posterior connecting segments，PCS)延伸并与靠近基底交通动脉(basal communicating artery，BCA)的原始后脑通道(the primordial hidbrainchannel，PHBC)融合，形成了半月形畸形表现；(2)BCA和PCS扩张；(3)大脑前动脉的发育不良(图2)。这些结果与之前报道的AVM斑马鱼模型相一致。

进一步验证SARS基因及其突变的功能，SARS突变体(SARS敲低的斑马鱼)的头部、心周出现了不同程度的水肿(图4A)，而RT-PCR胶图，可见被截断了约130bp的sars转录本(图4C)。对BAVM表型的斑马鱼进行统计，发现SARS敲除相比对照组显著提高了AVM表型，说明SARS与BAVM的发生发展相关，而注射人类野生型SARS基因mRNA可以缓解SARS突变体的BAVM样表型，而注射人类SARS突变体(c.971T>C)mRNA却无作用(图5)，说明SARS基因的c.971T>C(p.Ile324Thr)突变为致病突变。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

北京市神经外科研究所

<120> SARS及其突变体的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 514

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Ser Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ser Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Ile Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

Met Asp Lys Val Glu Phe Val His Met Leu Asn Ala Thr Met Cys Ala

420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Val Leu Asp Leu Asp Leu Phe Arg Val Asp Lys Gly Gly Asp Pro

1 5 10 15

Ala Leu Ile Arg Glu Thr Gln Glu Lys Arg Phe Lys Asp Pro Gly Leu

20 25 30

Val Asp Gln Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Trp Arg Arg Cys Arg Phe

35 40 45

Arg Ala Asp Asn Leu Asn Lys Leu Lys Asn Leu Cys Ser Lys Thr Ile

50 55 60

Gly Glu Lys Met Lys Lys Lys Glu Pro Val Gly Asp Asp Glu Ser Val

65 70 75 80

Pro Glu Asn Val Leu Ser Phe Asp Asp Leu Thr Ala Asp Ala Leu Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Val Ser Gln Ile Lys Lys Val Arg Leu Leu Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Ile Leu Lys Cys Asp Ala Glu Arg Ile Lys Leu Glu Ala Glu Arg

115 120 125

Phe Glu Asn Leu Arg Glu Ile Gly Asn Leu Leu His Pro Ser Val Pro

130 135 140

Ile Ser Asn Asp Glu Asp Val Asp Asn Lys Val Glu Arg Ile Trp Gly

145 150 155 160

Asp Cys Thr Val Arg Lys Lys Tyr Ser His Val Asp Leu Val Val Met

165 170 175

Val Asp Gly Phe Glu Gly Glu Lys Gly Ala Val Val Ala Gly Ser Arg

180 185 190

Gly Tyr Phe Leu Lys Gly Val Leu Val Phe Leu Glu Gln Ala Leu Ile

195 200 205

Gln Tyr Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Arg Gly Tyr Ile Pro Ile Tyr

210 215 220

Thr Pro Phe Phe Met Arg Lys Glu Val Met Gln Glu Val Ala Gln Leu

225 230 235 240

Ser Gln Phe Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Glu

245 250 255

Lys Ser Asp Asp Asn Ser Tyr Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ala Thr Ser

260 265 270

Glu Gln Pro Ile Ala Ala Leu His Arg Asp Glu Trp Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Asp Leu Pro Ile Lys Tyr Ala Gly Leu Ser Thr Cys Phe Arg Gln Glu

290 295 300

Val Gly Ser His Gly Arg Asp Thr Arg Gly Ile Phe Arg Val His Gln

305 310 315 320

Phe Glu Lys Thr Glu Gln Phe Val Tyr Ser Ser Pro His Asp Asn Lys

325 330 335

Ser Trp Glu Met Phe Glu Glu Met Ile Thr Thr Ala Glu Glu Phe Tyr

340 345 350

Gln Ser Leu Gly Ile Pro Tyr His Ile Val Asn Ile Val Ser Gly Ser

355 360 365

Leu Asn His Ala Ala Ser Lys Lys Leu Asp Leu Glu Ala Trp Phe Pro

370 375 380

Gly Ser Gly Ala Phe Arg Glu Leu Val Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp

385 390 395 400

Tyr Gln Ala Arg Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Gly Gln Thr Lys Lys Met

405 410 415

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420 425 430

Thr Thr Arg Thr Ile Cys Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Thr Glu Lys

435 440 445

Gly Ile Thr Val Pro Glu Lys Leu Lys Glu Phe Met Pro Pro Gly Leu

450 455 460

Gln Glu Leu Ile Pro Phe Val Lys Pro Ala Pro Ile Glu Gln Glu Pro

465 470 475 480

Ser Lys Lys Gln Lys Lys Gln His Glu Gly Ser Lys Lys Lys Ala Ala

485 490 495

Ala Arg Asp Val Thr Leu Glu Asn Arg Leu Gln Asn Met Glu Val Thr

500 505 510

Asp Ala

<210> 3

<211> 1545

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atggtgctgg atctggattt gtttcgggtg gataaaggag gggacccagc cctcatccga 60

gagacgcagg agaagcgctt caaggacccg ggactagtgg accagctggt gaaggcagac 120

agcgagtggc gacgatgtag atttcgggca gacaacttga acaagctgaa gaacctatgc 180

agcaagacaa tcggagagaa aatgaagaaa aaagagccag tgggagatga tgagtctgtc 240

ccagagaatg tgctgagttt cgatgacctt actgcagacg ctttagctaa cctgaaagtc 300

tcacaaatca aaaaagtccg actcctcatt gatgaagcca tcctgaagtg tgacgcggag 360

cggataaagt tggaagcaga gcggtttgag aacctccgag agattgggaa ccttctgcac 420

ccttctgtac ccatcagtaa cgatgaggat gtggacaaca aagtagagag gatttggggt 480

gattgtacag tcaggaagaa gtactctcat gtggacctgg tggtgatggt agatggcttt 540

gaaggcgaaa agggggccgt ggtggctggg agtcgagggt acttcttgaa gggggtcctg 600

gtgttcctgg aacaggctct catccagtat gcccttcgca ccttgggaag tcggggctac 660

attcccattt ataccccctt tttcatgagg aaggaggtca tgcaggaggt ggcacagctc 720

agccagtttg atgaagaact ttataaggtg attggcaaag gcagtgaaaa gtctgatgac 780

aactcctatg atgagaagta cctgattgcc acctcagagc agcccattgc tgccctgcac 840

cgggatgagt ggctccggcc ggaggacctg cccatcaagt atgctggcct gtctacctgc 900

ttccgtcagg aggtgggctc ccatggccgt gacacccgtg gcatcttccg agtccatcag 960

tttgagaaga ttgaacagtt tgtgtactca tcaccccatg acaacaagtc atgggagatg 1020

tttgaagaga tgattaccac cgcagaggag ttctaccagt ccctggggat tccttaccac 1080

attgtgaata ttgtctcagg ttctttgaat catgctgcca gtaagaagct tgacctggag 1140

gcctggtttc cgggctcagg agccttccgt gagttggtct cctgttctaa ttgcacggat 1200

taccaggctc gccggcttcg aatccgatat gggcaaacca agaagatgat ggacaaggtg 1260

gagtttgtcc atatgctcaa tgctaccatg tgcgccacta cccgtaccat ctgcgccatc 1320

ctggagaact accagacaga gaagggcatc actgtgcctg agaaattgaa ggagttcatg 1380

ccgccaggac tgcaagaact gatccccttt gtgaagcctg cgcccattga gcaggagcca 1440

tcaaagaagc agaagaagca acatgagggc agcaaaaaga aagcagcagc aagagacgtc 1500

accctagaaa acaggctgca gaacatggag gtcaccgatg cttga 1545

<210> 4

<211> 1545

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

atggtgctgg atctggattt gtttcgggtg gataaaggag gggacccagc cctcatccga 60

gagacgcagg agaagcgctt caaggacccg ggactagtgg accagctggt gaaggcagac 120

agcgagtggc gacgatgtag atttcgggca gacaacttga acaagctgaa gaacctatgc 180

agcaagacaa tcggagagaa aatgaagaaa aaagagccag tgggagatga tgagtctgtc 240

ccagagaatg tgctgagttt cgatgacctt actgcagacg ctttagctaa cctgaaagtc 300

tcacaaatca aaaaagtccg actcctcatt gatgaagcca tcctgaagtg tgacgcggag 360

cggataaagt tggaagcaga gcggtttgag aacctccgag agattgggaa ccttctgcac 420

ccttctgtac ccatcagtaa cgatgaggat gtggacaaca aagtagagag gatttggggt 480

gattgtacag tcaggaagaa gtactctcat gtggacctgg tggtgatggt agatggcttt 540

gaaggcgaaa agggggccgt ggtggctggg agtcgagggt acttcttgaa gggggtcctg 600

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cgggatgagt ggctccggcc ggaggacctg cccatcaagt atgctggcct gtctacctgc 900

ttccgtcagg aggtgggctc ccatggccgt gacacccgtg gcatcttccg agtccatcag 960

tttgagaaga ctgaacagtt tgtgtactca tcaccccatg acaacaagtc atgggagatg 1020

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gagtttgtcc atatgctcaa tgctaccatg tgcgccacta cccgtaccat ctgcgccatc 1320

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ccgccaggac tgcaagaact gatccccttt gtgaagcctg cgcccattga gcaggagcca 1440

tcaaagaagc agaagaagca acatgagggc agcaaaaaga aagcagcagc aagagacgtc 1500

accctagaaa acaggctgca gaacatggag gtcaccgatg cttga 1545

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggagaatgt gaacaaacct gacac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 25

<212> DNA

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<400> 7

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<210> 8

<211> 20

<212> DNA

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<400> 8

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<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaccaagcc tctaaatcca gc 22

Claims

1.一种构建BAVM斑马鱼模型的方法，其特征在于，

1）培育斑马鱼的胚胎；

2）针对斑马鱼中SARS的同源基因设计抑制剂，所述抑制剂为吗啉反义寡核苷酸，序列如SEQ ID NO.5和6所示；

3）将所述抑制剂5ng注射入斑马鱼胚胎单细胞期至二细胞期的细胞。

2.一种检测突变核苷酸的试剂在制备诊断BAVM的产品中的应用，其特征在于，该试剂所检测的突变核苷酸与SEQ ID NO.3相比，所述的突变核苷酸第971位由T突变为C，突变后核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种检测突变蛋白的试剂在制备诊断BAVM的产品中的应用，其特征在于，所述的突变蛋白由SEQ ID NO.2编码，与SEQ ID NO.1编码的蛋白相比，突变蛋白的第324位氨基酸由异亮酸突变为苏氨酸。