CN110885824B - miRNA-199核酸抑制物及其在翼状胬肉中的应用 - Google Patents

miRNA-199核酸抑制物及其在翼状胬肉中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及miRNA‑199核酸抑制物及其在翼状胬肉中的应用。所述核酸抑制物为分别针对miR‑199a‑3p和miR‑199a‑5p的成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA。本发明首次发现，miR‑199a‑3p inhibitor、miR‑199a‑5p inhibitor能够分别通过抑制miR‑199a‑3p和miR‑199a‑5p的表达，抑制结膜上皮细胞迁移、EMT发生，促进细胞的凋亡作用，从而达到抑制翼状胬肉发生发展的作用，这对翼状胬肉治疗新方法的建立具有重要的意义。

Description

miRNA-199核酸抑制物及其在翼状胬肉中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及miR-199a核酸抑制物的构建及其在翼状胬肉中的应用。
背景技术
翼状胬肉是常见的眼表疾病，在我国汉族人群中的患病率高达2％～5％。主要是由于睑裂部球结膜及结膜下组织变性、肥厚、增生，其头部多呈三角形，侵及角膜，并向角膜中央生长。多位于鼻侧，偶位于颞侧，当增生的结膜下组织覆盖瞳孔，会影响患者的视力，严重者可致盲。翼状胬肉病因复杂涉及多种因素，如氧化损伤，免疫异常，炎症反应和角膜缘干细胞功能障碍，细胞凋亡，人乳头状瘤病毒以及遗传因素等，也可能是以上因素联合作用的结果。翼状胬肉的病理表现有类似上皮肿瘤的生物学特性，其组织上皮细胞增生活性高、增殖速度快，凋亡减少，细胞迁移能力增加，呈现出上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的特点。多见于户外劳动者，以渔民、农民发病最多，与风尘、烟雾、紫外线等长期的慢性刺激有关。
翼状胬肉目前常用的治疗手段为外科手术切除法，但这种方法为有创性治疗，术后需要一定的恢复时间，且复发率很高，随翼状胬肉体积较大、进展速度增快，对手术方法的操作要求也有所增加。目前临床上辅以手术运用的药物主要有丝裂霉素和强力霉素，两种药物都属于抗血管生成药物，两种药物的治疗针对性有限，且仅用于术后防翼状胬肉的复发，而且丝裂霉素毒性较大，因此许多眼科医师一直致力于其发病机制的研究和治疗方式的改良，以期改善临床治疗防护的效果。近年来，鉴于microRNA(miRNA)具有高敏感性、不易降解、易于检测等优势，miRNA在翼状胬肉发病机制中的作用逐渐受到重视。
miRNA是一类长度为22bp上下的广泛存在真核生物体内的内源性非编码单链小分RNA，通过与目标基因3’端的非编码区完全或不完全互补配对，在转录后水平对靶基因的表达进行调控(降解mRNA或抑制其翻译)，在细胞增殖、迁移、分化、凋亡等细胞活动中发挥着重要的作用。目前已有研究表明miRNAs的异常表达与翼状胬肉的发生、发展密切相关。而miR-199a-3p和miR-199a-5p作为miR-199家族的重要成员，推动了许多组织纤维化的发展进程。研究表明，基于miRNA的基因治疗方法可以作为一种有效的翼状胬肉治疗手段。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种含miRNA-199核酸抑制物及其在翼状胬肉中的应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor，所述miR-199a-3pinhibitor是针对miR-199a-3p成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述miR-199a-5pinhibitor是针对miR-199a-5p成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述小片段单链RNA的序列与相应的miRNA序列反向互补。
上述方案中，所述的miR-199a-3p成熟miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的miR-199a-5p成熟miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
上述方案中，所述miR-199a-3p inhibitor的核苷酸序列为5’-UAACC AAUGUGCAGA CUACU GU-3’(SEQ ID NO:3)，所述miR-199a-5p inhibitor的核苷酸序列为5’-GAACA GGUAG UCUGA ACACU GGG-3’(SEQ ID NO:4)。
上述miR-199a-3p inhibitor和/或miR-199a-5p inhibitor在制备用于抑制结膜上皮细胞迁移、EMT、促进结膜上皮细胞凋亡方面的药物中的应用。
上述miR-199a-3p inhibitor和/或miR-199a-5p inhibitor在制备用于抗翼状胬肉药物中的应用。
一种抗翼状胬肉的药物组合物，其药物组合物中包含上述miR-199a-3inhibitor和/或miR-199a-5p inhibitor。
上述方案中，所述的药物组合物还可以含有药学上可接受的载体。如miR-199a-3pinhibitor或miR-199a-5p inhibitor可采用脂质体、脂蛋白、胆固醇等作为载体，将单链小片段RNA分子导入到目标细胞中。
上述方案中，所述药物组合物，为用于眼部的局部用药，其制剂形式包括但不限于冻干粉针、注射剂、滴眼液或贴剂等。
本发明中所述的miR-199a-3p和miR-199a-5p是指成熟的miRNA。成熟的miRNA是由较长的初级转录物(pri-miRNA)经过一系列核酸酶的剪切加工而成的。Pri-miRNA含5’帽子结构和3’poly A尾，其长度从几百到几千个碱基不等，链上存在数个发夹结构。Pri-miRNA剪切后，首先形成长度约为70个碱基上下的miRNA前体(pre-miRNA)。Pre-miRNA5’端含有磷酸基团，3’端含有羟基，是单一的发夹结构。Pre-miRNA进一步剪切，才会形成22bp上下的成熟的miRNA。
其中，成熟的miR-199a-3p和miR-199a-5p序列利用miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)获取。成熟的miR-199a-3p(has-miR-199a-3p，MIMAT0030040)和miR-199a-5p(has-miR-199a-5p，MIMAT0000231)的核苷酸序列分别为：
5’-ACAGU AGUCU GCACA UUGGU UA-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-CCCAG UGUUC AGACU ACCUG UUC-3’(SEQ ID NO:2)。
本发明的有益效果：本发明首次发现，miR-199a-3p和miR-199a-5p核酸抑制物(miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor)能够分别通过抑制miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达，抑制结膜上皮细胞迁移、EMT发生，促进结膜上皮细胞的凋亡，从而达到抑制翼状胬肉发生发展的作用，这对开发抗翼状胬肉新药物以及治疗新方法的建立具有重要的意义。
附图说明：
图1为miR-199a-3p和miR-199a-5p在翼状胬肉组织中的差异表达情况，其中A为miR-199a-3p，B为miR-199a-5p。
图2为miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor在结膜上皮细胞中的有效性验证结果，其中A为miR-199a-3p，B为miR-199a-5p。
图3为miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor抑制结膜上皮细胞迁移的结果。
图4为miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor抑制结膜上皮细胞EMT的发生的结果，其中A为miR-199a-3p，B为miR-199a-5p。
图5为miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor促进结膜上皮细胞凋亡的结果。其中，A为miR-199a-3p inhibitor，B为miR-199a-5p inhibitor，C为阴性对照(转染inhibitor-NC)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor的构建方法
1.利用miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库，获得miR-199a-3p(miR-199a-3p，MIMAT0030040)和miR-199a-5p(miR-199a-5p，MIMAT0000231)的成熟miRNA核苷酸序列，具体序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.利用PrimerPremier5.0软件分别设计引物(包括正义链和反义链)，所设计的引物除满足引物设计原则外，二者的PCR产物应分别包括全长miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5pinhibitor。miR-199a-3p inhibitor具体序列如下：5’-UAACC AAUGU GCAGA CUACUGU-3’；miR-199a-5p inhibitor具体序列如下：5’-GAACA GGUAG UCUGA ACACU GGG-3’。miRNA的RT Primer、F Primer、R Primer如下：
Figure GDA0003315876010000041
3.取翼状胬肉成纤维细胞，用Trizol裂解法提取总RNA，用试剂盒RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo scientific)逆转录得到cDNA。
4.寡脱氧核苷酸退火：将合成好的脱氧核苷酸(cDNA)稀释为1ug/ul，取相应的正义链和反义链各5ul退火形成双链，反应如下：
Figure GDA0003315876010000051
反应条件：95℃，5min，缓慢降至室温。梯度PCR扩增。
5.两组PCR产物分别进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳后于紫外光下切取相应的目的条带，两组目的条带分别为miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5pinhibitor的编码基因，然后用胶回收试剂盒和DNA纯化试剂盒进行回收和纯化。
6.将纯化后的DNA序列为模板，利用PCR扩增及化学合成的方法(将碱基T替代为碱基U)，合成miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor，反应过程如下：
Figure GDA0003315876010000052
实施例2 miR-199a-3p和miR-199a-5p在翼状胬肉组织中的表达情况
1.临床上收集手术切除的翼状胬肉组织和正常结膜上皮组织(60-100mg)，Trizol裂解法提取总RNA。
2.测定提取的RNA浓度后，用试剂盒RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit(Thermo scientific)逆转录miRNA。
Figure GDA0003315876010000053
Figure GDA0003315876010000061
3.使用SYBR Green的real-time PCR检测miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达水平，按照UltraSYBR Mixture(Cwbio)试剂盒的说明书进行操作。
Figure GDA0003315876010000062
反应条件如下：1个循环，95℃*5min(起始模板变性)；35-40个循环：95℃*10sec(PCR循环中模板变性)，60℃*30s(退火)，72℃*30s(延伸)；95℃*15s，60℃*1min(融解曲线分析)。
4.研究采用log10(2-ΔCt)相对定量法来计算miR-199a-3p和miR-199a-5p在翼状胬肉组织和正常结膜上皮组织中的表达水平，以U6位内源性对照。ΔCt＝翼状胬肉组织或正常结膜上皮组织中miR-199a-3p或miR-199a-5p的Ct值-对应样品U6的Ct值，以relativeexpression＝log10(2-ΔCt)分别表示miRNA在翼状胬肉组织和正常结膜上皮组织中的相对表达情况，t检验计算是否存在统计学差异。
实验结果：如图1(A)/图1(B)所示，与正常结膜组织对照相比，翼状胬肉中miR-199a-3p和miR-199a-5p均显示高表达。
实施例3 miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor能够抑制相应miRNA的表达
1.结膜上皮细胞的培养：含10％FBS和1％双抗(青霉素和链霉素)的高糖DMEM(H-DMEM)培养基，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞汇合度达80％-90％时，实验0.25％胰酶对细胞进行消化传代。
2.细胞转染：用riboFECTTM CP转染试剂将miR-199a-3p和miR-199a-5p的干扰核酸片段miR-199a-3pinhibitor和miR-199a-5p inhibitor，以及阴性对照inhibitor-NC分别转染结膜上皮细胞。
①将生长状态良好、处于对数生长期的结膜上皮细胞用胰酶消化后，分别按每孔4*105的细胞密度接种于六孔板，培养基为不含双抗的10％FBS的H-DMEM，培养24h。
②配置转染体系：108ul PBS+12ul 10*riboFECTTM CP Buffer+10ul miR-199a-3pinhibitor/miR-199a-5p inhibitor/inhibitor-NC+12ul riboFECTTM CP Reagent，室温静置15min后加入对应的六孔板，放入培养箱培养36h。
转染完成后，根据需要进行相关功能实验。
3.细胞RNA提取：HP Total RNA Kit(OMEGA)。
4.细胞转染inhibitor后miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达量检测：根据实施例一中的条件进行检测。
实验结果：如图2(A)/图2(B)所示，分别转染miR-199a-3p inhibitor或miR-199a-5pinhibitor后，结膜上皮细胞中miR-199a-3p和miR-199a-5p表达量显著下降，证明inhibitor能够抑制miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达。
实施例4 miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor均能够抑制结膜上皮细胞的迁移能力。
1.细胞转染：miR-199a-3p inhibitor、miR-199a-5p inhibitor和inhibitor-NC转染24h后安排下列实验。
2.Transwell实验：结膜上皮细胞转染后24h后，胰酶消化细胞后用不含血清的H-DMEM重悬，进行细胞计数，于每个transwell小室中分别加入8*105个细胞，加入的体积为100ul。与24孔板相应孔内加入含20％FBS的H-DMEM 600ul，将transwell小室放上，48h后取出，准备染色。
3.染色：取出小室，PBS与小室正面轻轻冲洗3遍(不要碰到小室的下面)。与24孔板加入600ul的4％的甲醛固定液，放入小室，固定15min，配置结晶紫染液(甲醇配置0.5％的结晶紫染液，使用前用用PBS稀释至0.1％)。固定后PBS冲洗上层小室3遍，于24孔板每孔加入600ul 0.1％的结晶紫，染色25min。染色25min后，PBS冲洗3遍，棉签擦干上层小室，开盖过夜晾干小室。
4.拍照分析结果：40倍镜下每个小室拍摄5张图片，ImageJ软件分析计数每张图片的细胞数。
实验结果：如图3所示，分别转染miR-199a-3p inhibitor或miR-199a-5pinhibitor后，结膜上皮细胞的迁移能力明显减弱，分别下降约30％。结果表明，miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor能够显著性抑制结膜上皮细胞的迁移能力。
实施例5 miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor均能够抑制结膜上皮细胞EMT的发生
1.细胞转染：miR-199a-3p inhibitor、miR-199a-5p inhibitor和inhibitor-NC转染48h后安排下列实验。
2.蛋白制备：转染后48h，胰酶消化细胞，六孔板每个孔消化的细胞置于1.5ml的EP管中，每管加入100ul的含1mM的PI和1mM的PMSF的RIPA蛋白裂解液，于4℃静置30min。4℃条件下12000rpm*15min离心，转上清液至另一洁净的EP管。
3.BCA法测定蛋白浓度，加入loading buffer，确保相同体积内蛋白质量一致，100℃煮蛋白10min，分装为每管20ug。
4.Western blot检测N-cadherin、E-cadherin和Vimentin(抗体从ABclonal购买)。
实验结果：如图4(A)/图4(B)所示，分别转染miR-199a-3p inhibitor或miR-199a-5pinhibitor后，结膜上皮细胞EMT的发生明显下降。在3个EMT指示靶标中，N-cadherin和Vimentin为间皮细胞标志物，在EMT的发生发展进程中升高；E-cadherin为上皮细胞标志物，在EMT的发生发展进程中降低。结果表明，miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5pinhibitor能够显著性抑制结膜上皮细胞中EMT的发生。
实施例6 miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor均能够促进结膜上皮细胞的凋亡
1.细胞转染：miR-199a-3p inhibitor、miR-199a-5p inhibitor和inhibitor-NC转染48h后安排下列实验。
2.细胞重悬：转染后48h，胰酶消化细胞，六孔板每个孔消化的细胞置于1.5ml的EP管中，PBS充分洗涤，用400ul Annexin V重悬，细胞浓度需达1*106/ml。
3.染色孵育：每孔加入5ul Annexin V-FITC染色液，震荡混匀后避光静置15min，中途需在振荡器上混匀一次，以确保染色剂与细胞充分结合。15min后，加入7ul的Propidium lodide(PI)染色液，震荡混匀后避光静置5min。
4.上流式分析仪进行检测。
实验结果，如图5(A)/图5(B)/图5(C)所示，分别转染miR-199a-3p inhibitor，miR-199a-5p inhibitor和inhibitor-NC后，结膜上皮细胞中凋亡细胞的比例明显上升。流式细胞分析结果显示，FITC和PI双染阳性为凋亡晚期细胞，在图中位于第一象限；FITC阳性，PI阴性为凋亡早期细胞，在图中位于第四象限。结果表明，miR-199a-3p inhibitor和miR-199a-5p inhibitor能够显著性促进结膜上皮细胞凋亡。
序列表
<110> 武汉大学
<120> miRNA-199核酸抑制物及其在翼状胬肉中的应用
<160> 4
<210> 1
<211> 22bp
<212> RNA
<213> 人
<400> 1
acaguagucu gcacauuggu ua 22
<210> 2
<211> 23bp
<212> RNA
<213> 人
<400> 2
cccag uguuc agacu accug uuc 23
<210> 3
<211> 22bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
uaaccaaugu gcagacuacu gu 22
<210> 4
<211> 23bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaca gguag ucuga acacu ggg 23

Claims (3)

1.miR-199a-3pinhibitor和/或miR-199a-5pinhibitor在制备用于抑制结膜上皮细胞迁移、EMT、促进结膜上皮细胞凋亡方面的药物中的应用，所述miR-199a-3pinhibitor是针对miR199a-3p成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述miR-199a-5p inhibitor是针对miR-199a-5p成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述小片段单链RNA的序列与相应的miRNA序列反向互补。
2.miR-199a-3pinhibitor和/或miR-199a-5pinhibitor在制备用于抗翼状胬肉药物中的应用，所述miR-199a-3p inhibitor是针对miR-199a-3p成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述miR-199a-5p inhibitor是针对miR-199a-5p成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述小片段单链RNA的序列与相应的miRNA序列反向互补。
3.根据权利要求1或2任一所述应用，其特征在于，所述miR-199a-3p成熟miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述miR-199a-5p成熟miRNA的核苷酸序列如SEQ IN NO:2所示；所述miR-199a-3p inhibitor的核酸序列为5’-UAACC AAUGU GCAGA CUACU GU3’，所述miR-199a-5p inhibitor的核酸序列为5’-GAACA GGUAG UCUGA ACACU GGG-3’。
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