CN107841503A - miR‑199a‑5p的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用 - Google Patents

miR‑199a‑5p的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用 Download PDF

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CN107841503A CN201711062731.9A CN201711062731A CN107841503A CN 107841503 A CN107841503 A CN 107841503A CN 201711062731 A CN201711062731 A CN 201711062731A CN 107841503 A CN107841503 A CN 107841503A
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孟竺
张春艳
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Abstract

本发明涉及一种miR‑199a‑5p的模拟物，所述miR‑199a‑5p的模拟物为SEQ ID NO.1，miR‑199a‑5p的抑制物为SEQ ID NO.2，其结合miR‑199a‑5p的位点为CACTGGA；二者均能够调节miR‑199a‑5p与TNF‑α的3′‑UTR的结合水平，从而起到调节细胞凋亡、细胞成活和增殖作用，本发明还公开了一种包含上述抑制物核苷酸序列的重组表达载体，并且进一步公开了上述模拟物及抑制物在制备调节肝细胞增殖的药物中的应用。本发明为开发相关药物提供了高效的、高通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。

Description

miR-199a-5p的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种miR-199a-5p的模拟物和一种抑制物及后者的重组表达载体及其用途。
背景技术
肝脏是机体的重要器官，具有储存、代谢、生物转化、解毒、造血、合成胆色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相关基因对肝细胞增殖和肝再生的作用，对揭示肝再生机制、构建人工肝、建立治疗和预防肝病方法等都有重要理论意义和应用价值。
microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA分子。miRNA通过与靶基因mRNA的3′-UTR特定区域的结合引起翻译的抑制或是mRNA的降解。由于miRNA参与调节细胞分化、增殖、凋亡等一系列的重要活动，且在许多疾病和肿瘤的发生发展过程中的作用，因此，越来越多地受到研究人员的高度重视miRNA研究。
研究表明，miR-199a-5p出现于多种生物，能调节TNF-α、VEGFA、mTOR、MMP9、CD44、HIF-1α等多个靶基因的表达。其中TNF-α是由巨噬细胞/单核细胞活化产生的一种细胞因子，以三聚体的形式发挥作用。TNF三聚体结合到TNF-R1的胞外区后，TNF-R1胞内区上的SODD(silencer of death domain)被释放。随后，TRADD(TNF-R1 associated death domainprotein)的C端死亡结构域与TNF-R1的死亡结构域结合，形成TNRRl/TRADD复合体。FADD(Fasassociated death domain protein)被招募到该复合体上，FADD的N端MORT结构域进而激活MACH/FLICE(Caspase-8)，被激活的Caspase-8再去激活其他的ICE/CED3蛋白酶。这样，通过caspasse-8蛋白酶的级联放大反应，诱导细胞凋亡。
miR-199a-5p的模拟物体内促细胞增殖的原理是用基因转染的方法将模拟物导入受体细胞，该模拟物与TNF-α的3′-UTR结合，导致TNF-α表达水平降低，从而阻遏TNF-α的促凋亡作用，促进细胞增殖；miR-199a-5p的抑制物体内发挥作用的原理是设计并构建重组载体，其内含有miR-199a-5p的抑制物核苷酸序列，用基因转移的方法将重组载体导入受体细胞，通过载体过表达miR-199a-5p的抑制物核苷酸序列，此抑制物核苷酸序列与miR-199a-5p定点结合，从而抑制miR-199a-5p与TNF-α的3′-UTR结合，TNF-α表达水平增加，从而促进TNF-α的促细胞凋亡作用。
发明内容
本发明提供了一种miR-199a-5p的模拟物及抑制物，该模拟物及抑制物可用于调节TNF-α蛋白表达，以及调节肝细胞增殖或凋亡的基础医学和临床医学的研究，有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种miR-199a-5p的模拟物，所述模拟物为SEQ ID NO.1。
本发明还提供了一种能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物，其特征在于，所述抑制物选自TNF-α的3′-UTR中长约700～1000bp区段；所述抑制物与miR-199a-5p的结合位点为CACTGGA。
在根据本发明的一个实施方案中，所述抑制物为SEQ ID NO.2。
在根据本发明的一个实施方案中，所述抑制物核苷酸序列的5′和3′末端分别添加限制性酶切位点；优选地，所述限制性酶切位点在酶切后产生粘性末端；更优选地，所述的限制性酶切位点分别为Xho I和Not I对应的核苷酸序列；所述Xho I酶切位点位于5′末端，所述Not I酶切位点位于3′末端。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物。
在根据本发明的一个实施方案中，所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素报告酶。
在根据本发明的一个实施方案中，所述重组表达载体是通过将上述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物连接到报告载体psi-CHECK-2中得到的。
本发明进一步提供了上述的miR-199a-5p的模拟物和/或上述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物在制备用于促进肝再生的药物中的应用。
在根据本发明的一个实施方案中，所述促进肝再生的药物为抑制细胞凋亡相关蛋白TNF表达和/或促进肝细胞增殖相关蛋白表达的药物。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
本发明提供的miR-199a-5p的模拟物可以用于降低TNF-α蛋白的表达，以及促进肝细胞增殖的基础医学和临床医学的研究；本发明提供的miR-199a-5p的抑制物及其重组表达载体可以用于增加TNF-α蛋白的表达，以及促进肝细胞凋亡的基础医学和临床医学的研究；二者有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。
附图说明
图1为miR-199a-5p的高通量检测结果与qRT-PCR检测结果的比较。蓝线为高通量检测结果；红线为qRT-PCR检测结果；
图2为用MTT法检测miR-199a-5p的mimic及inhibitor对BRL-3A细胞增殖活性的影响；
图3a为EdU法检测miR-199a-5p的mimic及inhibitor对BRL-3A细胞增殖活性的影响；
图3b为miR-199a-5p的mimic及inhibitor对BRL-3A细胞增殖活性统计分析结果；
图4为miR-199a-5p的mimic和inhibitor对BRL-3A细胞周期的影响；
图5a为miR-199a-5p与TNF-α的3′-UTR结合位点示意图；
图5b为双荧光素酶方法验证miR-199a-5p与TNF-d的3′-UTR的结合。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1：大鼠肝再生模型制备与取材
实验大鼠为成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重230±20g，由河南师范大学实验动物中心提供。饲养温度为21±2℃，相对湿度为60±10％，光照时间12h/d(8：00-20：00)，自由饮水、摄食。取114只上述大鼠，随机分为19组，每组6只。其中，正常对照(0h)1组，2/3肝切除(partial hepatectomy，PH)与假手术对照(sham operation，SO)各9组。PH组按Higgins和Anderson方法进行，SO组除不切除肝叶外，其他同PH。手术后2、6、12、24、30、36、72、120和168h时，取肝右叶置于组织储存试剂(例如RNA Later)中，于-20℃保存备用。
实施例2：miRNAs的高通量测序
取适量上述保存于-20℃的肝组织置于装有液氮的研钵中研磨，按mirVana miRNAIsolation Kit(Ambion，USA)操作指南提取和纯化miRNAs。用琼脂糖凝胶电泳(180V，0.5h)检测总RNA质量，28S rRNA：18S rRNA约为2∶1，且时分别测定OD260和OD280，在OD260/OD280≥2.0，视为RNA合格。miRNAs的定性和定量分析由上海伯豪生物技术公司进行，测序方法为单端Solexa microRNA-Seq测序，读长36nt。将测序得到的miRNAs序列与miRNAs库比对，确定miRNAs的种类和丰度。
实施例3：大鼠肝再生相关miRNAs
用单端Solexa microRNA-Seq高通量测序法，从实验组(PH)和假手术组(SO)的0、2、6、12、24、30、36、72、120和168h等10个时间点的大鼠再生肝中检测出425条miRNAs，经过ratio值分析表明，信号值大于20的126条miRNAs中，39条发生了有意义的表达变化。其中，31条的ratio值≥对照2倍，视为有意义表达上调。4条的ratio值≤对照2倍，视为有意义表达下调。4条在有的时间点上调，有的时间点下调，视为上/下调。T-检验表明，上述39条发生了有意义表达变化的miRNAs中，23条miRNAs与肝再生相关(表1)。
表1大鼠肝再生中发生有意义转录变化的miRNAs
注：表示ratio值≥2；表示ratio值≤05；表示P＜005，推测为大鼠肝再生相关microRNAs。
实施例4：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测
利用Oligo 6及Primer Premier 5.0软件，设计特异性Stem-Loop反转录(RT)引物和qRT-PCR上下游引物序列，并与miRBase进行物种比对，确定引物的特异性。将设计好的引物序列及U6内参引物序列交由上海生工生物工程公司合成(表2)。
按RNA提取试剂(Trizol)操作说明书(Invitrogen，USA)进行细胞总RNA抽提，分光光度计测定OD260和OD280，在OD260/OD280≥2.0，且变性琼脂糖凝胶电泳(70V，20min)检测28SrRNA∶18S rRNA约为2∶1时视为RNA合格。以2μg RNA为模板，按AMV反转录试剂盒(Promega，USA)的操作说明进行反转录，得到第一链cDNA。接着，取1μl cDNA，加入10μl荧光染料混合物(SyBr Green I Mix)、0.4μl引物、8.6μl去核酸酶的纯水。混匀后，放入荧光定量PCR仪(Rotor-Gene 3000)(Corbett Robotics，Australia)中扩增基因，检测扩增产物的荧光信号值，并以β-actin(NM_031144)为内参计算基因的相对表达量(ratio值)。qRT-PCR的条件均为：95℃2min，95℃15sec，60℃20sec，72℃20sec，40个循环。每个样品重复检测三次，所得数据用法作相对定量处理。
表2反转录引物及PCR引物序列
注：RT.反转录引物；FP.上游引物；RP.下游引物。
用qRT-PCR验证miR-199a-5p在大鼠再生肝中表达变化，验证结果如图1所示，miR-199a-5p的表达趋势与高通量测序结果基本吻合。
实施例5：大鼠肝细胞培养
实验所用大鼠正常肝细胞BRL-3A购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养基为含10％胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基，细胞培养于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱里。取对数生长期细胞进行传代，5×104个细胞/瓶。
实施例6：MTT法检测肝细胞增殖
取对数生长期的BRL-3A细胞，0.25％胰酶(Invitrogen，USA)消化，按1ml/孔、含5×104个/ml细胞的细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，培养12h后，按脂质体转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX，Invitrogen，USA)的操作说明书进行细胞转染。简言之，分别在25μl OPTI-MEM培养基中加入miR-199a mimic(100nM)、mimic NC(150nM)、inhibitor(100nM)、inhibitor NC(150nM)和1.5μl转染试剂，室温静置5min。将上述溶液轻轻混匀，形成转染复合物，室温静置20min，加入到含0.45mL OPTI-MEM培养基(Gibco，USA)的细胞中，37℃孵育4h，换正常培养基。实验重复3次，每个实验组设置3个复孔。
在含细胞和培养基的96孔板里加入10μl/孔MTT(Geneview，USA)，使其最终浓度达0.5g/L，于37℃避光培养4h，彻底弃去培养液后，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO，Geneview，USA)，轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，用酶标仪(Biotek，USA)于490nm波长处检测各孔的吸光值。实验重复3次，每个实验组设置3个复孔。检测结果如图2所示，mimic处理组，细胞增殖活性高于mimic NC组，说明mimic促进BRL-3A细胞的增殖；inhibitor处理组，细胞增殖活性低于inhibitor NC组，说明inhibitor抑制BRL-3A细胞增殖(P＜0.05)。
实施例7：Edu标记法检测肝细胞增殖
取对数生长期的BRL-3A细胞，按5×104/孔的细胞密度接种于预置圆玻片的24孔板中，培养12h后，mimic(100nM)和inhibitor(150nM)转染体外培养的BRL-3A细胞，转染后48h取出细胞爬片，取材前2h加入EdU(锐博，广州)使其终浓度为50μ mol/L，4％的多聚甲醛固定30min。再于甘氨酸溶液(2g/L)中脱色孵育5min。然后，再于0.5％TritonX-100脱色孵育10min。接着，于1×Apollo染色反应液(锐博，广州)中孵育30min，再于0.5％TritonX-100孵育10-30min，并于1×Hoechst 33342反应液(锐博，广州)中室温孵育30min标记细胞核，上述每进行一个步骤，均用PBS洗3次，每次5min。最后，荧光显微镜下随机选取5个不重叠的视野(20×)，进行观察和拍照，并用Image-Pro Plus 6.0软件对EdU阳性细胞和相应视野下的细胞核分别进行计数。并用SPSS13.0统计学软件的单因素方差分析方法分析组间差异。
检测结果表明，mimic组EdU阳性细胞比率为42.2％，明显高于其对照组(30.5％)(P＜0.05)，inhibitor组的EdU阳性细胞比率为27.6％，明显低于其对照组(35.4％)(P＜0.05)(图3a、b)。上述结果表明，miR-199a-5p促进BRL-3A细胞增殖。
实施例8：miRNAs的靶基因预测及其功能确认
根据miRNAs在大鼠肝再生中的表达变化，找出发生有意义表达变化的miRNAs。用TargetScan、miRanda、PciTar、miRDB、miRWalk等在线分析工具预测上述miRNAs的靶基因。简要地说，在miRWalk(www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirqwalk/index.html)主页上点击“MicroRNA targets”栏的“gene targets”，将目的miRNAs输入搜索栏，在数据库选项中选择TargetScan、miRanda、PciTar、miRDB、miRWalk，点击“SEARCH”，获得靶基因。进一步查找KEGG(www.genome.Jp/keg/pathway.html)网站，确认miRNAs的靶基因。将确认的靶基因与GO数据库比对，找出靶基因参与的信号通路和/或细胞增殖和凋亡活动。继续将参与细胞增殖和凋亡信号通路的靶基因输入IPA等软件和Qiagen等数据库，获得信号通路的结构、成分和信号传导路径。
实施例9：细胞周期检测
为检测miR-199a-5p对大鼠正常肝细胞BRL-3A的细胞周期的影响，将细胞接种于24孔细胞培养板中，1×105个细胞/孔，待细胞长到50～60％汇合度时，加入Lipofectamine2000(Invitrogen)和模拟物及对照或抑制物及对照转染细胞，转染浓度为：模拟物及其对照浓度均为100nM/孔，抑制物及其对照浓度均为150nM/孔。在5％CO2、37℃培养箱中培养48h后收集细胞。用70％乙醇于-20℃固定细胞过夜，用PBS洗涤和200目筛网过滤细胞后，再用PI染液(50μg/mL PI、100μg/mL DNase-free RNase A)室温避光染色30min，用流式细胞术检测细胞周期。流式细胞术检测结果显示，mimic处理组的与其对照组的细胞增殖率(S+G2/M％)分别为34.90±1.9％和24.03±2.7％(p＜0.05)，inhibitor处理组的与其对照组的细胞增殖率(S+G2/M％)分别为19.03±2.5％和23.11±3.4％(p＜0.05)。以上结果表明miR-199a-5p促进了BRL-3A的细胞周期进程(图4)。
实施例10：双荧光素酶报告基因检测系统的设计与构建
首先在miRWalk(www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirqwalk/index.html)主页点击“MicroRNA targets”栏的“gene targets”，将目的miRNAs输入搜索栏，在数据库选项中选择TargetScan、miRanda、PciTar、miRDB、miRWalk，点击“SEARCH”，获得靶基因及结合位点(图5a)，随后，从NCBI获得TNF-α的3′-UTR序列(即miR-199a-5p的抑制物)；用突变方法将miR-199a-5p的抑制物中的CACTGGA突变为TATTAA，分别克隆到psi-CHECKTM-2载体上，得到相应的含miR-199a-5p的抑制物的载体(psi-CH-tnf-wt)、含miR-199a-5p的抑制物突变序列的载体(psi-CH-tnf-mu)，psi-CHECKTM-2载体作为对照(psi-CH)。
实施例11：miR-199a-5p的促进BRL-3A细胞生长增殖机制
取对数生长期的BRL-3A细胞，按5×104/孔接种在24孔板中，用psi-CH-tnf-wt、psi-CH-tnf-mu、psi-CH2分别与miR-199a-5p mimic/inhibitor共转。在转染后48h，使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒(Promega)分析蛋白质提取物的荧光值。结果表明，miR-199a-5p的mimic能与TNF-α的3′-UTR结合，并降低荧光活性(P＜0.05)，但添加miR-199a-5p的inhibitor后，miR-199a-5p与TNF-α的3′-UTR结合降低，也未见荧光活性降低(P＜0.05)(图5b)。此结果表明miR-199a-5p可以通过靶向结合TNF-α的3′-UTR，阻遏TNF-α表达，从而抑制BRL-3A细胞凋亡，促进BRL-3A的增殖。而miR-199a-5p的inhibitor可以抑制miR-199a-5p与TNF-α的3′-UTR结合，促进TNF-α表达，促进BRL-3A细胞凋亡。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明透露的技术范围内，可想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> miR-199a-5p的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用
<130> EY01PT011701966
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> HUMAN artificial
<400> 1
cccaguguuc agacuaccug uuc 23
<210> 2
<211> 835
<212> DNA
<213> HUMAN artifical
<400> 2
ggcgactggc gtgttcatcc gttctctacc cagcccctgt ccccgactct gacccccatt 60
actctgaccc ctttatcgtc tactcctcag agcccccaat ctgtgtcctt ctaacttaga 120
aagggaattg tggctctggg tccaactccg ggctcagaat ttccaacaac tacgatgctc 180
agaaacacac gagacgctga agtagtggcc tggattgcgg gctgctcatg agccgccacc 240
ggcaaggatt ccaatgggct ttcggaactc actggatccc ggaatgtcga tgcctgagtg 300
gatcggggga gtggaggggg gagtggatca ggctgcctct ggctcacaag gctgctgaag 360
atgtctcagg cctcccttcc ttccttcctt ccctccctca gagcttccca gactgttccc 420
tgaggcacag cgcccagcct tccttacgga accccctcta tttataattg cacctgtgac 480
tatttattta ttatttatta tttatttatt tgcttatgaa tgtatttatt tggaaggccg 540
gggcgtcctg gaggacccag cgttgggaag ctgtcttcag gccaacatgt tttctgtgaa 600
aacggagcta aactaccagc tatccccatc tggtccccca cccctgcctc gttgcctccc 660
cccttttctt ttgcttatgt ttaaaacaag atatttatct aacccagttg tcttaataat 720
gctgatttgg tgaccaggct gtcgctacat cactgaacct ctgctcccca cgggagccgt 780
gactgtaatc gccctacggg tcattgagag aaataaagtt cgcttggaaa agaaa 835
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> HUMAN ARTIFICIAL
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgaacag 50
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> HUMAN ARTIFICAL
<400> 4
cccagtgttc agactacctg 20
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> HUMAN ARTIFICIAL
<400> 5
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> HUMAN ARTIFICIAL
<400> 6
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> HUMAN ARTIFICIAL
<400> 7
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (9)

1.一种miR-199a-5p的模拟物，其特征在于，所述模拟物为SEQ ID NO.1。
2.一种能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物，其特征在于，所述抑制物选自TNF-α的3′-UTR中长约700～1000bp区段；所述抑制物与miR-199a-5p的结合位点为CACTGGA。
3.如权利要求2所述的抑制物，其特征在于，所述抑制物为SEQ ID NO.2。
4.如权利要求2或3所述的抑制物，其特征在于，所述抑制物核苷酸序列的5′和3′末端分别添加限制性酶切位点；优选地，所述限制性酶切位点在酶切后产生粘性末端；更优选地，所述的限制性酶切位点分别为Xho I和Not I对应的核苷酸序列；所述Xho I酶切位点位于5′末端，所述Not I酶切位点位于3′末端。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2～4中任一项所述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素报告酶。
7.如权利要求5或6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是通过将如权利要求2或3所述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物连接到报告载体psi-CHECK-2中得到的。
8.如权利要求1所述的miR-199a-5p的模拟物和/或如权利要求2～4中任一项所述的能抑制miR-199a-5p结合TNF-α的3′-UTR的抑制物在制备用于促进肝再生的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促进肝再生的药物为抑制细胞凋亡相关蛋白TNF表达和/或促进肝细胞增殖相关蛋白表达的药物。
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