CN110760513A - 靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用 - Google Patents
靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR‑506及其应用，通过miRWalk 2.0、miRBase、TargetScanHuman 7.0数据库筛选以及qRT‑PCR技术检测三阴性乳腺癌病人组织样本，证实miR‑506在三阴性乳腺癌表达显著下降，平均下调88.95％，通过双荧光素酶报告实验证实miR‑506与Penk能直接相互作用，说明miR‑506能靶向作用于PENK。本发明证实miR‑506通过靶向提高penk的含量影响三阴性乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭。本发明通过裸鼠乳腺癌模型检测miR‑506靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤进展的有效性。结果表明miR‑506能通过靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤的发展。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用。
背景技术
在全球女性的癌症中，乳腺癌的发病率处于第一位。乳腺虽然不是人体生命活动的必需组织，但是乳腺组织细胞癌变之后细胞连接松散，极易脱落，且脱落的癌细胞会随着血液循环或者淋巴循环系统转移全身，引起其他组织的癌变，最终危及生命。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的一种亚型，其孕激素受体、雌激素受体、与人类表皮生长因子受体2的表达均为阴性。三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的10.0％～20.8％，具有特殊的临床病理特征和生物学行为，预后较其他乳腺癌亚型差。三阴性乳腺癌特点是死亡率高，并伴有较高的脑、肺、肝转移倾向。由于三阴性乳腺癌的异质性和缺少较为明确的分子靶点，所以至今临床上没有具有针对性的治疗方案，化疗依然是标准治疗方法。因此只有不到30％的患者能存活5年，并且即使有系统的治疗，平均存活时间也只有13.3个月，几乎所有TNBC患者最终会死亡。因此了解三阴性乳腺癌的有效的分子靶点并研究如何针对该靶点进行治疗就显得尤为重要。
据发表在J Clin Oncol.上的文献(PMID:26169618 DOI:10.1200/JCO.2014.59.7682)报道，Penk蛋白被证实为乳腺癌发生及发展的标志物。绝经后妇女血浆中penk水平与乳腺癌的发生呈负相关，血浆中penk低表达的女性乳腺癌发病的风险比较高。penk表达下调会导致细胞粘附及运动，极大增加脑转移的风险。Penk的水解产物为脑啡肽，在免疫系统与神经内分泌的分子联系中发挥重要作用。脑啡肽可以结合中枢神经系统中的受体分子，通过下丘脑-垂体-肾上腺通路对机体进行调控，提高机体的抗肿瘤能力及免疫反应。我们之前的研究表明penk在三阴性乳腺癌肿瘤组织中显著下调，当诱导penk过表达时，癌细胞的增殖、侵袭与迁移都受到明显的抑制，并能诱导细胞凋亡与细胞周期阻滞。因此，penk是调控三阴性乳腺癌细胞生命活动的重要作用因子，通过研究如何靶向提高penk表达量是获得良好治疗效果的关键。在当前的研究领域，miRNA是一种熟知的能够靶向调节基因表达的物质。
miRNA是由内源基因编码的单链RNA分子，长度在19到25个核苷酸左右。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。miRNA主要是通过特异性结合靶mRNA的3'端非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)，使靶标mRNA翻译抑制或降解，降低相应蛋白质的表达，参与动植物的转录后调控过程，进而影响细胞的增殖、转移、凋亡等一系列生命活动。据发表在Pharmacol Ther.的文献(PMID:27916656 DOI:10.1016/j.pharmthera.2016.11.012)报道，miRNA在乳腺细胞里的异常表达是造成乳腺癌的重要原因，并与乳腺癌细胞的增殖、转移、侵袭及凋亡等生物学过程息息相关。此外，miRNA还会介导三阴性乳腺癌的耐药过程。因此，通过对miRNA功能的研究确定其在细胞生命活动中承担的作用，是实现靶向治疗重大疾病的关键途径。目前还没有通过miRNA途径靶向提高三阴性乳腺癌细胞内penk表达量的研究，因此，探索penk相关的TNBC发病机制，寻找相对应的miRNA作为治疗TNBC的分子靶点，对TNBC的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是：针对三阴性乳腺癌缺乏明确的分子靶点，本发明的目的在于提供靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列及其应用。
本发明的技术方案是：一种能靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列，其特征在于，序列结构为：5’-UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA-3’。
本发明的进一步技术方案是：一种miR-506序列的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、根据miR-506的序列合成得到miR-506模拟物和miR-506抑制物；
步骤二、将miR-506模拟物及抑制物分别转染到三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到影响penk表达的目的，包括以下子步骤：
子步骤一：使用MTT法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖；
子步骤二：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506诱导三阴性乳腺癌细胞的周期阻滞；
子步骤三：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡；
子步骤四：使用划痕实验法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移；
子步骤五：使用transwell小室检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭；
步骤三、将miR-506模拟物构建局部缓释体系，作用于裸鼠乳腺癌模型，包括以下子步骤：
子步骤一：构建裸鼠乳腺癌模型：选取3-4周龄的BABL/c雌性裸鼠，将足量的与基质胶混合好的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞注射到裸鼠左胸第二对脂肪垫下，观察肿瘤形成状况，得到裸鼠乳腺癌模型；
子步骤二：以明胶纳米微球作为载体，每只裸鼠按照如下配制：明胶纳米微球缓释体系总体积为120μL。取32.5μL
2000加入到45μL Opti-MEM，取10μL浓度为1μg/μL的miR-506加入到32.5μL Opti-MEM,轻弹混匀，静置5min。将RNA加到2000中，室温静置20min。将混合物与16mg明胶纳米微球混合，4℃静置1h混匀，得到miR-506局部缓释体系；
子步骤三：用1mL注射器在裸鼠肿瘤周围注射120μL miR-506局部缓释体系；
子步骤四：给药处理20天后，处死裸鼠，剥离肿瘤，计算肿瘤体积，检测肿瘤标志物，Tunel染色检测肿瘤细胞凋亡状况。得到miR-506可有效抑制三阴性乳腺癌肿瘤的结论。
发明效果
本发明的技术效果在于：
[1]本发明通过miRWalk 2.0、miRBase、TargetScanHuman 7.0数据库筛选以及qRT-PCR技术检测三阴性乳腺癌病人组织样本，证实miR-506在三阴性乳腺癌表达显著下降，平均下调88.95％。
[2]本发明证实miR-506与Penk能直接相互作用。
[3]本发明证实miR-506通过靶向提高penk的含量影响三阴性乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭。
[4]本发明通过裸鼠乳腺癌模型检测miR-506靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤进展的有效性。结果表明miR-506能通过靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤的发展。因此利用miR-506能为药物治疗、基因治疗等临床应用提供治疗靶点和重要理论依据。
附图说明
图1为miR-506在三阴性乳腺癌样本中的表达变化。
图2为miR-506对MDA-MB-231细胞增殖的影响。
图3为miR-506对MDA-MB-231细胞周期的影响。
图4为miR-506对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。
图5为miR-506对MDA-MB-231细胞迁移的影响。
(a)MDA-MB-231细胞迁移的图片；(b)MDA-MB-231细胞迁移的统计数据结果。
图6为miR-506对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响。
(a)转染NC后的侵袭结果；(b)转染miR-506模拟物后的侵袭结果；(c)转染miR-506抑制物后的侵袭结果；(d)MDA-MB-231细胞侵袭情况的统计数据结果。
图7为裸鼠肿瘤最终净体积和最终净重比较。
(a)裸鼠肿瘤最终净体积；(b)裸鼠肿瘤最终净重。
图8为裸鼠肿瘤组织中肿瘤标志物、炎症因子及信号通路分子检测结果。
(a)肿瘤标志物和炎症因子检测结果；(b)信号通路分子检测结果
图9为对照组与miR-506治疗组的裸鼠肿瘤组织Tunel染色结果。
具体实施方式
参见图1—图9，下面结合实例及附例为本发明提供进一步的说明，但以下详细说明都是例示性的，本发明的实施方式不限于此。若未另有指明，下述实施例中所使用的试验方法均为本领域技术人员所熟悉的常规方法，或试剂制造厂家所建议的方法。所用的试剂、材料等如无特殊说明，均为从商业公司购买获得。本发明利用miRWalk 2.0、miRBase、TargetScanHuman 7.0数据库预测penk相关miRNA及通过PCR筛选并验证在三阴性乳腺癌组织中表达变化显著的miRNA。通过双荧光素酶报告实验验证penk与miR-506直接相互作用。通过细胞功能性实验检测miR-506通过靶向penk对三阴性乳腺癌细胞的影响。通过裸鼠乳腺癌模型检测miR-506靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤进展的有效性。
一种能靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列，其序列结构为：5’-UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA-3’。所述miR-506在三阴性乳腺癌中表达下调。所述miR-506能在三阴性乳腺癌细胞中靶向结合并作用于penk，使penk提高表达。其特征在于采用以下步骤：
以下对应权利书红字提问进行对应完善修改
步骤一、利用miRWalk 2.0、miRBase、TargetScanHuman 7.0数据库预测与penk基因相互作用的miRNA；根据评分信息排序筛选，得到miR-300、miR-502、miR-146a、miR-506、miR-200b、miR-200c、miR-3145、miR-3591和miR-4731等9种miRNA；
步骤二、Trizol试剂提取病人组织总RNA，RT-PCR以及Q-PCR，筛选得到在三阴性乳腺癌中表达显著降低的miR-506；
步骤三、通过双荧光素酶报告实验，得到miR-506与penk直接相互作用。
一种上述miR-506序列的应用，其特征在于采用以下步骤：
步骤一、根据miR-506的序列合成得到miR-506模拟物和miR-506抑制物。
步骤二、将miR-506模拟物及抑制物分别转染到三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到影响penk表达的目的，进而达到影响三阴性乳腺癌细胞生物学功能的目的。
①使用MTT法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。
②使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506诱导三阴性乳腺癌细胞的周期阻滞。
③使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡。
④使用划痕实验法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移。
⑤使用transwell小室检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭。
步骤三、将miR-506模拟物构建局部缓释体系，作用于裸鼠乳腺癌模型，达到提高penk基因表达的目的，进而达到抑制肿瘤进展的目的。
①构建裸鼠乳腺癌模型：选取3-4周龄的BABL/c雌性裸鼠，将足量的与基质胶混合好的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞注射到裸鼠左胸第二对脂肪垫下，观察肿瘤形成状况，得到裸鼠乳腺癌模型。
②以明胶纳米微球作为载体，每只裸鼠按照如下配制：明胶纳米微球缓释体系总体积为120μL。取32.5μL
2000加入到45μL Opti-MEM，取10μL浓度为1μg/μL的miR-506加入到32.5μL Opti-MEM,轻弹混匀，静置5min。将RNA加到
2000中，室温静置20min。将混合物与16mg明胶纳米微球混合，4℃静置1h混匀，得到miR-506局部缓释体系。
③用1mL注射器在裸鼠肿瘤周围注射120μL miR-506局部缓释体系。
④给药处理20天后，处死裸鼠，剥离肿瘤，计算肿瘤体积，检测肿瘤标志物，Tunel染色检测肿瘤细胞凋亡状况。得到miR-506可有效抑制三阴性乳腺癌肿瘤的发展。
实施例1 miR-506靶向三阴性乳腺癌penk的发现与验证。
发明人通过研究发现Penk在多个三阴性乳腺癌患者组织样本中的表达显著下调，为进一步探究影响Penk表达的机制，发明人通过网站或软件查找可能与Penk相互作用的蛋白或RNA。miRNA是一种约为22nt的单链RNA分子，不编码蛋白质。miRNA主要是通过特异性地结合靶标mRNA的3’端非翻译区(3'-UTR)，使抑制mRNA翻译或降解mRNA，从而降低相应蛋白质的表达，进而影响细胞的增殖、转移、凋亡等一系列生命活动。
1、Penk相关miRNA的预测和验证
1)利用数据库(miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.htmL)、TargetScanHuman 7.0(http://www.targetscan.org/vert_72)、miRBase(http://www.mirbase.org)等)生物信息学分析penk蛋白的基因序列，预测出可能与penk相互作用的miRNA。
2)提取病人组织总RNA
a、将病人组织置于组织研磨器内，加入1mL TRIzol，研磨至组织完全破碎，转移至无RNA酶的1.5mL离心管中。
b、每离心管中加入0.2mL氯仿，上下轻轻震荡15秒，室温放置2～3分钟，按12000g，4℃，15min的条件离心。
c、取出离心管可观察到溶液已分为三层，在不接触到中间层的条件下将上层的水相小心转移到新的1.5mL离心管中。
d、向离心管中加入0.5mL 4℃预冷的异丙醇，轻轻吹打均匀。在-20℃环境中静置30分钟以沉淀RNA，按12000g，4℃，10min的条件离心。
e、取出离心管，弃上清，沿离心管壁缓慢加入75％的乙醇1mL，小心吹打混匀，按7500g，4℃，10min的条件离心。
f、取出离心管，弃上清，室温下干燥沉淀15分钟左右，待管内没有液体且沉淀没有完全干燥加入30μL DEPC水溶解RNA沉淀。分装出3μL测得RNA浓度，其余RNA进行下一步实验或置于-80℃保存。
3)反转录
a、使用反转录试剂盒将上述步骤提取的RNA反转录成cDNA以进行后续实验，按表1建立反应体系：
表1 组织提取总RNA的反转录体系
b.实验使用miRNA所用反转录特异性引物如表2所示：
表2 miRNA反转录特异性引物序列
c.按表3建立反转录程序：
表3 组织提取总RNA的反转录程序
| 50℃ | 15min |
| 85℃ | 5sec |
| 4℃ | ∞ |
4)定量PCR
a、按表4建立反应体系
表4 miR-506的PCR反应体系
b、按表5建立qPCR反应程序
表5 miR-506的PCR反应程序
c、进行qPCR时使用U6作为内参基因，U6及miRNA引物序列如表6所示。
表6 U6及miRNA引物序列
d.qPCR实验结果采用2-ΔΔCT(Livak法)进行分析处理。
2、Penk与miR-506直接相互作用的验证
1)将对数期的MDA-MB-231细胞消化计数，六孔板铺板，每孔接种1×106个细胞。
2)将NC+penk-3’UTR质粒、miR-506+penk-3’UTR质粒、NC+mut-506质粒、miR-506+mut-506质粒分别转染细胞，6h后换液。
3)转染后两天，对细胞进行检测。吸出孔内培养基，用PBS细胞清洗细胞，确保将培养基完全清洗干净。
4)每孔加150～200μLPassive Lysis Buffer裂解细胞，在室温条件下避光孵育30分钟。孵育完成后，吹打混匀孔内细胞裂解液用于检测。
5)试剂盒中A液Luciferase Assay Substrate为萤火虫发光底物，B液Stop&
Substrate为海肾虫发光底物。检测时，先加入100μL A液于酶标条。然后再向酶标条中加入20μL细胞裂解液，用528/20和whole波长测量发光值；取出酶标条，向孔中加入100μL B液，使用460/40和whole波长测量发光值。
6)根据相对荧光活性＝萤火虫发光值/海肾虫发光值的公式计算每组细胞的相对荧光活性。
结果分析
1)在数据库中输入penk序列，根据序列及评分等信息整理筛选出miR-300、miR-502、miR-146a、miR-506、miR-200b、miR-200c、miR-3145、miR-3591和miR-4731共9种miRNA。
2)在三阴性乳腺癌患者组织样本中检测miRNA的表达变化情况，与癌旁组织相比，TNBC组织中miR-300表达量减少93.31％，miR-502的表达量减少50.2％，miR-146a增加259.91％，miR-506表达量减少94.54％，miR-200b增加0.096％，miR-200c减少95.43％，miR-3145减少58.41％，miR-3591减少57.62％，miR-4731增加32.68％。根据表达变化量差异及TNBC中的研究现状，最终确定miR-506为目的miRNA。如图1所示，与癌旁组织相比，三例TNBC组织中miR-506表达量分别减少了94.54％、85.50％和96.07％，平均下调92.037％。miR-506在TNBC组织中的表达水平显著下降。
3)利用双荧光素酶报告实验检测penk与miR-506有直接相互作用。
实施例2 miR-506通过靶向penk对三阴性乳腺癌细胞生物学功能的影响检测
1)miR-506对MDA-MB-231细胞增殖的影响
a、使用96孔板铺板，每孔接种细胞量为1×103个。设置三个组，分别为NC组、miR-506模拟物组、miR-506抑制物组，每组六个重复。次日，每孔细胞按照0.2μL
2000，0.5μL RNA进行转染。
b、转染后第3、4、5d使用MTT法检测细胞存活率。每孔更换100μL新鲜培养基，并在避光条件下加入10μL MTT溶液，在37℃环境下孵育4h。吸出孔中混合液，每孔加入100μLDMSO溶液，摇晃10min，酶标仪获取570nm和650nm波长处混合液的吸光值，并进行分析。
2)miR-506对MDA-MB-231细胞周期的影响
a、使用六孔板铺板，每孔接种细胞量为1×106，设置三个组，分别转染NC、miR-506模拟物、miR-506抑制物。转染后48h，使用胰酶消化成单个细胞，计数收集到2×106个细胞。将细胞用PBS洗涤干净，用70％的乙醇固定至少24h。
b、配制PI(碘化丙啶)染液对细胞进行染色。取出已固定好的细胞，PBS洗涤干净，之后加入1mL PI染液，4℃环境中静置30min。
c、使用流式细胞仪检测细胞周期分布。
3)miR-506对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
a、使用六孔板铺板，每孔接种细胞量为5×105个，设置三个组，分别转染NC、miR-506模拟物、miR-506抑制物，同时设置Blank组、AnnexinV-FITC单染组和PI单染。转染后48h胰酶消化细胞并吹打成单个细胞。计数收集1×105个细胞。
b、使用凋亡试剂盒对细胞样品进行染色。向每个样品中加入195μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞。
c、对照及实验各组加入5μL AnnexinV-FITC，混匀；加入10μLPI染液，混匀。Blank组两种染液均不加，AnnexinV-FITC单染组只加5μL AnnexinV-FITC染液，PI单染组只加入10μL PI染液，。
d、室温环境下，对照及实验各组避光孵育10～20分钟，Blank组及单染组56℃环境下诱导凋亡7min。
e、使用流式细胞仪进行检测。
4)miR-506对MDA-MB-231细胞迁移的影响
a、在六孔板背面水平划线，每孔至少五条线。使用六孔板铺板，每孔接种细胞量为1×106个，铺板第二天转染NC、miR-506模拟物、miR-506抑制物，6h后换液。
b、转染48h后将培养基吸出，使用黄枪头划线，划痕与底部线垂直。使用PBS溶液清洗以将划下的细胞清洗干净。向孔加入无血清的L-15培养基，37℃培养箱培养。
c、分别在划线后第0h、12h、24h、36h、48h的时间拍照，使用ImageJ软件计算细胞间距离的均值。细胞迁移距离＝0h细胞距离-12h/24h/36h/48h细胞间距离。
5)miR-506对MDA-MB-231细胞侵袭的影响
a、使用六孔板铺板，每孔接种细胞量为1×106个，分别转染NC、miR-506模拟物、miR-506抑制物。6h后换液。
b、转染36h后，将培养基更换为无血清培养基，过夜培养。
c、基质胶稀释为300μg/mL，将100μL基质胶铺于transwell小室聚碳酸酯膜上，37℃环境下过夜放置，使其聚合成凝胶。
d、转染48h后，使用胰酶将细胞消化并吹打成单个细胞，血球计数板计数。每组计数收集2×104个细胞于200μL无血清培养基中，加入到transwell小室的上室。下室中加500μL含10％血清的培养基，在37℃培养箱中培养24h。
e、24h后，吸出上室中的液体，并小心取出上室。擦去基质胶和未过膜的细胞。
f、细胞染色。使用4％的中性甲醛固定细胞10min，结晶紫染液染色10min，随后用PBS清洗干净，干燥，在正置显微镜下观察穿过膜的细胞。在每张膜的中央部分和周围部分随机选择5个部分，计数每个部分穿过膜的细胞总数。
结果分析
1)如图2所示，与对照组相比，MDA-MB-231细胞在转染miR-506模拟物后细胞增殖活性降低，转染miR-506抑制物后细胞增殖活性升高。转染模拟物后第5d，细胞增殖活性减少6.64％。在转染抑制物第5d，细胞增殖活性增加了17.55％。说明miR-506能影响MDA-MB-231细胞的增殖。
2)如图3所示，与对照组相比，转染miR-506模拟物后，G1期的细胞增加12.74％，S期的细胞减少15.77％，G2期的细胞减少11.64％；转染miR-506抑制物后，G1期的细胞增加3.84％，S期的细胞减少4.36％，G2期的细胞减少3.77％。因此可以看出转染miR-506的模拟物及抑制物对细胞周期均有一定影响，并且miR-506模拟物比抑制物对细胞周期的影响更为显著。
3)图4中LR、UR、LL和UL分别表示早期凋亡、晚期凋亡、细胞坏死以及细胞存活。与对照组相比，转染miR-506模拟物后，LR区的细胞增加10.586％，UR区的细胞减少0.48％；转染miR-506抑制物后，LR区的细胞增加10.346％，UR区的细胞增加了2.09％。由图4可以看出，转染miR-506后对细胞的坏死、凋亡及存活等均有一定影响。
4)如图5所示，可以明显看出转染miR-506模拟物后，细胞划痕的愈合速度减小，说明细胞的迁移能力降低。转染miR-506抑制物后，细胞迁移速度显著增加。与对照组相比，转染miR-506模拟物后，在四个时间段内MDA-MB-231细胞的迁移能力均有下降。转染miR-506抑制物后，细胞迁移能力明显增强。由此可知，miR-506显著影响细胞迁移，miR-506表达增加时能显著降低MDA-MB-231细胞的迁移能力。
6)如图6所示，从图中可以看出不同处理组的细胞侵袭能力有很大差异。转染miR-506模拟物的细胞侵袭数量显著减少，而转染miR-506抑制物的细胞侵袭数量明显增加。与对照组相比，转染miR-506模拟物的细胞侵袭率下降了52.31％，转染miR-506抑制物的细胞侵袭率增加了97.39％，差异均有显著性。说明miR-506表达量上调后能明显降低MDA-MB-231细胞的侵袭能力，其表达量下调后显著促进细胞的侵袭能力。
实施例3 miR-506局部缓释体系药物对裸鼠乳腺癌模型的影响
1)miRNA局部缓释体系的构建
取16mg明胶纳米微球，紫外照射30min进行灭菌。取32.5μL2000加入到45μL Opti-MEM中，调整RNA的浓度为1μg/μL，取10μL RNA加入到32.5μL Opti-MEM中,轻弹混匀，静置5min。将RNA混合液加到
2000中，室温静置20min。将混合液与微球混合，4℃环境下静置1h混匀备用。
2)裸鼠乳腺癌模型的建立
a、培养足量的MDA-MB-231细胞并收集在50mL离心管中。将基质胶用不含血清的L-15培养基稀释到3mg/mL，取3mL基质胶混合液将细胞重悬，使每100μL细胞悬液密度为2×107个，置于冰上备用。
b、选取3～4周龄，体重16～18g的BABL/c雌性裸鼠，每只老鼠订耳标以标记老鼠，电子秤称量并记录老鼠体重。
c、超净台内使用75％的酒精棉球消毒裸鼠皮肤，从右侧腹部进针，在裸鼠左胸第二对乳房垫注射细胞。
d、从接种肿瘤细胞当天开始，记录裸鼠体重及肿瘤形成情况。使用电子秤称量裸鼠体重，使用游标卡尺记录肿瘤的长径与短径，由此计算肿瘤体积，绘制肿瘤原位生长曲线。肿瘤体积计算公式为V＝0.5236×L1×(L2)2，其中，L1表示肿瘤短径，L2表示肿瘤长径。
3)裸鼠给药与处死
a、接种肿瘤细胞2周后，对裸鼠注射miR-506缓释体系，进行给药处理。给药治疗后，每天称重并测量肿瘤体积。
b、裸鼠进行给药处理后20d，处死裸鼠。将肿瘤剥离出来，使用游标卡尺测量肿瘤的短径与长径并使用电子天平称重，记录剥离的肿瘤的净体积及净重。将剥离下来的肿瘤组织进行拍照记录。根据测量的肿瘤数据以及抑瘤率的计算公式，计算抑瘤率。抑瘤率＝(1-E/C)×100％，其中，E为实验组平均肿瘤体积，C为对照组平均肿瘤体积。
c、提取裸鼠肿瘤中的RNA，qPCR检测肿瘤组织内的肿瘤标志物ST6GALNAC5、P53、COX-2、CDH1、P53、Vimentin(VIM)、MMP1、FN1和炎症因子IL-6、TNF-α、IL-13、IL-1β和信号通路相关分子Akt、ERK、FOS、β-catenin、NF-κB2、RACGAP的表达水平。通过检测以上相关因子的表达情况，分析miR-506对肿瘤发展的影响。
d、随机各取一只对照组和miR-506治疗组的肿瘤，及时用4％多聚甲醛浸泡，之后石蜡包埋、切片，分别做Tunel染色，检测对照组和miR-506治疗组肿瘤组织中细胞凋亡的情况。
结果分析
1)从图7中可明显看出，治疗组的裸鼠肿瘤体积明显减小。治疗20d后，对照组和注射miR-506组的裸鼠肿瘤平均体积分别为为614.2mm3和421.7mm3，给药处理的抑瘤率为31.3％。因此，对裸鼠进行miR-506药物治疗后，能够明显抑制肿瘤的生长。
2)如图8所示，经miR-506治疗后的肿瘤组织内ST6基因下调32.26％，COX2基因表达量下调31.94％，CDH1基因上调137.62％，P53基因上调314.7％，VIM基因下调60.83％，MMP1基因下调55.73％，IL-1β基因下调75.40％，TNF-α基因下调44.46％。说明经miR-506治疗后的裸鼠肿瘤的脑转移风险降低，增殖、侵袭及转移过程受到抑制，相关炎症因子的表达也受到抑制。经miR-506治疗的肿瘤组织内ERK、β-catenin、RACGAP、Akt、NF-κB2和FOS等因子均有显著下调，说明miR-506可能通过以上因子影响信号通路。
图9中凋亡的细胞呈绿色，可以明显的看出，对照组中肿瘤状态良好，几乎没有细胞凋亡，经miR-506治疗后有部分细胞凋亡，说明miR-506能在动物体内促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
由此可知，miR-506局部缓释体系能有效抑制三阴性乳腺癌肿瘤的生长。
在上文中对本发明作了一般性说明以及较佳的具体实施方案，但可在此基础上进行一些修改或改进，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的任何改进、变动、优化、替代、简化，均应为等效的置换方式，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种能靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列，其特征在于，序列结构为：5’-UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA-3’。
2.一种基于权利要求1所述的miR-506序列的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、根据miR-506的序列合成得到miR-506模拟物和miR-506抑制物；
步骤二、将miR-506模拟物及抑制物分别转染到三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到影响penk表达的目的，包括以下子步骤：
子步骤一：使用MTT法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖；
子步骤二：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506诱导三阴性乳腺癌细胞的周期阻滞；
子步骤三：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡；
子步骤四：使用划痕实验法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移；
子步骤五：使用transwell小室检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭；
步骤三、将miR-506模拟物构建局部缓释体系，作用于裸鼠乳腺癌模型，包括以下子步骤：
子步骤一：构建裸鼠乳腺癌模型：选取3-4周龄的BABL/c雌性裸鼠，将足量的与基质胶混合好的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞注射到裸鼠左胸第二对脂肪垫下，观察肿瘤形成状况，得到裸鼠乳腺癌模型；
子步骤二：以明胶纳米微球作为载体，每只裸鼠按照如下配制：明胶纳米微球缓释体系总体积为120μL。取32.5μL2000加入到45μL Opti-MEM，取10μL浓度为1μg/μL的miR-506加入到32.5μL Opti-MEM,轻弹混匀，静置5min。将RNA加到
2000中，室温静置20min。将混合物与16mg明胶纳米微球混合，4℃静置1h混匀，得到miR-506局部缓释体系；
子步骤三：用1mL注射器在裸鼠肿瘤周围注射120μL miR-506局部缓释体系；
子步骤四：给药处理20天后，处死裸鼠，剥离肿瘤，计算肿瘤体积，检测肿瘤标志物，Tunel染色检测肿瘤细胞凋亡状况。得到miR-506可有效抑制三阴性乳腺癌肿瘤的结论。
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