CN114736965A - miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用 - Google Patents

miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114736965A
CN114736965A CN202210240452.1A CN202210240452A CN114736965A CN 114736965 A CN114736965 A CN 114736965A CN 202210240452 A CN202210240452 A CN 202210240452A CN 114736965 A CN114736965 A CN 114736965A
Authority
CN
China
Prior art keywords
breast cancer
mir
negative breast
triple negative
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210240452.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114736965B (zh
Inventor
刘凯
李振山
张妍
李雅林
何浩
毛双
汤兰静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences filed Critical Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority to CN202210240452.1A priority Critical patent/CN114736965B/zh
Publication of CN114736965A publication Critical patent/CN114736965A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114736965B publication Critical patent/CN114736965B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子标志物技术领域，本发明提供了miR‑18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用。本发明的生物信息学分析和实验结果表明，miR‑18a在三阴性乳腺癌细胞中高表达，可作为三阴性乳腺癌的诊断标志物。本发明的研究结果还表明，敲除了miR‑18a后Rab5A表达明显上调，EGFR表达明显下调，并能明显抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。据此认为miR‑18a是一个有功能的microRNA，对其功能进行深入分析，将有可能揭示三阴性乳腺癌发生发展的新机制，并为三阴性乳腺癌的早期诊断和治疗提供靶标。

Description

miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中 的应用
技术领域
本发明涉及分子标志物技术领域，尤其涉及miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用。
背景技术
三阴性乳腺癌(TNBC)是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人类表皮生长因子受体-2(HER2)表达均为阴性的一类乳腺癌，具有组织学分级高、淋巴结转移阳性率高、易复发及远处转移的特点。目前还没有特有的针对三阴性乳腺癌的治疗指南。因此其治疗一般按乳腺癌常规标准治疗进行。常规方法为：一、化疗：与其他类型乳腺癌相比，化疗对三阴性乳腺癌的有效率较高，但如果只是常规的标准治疗，其预后依然很差。二、辅助化疗：FEC序贯多西他赛化疗有较好的反应，紫杉类药物对三阴性乳腺癌有一定的疗效，铂类药物在三阴性乳腺癌中可能更有效，顺铂新辅助化疗有相当疗效。但从总体上来看，由于缺乏固定的治疗靶点，三阴性乳腺癌患者对常规的联合化疗反应仍较差，死亡风险较高。因此，急需研究一种针对三阴性乳腺癌的新型生物标志物和生物靶向治疗方法。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了miR-18a敲减慢病毒载体在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
优选的，所述应用的过程包括：将所述miR-18a敲减慢病毒载体与包装质粒共转染受体细胞，收集病毒感染的细胞上清并浓缩，得病毒颗粒。
优选的，所述miR-18a敲减慢病毒载体包括miR-18a基因和原始载体，所述miR-18a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述原始载体包括pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro。
优选的，所述包装质粒包括pMD2.G和psPAX2。
优选的，所述受体细胞包括HEK-293T细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的生物信息学分析和实验结果表明，miR-18a在三阴性乳腺癌细胞中高表达，可作为三阴性乳腺癌的诊断标志物。本发明的研究结果还表明，敲除了miR-18a后Rab5A表达明显上调，EGFR表达明显下调，并能明显抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。据此认为miR-18a是一个有功能的 microRNA，对其功能进行深入分析，将有可能揭示三阴性乳腺癌发生发展的新机制，并为三阴性乳腺癌的早期诊断和治疗提供靶标。
附图说明
图1为CMTM7相互作用分子质谱鉴定图；
图2为CMTM7在非三阴性乳腺癌和三阴性乳腺癌中的表达情况(A： TCGA数据库中，CMTM7在109对配对乳腺癌(非三阴性)和癌旁组织中的表达情况，P<0.0001；B：CMTM7在113例正常乳腺、95例三阴性乳腺癌和520例非三阴性乳腺癌组织的表达情况，P<0.0001；C：非三阴性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线；D：三阴性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线)；
图3为CMTM7在乳腺癌细胞系的表达情况；
图4为CMTM7在乳腺癌原发病例和组织芯片的表达情况(A：免疫组化分析2张乳腺癌芯片和原发性乳腺癌病例中(共含95例TNBC和162例非TNBC组织)CMTM7的表达情况，用IHC分数来表示；B～H：不同类型的乳腺组织中CMTM7表达的典型免疫组化结果，其中，B为癌旁组织，C 为乳腺增生，D为乳腺炎，E为乳腺良性肿瘤，F为转移性乳腺癌，G为非三阴性乳腺癌，H为三阴性乳腺癌)；
图5为CMTM7、Rab5A、EGFR三种蛋白在非三阴性乳腺癌细胞系 MCF-7和三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468的表达情况(A～B：TCGA数据库中，Rab5A(A)、EGFR(B)2种蛋白在正常、非TNBC和TNBC组织中的表达情况，****，P<0.0001；C～D：TCGA数据库中，EGFR-CMTM7 (C)及Rab5A-CMTM7(D)表达的相关性分析，Spearman或Pearson相关性检验；E：Western Blot检测非TNBC细胞系MCF-7和TNBC细胞系 MDA-MB-468中CMTM7、Rab5A、EGFR 3种蛋白的表达情况)；
图6为生物信息学分析能够结合Rab5A的microRNA的韦恩图；
图7为TCGA数据库和ROC曲线对miR-18a作为诊断标志物的准确性的评估图(A：TCGA数据库中miR-18a在正常、TNBC、非TNBC中的表达；B：Realtime PCR分析3株乳腺癌细胞系中miR-18a的表达；C～D：ROC 曲线预测miR-18a作为TNBC(C)、非TNBC(D)诊断标志物的价值)；
图8为miR-18a对靶蛋白表达和三阴性乳腺癌的影响(A：生物信息学分析Rab5A3'UTR区与miR-18a种子区的结合序列；B：Realtime PCR检测 miR-18a敲除效率；C：RealtimePCR检测MDA-MB-468细胞敲除miR-18a 后，Rab5A和EGFR的表达情况；D：CCK8实验检测敲除miR-18a对 MDA-MB-468细胞增殖能力的影响；E：Transwell实验检测敲除miR-18a对 MDA-MB-468细胞侵袭能力的影响，×100)。
具体实施方式
本发明提供了miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了miR-18a敲减慢病毒载体在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
在本发明中，所述应用的过程优选包括：将所述miR-18a敲减慢病毒载体与包装质粒共转染受体细胞，收集病毒感染的细胞上清并浓缩，得病毒颗粒，具体为：转染前24小时，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，以含10％血清的培养基将4～5×105个细胞铺于六孔细胞培养板，37℃、 5％CO2培养箱内培养。24小时待细胞密度达70％～80％，采用PEI法转染 HEK293T细胞，具体步骤为：于9μl PEI中加入100μl PBS，混匀；miR-18a 敲减慢病毒质粒1.5μg、辅助质粒pMD2.G和psPAX20.5μg加入100μl PBS 混匀；室温静置5分钟后，将二者混匀，室温静置15分钟后缓慢滴入并混匀细胞。转染48小时后，小心收集含有病毒的上清，置于EP管中，800rpm、 4℃离心5分钟，以去除上清中的细胞。弃掉沉淀，吸取上清，该病毒上清可以放于-80℃冰箱保存，或者即刻感染靶细胞。病毒浓缩：细胞转染后48 或72h，将细胞上清液移至无菌的50ml离心管中。4℃，2000g，15min离心去除细胞及碎片。离心完毕，用0.45μm的滤器过滤，将滤过液(病毒浓缩液)收集于无菌的高速离心管中，4℃(一周内)或-80℃(超过一周)保存。
在本发明中，所述miR-18a敲减慢病毒载体优选包括miR-18a基因和原始载体，所述miR-18a基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，所述原始载体优选包括pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro。
在本发明中，所述包装质粒优选包括pMD2.G和psPAX2。
在本发明中，所述受体细胞优选包括HEK-293T细胞。
下面结合实验例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验例1
(1)质谱鉴定结果提示CMTM7和Rab5蛋白的相互作用：
CMTM7对EGFR运输、稳定性及信号通路发挥重要负调控作用。本发明利用质谱检测了CMTM7潜在相互作用分子。Hela细胞转染 pcDB-CMTM7-myc或pcDB-myc空载体，裂解液中加入抗myc抗体，免疫沉淀后样品进行SDS-PAGE电泳。结果如表1和图1所示。由表1和图1 可知，与对照组相比，CMTM7过表达组有10条差异条带。对差异条带进行高通量质谱检测，发现在第7条差异条带中有早期内体标志物Rab5A和 Rab5C。由于Rab5A和Rab5B在内体运输中起主要作用，因此与CMTM7 结合，在EGFR内化过程中起作用的可能主要是Rab5A。
表1质谱分析CMTM7潜在相互作用分子
Figure BDA0003540911020000041
(2)生物信息学分析结果提示CMTM7在非三阴性乳腺癌中表达下调，而在三阴性乳腺癌中表达异常升高：
TCGA数据库(http://cancergenome.nih.gov/)中包含1110例侵袭性乳腺癌病例和113例正常乳腺组织，其中包含109对配对非三阴性乳腺癌和癌旁组织。首先，在TCGA数据库中下载109对配对非三阴性乳腺癌和癌旁组织病例数据，利用IBM SPSS Statistics v20软件进行χ2检验，比较配对组织中非三阴性乳腺癌和癌旁组织中CMTM7的表达情况。分析结果表明，在配对非三阴性乳腺癌组织中CMTM7表达明显下调(p<0.0001)。本发明通过患者临床资料中的ER、PR、HER-2免疫组化结果将所有1110乳腺癌分成三阴性和非三阴性2种类型加以研究，其中三阴性乳腺癌95例，非三阴性乳腺癌520例。经分析发现在三阴性乳腺癌组织中，与正常相比，CMTM7表达明显上调(p<0.0001)，在非三阴性乳腺癌组织中，CMTM7表达明显下调 (p<0.0001)(图2)。
(3)乳腺癌细胞系、乳腺癌组织芯片、乳腺癌临床病例的结果与生物信息学分析结果相同：
本发明通过RT-PCR分析了CMTM7在2株永生化的乳腺上皮细胞系和 9种乳腺癌细胞系中的表达量，具体分析条件为：利用ABI PCR扩增仪进行实时定量PCR检测。所有的cDNA模板均稀释100倍，在20μl的实时定量 PCR扩增体系中，加入8μl稀释的cDNA模板及相应的引物，cDNA首先在 95℃变性10分钟，然后按照95℃15秒，60℃1分钟的条件进行扩增。扩增β-actin作为系统内参。
CMTM7引物：
正向引物如SEQ ID NO.2所示(5’ -GGCAAGCATATGGCTGTCCTA-3’)；
反向引物如SEQ ID NO.3所示(5’-CTCTGCAAAGCTCCTGAGGG-3’)；
β-actin引物：
正向引物如SEQ ID NO.4所示(5’ -CAGCACAATGAAGATCAAGATCA-3’)；
反向引物如SEQ ID NO.5所示(5’-CGGACTCGTCATACTCCTGC-3’)。
结果表明，CMTM7在多种乳腺癌来源的细胞系中表达下调或缺失(图 3)。同时，本发明购买了2张乳腺癌组织芯片(陕西超英生物工程有限公司，BR2082b，含112例乳腺癌(19例TNBC和93例非TNBC)，32例转移癌， 9例乳腺良性肿瘤，8例乳腺增生，11例乳腺炎，19例正常或癌旁组织； BR1901，含66例TNBC和31例非TNBC组织)，并与附属医院合作，选取了48例手术患者肿瘤组织，利用免疫组化检测了CMTM7在不同来源的乳腺组织的表达情况，结果与生物信息学分析和细胞系的结果一致(图4)。
(4)多因素方差分析提示CMTM7表达水平是乳腺癌患者生存的独立预后因子：
本发明对TCGA数据库中所有乳腺癌CMTM7表达水平和其临床病理特征进行了分析(表2)，分析结果表明CMTM7表达水平与乳腺癌亚型明显相关，基底样和三阴性乳腺癌表达CMTM7水平最高。单因素方差分析结果表明CMTM7表达、患者的年龄、T分期、N分期、TNM分期和临床亚型均与生存期有关，将以上指标进行多因素Cox回归分析以消除不同因素之间的影响，发现CMTM7表达水平是乳腺癌患者生存的独立预后因子(表3、表4)。
表2TCGA数据库中乳腺癌患者临床病理特征和CMTM7表达水平的关系
Figure BDA0003540911020000061
Figure BDA0003540911020000071
(注：对于每一项临床病理特征，表达数值是NA或者数量非常少的项目没有纳入上表中(如PAM50亚型中的正常乳腺样型)；
缩写：IDC，浸润性导管癌；ILC，浸润性小叶癌；HR，激素受体；HER2，人类表皮生长因子受体2；TNBC，三阴性乳腺癌)
表3患者临床资料与生存预后关系的单因素方差分析
Figure BDA0003540911020000081
Figure BDA0003540911020000091
(注：缩写：CI，可信区间；HR，风险比)
表4患者临床病例特征与生存预后关系的多因素回归分析
Figure BDA0003540911020000092
Figure BDA0003540911020000101
(5)在三阴性乳腺癌，CMTM7与EGFR和Rab5A的表达相关：
作为抑癌分子，CMTM7在TNBC细胞系中反常地高表达，机制不清。本发明推测可能某些机制导致与CMTM7结合的Rab5蛋白水平下调，使 EGFR内化和降解受阻。本发明分析了TCGA数据库中与CMTM7相关的 Rab5A和EGFR两种蛋白在TNBC和非TNBC组织中的表达水平，发现与推测相符，与非TNBC相比，TNBC中Rab5A表达明显下调，EGFR表达显著上调。与非TNBC相比，3种蛋白在TNBC中的表达水平更具有显著相关性。并且本发明用Western Blot的方法检测了CMTM7、Rab5A、EGFR三种蛋白在非三阴性乳腺癌细胞系MCF-7和三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468 的表达情况，发现它们的表达情况与生物信息学的预测相符(图5)。
(6)生物信息学分析可能靶向沉默Rab5A表达的microRNA：
本发明推测，可能某些miRNA通过与Rab5A的3’UTR区结合而沉默了其表达。本发明选择了miRanda、TargetScan、PicTar、miRDB等多个网站来预测能结合Rab5A的可能miRNA，通过绘制韦恩图取其交集以缩小目标 miRNA的范围、提高准确率。结果发现了3个以上网站均预测结合的 microRNA共14条(图6)。本发明分析了TCGA数据库中这14条miRNA 在TNBC的表达情况，发现miR-18a在TNBC和非TNBC之间的表达差异最大(表5)，这种差异性与CMTM7和Rab5A在TNBC和非TNBC的表达模式类似。
表5 TCGA数据库中预测与RAB5A结合的microRNA在三阴性和非三阴性乳腺癌组织的差异分析(TNBC vs非TNBC)
Figure BDA0003540911020000111
Figure BDA0003540911020000121
(7)生物信息学分析和实验结果提示miR-18a在TNBC高表达，并可作为TNBC特异性预后标志物：
本发明分析了TCGA数据库中miR-18a在正常、TNBC和非TNBC组织中的表达，发现其在TNBC中的表达水平明显高于非TNBC，与Rab5A 的表达趋势正好相反。进而本发明利用Realtime PCR方法分析了TNBC细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和非TNBC细胞系MCF-7中miR-18a 的表达情况，其在TNBC细胞中的表达显著高于非TNBC细胞系。此外，本发明利用TCGA数据库和ROC曲线评估了miR-18a作为诊断标志物的准确性，评估过程为：利用ROC曲线，ROC曲线越靠近左上角，此诊断方法的灵敏度越高，误判率越低，则诊断方法的性能越好。结果发现，与非TNBC 相比，miR-18a更适合作为TNBC的诊断标志(图7)。
(8)miR-18a可能是功能性的microRNA：
为了确定miR-18a是否是功能性的miRNA以及是否与三阴性乳腺癌的发生发展有关，本发明构建了miR-18a敲减慢病毒载体 pHBLV-U6-anti-miR-18a-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro(以空载体 pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro为对照)，与包装质粒共转染HEK-293T细胞，收集病毒感染的细胞上清及浓缩病毒(浓缩程度为50倍) 后，将其感染MDA-MB-468细胞。利用Realtime PCR的方法检测了敲除 miR-18a的细胞和空载体对照组细胞中Rab5A和EGFR的表达情况，具体步骤为：
对于miR-18a的Realtime-PCR分析条件：
采用miRcute miRNA提取分离试剂盒(Tiangen)提取细胞的小RNA，利用miRcutemiRNA cDNA第一链合成试剂盒(Tiangen)将小RNA反转录成cDNA，按荧光定量检测试剂盒试剂盒(Tiangen)说明进行Realtime-PCR，用2-△△Ct法计算miR-18a的相对表达量，以U6为内参。cDNA首先在95℃变性15分钟，然后按照94℃20秒，60℃34秒的条件进行扩增。
miR-18a引物：
正向引物如SEQ ID NO.6所示(5'-TCTCACACAGAAATCGC-3')；
反向引物如SEQ ID NO.7所示(5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3')。
U6引物：
正向引物如SEQ ID NO.8所示 (5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3')；
反向引物如SEQ ID NO.9所示(5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3')。
对于Rab5A和EGFR的Realtime-PCR分析条件：
利用ABI PCR扩增仪，使用探针法进行实时定量PCR检测。用TRIzolTM 提取细胞总RNA，每个样品取2μg，用逆转录试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)(Thermo Fisher)逆转录合成单链cDNA文库，然后以TaqMan Gene ExpressionMasterMix作为Buffer，加入引物200nM，探针100nM进行扩增。扩增GAPDH作为系统内参。
EGFR引物：
正向引物如SEQ ID NO.10所示(5’-TCTTGCTGCTGGTGGTG-3’)；
反向引物如SEQ ID NO.11所示(5’-ATGCTGCGGTGTTTTCA-3’)。
EGFR扩增条件：cDNA首先在95℃变性5分钟，然后按照95℃30秒， 52℃30秒的条件进行扩增。
Rab5A引物：
正向引物如SEQ ID NO.12所示(5’-TATTGGCCCCTTGAATTCTG-3’)；
反向引物如SEQ ID NO.13所示(5’ -TTAGAAAAGCAGCCCCAATG-3’)。
Rab5A扩增条件：cDNA首先在95℃变性5分钟，然后按照95℃30秒，60℃1分钟的条件进行扩增。
GAPDH引物：
正向引物如SEQ ID NO.14所示(5’ -CAAGGTCATCCATGCAACTTTG-3’)；
反向引物如SEQ ID NO.15所示(5’ -GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’)。
GAPDH扩增条件：cDNA首先在95℃变性5分钟，然后按照95℃30 秒，58℃30秒的条件进行扩增。
结果表明，敲除了miR-18a后Rab5A表达明显上调，EGFR表达明显下调，并能明显抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力(图8)，据此可初步认为miR-18a确实是一个有功能的microRNA，对其功能进行深入分析，将有可能揭示三阴性乳腺癌发生发展的新机制，并为临床治疗提供靶标。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东第一医科大学（山东省医学科学院）
<120> miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctatctgcac tatcgcacct tatataccta tctgcactat cgcaccttaa catcctatct 60
gcactatcgc accttatctt cactatctgc actatcgcac ctta 104
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcaagcata tggctgtcct a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctgcaaag ctcctgaggg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcacaatg aagatcaaga tca 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggactcgtc atactcctgc 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctcacacag aaatcgc 17
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagcaggctg gagaa 15
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcttcggca gcacatatac ta 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcttcacga atttgcgtgt ca 22
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcttgctgct ggtggtg 17
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgctgcggt gttttca 17
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tattggcccc ttgaattctg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttagaaaagc agccccaatg 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caaggtcatc catgcaactt tg 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtccaccacc ctgttgctgt ag 22

Claims (6)

1.miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用。
2.miR-18a敲减慢病毒载体在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的过程包括：将所述miR-18a敲减慢病毒载体与包装质粒共转染受体细胞，收集病毒感染的细胞上清并浓缩，得病毒颗粒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述miR-18a敲减慢病毒载体包括miR-18a基因和原始载体，所述miR-18a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述原始载体包括pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述包装质粒包括pMD2.G和psPAX2。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受体细胞包括HEK-293T细胞。
CN202210240452.1A 2022-03-10 2022-03-10 miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用 Active CN114736965B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240452.1A CN114736965B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210240452.1A CN114736965B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114736965A true CN114736965A (zh) 2022-07-12
CN114736965B CN114736965B (zh) 2023-06-16

Family

ID=82276004

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210240452.1A Active CN114736965B (zh) 2022-03-10 2022-03-10 miR-18a作为标志物在制备三阴性乳腺癌早期检测试剂盒中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114736965B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110760513A (zh) * 2019-08-23 2020-02-07 西北工业大学 靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用
CN110923324A (zh) * 2019-12-30 2020-03-27 北京大学深圳医院 一种乳腺癌miRNA标记物及其应用
CN111424090A (zh) * 2020-04-20 2020-07-17 中国科学院昆明动物研究所 Sgce基因作为三阴性乳腺癌标志物的应用
CN112430665A (zh) * 2020-12-17 2021-03-02 山东大学齐鲁医院 一种诊治三阴性乳腺癌分子生物标志物及其应用
CN112921098A (zh) * 2021-04-27 2021-06-08 深圳市人民医院 一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110760513A (zh) * 2019-08-23 2020-02-07 西北工业大学 靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用
CN110923324A (zh) * 2019-12-30 2020-03-27 北京大学深圳医院 一种乳腺癌miRNA标记物及其应用
CN111424090A (zh) * 2020-04-20 2020-07-17 中国科学院昆明动物研究所 Sgce基因作为三阴性乳腺癌标志物的应用
CN112430665A (zh) * 2020-12-17 2021-03-02 山东大学齐鲁医院 一种诊治三阴性乳腺癌分子生物标志物及其应用
CN112921098A (zh) * 2021-04-27 2021-06-08 深圳市人民医院 一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHA LY等: "MiR-18a upregulation decreases Dicer expression and confers paclitaxel resistance in triple negative breast cancer", vol. 20, no. 11, pages 2201 - 2208 *
张亚珍 等: "miR-103a-3p在乳腺癌组织和血清中的表达及通过下调PDK4抑制乳腺癌细胞的有氧糖酵解及增殖", vol. 25, no. 5, pages 490 - 496 *
张双鹤 等: "筛选三阴型乳腺癌差异表达microRNA的临床转化研究" *
张双鹤 等: "筛选三阴型乳腺癌差异表达microRNA的临床转化研究", 解放军医药杂志, no. 06, pages 19 - 22 *
范楚苓;张萍;孙彩虹;钱晨;戚博;赵茹;肖荣琴;刘亚坤;李菲菲;: "miR-205慢病毒表达载体的构建及其对乳腺癌细胞作用的初步研究", no. 08, pages 1099 - 1103 *
鲁娟;王爽;揭荣荣;姚开泰;: "微小RNA miR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建" *
鲁娟;王爽;揭荣荣;姚开泰;: "微小RNA miR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建", 热带医学杂志, no. 05, pages 422 - 426 *
黄剑;庞慧;宋雨航;蔡莉;: "microRNA在乳腺癌耐药中的作用", no. 03, pages 86 - 90 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114736965B (zh) 2023-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sun et al. Increased expression of lncRNA HULC indicates a poor prognosis and promotes cell metastasis in osteosarcoma
Wang et al. FAM83D activates the MEK/ERK signaling pathway and promotes cell proliferation in hepatocellular carcinoma
Wang et al. Downregulation of miR-486-5p contributes to tumor progression and metastasis by targeting protumorigenic ARHGAP5 in lung cancer
Wang et al. MicroRNA-182 downregulates metastasis suppressor 1 and contributes to metastasis of hepatocellular carcinoma
Zhang et al. Down-regulation of hsa_circ_0001649 in hepatocellular carcinoma predicts a poor prognosis
Chen et al. MiR-125a/b regulates the activation of cancer stem cells in paclitaxel-resistant colon cancer
Huang et al. Down-regulated miR-125a-5p promotes the reprogramming of glucose metabolism and cell malignancy by increasing levels of CD147 in thyroid cancer
Lei et al. ELFN1-AS1 accelerates the proliferation and migration of colorectal cancer via regulation of miR-4644/TRIM44 axis
Kang et al. MiR‐24 enhances radiosensitivity in nasopharyngeal carcinoma by targeting SP 1
Yang et al. Hypoxia/lncRNA-AK123072/EGFR pathway induced metastasis and invasion in gastric cancer
Park et al. MiR 21‐5p as a predictor of recurrence in young gastric cancer patients
Duan et al. Overexpression of Tyro3 and its implications on hepatocellular carcinoma progression
Yuan et al. Up-regulation of microRNA-145 associates with lymph node metastasis in colorectal cancer
Yin et al. Serum/Plasma MicroRNAs as Biomarkers for HBV‐Related Hepatocellular Carcinoma in China
Chen et al. Long noncoding RNA TP53TG1 suppresses the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma by regulating the PRDX4/β-catenin pathway
Zeng et al. LncRNA-AF113014 promotes the expression of Egr2 by interaction with miR-20a to inhibit proliferation of hepatocellular carcinoma cells
Cao et al. Identification of microRNA-124 in regulation of Hepatocellular carcinoma through BIRC3 and the NF-κB pathway
Zhang et al. MALAT1 inhibits the Wnt/β-catenin signaling pathway in colon cancer cells and affects cell proliferation and apoptosis
Foruzandeh et al. CircRNAs as potent biomarkers in ovarian cancer: a systematic scoping review
Dianatpour et al. Expression analysis of AFAP1-AS1 and AFAP1 in breast cancer
Li et al. MicroRNA‑30a‑5p suppresses tumor cell proliferation of human renal cancer via the MTDH/PTEN/AKT pathway
Wu et al. Changes of miRNA expression profiles from cervical‐vaginal fluid‐derived exosomes in response to HPV16 infection
Song et al. A novel polypeptide CAPG-171aa encoded by circCAPG plays a critical role in triple-negative breast cancer
CN107586850B (zh) 非编码基因在肝癌诊疗中的应用
Chen et al. miR‐876 Inhibits EMT and Liver Fibrosis via POSTN to Suppress Metastasis in Hepatocellular Carcinoma

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant