CN112921098A - 一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用 - Google Patents

一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用，涉及肿瘤检测技术领域，本发明通过对ZEB1‑AS1、TMEM254‑AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中至少一种标志物表达水平的检测，利用这些标志物在三阴性乳腺癌癌组织及其癌旁组织中的差异化表达，可用于三阴性乳腺癌的诊断、预后评估或筛药。

Description

一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤检测技术领域，具体而言，涉及一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用。
背景技术
乳腺癌(Breast cancer)是全球女性死亡的第二大癌症，其治疗的主要挑战之一是乳腺癌细胞具有异质性，从而决定治疗策略的选择。根据受体类型的不同，乳腺癌可被分为4种亚型：雌激素/孕激素受体阳性(ER/PR)、人类表皮生长因子受体阳性(HER2)和三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)；而根据病理及分子分型的不同可分为：管腔样A型[Luminal A，(ER/PR阳性，HER2阴性)]、管腔样B型[Luminal B，(ER/PR阳性，HER2阳性)]、HER2阳性类型以及基底样型(Basal)。而Basal类型中大部分由三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是组成。
三阴性乳腺癌内部仍具有异质性，占所有乳腺癌亚型的12％-17％。三阴性乳腺癌细胞表面不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及表皮生长因子受体(HER2)，目前可选手术及化学治疗。
然而，由于三阴性乳腺癌转移及复发性较其他乳腺癌高，长期应用化疗药物会导致患者耐受，且目前用于三阴性乳腺癌治疗的药物十分有限。
因此，如何探索有效的三阴性乳腺癌发生发展的分子机制，开发新型靶向治疗药物，对三阴性乳腺癌患者的治疗提供有潜力地临床治疗前景。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了检测样本中lncRNA表达水平的试剂在制备用于三阴性乳腺癌检测的试剂盒中的应用，所述lncRNA选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少一种。
第二方面，本发明实施例提供了检测样本中lncRNA表达水平的试剂在筛选用于治疗三阴性乳腺癌药物中的应用，所述lncRNA选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122、LINC00856中的至少一种，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第三方面，本发明实施例提供了一种三阴性乳腺癌的检测试剂盒，其包括：用于检测ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中至少一种标志物的试剂。
第四方面，本发明实施例提供了一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物组合，所述标志物选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少两种或两种以上的组合。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过对ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中至少一种标志物表达水平的检测，利用这些标志物在三阴性乳腺癌癌组织及其癌旁组织中的差异化表达，可用于三阴性乳腺癌的诊断、预后评估或筛药。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中四种亚型乳腺癌癌组织癌组织与癌旁差异表达基因的结果，其中，Luninal A Ca代表Luminal A型癌组织，Luninal A P代表癌旁组织；Luminal A Ca代表Luminal B型癌组织，Luninal B P代表癌旁组织；HER2 Ca代表HER2阳性亚型癌组织，HER2P代表癌旁组织；Basal Ca代表TNBC亚型癌组织，Basal P代表癌旁组织；
图2为实施例2中四种亚型乳腺癌癌组织两两比较的差异基因表达量；其中，BasalCa代表TNBC亚型癌组织；HER2 Ca代表HER2阳性亚型癌组织；Luninal A Ca代表Luminal A型癌组织；LuninalB Ca代表Luminal B型癌组织；
图3为实施例2中Basal亚型乳腺癌差异表达的lncRNA与三阴性乳腺癌患者无复发生存期相关性分析；其中，HR(Hazard ratio)为风险率；
图4为实施例2中qRT-PCR方法验证3种TNBC癌组织与癌旁组织中5种基因的相对表达量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了检测样本中lncRNA表达水平的试剂在制备用于三阴性乳腺癌检测的试剂盒中的应用，所述lncRNA选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少一种。
本文中的“ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856”均属于lncRNA，又称长链非编码RNA(Long-non coding RNA)，是一类核苷酸大于200nt的非编码RNA。
本文中的“检测”可以指对样品进行三阴性乳腺癌的诊断、辅助诊断或预后评估的检测。
具体地，ZEB1-AS1(ENST00000423714.1)的碱基序列如SEQ ID No.1所示：CGCCCACAGCCCGGCCCGAGTCGCGGGGCCCGAGCGACAGCGACGGCGCCGGCCGGGGCCGCGGCGCGCGGAAGCCACTTTGCACGGTCAGCGCCGGGCACAAGTTTGTTCCGCGGCTCCCGGGGGCCTGGGCGCTGAGGGAGAATCGCGCTGAGGGGGCCAGGAGGAGGGGGAGAGGGAGGCGCCGAAGGGCACAAGAGTGGGGAAAAGTGCGGAAAGAAGCAACAGCCGCTCCACCCGGGACCAGAAAAGTGGCCAGTGCGTCCCGGCCGCCCGCCCTGCGCCGGGGATGCGGCGGCGTCGGCGCCGGCTAACGGTCCAGGGAGGCGGCAGGGGCGGCGGGAGCCGCTAGGCGGAGAGAGACCAGGGACGCCTGGTTTCCCCCCAAGCGAACCGGGATGGGAAGTGACTTCAATGAGATTGAACTTCAGCTGGATTGAAAGAGAGGCTAGAAGT；
TMEM254-AS1(ENST00000432070.2)的碱基序列如SEQ ID No.2所示：AGCGCGCGGGAGTCGGGATTGTGCTTGCACGACTTCCCCCGGCCCGCGGCCTGTGAGCCCAGGTCCTGGGGTGAACCGAGCGCTCGCTCGTTCGTCAGACCGTAGCGCTCCAGCGGCTGTCCTTACTGTGTAGTAGCCAAAGCTGAGGGTGATGACTGTGAACCAGAACAGACTGCCTCGCTGAAAAGTCACTTGGAACTCTTCTGTGGCATCTGAAGCAGATGGACGAAGCCAAGAGGGCCGAGAGTATCTCAGCACCTAGAAATGGACAAGGCTGGTTATTAGAACAAAGATTTCGCAGGTGGTGAGTCTCAAAGGCGAAGCTGAATGAGGCAAGAATCTGCATCAAAGAGCCCTGGAAGCAATCATGGCTCAACTGTGATGCCTTTAGAACATGAAGTCCTCCAAGAAGATGCCATAGGAATGGCCTCCATCCCAGGGCCTGGAGAGCAGCCAGAGACAAGAAGAGTAGCCCAGGAGGGCACTGGCAGTCAGTGCTACACTGTGGCCTGTCAGTCTCAGAGCCAGGATTTAATCACTGGATCTCCCATTAACCAGTCATAATGAAGTAAGAACAAGAAGATGGGGAAGAGGAAGTGTAAAACCGTGGCTTAAATTTGCCAAGGATAAGCTGAGTGTACTTCAGCAGTCATTTGCACAGAATCCTTATCCTAATTTTACAACCAGGGAAAAACTGGCTGGACAGTCTCTTGTCCTGTGTTTGTAATTGATAACTGGTTTCAAAATAAAAGCCAGACCACCACTTAGAGAGAGACACAGAATGTTCACTGCCAGGGAACTGCATGATTCCTCTGCCAAAGGCCACCCATTTACAAGAATCCAGGAAAACCAGGTGGAATCTCCCAATGATGACCCTGAGCAGAACTTCTTGTACCCAGGAAGTTCTACTGGGTGGAGCTGGCCACTCTTCCGTGGAGACACAGGGGACTCCCAATTAACATGATGGCTCAAATAACTGTAGCCTTATGGATTAAAAGGAAACTAAGCTGTGATTTGGAGTATCCAGGTGATACAGAAAATGGCCCTTGTCGATGTAGATCAGCATTATTTCCTTATCCTTCTGCATCTCCTCCTCAGTATTCTGAAAGGGACAAGCCTGAGATGGGGGAAAGCCAGCATGCAAGGCCCTCCCCTTTGTGCTGTGTTCATGGTGTGCACGGAGAGAGGCAGCAGCAGGAGGAACAGAAAGGTTATTTTCTTTACTGACTCTTTCAAGGACATCAGCAGAATGGTTGGGAATGTCATCATGAGCAGCCTCAGCCTCAGAATTACCAGGAGAAGCTGGTCTTCCAGGATCAGGTTCTAATGTATATGAGTCACAGGATTTAGGGAAGCAGGCACTTTCCCTTCAGTCCCAGCAGCATGGTTGATGTTCCCAAGTAATGGAGAGTCCCTGTGCTCTCAGTTGTGGCACACACCTTTGCAAATAGTGATCAGATCTCCACAAACGCCTCTTGGGTAAGATATGCAGCAACATAGCTGGCTGCAGAGCAACCCAGTTCCCAAATCCAGCAGCTCTTGGATGAGAAGTCTGCAAGTGTTTACTGCTGGGACCAGGACTGTGTTTCTAGGAAATGGTGCTAGGCTTCAGAGAGCATCATCCACAGGTCATCCCACAACCATCCACACAGAAGCCTGAGGAAAAGGGCTCTGCAGAGCTTGCACATAAAGATGCTGAACTCAGGAAGGCTCTGTGAGCTGCTGGTCTCTTCTGGTAGGGCAGCAGTGTCCTGAGAAGGTGGAGCTAGAGTATGGAGAACAAAACTAACAAGCACCAAGGCAGCAAGCAAGGCAACCCCCAAATGACAGCAGTTGCCAAATCCAAAGCAATCTGTGCTTCAGAAGACAGAGGCTCTGCACAGTCCCTGTCTCAGACATTGTCTCCTCCTTAGAAGATACCTAACAACAGCACTGTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGATCACCAGGTCAGGAGATCAAGACCATCCTTGATCTTTAGTAGAGACGGTGAAACACTGTCTCTACTAAAAAATACAAAAAAAAATTAGCTAGCCGTGGCGGCGGGCACCTGTAGTCTCAACTATTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCCTGAACCCGGGAGGCAGAGCTTGCAGTGAGCTGAGATTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACTCCATCTC；
LINC01087(ENST00000431979.1)的碱基序列如SEQ ID No.3所示：GCCAAGCTGGCTCAAAGAGCAACCAGCCACCTCTGCAAGGGTGTGCCAGGAGCAGGTGGAGCAGCCACCAACCTCACCCACTCAAAGAAGCAGGGATGGCCAGGTTCCAACAGCCTGAGTGGCTGCCACCTGATGGCTGATGGAGCAGAGGCGTGAGGAAAAGCTGATGGCACTGCTTTGTAGTGCTGTTCTTTGTCTCTCTTCATCTTTTTCAGTTAAAGTCTGTTTTATCAGAGACTAGGATTGCAAACCCTGCTTTTTTTTGCTTTCCATTTGCTTGGTAAATATTCCTCCATCCCTTTATTTTAAACCTATGTGTGTCTTTGCGCATGAGATGGGTCTCCTGAATACAGGACACCATTGGGTCTTTACTCTTTATCCAACTTGCCAGTCTGTGTCTTTTAACTGGGGCATTTAGCCCATTTACATTTAAGTTTAGTATTGTTACATGTGAAATTTATCCTGTCATGATGTTGCTAGTTTTTAATTTTTCCCATTAGTTAATGCAGTTTCTTTATAGTGTCAATGGTCTTTACAATTTGGTATGTTTTTGTAGTGGCTGGTACTGGTTGTTCCTTTCCACGTTTAGTGCTTACTTCAGGAGCTCTTGTAACGCAAGAATGTGGATTTATTTCTGGTAAGGTAAATAAGTGGATTTATTTCTCAATGCTGTATTCTATGTCCTTTACCCCAAGAATCATTACTTTTTAAAATGCAATTCAAATTAGCATAAAACATTTACAGCCTAGGAAAAGGCTTGTGGCATTAGAATACTTATTTATAGGATTATTTTGTGTTTTTTTGAGATACGGTCTTTGTCATCGAGGCAGAAGTGCAGTGGTTTGATCATAATTCACCACAGCCCTGAACTCTGAGTCCAAGCCATCCTTTTGCCTTAATCTCCCAACTAGTTGGATCTACAAGCATAAGGCATCATGCCTGGCTAATTTTTTTACATGTTTTTTTTTTTTTTTGTCGAGATTATGGTATCACTATGTTGCTCTGGCTGATCTCAAATTCCTGACCTCAAGTGATCTTTCTGCCACAGCCTCCTAAAGTGCTAGGATTACATGCATGATGCACCATGCCTAGCGTAGAGTATTACATTAGTTTCAAAGTCTTATTCTAAGAGCCATTTATTGACTTTGGCCTAAATAACTCAATATAATATCTCTGAAACTTTTTTTGACAAATTTTGGGGCATGATGATGAGAGAAGGGGGTTTGAAACTTTCTAATAAGAATTAACTTAGACCCATTTAAGAAGGAAAAAACACAAATTATCAGAAAAATATAAAAGTAAGATCAAGTGCAAAAGTTCTGTGGCAAAGATGATGAGAGTAAAGAATATATGTTTGTGACTCATGGTGGCTTTTACTTTGTTCTTGAATTTTTGAGTACGAGTTAACATTTAAAGAATCTACATTATAGATAACATTTTATTGCAAGTAAATGTATTTCAGAATTTGTTATTGGTTTTGTATGAGATTATTCTCAGCCTATTTCATTATCAAGCTATATTATTTTATTAATGTAGTTTGATGATCTTACAGCAAAGCTGGAAGCTGTATCTTCAAAATATGTCTATTTGACTAAGAAGAAGTTATTCAACAGGAGTTATTATCTATGAAAAAAGTACAACCAGAATATAAAAAACTTGAGGAGGATAAAAAGATGTTGGAAGAAGTAATATTAAATCTTAAAAAACATGGAAACTGCACATTGGTGAAGACACATTGGTGAAGTACAAAAATATAAATTGGATGTAGAAGAAAGGGCAATGCAGGCAATAGAAAAATTAGTAGAAATCCCTTTACAGGTTAGTTTGTAAAATCAGGTAAGTTTATTTATAATGTGCTTTCATTTATTTCACTGCAAATTATATTTTGGATATATATATTGTGTTTCCTCTGCCTCTCTTATAGCAATTTGCCTTGTAGAGTTCTAGCAAAAAGGTGGCATCTGTTTTTACTTTCAAATATTTAAATTTCCATCATTATAACAAAATCAATTTTTCAGAGTAATGATTCTTACTGTGGAGTCATTTGATTATTAAGACCCATTGGCATAAGATTACATCCTCTGACTATAAAAATCGTGGAAGAAAACCTAGGAAATATTCGTCTGGACATTGCACTTGGCAGTGAATTTATGGTTAACCTGCGGACGCCCAGGGGCTCCTCCATCTCCACCGTGTTCTCCTCGGGCTGAAGCCCAAAGTCCCACATTTTCTCCTCAAACAGCTCTCAGAGCCACTTCTGCAGGCAGGAGGACAGCGCGTGGACTCAGTGTCTGACTTGGGAAGCCACATGTGAAGGAACTGCTGGGTGACTATGGTCGTAAGTCAATCAAAGCAGACTTTCCCTGGCTTGCTGTGCTACGTTGATTTTGTTTTCGTATTTTAAAAGAAGCAGAAGGGAGGTTCTAGGAAATTTGCCCAACGTAGATGCTGACAAGAGTGGTGACATGAAAAAGATTACCCAGAAGGAAAACGAGCTATTTTCTAAACATCTGAAATCTGTGTAGGCTTTTGGAAAAGTGAAACTAGATGCAAAACACAATGATATAATTCTGGCAATTTCCACTGACACAGAACTCAGTCAATCTGAATTAATCTAAGAGTTATAAGGAAAATGGCACTCCAAGAAGTACCTATTAACATCACTCAGCTGCTGTGAAATAGGCTTACAGGCAACATGGAGTGTCAATTACCCAATGTTTAAAGTCGATCATACAGATTGGACTACAATCTCTATGGCTCATAAAGTCTTTAAAGGATTGACAGATGATTTATCTCATATGTAGACAATGATTCTCAGCAGTTAACTAGCGCAACTTGATAATGTCAATTGCTTGAGAAAATCAGATAATTGCTTGAGAAAATTAGGACATTGCTTGAGGAAGTTAGGTAGTTAAATAAATTACTTTTTTTAAAGAATAGTTTAATATTTTGGCAAGTAGACTTTAAAATAGGTTGGTAATATTTTAAAGGCTACTTTTAAAGAAGTAGCAATATAACATGTTTAATTATGAAAAATAATGTTGGAAACAATTCAATTTTCTATCAGATCATTCACAAATACAGAAATACCATCTCAATAATTAGAAGAAGTAGCAGCAATTTCTGTCATTTTTATGCAAGTTACTCTTAGTCCATTTATTTGGTTTTAAATAGTGTTTTTAAAATTTGTTTTCAAACAGGGCTAATCATAAATAATAGAACATATTTTACAATAGTTGAAGGTAACAAAAAGTAAGTGCCATTTAAAAAATTGTATTAGATTGTTTAAAAATGTTGTGGGTACATAGTATGTGTTGTGGGTACATCGTATGTGTTGTGGGTACATAGTATGTGGGGTCCATGAGATGTTTTGATACAGGCATGCAATGTGAAATAAGCACATCATGGGGAATGGGGTATCCCTCCCCTCAAGCATTTATCCTTCAAGTTATAAAAAATTCAATTACAGTCTTAGTTATGTCAAACTGTACAATTAAATTATTATTGAATATAGTC；
LINC01122(ENST00000431979.1)的碱基序列如SEQ ID No.4所示：GCCAAGCTGGCTCAAAGAGCAACCAGCCACCTCTGCAAGGGTGTGCCAGGAGCAGGTGGAGCAGCCACCAACCTCACCCACTCAAAGAAGCAGGGATGGCCAGGTTCCAACAGCCTGAGTGGCTGCCACCTGATGGCTGATGGAGCAGAGGCGTGAGGAAAAGCTGATGGCACTGCTTTGTAGTGCTGTTCTTTGTCTCTCTTCATCTTTTTCAGTTAAAGTCTGTTTTATCAGAGACTAGGATTGCAAACCCTGCTTTTTTTTGCTTTCCATTTGCTTGGTAAATATTCCTCCATCCCTTTATTTTAAACCTATGTGTGTCTTTGCGCATGAGATGGGTCTCCTGAATACAGGACACCATTGGGTCTTTACTCTTTATCCAACTTGCCAGTCTGTGTCTTTTAACTGGGGCATTTAGCCCATTTACATTTAAGTTTAGTATTGTTACATGTGAAATTTATCCTGTCATGATGTTGCTAGTTTTTAATTTTTCCCATTAGTTAATGCAGTTTCTTTATAGTGTCAATGGTCTTTACAATTTGGTATGTTTTTGTAGTGGCTGGTACTGGTTGTTCCTTTCCACGTTTAGTGCTTACTTCAGGAGCTCTTGTAACGCAAGAATGTGGATTTATTTCTGGTAAGGTAAATAAGTGGATTTATTTCTCAATGCTGTATTCTATGTCCTTTACCCCAAGAATCATTACTTTTTAAAATGCAATTCAAATTAGCATAAAACATTTACAGCCTAGGAAAAGGCTTGTGGCATTAGAATACTTATTTATAGGATTATTTTGTGTTTTTTTGAGATACGGTCTTTGTCATCGAGGCAGAAGTGCAGTGGTTTGATCATAATTCACCACAGCCCTGAACTCTGAGTCCAAGCCATCCTTTTGCCTTAATCTCCCAACTAGTTGGATCTACAAGCATAAGGCATCATGCCTGGCTAATTTTTTTACATGTTTTTTTTTTTTTTTGTCGAGATTATGGTATCACTATGTTGCTCTGGCTGATCTCAAATTCCTGACCTCAAGTGATCTTTCTGCCACAGCCTCCTAAAGTGCTAGGATTACATGCATGATGCACCATGCCTAGCGTAGAGTATTACATTAGTTTCAAAGTCTTATTCTAAGAGCCATTTATTGACTTTGGCCTAAATAACTCAATATAATATCTCTGAAACTTTTTTTGACAAATTTTGGGGCATGATGATGAGAGAAGGGGGTTTGAAACTTTCTAATAAGAATTAACTTAGACCCATTTAAGAAGGAAAAAACACAAATTATCAGAAAAATATAAAAGTAAGATCAAGTGCAAAAGTTCTGTGGCAAAGATGATGAGAGTAAAGAATATATGTTTGTGACTCATGGTGGCTTTTACTTTGTTCTTGAATTTTTGAGTACGAGTTAACATTTAAAGAATCTACATTATAGATAACATTTTATTGCAAGTAAATGTATTTCAGAATTTGTTATTGGTTTTGTATGAGATTATTCTCAGCCTATTTCATTATCAAGCTATATTATTTTATTAATGTAGTTTGATGATCTTACAGCAAAGCTGGAAGCTGTATCTTCAAAATATGTCTATTTGACTAAGAAGAAGTTATTCAACAGGAGTTATTATCTATGAAAAAAGTACAACCAGAATATAAAAAACTTGAGGAGGATAAAAAGATGTTGGAAGAAGTAATATTAAATCTTAAAAAACATGGAAACTGCACATTGGTGAAGACACATTGGTGAAGTACAAAAATATAAATTGGATGTAGAAGAAAGGGCAATGCAGGCAATAGAAAAATTAGTAGAAATCCCTTTACAGGTTAGTTTGTAAAATCAGGTAAGTTTATTTATAATGTGCTTTCATTTATTTCACTGCAAATTATATTTTGGATATATATATTGTGTTTCCTCTGCCTCTCTTATAGCAATTTGCCTTGTAGAGTTCTAGCAAAAAGGTGGCATCTGTTTTTACTTTCAAATATTTAAATTTCCATCATTATAACAAAATCAATTTTTCAGAGTAATGATTCTTACTGTGGAGTCATTTGATTATTAAGACCCATTGGCATAAGATTACATCCTCTGACTATAAAAATCGTGGAAGAAAACCTAGGAAATATTCGTCTGGACATTGCACTTGGCAGTGAATTTATGGTTAACCTGCGGACGCCCAGGGGCTCCTCCATCTCCACCGTGTTCTCCTCGGGCTGAAGCCCAAAGTCCCACATTTTCTCCTCAAACAGCTCTCAGAGCCACTTCTGCAGGCAGGAGGACAGCGCGTGGACTCAGTGTCTGACTTGGGAAGCCACATGTGAAGGAACTGCTGGGTGACTATGGTCGTAAGTCAATCAAAGCAGACTTTCCCTGGCTTGCTGTGCTACGTTGATTTTGTTTTCGTATTTTAAAAGAAGCAGAAGGGAGGTTCTAGGAAATTTGCCCAACGTAGATGCTGACAAGAGTGGTGACATGAAAAAGATTACCCAGAAGGAAAACGAGCTATTTTCTAAACATCTGAAATCTGTGTAGGCTTTTGGAAAAGTGAAACTAGATGCAAAACACAATGATATAATTCTGGCAATTTCCACTGACACAGAACTCAGTCAATCTGAATTAATCTAAGAGTTATAAGGAAAATGGCACTCCAAGAAGTACCTATTAACATCACTCAGCTGCTGTGAAATAGGCTTACAGGCAACATGGAGTGTCAATTACCCAATGTTTAAAGTCGATCATACAGATTGGACTACAATCTCTATGGCTCATAAAGTCTTTAAAGGATTGACAGATGATTTATCTCATATGTAGACAATGATTCTCAGCAGTTAACTAGCGCAACTTGATAATGTCAATTGCTTGAGAAAATCAGATAATTGCTTGAGAAAATTAGGACATTGCTTGAGGAAGTTAGGTAGTTAAATAAATTACTTTTTTTAAAGAATAGTTTAATATTTTGGCAAGTAGACTTTAAAATAGGTTGGTAATATTTTAAAGGCTACTTTTAAAGAAGTAGCAATATAACATGTTTAATTATGAAAAATAATGTTGGAAACAATTCAATTTTCTATCAGATCATTCACAAATACAGAAATACCATCTCAATAATTAGAAGAAGTAGCAGCAATTTCTGTCATTTTTATGCAAGTTACTCTTAGTCCATTTATTTGGTTTTAAATAGTGTTTTTAAAATTTGTTTTCAAACAGGGCTAATCATAAATAATAGAACATATTTTACAATAGTTGAAGGTAACAAAAAGTAAGTGCCATTTAAAAAATTGTATTAGATTGTTTAAAAATGTTGTGGGTACATAGTATGTGTTGTGGGTACATCGTATGTGTTGTGGGTACATAGTATGTGGGGTCCATGAGATGTTTTGATACAGGCATGCAATGTGAAATAAGCACATCATGGGGAATGGGGTATCCCTCCCCTCAAGCATTTATCCTTCAAGTTATAAAAAATTCAATTACAGTCTTAGTTATGTCAAACTGTACAATTAAATTATTATTGAATATAGTC；
LINC00856(ENST00000476909.1)的碱基序列如SEQ ID No.5所示：CACCCCACACCCCTAGCCCAGGGTCTCTTCATCGATAGGGGGTGATCTGTCTGCCCCTCACTGTTTTCTCCAAATAGAGATAAGATCTCACTATATTGCCCTGGCTGGTCTCAAACTCCCGTGTTCAAGTCATCTGCCTGCCTCGACCTCCTAAAGGGCAAGCGGGATTACAGCCTTCTCCACAGCCCAGCCACAGTGAGGGAGTCATCAGCACTGGAACCCGGGGTCCACGGCCTTGGAGGATCCGGACCCTCCGCATTTGAGGAACTTGGCCTTCAGTCAGGGAGCCAAGAAGTCCCTGCCAATCAAGGAGGGGGTGTGGGCTGGTGGGGGGGGGGCAGCCTTGGGGCACGGGAGCTGATAGACCAGACTCAAGAGTTCTACTCCTGACTTCTAGATTGTTCCACCTCCATATGGAATATGTTCCTTCCATCTAACACTGTGTGATTTGGGGACCATCCAACTCAAATGAAAGAAGCCAAGCCATGCAGCGAGCCACCCCCTCCCCAATGTGGGGTACCCCCTGCCCCCGCCCAGCTCCCCTGCCCTCCCAGCTGAGGGGGGATCGCCGCCTGGTGATCTCAGCCTCCCCTCCAAGTGGGCTGTGAAGTGTCTAATCCAGGCTTTCATCTGGCATCCACAATTATAATGTCAAGATTGAATAATCTGCCTTTATCTCCCGGGTGACAGCCATGTAGAAACTTCAAAAGAAACAGTTTTGCTGGCATCTAACGGCTTTTGTTAATTACTATATCCCAAAGAAAATGAAATAAAGGAGGGAGAAAAATGATA。
在一些实施例中，所述试剂包括引物和/或探针。
优选地，所述试剂包括：分别用于检测ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856的引物对1～5中的至少一种；
其中，引物对1的序列如SEQ ID No.6～7所示；引物对2的序列如SEQ ID No.8～9所示；引物对3的序列如SEQ ID No.10～11所示；引物对4的序列如SEQ ID No.12～13所示，引物对5的序列如SEQ ID No.14～15所示。
本文中“引物对”包括上游引物和下游引物，因此，“所述引物对1的序列如SEQ IDNo.6～7所示”是指引物对1中的上游引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID No.7所示，引物对2～5依次类推。
优选地，所述生物组织样本包括三阴性乳腺癌癌组织和三阴性乳腺癌癌旁组织中的至少一种。
本文中的“癌旁组织”为距肿瘤组织约～5cm处切除。
本发明实施例还提供检测样本中lncRNA表达水平的试剂在筛选用于治疗三阴性乳腺癌药物中的应用，所述lncRNA选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少一种，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
以上五种lncRNA在三阴性乳腺癌癌组织及其癌旁组织中的差异化表达，通过比较其在癌组织和癌旁组织中的表达水平，能够对三阴性乳腺癌患者进行诊断或预后观察，从而完成对治疗三阴性乳腺癌患者药物的有效筛选。
本发明实施例还提供了一种三阴性乳腺癌的检测试剂盒，其包括：用于检测ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中至少一种标志物的试剂。
优选地，所述试剂盒包括引物对1～5中的任意一种。
其中，引物对1的序列如SEQ ID No.6～7所示；引物对2的序列如SEQ ID No.8～9所示；引物对3的序列如SEQ ID No.10～11所示；引物对4的序列如SEQ ID No.12～13所示，引物对5的序列如SEQ ID No.14～15所示。
优选地，所述试剂盒还包括用于PCR检测的检测试剂。
优选地，所述试剂盒还包括用于检测内参的试剂。内参可选择所有细胞中均要稳定表达的一类基因，如GAPDH；内参可根据生物样本和实际情况进行常规选择，检测内参的试剂包括引物对和/或探针。
此外，本发明还提供了一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物组合，所述标志物选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少两种或两种以上的组合。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供用于三阴性乳腺癌检测的标志物，标志物选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少一种。
检测上述标志物的引物序列如表1所示。
表1引物序列
引物名称 序列(5’-3’) SEQID No.
ZEB1-AS1_FP GCACAAGTTTGTTCCGCG 6
ZEB1-AS1_RP TCTTTCCGCACTTTTCCCC 7
TMEM254-AS1_FP ATCCCACAACCATCCACAC 8
TMEM254-AS1_RP TCTCCATACTCTAGCTCCACC 9
LINC01087_FP CCAACCTCACCCACTCAAAG 10
LINC01087_RP GAGACAAAGAACAGCACTACAAAG 11
LINC01122_FP CATCCTCATTGTACTCCCTTGG 12
LINC01122_RP GCAATCAGTTTTCAGCTCCTG 13
LINC00856_FP AGAAGTCCCTGCCAATCAAG 14
LINC00856_RP GGAGGTGGAACAATCTAGAAGTC 15
备注：FP为上游引物，RP为下游引物。
实施例2
选取12例乳腺癌患者，其中包括3例Luminal A型，3例Luminal B型，3例HER2阳性，3例TNBC型。所有乳腺癌患者均来自深圳市人民医院甲乳外科已确诊的侵袭性导管乳腺癌的患者。手术切除肿瘤组织，癌旁组织为距肿瘤组织约3-5cm处切除。患者年龄在34岁至70岁。
实验过程
1、RNA提取
(1)在将组织在液氮中速冻，使用研磨器将组织磨碎，每管组织内加入1mL TRIzol后用振荡器中涡旋，在水平摇床上慢摇10min，充分裂解组织；
(2)将TRIzol-细胞裂解液加入到1.5mL的无酶管中，每个样品中加入200μL氯仿，剧烈震荡15sec后，室温静置2-3min，10000rcf，4℃离心15min；
(3)将上层水相转移至新的1.5mL的无酶管中，加入500μL异丙醇，混合均匀后室温放置40min，10000rcf，4℃离心15min；
(4)小心移除上清液体，管底可见RNA白色沉淀，使用预冷的无酶水配制的75％乙醇清洗一次，10000rcf，4℃离心1min。
(5)室温干燥RNA白色沉淀，加入30-60μL无酶水水溶解沉淀。-80℃保存备用。
2、RNA反转录建库。
(1)首先进行RNA样本质检：琼脂糖凝胶电泳分析样本RNA完整性及是否存在DNA污染；NanoDrop：检测RNA纯度(OD260/280及OD260/230比值)；Agilent 2100bioanalyzer：精确检测RNA完整性。
(2)通过Oligo(dT磁珠)富集带有poly A尾的RNA(包括mRNA和lncRNA)，从总RNA中去除核糖体RNA，在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子打断RNA，片段化的RNA为模板，引物选择随机寡核苷酸，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选250-300bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。
3、质检及RNA-seq上机测序。
3.1、文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insertsize符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。
3.2、把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。测序的基本原理是边合成边测序。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
4、RNA-seq数据生物信息学分析。
4.1、数据质控：测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，去除带接头(adapter)的reads；去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads；去除低质量reads(Qphred<＝20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。
4.2、数据分析：基因表达水平分析：我们计算各样本所有基因的表达值(Expectednumber of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions basepairs sequenced，FPKM)后，FPKM是指每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments成对的reads数目，然后通过盒形图展示不同样本基因表达水平的分布情况；基因差异表达分析，首先对原始的readcount进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正。然后统计学模型进行假设检验概率(Pvalue)的计算，最后进行多重假设检验校正，得到FDR值(错误发现率)。对不同组别间的基因做差异分析，|log2(FoldChange)|>1&padj<0.05的候选基因进一步分析；此外，采用GO富集分析和KEGG信号通路富集性分析进行细胞功能及差异基因通路分析。
5、实时荧光定量PCR反应同实施例1。
5.1、RNA反转录
按照表2所示的10μL体系，在RNase-Free microtube管中配制混合液，首先使用DNase降解样本中DNA；
表2混合液
DNase I缓冲液(10x) 1μL
RNA样本 1μg
DEPC H<sub>2</sub>O 7μL
Dnase I 1μL
Total 10μL
反应条件：37℃，30min。
5.2、将25mM EDTA 1μL添加至混合液，65℃热激反应10min。向混合液中加入50μM0.5μL引物和4μM 1μL dNTP。
反应条件：72℃，10min，然后置于冰上。
5.3、RNA反转录合成cDNA。
表3 RNA反转录体系
5×First Strand Buffer 4μL
0.1M DTT 1μL
RNase inhibitior 0.5μL
M-MLV 1μL
DEPC H<sub>2</sub>O 1μL
Total 7.5μL
PCR反应条件：37℃，60min；70℃，15min。
5.4、得到的20μL cDNA用DEPC H2O稀释20倍后，-20℃冰箱贮存。
5.5、qRT-PCR
检测上述标志物的引物序列实施例1中表1所示。
在EP管中按照表4配制PCR反应液，并按照表5所示的反应条件在PCR仪上进行qRT-PCR反应。
表4 PCR反应体系
SYBR反应缓冲液 5μL
cDNA 3μL
引物(R+F) 0.2μL
DEPC H<sub>2</sub>O 1.8μL
总体 10μL
表5反应条件
Figure BDA0003042343930000071
Figure BDA0003042343930000081
实验结果分析：反应结束后确认qRT-PCR的扩增曲线和熔解曲线，基因的表达量＝2-ΔΔCt，即ΔΔCt＝(实验组目的基因的Ct的平均值－实验组管家基因GAPDH的Ct的平均值)－(对照组目的基因的Ct的平均值一对照管家基因的Ct的平均值)。
实验结果
基于12例乳腺癌样本的RNA-seq数据分析，结果参照附图1。首先，四种乳腺癌亚型：Luminal A、Lunimal B、HER2和Basal分别与各自亚型的癌旁(P)进行比较可知：
Luminal A癌组织中差异表达上调的基因是4437个，下调的基因是5107个；
Luminal B癌组织中差异表达上调的基因是5948个，下调的基因是6075个；
HER2癌组织中差异表达上调的基因是4732个，下调的基因是6017个；
Basal癌组织中差异表达上调的基因是6583个，下调的基因是5437个。
1、在Basal乳腺癌中差异表达的lncRNA。
在上述数据分析的基础上，分别去除每种乳腺癌亚型癌旁基因，再将Basal亚型分别与Luminal A、Luminal B和HER2进行比较，筛选得到差异表达的lncRNA包括上调与下调的lncRNA。
如图2所示，Basal与HER2比较差异表达的lncRNA有657个，Basal与Luminal A比较差异表达的lncRNA有743个，Basal与Luminal B比较差异表达的lncRNA有667个。
此外，Basal与其他三种亚型的乳腺癌比较筛选的差异表达的lncRNA继续做交集，表达差异的lncRNA有116个。
2、Basal亚型乳腺癌与其他亚型比较后显著性差异表达的lncRNA。
在步骤1筛选得到的116个lncRNA中，有41个Basal亚型中特异性表达的lncRNA。与其他亚型比较，Basal中上调的lncRNA为13个，Basal中下调的lncRNA为28个，见表6～表10。
表6Basal癌组织与LuminalA癌组织比较差异表达的lncRNA
Figure BDA0003042343930000082
表7Basal癌组织与LuminalB癌组织比较差异表达的lncRNA
Figure BDA0003042343930000083
表8Basal癌组织与HER2癌组织比较差异表达的lncRNA
Figure BDA0003042343930000091
表9Basal癌组织与LuminalA/LuminalB癌组织标胶差异表达的lncRNA
Figure BDA0003042343930000092
表10Basal癌组织与HER2/LuminalA/LuminalB癌组织标胶差异表达的lncRNA
Figure BDA0003042343930000093
上调的lncRNA分别是：ZEB1-AS1、LINC01169-201、C1orf162-OT3、MYH13-OT1、SPATA6-AS1、FAM174B-AS1、ITGB2-AS1-202、P2RY8-OT2、ATP2B4-AS1、ZNF518B-OT1、ARHGAP18-AS1和TMEM254-AS1-202；
下调的lncRNA分别是：SPRY4-AS1-202、HLA-DPA1-OT2、COL4A6-OT3、LINC01087-201、PIK3CD-AS2-201、ZNF804A-OT1、OCIAD1-AS1-201、ANO10-AS1、BHLHE40-AS1-202、CSNK1A1L-AS1、MS4A6A-OT1、GPR18-OT3、MCPH1-AS1-203、TRNT1-OT1、CLIC5-AS2、IL7-OT1、ANKUB1-OT1、TEX14-OT1、LINC01122-204、TMEM161B-AS1-207、DSCR8-203、ECE1-AS1、LINC00856-207、RTN4-AS1、LINC01122-201、MSC-AS1-207、CKMT2-AS1-201、CACNA2D4-AS1和WDPCP-OT3。
3、上述差异表达的lncRNA在Basal乳腺癌患者中的生存期。
根据上述分析，通过Gene card数据库(https://www.genecards.org/)筛选已知lncRNA名称的lncRNA；并通过Kaplan-Meier数据库(https://kmplot.com/analysis)筛选出在三阴性乳腺癌(ER negative、PR negative和HER2 negative)条件下筛选出的高表达的lncRNA与患者预后成负相关，低表达的lncRNA与患者预后成正相关的生存分析，见图3和表11。
表11参数
Figure BDA0003042343930000101
结果发现，Basal中上调的lncRNA：ZEB1-AS1或TMEM254-AS1表达越高，三阴性乳腺癌患者的无复发生存期(Relapse-free survival，RFS)越短(ZEB1-AS1：HR＝2.11，P＝0.012；TMEM254-AS1：HR＝2.58，P＝0.0016)；Basal中下调的lncRNA：LINC01087、LINC01122、LINC00856表达越低，三阴性乳腺癌患者的无复发生存期(Relapse-freesurvival，RFS)越短(LINC01087：HR＝0.48，P＝0.014；LINC01122：HR＝0.48，P＝0.014；LINC00856：HR＝0.53，P＝0.03)。
此外，通过qRT-PCR实验验证发现，与各自癌旁组织比较，在3种三阴性乳腺癌组织中，ZEB1-AS1或TMEM254-AS1表达升高；而LINC01087、LINC01122、LINC00856表达降低，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001为显著性差异，如图4所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市人民医院
<120> 一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcccacagc ccggcccgag tcgcggggcc cgagcgacag cgacggcgcc ggccggggcc 60
gcggcgcgcg gaagccactt tgcacggtca gcgccgggca caagtttgtt ccgcggctcc 120
cgggggcctg ggcgctgagg gagaatcgcg ctgagggggc caggaggagg gggagaggga 180
ggcgccgaag ggcacaagag tggggaaaag tgcggaaaga agcaacagcc gctccacccg 240
ggaccagaaa agtggccagt gcgtcccggc cgcccgccct gcgccgggga tgcggcggcg 300
tcggcgccgg ctaacggtcc agggaggcgg caggggcggc gggagccgct aggcggagag 360
agaccaggga cgcctggttt ccccccaagc gaaccgggat gggaagtgac ttcaatgaga 420
ttgaacttca gctggattga aagagaggct agaagt 456
<210> 2
<211> 2189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcgcgcggg agtcgggatt gtgcttgcac gacttccccc ggcccgcggc ctgtgagccc 60
aggtcctggg gtgaaccgag cgctcgctcg ttcgtcagac cgtagcgctc cagcggctgt 120
ccttactgtg tagtagccaa agctgagggt gatgactgtg aaccagaaca gactgcctcg 180
ctgaaaagtc acttggaact cttctgtggc atctgaagca gatggacgaa gccaagaggg 240
ccgagagtat ctcagcacct agaaatggac aaggctggtt attagaacaa agatttcgca 300
ggtggtgagt ctcaaaggcg aagctgaatg aggcaagaat ctgcatcaaa gagccctgga 360
agcaatcatg gctcaactgt gatgccttta gaacatgaag tcctccaaga agatgccata 420
ggaatggcct ccatcccagg gcctggagag cagccagaga caagaagagt agcccaggag 480
ggcactggca gtcagtgcta cactgtggcc tgtcagtctc agagccagga tttaatcact 540
ggatctccca ttaaccagtc ataatgaagt aagaacaaga agatggggaa gaggaagtgt 600
aaaaccgtgg cttaaatttg ccaaggataa gctgagtgta cttcagcagt catttgcaca 660
gaatccttat cctaatttta caaccaggga aaaactggct ggacagtctc ttgtcctgtg 720
tttgtaattg ataactggtt tcaaaataaa agccagacca ccacttagag agagacacag 780
aatgttcact gccagggaac tgcatgattc ctctgccaaa ggccacccat ttacaagaat 840
ccaggaaaac caggtggaat ctcccaatga tgaccctgag cagaacttct tgtacccagg 900
aagttctact gggtggagct ggccactctt ccgtggagac acaggggact cccaattaac 960
atgatggctc aaataactgt agccttatgg attaaaagga aactaagctg tgatttggag 1020
tatccaggtg atacagaaaa tggcccttgt cgatgtagat cagcattatt tccttatcct 1080
tctgcatctc ctcctcagta ttctgaaagg gacaagcctg agatggggga aagccagcat 1140
gcaaggccct cccctttgtg ctgtgttcat ggtgtgcacg gagagaggca gcagcaggag 1200
gaacagaaag gttattttct ttactgactc tttcaaggac atcagcagaa tggttgggaa 1260
tgtcatcatg agcagcctca gcctcagaat taccaggaga agctggtctt ccaggatcag 1320
gttctaatgt atatgagtca caggatttag ggaagcaggc actttccctt cagtcccagc 1380
agcatggttg atgttcccaa gtaatggaga gtccctgtgc tctcagttgt ggcacacacc 1440
tttgcaaata gtgatcagat ctccacaaac gcctcttggg taagatatgc agcaacatag 1500
ctggctgcag agcaacccag ttcccaaatc cagcagctct tggatgagaa gtctgcaagt 1560
gtttactgct gggaccagga ctgtgtttct aggaaatggt gctaggcttc agagagcatc 1620
atccacaggt catcccacaa ccatccacac agaagcctga ggaaaagggc tctgcagagc 1680
ttgcacataa agatgctgaa ctcaggaagg ctctgtgagc tgctggtctc ttctggtagg 1740
gcagcagtgt cctgagaagg tggagctaga gtatggagaa caaaactaac aagcaccaag 1800
gcagcaagca aggcaacccc caaatgacag cagttgccaa atccaaagca atctgtgctt 1860
cagaagacag aggctctgca cagtccctgt ctcagacatt gtctcctcct tagaagatac 1920
ctaacaacag cactgtggga ggctgaggtg ggtggatcac caggtcagga gatcaagacc 1980
atccttgatc tttagtagag acggtgaaac actgtctcta ctaaaaaata caaaaaaaaa 2040
ttagctagcc gtggcggcgg gcacctgtag tctcaactat ttgggaggct gaggcaggag 2100
aatggcctga acccgggagg cagagcttgc agtgagctga gattgcgcca ctgcactcca 2160
gcctgggcaa cagagtgaga ctccatctc 2189
<210> 3
<211> 3516
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gccaagctgg ctcaaagagc aaccagccac ctctgcaagg gtgtgccagg agcaggtgga 60
gcagccacca acctcaccca ctcaaagaag cagggatggc caggttccaa cagcctgagt 120
ggctgccacc tgatggctga tggagcagag gcgtgaggaa aagctgatgg cactgctttg 180
tagtgctgtt ctttgtctct cttcatcttt ttcagttaaa gtctgtttta tcagagacta 240
ggattgcaaa ccctgctttt ttttgctttc catttgcttg gtaaatattc ctccatccct 300
ttattttaaa cctatgtgtg tctttgcgca tgagatgggt ctcctgaata caggacacca 360
ttgggtcttt actctttatc caacttgcca gtctgtgtct tttaactggg gcatttagcc 420
catttacatt taagtttagt attgttacat gtgaaattta tcctgtcatg atgttgctag 480
tttttaattt ttcccattag ttaatgcagt ttctttatag tgtcaatggt ctttacaatt 540
tggtatgttt ttgtagtggc tggtactggt tgttcctttc cacgtttagt gcttacttca 600
ggagctcttg taacgcaaga atgtggattt atttctggta aggtaaataa gtggatttat 660
ttctcaatgc tgtattctat gtcctttacc ccaagaatca ttacttttta aaatgcaatt 720
caaattagca taaaacattt acagcctagg aaaaggcttg tggcattaga atacttattt 780
ataggattat tttgtgtttt tttgagatac ggtctttgtc atcgaggcag aagtgcagtg 840
gtttgatcat aattcaccac agccctgaac tctgagtcca agccatcctt ttgccttaat 900
ctcccaacta gttggatcta caagcataag gcatcatgcc tggctaattt ttttacatgt 960
tttttttttt ttttgtcgag attatggtat cactatgttg ctctggctga tctcaaattc 1020
ctgacctcaa gtgatctttc tgccacagcc tcctaaagtg ctaggattac atgcatgatg 1080
caccatgcct agcgtagagt attacattag tttcaaagtc ttattctaag agccatttat 1140
tgactttggc ctaaataact caatataata tctctgaaac tttttttgac aaattttggg 1200
gcatgatgat gagagaaggg ggtttgaaac tttctaataa gaattaactt agacccattt 1260
aagaaggaaa aaacacaaat tatcagaaaa atataaaagt aagatcaagt gcaaaagttc 1320
tgtggcaaag atgatgagag taaagaatat atgtttgtga ctcatggtgg cttttacttt 1380
gttcttgaat ttttgagtac gagttaacat ttaaagaatc tacattatag ataacatttt 1440
attgcaagta aatgtatttc agaatttgtt attggttttg tatgagatta ttctcagcct 1500
atttcattat caagctatat tattttatta atgtagtttg atgatcttac agcaaagctg 1560
gaagctgtat cttcaaaata tgtctatttg actaagaaga agttattcaa caggagttat 1620
tatctatgaa aaaagtacaa ccagaatata aaaaacttga ggaggataaa aagatgttgg 1680
aagaagtaat attaaatctt aaaaaacatg gaaactgcac attggtgaag acacattggt 1740
gaagtacaaa aatataaatt ggatgtagaa gaaagggcaa tgcaggcaat agaaaaatta 1800
gtagaaatcc ctttacaggt tagtttgtaa aatcaggtaa gtttatttat aatgtgcttt 1860
catttatttc actgcaaatt atattttgga tatatatatt gtgtttcctc tgcctctctt 1920
atagcaattt gccttgtaga gttctagcaa aaaggtggca tctgttttta ctttcaaata 1980
tttaaatttc catcattata acaaaatcaa tttttcagag taatgattct tactgtggag 2040
tcatttgatt attaagaccc attggcataa gattacatcc tctgactata aaaatcgtgg 2100
aagaaaacct aggaaatatt cgtctggaca ttgcacttgg cagtgaattt atggttaacc 2160
tgcggacgcc caggggctcc tccatctcca ccgtgttctc ctcgggctga agcccaaagt 2220
cccacatttt ctcctcaaac agctctcaga gccacttctg caggcaggag gacagcgcgt 2280
ggactcagtg tctgacttgg gaagccacat gtgaaggaac tgctgggtga ctatggtcgt 2340
aagtcaatca aagcagactt tccctggctt gctgtgctac gttgattttg ttttcgtatt 2400
ttaaaagaag cagaagggag gttctaggaa atttgcccaa cgtagatgct gacaagagtg 2460
gtgacatgaa aaagattacc cagaaggaaa acgagctatt ttctaaacat ctgaaatctg 2520
tgtaggcttt tggaaaagtg aaactagatg caaaacacaa tgatataatt ctggcaattt 2580
ccactgacac agaactcagt caatctgaat taatctaaga gttataagga aaatggcact 2640
ccaagaagta cctattaaca tcactcagct gctgtgaaat aggcttacag gcaacatgga 2700
gtgtcaatta cccaatgttt aaagtcgatc atacagattg gactacaatc tctatggctc 2760
ataaagtctt taaaggattg acagatgatt tatctcatat gtagacaatg attctcagca 2820
gttaactagc gcaacttgat aatgtcaatt gcttgagaaa atcagataat tgcttgagaa 2880
aattaggaca ttgcttgagg aagttaggta gttaaataaa ttactttttt taaagaatag 2940
tttaatattt tggcaagtag actttaaaat aggttggtaa tattttaaag gctactttta 3000
aagaagtagc aatataacat gtttaattat gaaaaataat gttggaaaca attcaatttt 3060
ctatcagatc attcacaaat acagaaatac catctcaata attagaagaa gtagcagcaa 3120
tttctgtcat ttttatgcaa gttactctta gtccatttat ttggttttaa atagtgtttt 3180
taaaatttgt tttcaaacag ggctaatcat aaataataga acatatttta caatagttga 3240
aggtaacaaa aagtaagtgc catttaaaaa attgtattag attgtttaaa aatgttgtgg 3300
gtacatagta tgtgttgtgg gtacatcgta tgtgttgtgg gtacatagta tgtggggtcc 3360
atgagatgtt ttgatacagg catgcaatgt gaaataagca catcatgggg aatggggtat 3420
ccctcccctc aagcatttat ccttcaagtt ataaaaaatt caattacagt cttagttatg 3480
tcaaactgta caattaaatt attattgaat atagtc 3516
<210> 4
<211> 3516
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccaagctgg ctcaaagagc aaccagccac ctctgcaagg gtgtgccagg agcaggtgga 60
gcagccacca acctcaccca ctcaaagaag cagggatggc caggttccaa cagcctgagt 120
ggctgccacc tgatggctga tggagcagag gcgtgaggaa aagctgatgg cactgctttg 180
tagtgctgtt ctttgtctct cttcatcttt ttcagttaaa gtctgtttta tcagagacta 240
ggattgcaaa ccctgctttt ttttgctttc catttgcttg gtaaatattc ctccatccct 300
ttattttaaa cctatgtgtg tctttgcgca tgagatgggt ctcctgaata caggacacca 360
ttgggtcttt actctttatc caacttgcca gtctgtgtct tttaactggg gcatttagcc 420
catttacatt taagtttagt attgttacat gtgaaattta tcctgtcatg atgttgctag 480
tttttaattt ttcccattag ttaatgcagt ttctttatag tgtcaatggt ctttacaatt 540
tggtatgttt ttgtagtggc tggtactggt tgttcctttc cacgtttagt gcttacttca 600
ggagctcttg taacgcaaga atgtggattt atttctggta aggtaaataa gtggatttat 660
ttctcaatgc tgtattctat gtcctttacc ccaagaatca ttacttttta aaatgcaatt 720
caaattagca taaaacattt acagcctagg aaaaggcttg tggcattaga atacttattt 780
ataggattat tttgtgtttt tttgagatac ggtctttgtc atcgaggcag aagtgcagtg 840
gtttgatcat aattcaccac agccctgaac tctgagtcca agccatcctt ttgccttaat 900
ctcccaacta gttggatcta caagcataag gcatcatgcc tggctaattt ttttacatgt 960
tttttttttt ttttgtcgag attatggtat cactatgttg ctctggctga tctcaaattc 1020
ctgacctcaa gtgatctttc tgccacagcc tcctaaagtg ctaggattac atgcatgatg 1080
caccatgcct agcgtagagt attacattag tttcaaagtc ttattctaag agccatttat 1140
tgactttggc ctaaataact caatataata tctctgaaac tttttttgac aaattttggg 1200
gcatgatgat gagagaaggg ggtttgaaac tttctaataa gaattaactt agacccattt 1260
aagaaggaaa aaacacaaat tatcagaaaa atataaaagt aagatcaagt gcaaaagttc 1320
tgtggcaaag atgatgagag taaagaatat atgtttgtga ctcatggtgg cttttacttt 1380
gttcttgaat ttttgagtac gagttaacat ttaaagaatc tacattatag ataacatttt 1440
attgcaagta aatgtatttc agaatttgtt attggttttg tatgagatta ttctcagcct 1500
atttcattat caagctatat tattttatta atgtagtttg atgatcttac agcaaagctg 1560
gaagctgtat cttcaaaata tgtctatttg actaagaaga agttattcaa caggagttat 1620
tatctatgaa aaaagtacaa ccagaatata aaaaacttga ggaggataaa aagatgttgg 1680
aagaagtaat attaaatctt aaaaaacatg gaaactgcac attggtgaag acacattggt 1740
gaagtacaaa aatataaatt ggatgtagaa gaaagggcaa tgcaggcaat agaaaaatta 1800
gtagaaatcc ctttacaggt tagtttgtaa aatcaggtaa gtttatttat aatgtgcttt 1860
catttatttc actgcaaatt atattttgga tatatatatt gtgtttcctc tgcctctctt 1920
atagcaattt gccttgtaga gttctagcaa aaaggtggca tctgttttta ctttcaaata 1980
tttaaatttc catcattata acaaaatcaa tttttcagag taatgattct tactgtggag 2040
tcatttgatt attaagaccc attggcataa gattacatcc tctgactata aaaatcgtgg 2100
aagaaaacct aggaaatatt cgtctggaca ttgcacttgg cagtgaattt atggttaacc 2160
tgcggacgcc caggggctcc tccatctcca ccgtgttctc ctcgggctga agcccaaagt 2220
cccacatttt ctcctcaaac agctctcaga gccacttctg caggcaggag gacagcgcgt 2280
ggactcagtg tctgacttgg gaagccacat gtgaaggaac tgctgggtga ctatggtcgt 2340
aagtcaatca aagcagactt tccctggctt gctgtgctac gttgattttg ttttcgtatt 2400
ttaaaagaag cagaagggag gttctaggaa atttgcccaa cgtagatgct gacaagagtg 2460
gtgacatgaa aaagattacc cagaaggaaa acgagctatt ttctaaacat ctgaaatctg 2520
tgtaggcttt tggaaaagtg aaactagatg caaaacacaa tgatataatt ctggcaattt 2580
ccactgacac agaactcagt caatctgaat taatctaaga gttataagga aaatggcact 2640
ccaagaagta cctattaaca tcactcagct gctgtgaaat aggcttacag gcaacatgga 2700
gtgtcaatta cccaatgttt aaagtcgatc atacagattg gactacaatc tctatggctc 2760
ataaagtctt taaaggattg acagatgatt tatctcatat gtagacaatg attctcagca 2820
gttaactagc gcaacttgat aatgtcaatt gcttgagaaa atcagataat tgcttgagaa 2880
aattaggaca ttgcttgagg aagttaggta gttaaataaa ttactttttt taaagaatag 2940
tttaatattt tggcaagtag actttaaaat aggttggtaa tattttaaag gctactttta 3000
aagaagtagc aatataacat gtttaattat gaaaaataat gttggaaaca attcaatttt 3060
ctatcagatc attcacaaat acagaaatac catctcaata attagaagaa gtagcagcaa 3120
tttctgtcat ttttatgcaa gttactctta gtccatttat ttggttttaa atagtgtttt 3180
taaaatttgt tttcaaacag ggctaatcat aaataataga acatatttta caatagttga 3240
aggtaacaaa aagtaagtgc catttaaaaa attgtattag attgtttaaa aatgttgtgg 3300
gtacatagta tgtgttgtgg gtacatcgta tgtgttgtgg gtacatagta tgtggggtcc 3360
atgagatgtt ttgatacagg catgcaatgt gaaataagca catcatgggg aatggggtat 3420
ccctcccctc aagcatttat ccttcaagtt ataaaaaatt caattacagt cttagttatg 3480
tcaaactgta caattaaatt attattgaat atagtc 3516
<210> 5
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caccccacac ccctagccca gggtctcttc atcgataggg ggtgatctgt ctgcccctca 60
ctgttttctc caaatagaga taagatctca ctatattgcc ctggctggtc tcaaactccc 120
gtgttcaagt catctgcctg cctcgacctc ctaaagggca agcgggatta cagccttctc 180
cacagcccag ccacagtgag ggagtcatca gcactggaac ccggggtcca cggccttgga 240
ggatccggac cctccgcatt tgaggaactt ggccttcagt cagggagcca agaagtccct 300
gccaatcaag gagggggtgt gggctggtgg ggggggggca gccttggggc acgggagctg 360
atagaccaga ctcaagagtt ctactcctga cttctagatt gttccacctc catatggaat 420
atgttccttc catctaacac tgtgtgattt ggggaccatc caactcaaat gaaagaagcc 480
aagccatgca gcgagccacc ccctccccaa tgtggggtac cccctgcccc cgcccagctc 540
ccctgccctc ccagctgagg ggggatcgcc gcctggtgat ctcagcctcc cctccaagtg 600
ggctgtgaag tgtctaatcc aggctttcat ctggcatcca caattataat gtcaagattg 660
aataatctgc ctttatctcc cgggtgacag ccatgtagaa acttcaaaag aaacagtttt 720
gctggcatct aacggctttt gttaattact atatcccaaa gaaaatgaaa taaaggaggg 780
agaaaaatga ta 792
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcacaagttt gttccgcg 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atcccacaac catccacac 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tctccatact ctagctccac c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccaacctcac ccactcaaag 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagacaaaga acagcactac aaag 24
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
catcctcatt gtactccctt gg 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcaatcagtt ttcagctcct g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agaagtccct gccaatcaag 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggaggtggaa caatctagaa gtc 23

Claims (10)

1.检测样本中lncRNA表达水平的试剂在制备用于三阴性乳腺癌检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述lncRNA选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的检测样本中lncRNA表达水平的试剂在制备用于三阴性乳腺癌检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂包括引物和/或探针。
3.根据权利要求2所述的检测样本中lncRNA表达水平的试剂在制备用于三阴性乳腺癌检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂包括：分别用于检测ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856的引物对1～5中的至少一种；
其中，引物对1的序列如SEQ ID No.6～7所示；引物对2的序列如SEQ ID No.8～9所示；引物对3的序列如SEQ ID No.10～11所示；引物对4的序列如SEQ ID No.12～13所示，引物对5的序列如SEQ ID No.14～15所示。
4.根据权利要求1所述的检测样本中lncRNA表达水平的试剂在制备用于三阴性乳腺癌检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述样本包括生物组织样本；
优选地，所述生物组织样本包括三阴性乳腺癌癌组织和三阴性乳腺癌癌旁组织中的至少一种。
5.检测样本中lncRNA表达水平的试剂在筛选用于治疗三阴性乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述lncRNA选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少一种，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
6.一种三阴性乳腺癌的检测试剂盒，其特征在于，其包括：用于检测ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中至少一种标志物的试剂。
7.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对1～5中的任意一种；
其中，引物对1的序列如SEQ ID No.6～7所示；引物对2的序列如SEQ ID No.8～9所示；引物对3的序列如SEQ ID No.10～11所示；引物对4的序列如SEQ ID No.12～13所示，引物对5的序列如SEQ ID No.14～15所示。
8.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于PCR检测的检测试剂。
9.根据权利要求6所述的三阴性乳腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测内参的试剂。
10.一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物组合，其特征在于，所述标志物选自ZEB1-AS1、TMEM254-AS1、LINC01087、LINC01122和LINC00856中的至少两种或两种以上的组合。
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