CN115992245A - 用于人微卫星不稳定msi检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于人微卫星不稳定MSI检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用。本发明采用多重荧光PCR技术与毛细管电泳相结合，检测结直肠癌患者微卫星不稳定状态。相比于免疫组化(IHC)，该方法具有样本量少，检测方便，经济，快捷，灵敏度高，特异性好，通量大等优点。同时，设置的质控位点能够随时监测样本是否混合或污染，确保结果的准确可信。该方法有助于临床上结直肠癌患者微卫星不稳定的检测，对于及时干预治疗结直肠癌、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

Description

用于人微卫星不稳定MSI检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于人微卫星不稳定MSI检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用。

背景技术

微卫星(Microsatellite)又称短串联重复序列(Short tandem repeats，STRs)、简单重复顺序，由1～6个核苷酸组成，具有高度多态性，广泛存在于原核及真核生物基因组中，微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是指由于复制错误(replicationerrors，RER)引起的微卫星DNA长度发生改变。其发生主要是参与配对错误修复(mismatchrepair，MMR)的基因功能缺陷而产生一种缺陷蛋白质，因而不能正常的校正复制错误，从而引起微卫星DNA的改变，使其不能正常地发挥调控作用，导致细胞增殖及分化异常，促发恶性肿瘤形成。

微卫星不稳定性(MSI)最开始主要在结直肠癌中进行研究，结直肠癌是世界范围内的第三大癌症，结直肠癌是一种遗传异质性的疾病，肿瘤临床病理特征相同的患者却对治疗有截然不同的反应和生存率。大约15％的结直肠癌存在染色体组不稳定，而染色体组不稳定，是由于不同程度的微卫星不稳定造成的。其中3％左右为家族遗传性(Lynch综合征)，又称为遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)，患Lynch综合征的人一生中患结直肠癌的可能性最高可达80％，而且其结直肠癌发病年龄提早，平均诊断年龄约45岁。另外12％为散发性。与Lynch综合征不同的是，多数散发性MSI结直肠癌并不是由错配修复基因体细胞突变导致的，而是因MLHI基因启动子甲基化导致MLHI基因发生表观遗传学沉默所致。虽然MSI作为在结直肠癌中治疗的预测标志物还存在许多争议，但是有许多研究已经表明，III期的结直肠癌病人中，携带MSI的病人预后效果要好于无MSI的病人。所以，对结直肠癌病人中MSI状态进行分析具有重要的临床指导意义。

MSI分为三类：①高频微卫星不稳定(High-frequency microsatelliteinstability，MSI-H)：2个或2个以上微卫星位点不稳定(或检测的大板标记中>30％的位点不稳定)。②低频微卫星不稳定(Low-frequency microsatellite instability，MSI-L)：只有1个微卫星位点不稳定(10％～30％标记位点不稳定)。③微卫星稳定(Microsatellitestability，MSS)：无不稳定微卫星位点(<10％标记点不稳定)。

1998年，美国国立癌症研究院协作组推荐2个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26)和3个双核苷酸位点(D2S123、D5S346、D17S250)作为MSI检测的标记点，但由于双核苷酸位点具有多态性，在群体中重复单位的数目表现杂合性，为了提高MSI检测的准确性，故推荐病理学家从肿瘤组织周围的正常组织或者抽血提取DNA与肿瘤组织配对进行MSI检测。2004年，新的专家共识意见中推荐5个准单态性的单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27)作为MSI检测的标记点。其原因是研究发现单核苷酸标记位点在大部分个体的等位基因中重复单位的数目是相同且恒定，故单核苷酸标记位点可被看作准单态性。因此，采用单核苷酸标记位点进行MSI检测，无需对肿瘤组织配对正常组织的DNA进行MSI检测，不但可以提高MSI检测的敏感性，而且降低成本和时间损耗。

目前，通过免疫组化(IHC)和PCR检测可以定量分析微卫星的稳定程度。但IHC判读识别dMMR对病理医师要求较高，检测结果在很大程度上受判读人员的主观因素影响，存在一定概率的假阴性和假阳性。另一方面，IHC检测的一抗选择对阳性和阴性的判断至关重要，操作流程难以标准化和规范化，无法保证IHC结果的可重复性，从而大大影响检测结果的判读。而本项目采用多重荧光PCR+毛细管电泳法，是目前公认的检测MSI的金标准。此方法通过多重PCR同时对同一个体来源的肿瘤组织和正常组织的微卫星位点进行扩增，再借助毛细管电泳对扩增产物进行DNA片段分析。比较肿瘤组织和正常组织的基因图谱，如果肿瘤组织的五指峰相较于正常组织发生了位移，则判定该微卫星位点不稳定。目前广泛使用的是单核苷酸位点检测MSI，但检测的灵敏度和准确性仍需进一步提高。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一组更优的人微卫星不稳定状态MSI的检测引物，以期望将该检测引物用于PCR联合毛细管电泳方法后，能够快速准确、灵敏度高、特异性好地检出人微卫星不稳定状态MSI的不稳定状态，并且能够实现检测通量大，适用机型广，检测结果真实可靠等优点，以满足推广需求。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了用于人微卫星不稳定MSI检测的引物组合物，所述引物组合物包括第一引物对，和，第二引物对至第六引物对中至少一种；

所述第一引物对用于检测单核酸位点CAT-25，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示；

所述第二引物对用于检测单核酸位点BAT-25，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示；

所述第三引物对用于检测单核酸位点BAT-26，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示；

所述第四引物对用于检测单核酸位点NR-21，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

所述第五引物对用于检测单核酸位点NR-24，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

所述第六引物对用于检测单核酸位点NR-27，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12所示。

在可选实施方式中，每组引物对中至少一条引物的5’端含有荧光标记。

优选地，每组引物对的正向引物的5’端含有荧光标记。

在可选实施方式中，所述荧光标记选自FAM、ROX或JOE。

第二方面，本发明提供了人微卫星不稳定MSI的PCR扩增试剂，所述试剂包括前述实施方式任一项所述的引物组合物，和PCR反应体系。

优选地，所述PCR反应体系包括DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl₂和dNTP。

第三方面，本发明提供了人微卫星不稳定MSI的PCR扩增试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式所述的PCR扩增试剂和质控品，所述质控品包括阴性质控品、阳性质控品和质控位点检测引物对。

优选地，所述阴性质控品包括无核酸酶水。

优选地，所述阳性质控品包括细胞系HT-29基因组DNA。

优选地，所述质控位点包括至少一个五核苷酸重复位点。

优选地，所述五核苷酸重复位点包括Penta C或Penta D。

优选地，Penta C的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13(ACATGAACACACTTTGCACCTG)和SEQ ID No.14(GCTACAAGAGAGCATTCCAAC)所示。

优选地，Penta D的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15(CCTGGAAGGTCGAAGCT)和SEQ ID No.16(TAAGAAATATTTGCCTAACCTATG)所示。

第四方面，本发明提供了非诊断目的的MSI稳定性检测方法，所述检测方法包括使用前述实施方式所述PCR扩增试剂或PCR扩增试剂盒分别对待测样本和对照样本进行PCR扩增，而后依据两种样本扩增产物中单核苷酸位点片段长度变化输出MSI稳定性检测结果。

优选地，所述PCR扩增试剂或PCR扩增试剂盒中含有第一引物对至第六引物对共计六组单核酸位点检测引物对。

优选地，所述PCR扩增试剂盒中含有Penta C的检测引物对和Penta D的检测引物对。

优选地，所述扩增程序为95℃3分钟；95℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃30秒；60℃30分钟；4℃∞。

在可选实施方式中，两种样本扩增产物中每种单核苷酸位点片段长度变化差异大于2nt时，输出待测样本中该单核苷酸位点不稳定标识。

在可选实施方式中，待测样本中不稳定标识数量大于等于2时，输出该待测样本的MSI高度不稳定标识。

在可选实施方式中，所述待测样本包括疑似病灶组织、疑似病灶细胞、疑似病变外周血、施药后病灶组织、施药后病灶细胞或施药后病变外周血的核酸提取物；

所述对照样本包括癌旁组织、健康细胞或健康外周血的核酸提取物。

第五方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述检测方法的如下(a)～(d)中任一项的应用：

(a)诊断结直肠癌试剂的开发；

(b)诊断结直肠癌试剂的效果评价；

(c)治疗结直肠癌药物的开发；

(d)治疗结直肠癌药物的药效评价。

本发明采用多重荧光PCR技术与毛细管电泳相结合，检测结直肠癌患者微卫星不稳定状态。相比于免疫组化(IHC)，该方法具有所需样本量少、检测方便、经济、快捷、灵敏度高、特异性好、通量大等优点。同时本申请使用了与本申请检测引物对相匹配的质控位点Penta C和Penta D的检测引物对，随时监测样本是否混合或污染，确保结果的准确可信。该方法有助于临床上结直肠癌患者微卫星不稳定的检测，对于及时干预治疗结直肠癌、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发、相关药物研发都具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3中4对引物对CAT-25位点扩增后的电泳结果；

图2为使用本发明引物实施例4中肿瘤组织毛细管电泳图谱；

图3为使用本发明引物实施例4中癌旁组织毛细管电泳图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在某次具体的实施方式中，第一方面，本发明提供了用于人微卫星不稳定MSI检测的引物组合物，所述引物组合物包括第一引物对，和，第二引物对至第六引物对中至少一种；

所述第一引物对用于检测单核酸位点CAT-25，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.1(TCCCTGCTTATCTGAAACTTCCCAAC)和SEQ ID No.2(TGTAGTCCCAGCTACTTGGAAG)所示；

所述第二引物对用于检测单核酸位点BAT-25，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.3(CTCCAAGAATGTAAGTGGGA)和SEQ ID No.4(ACATTCTGCATTTTAACTATGGC)所示；

所述第三引物对用于检测单核酸位点BAT-26，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.5(ATGATTCCAACTTTGGACAGT)和SEQ ID No.6(GCTTCTTCAGTATATGTCAATGA)所示；

所述第四引物对用于检测单核酸位点NR-21，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7(GGAGTCGCTGGCACAGTTCT)和SEQ ID No.8(TGGTCACTCGCGTTTACAAAC)所示；

所述第五引物对用于检测单核酸位点NR-24，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.9(TGAATTTTACCTCCTGACTC)和SEQ ID No.10(AGATTGTGCCATTGCATTCCAAC)所示；

所述第六引物对用于检测单核酸位点NR-27，引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.11(CCATGCTTGCAAACCACTGG)和SEQ ID No.12(GTCGATAATACTAGCAATGACC)所示。

在可选实施方式中，每组引物对中至少一条引物的5’端含有荧光标记。

优选地，每组引物对的正向引物的5’端含有荧光标记。

在可选实施方式中，所述荧光标记选自FAM、ROX或JOE。

第二方面，本发明提供了人微卫星不稳定MSI的PCR扩增试剂，所述试剂包括前述实施方式任一项所述的引物组合物，和PCR反应体系。

优选地，所述PCR反应体系包括DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl₂和dNTP。

第三方面，本发明提供了人微卫星不稳定MSI的PCR扩增试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式所述的PCR扩增试剂和质控品，所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品。

优选地，所述阴性质控品包括无核酸酶水。

优选地，所述阳性质控品包括细胞系HT-29基因组DNA。

优选地，所述质控位点包括至少一个五核苷酸重复位点。

优选地，所述五核苷酸重复位点包括Penta C或Penta D。

优选地，Penta C的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示。

优选地，Penta D的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。

某次具体实施方式中，本发明提供试剂盒组成见下表1，该试剂盒能够用于，以多重荧光PCR技术为基础，结合毛细管电泳进行核酸片段分析，检测人类细胞中微卫星不稳定性状态。本具体实施方式提供的试剂盒检测6个单核苷酸重复位点和2个五核苷酸重复位点，具体检测位点见下表2。

表1试剂盒组成

表2试剂盒检测位点

第四方面，本发明提供了非诊断目的的MSI稳定性检测方法，所述检测方法包括使用前述实施方式所述PCR扩增试剂或PCR扩增试剂盒分别对待测样本和对照样本进行PCR扩增，而后依据两种样本扩增产物中单核苷酸位点片段长度变化输出MSI稳定性检测结果。

优选地，所述PCR扩增试剂或PCR扩增试剂盒中含有第一引物对至第六引物对共计六组单核酸位点检测引物对。

优选地，所述PCR扩增试剂盒中含有Penta C的检测引物对和Penta D的检测引物对。

优选地，所述扩增程序为95℃3分钟；95℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃30秒；60℃30分钟；4℃∞。

在可选实施方式中，两种样本扩增产物中每种单核苷酸位点片段长度变化差异大于2nt时，输出待测样本中该单核苷酸位点不稳定标识。

在可选实施方式中，待测样本中不稳定标识数量大于等于2时，输出该待测样本的MSI高度不稳定标识。

在可选实施方式中，所述待测样本包括疑似病灶组织、疑似病灶细胞、疑似病变外周血、施药后病灶组织、施药后病灶细胞或施药后病变外周血的核酸提取物；

所述对照样本包括癌旁组织、健康细胞或健康外周血的核酸提取物。

第五方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述检测方法的如下(a)～(d)中任一项的应用：

(a)诊断结直肠癌试剂的开发；

(b)诊断结直肠癌试剂的效果评价；

(c)治疗结直肠癌药物的开发；

(d)治疗结直肠癌药物的药效评价。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1：一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成单核苷酸位点目标基因的引物序列。具体引物如下所示：

BAT-25-F:FAM–CTCCAAGAATGTAAGTGGGA；

BAT-25-R:ACATTCTGCATTTTAACTATGGC；

BAT-26-F:FAM–ATGATTCCAACTTTGGACAGT；

BAT-26-R:GCTTCTTCAGTATATGTCAATGA；

NR-21-F:ROX–GGAGTCGCTGGCACAGTTCT；

NR-21-R:TGGTCACTCGCGTTTACAAAC；

NR-24-F:JOE–TGAATTTTACCTCCTGACTC；

NR-24-R:AGATTGTGCCATTGCATTCCAAC；

NR-27-F:FAM–CCATGCTTGCAAACCACTGG；

NR-27-R:GTCGATAATACTAGCAATGACC；

CAT-25-F:ROX–TCCCTGCTTATCTGAAACTTCCCAAC；

CAT-25-R:TGTAGTCCCAGCTACTTGGAAG；

Penta C-F:JOE–ACATGAACACACTTTGCACCTG；

Penta C-R:GCTACAAGAGAGCATTCCAAC；

Penta D-F:ROX–CCTGGAAGGTCGAAGCT；

Penta D-R:TAAGAAATATTTGCCTAACCTATG。

本实施例提供的人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒包含以下三组分，分别为：

PCR反应混合液包括多重DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl₂和dNTPs。

MSI引物混合液：包含用于检测6个单核苷酸重复位点和2个五核苷酸重复位点的引物对，6个单核苷酸重复位点分别为BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27和CAT-25，2个五核苷酸重复位点为PentaC和PentaD，引物的核苷酸序列如上所述。

阴性质控品为无核酸酶水；阳性质控品为细胞系HT-29基因组DNA。

实施例2：人类微卫星不稳定性状态检测方法

采用本发明实施例1的试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态，包括以下步骤：

(1)待测样本处理和模板提取；

同一个体肿瘤样本(石蜡包埋肿瘤组织)和对照样本(石蜡包埋癌旁组织)按照提取试剂盒(康为世纪，CWY017S)说明书提取DNA。提取的模板DNA原液稀释至5～10ng/μL(qubit测定浓度)或50～100ng/μL(nanodrop或其他微量紫外分光光度计测定浓度)作为PCR扩增模板。

(2)试剂配制如表3所示：

表3 PCR反应体系Mix

试剂	添加量μL(1T)	添加量μL(N+3)
			PCR反应混合液	10	10×(N+3)
MSI引物混合液	2	2×(N+3)
			无核酸酶水	7	7×(N+3)
总体积	19	19×(N+3)

按检测人份数配制检测体系PCR反应液XμL，每人份19μL分装：X＝19μL反应液Mix×(N份标本+1份阳性质控+1份阴性质控+1)；

(3)加样：向检测体系PCR反应液中加入1μL DNA；阳性质控和阴性质控直接加1μL阳性质控品和阴性质控品。

(4)多重PCR扩增：扩增程序为95℃3分钟；95℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃30秒；60℃30分钟；4℃∞。

(5)毛细管电泳

样品准备：将分子内标GeneScan^TM 500LIZ标准品和甲酰胺进样溶剂以1:35比例混匀得到混合液，取9μL如上混合液分装到八连管，再加入1μLPCR产物，涡旋振荡后离心，将离心后的混合液放置到金属浴95℃静置5min，然后冰浴放置2min。取出基因分析仪的96孔板，将10μL的混合液依次转移到96孔板中，准备检测。

打开基因分析仪，按仪器说明书操作。检测完毕后，分析数据。

(6)结果分析：

分子内标GeneScan^TM 500LIZ片段大小标注准确，依次为35nt、50nt、75nt、100nt、139nt、150nt、160nt、200nt、250nt、300nt、340nt、350nt、400nt、450nt、490nt和500nt。

检测峰高没有出现超阈值现象，否则应稀释PCR产物进行毛细管电泳检测。

阴性质控品无产物扩增，阳性质控品的6个单核苷酸重复位点和2个质控位点均有产物扩增，且片段大小在合理范围内。

同一个体肿瘤组织与对照组织的两个五核苷酸标志物Penta C与Penta D扩增片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，比较肿瘤组织6个单核苷酸标志物BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27和CAT-25片段大小改变情况，产物片段变化超过2nt即判定该基因不稳定，反之稳定。根据同一组织肿瘤样本和对照样本不稳定单核苷酸重复位点的个数，确定该样本微卫星状态。微卫星不稳定判断标准件见表4。

表4微卫星不稳定判断标准

实施例3：CAT-25引物对的结果对比

在实验过程中发明人摸索了CAT-25位点多组引物组合对实验结果的影响。首先，用四对引物(如表5所示)分别对实施例2提取自肿瘤组织的样本进行单独PCR扩增，各对引物扩增产物电泳结果显示都有单一明亮的条带，如图1所示，泳道1～4分别对应引物对1～引物对4的电泳结果，证明该四对引物的特异性均非常好。

下一步，将这四对引物分别与实施例1中其他7个位点引物混合，并采用实施例2的方法对来自肿瘤组织和癌旁组织的提取样本进行扩增。以下为采用四组引物组合以实施例1、实施例2方法进行实验所得结果(表5)。实验证明，引物组合决定了方法的可行性。

表5摸索过程采用的4对引物组合及其产生峰型、判读结果比较

结果显示，该例肿瘤患者使用商品化试剂盒检测判读为CAT-25位点不稳定，使用上述四对引物，分别进行本发明所述发法进行检测。发现只有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示引物(即上列表中引物对1)可以准确判读该例患者CAT-25位点不稳定，其余三对引物(即上列表中引物对2～4)均无法准确判读。尽管通过软件设计出了诸多针对CAT-25位点的引物(不限于上述示例性的引物)，然而，采用本发法检测的结果显示，其中一大部分的引物无法准确判读，而SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2则突出地得到了准确的结果。

实施例4：采用本发明试剂盒检测临床样本

采用本发明试剂盒和检测方法检测结直肠癌患者微卫星不稳定状态，方法如下：

取一例样本结直肠癌与癌旁FFPE组织，按实施例2所述方法提取基因组DNA、配制试剂并检测。

每份样本加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性质控，阴性质控各一份。一台PCR仪同时扩增这两份样本，一份阳性质控，一份阴性质控。扩增结束后产物在同一台基因分析仪上做毛细管电泳分析。

结果分析：

毛细管电泳图中，图2为结直肠癌患者肿瘤组织毛细管电泳图谱，图3为癌旁组织毛细管电泳图谱，横坐标代表扩增产物片段大小，纵坐标代表扩增产物量(荧光强度)。阴性质控品无产物扩增出，阳性质控品的6个单核苷酸位点和2个质控位点均有产物扩增出，且片段大小在合理的范围内。肿瘤组织与正常组织的两个五核苷酸标志物Penta C与Penta D片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，肿瘤组织5个单核苷酸标志物均发生≥3bp片段大小改变，样本的微卫星不稳定性状态为微卫星高度不稳定(MSI-H)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.用于人微卫星不稳定MSI检测的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括第一引物对，和，第二引物对至第六引物对中至少一种；

所述第一引物对用于检测单核酸位点CAT-25，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

所述第二引物对用于检测单核酸位点BAT-25，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

所述第三引物对用于检测单核酸位点BAT-26，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

所述第四引物对用于检测单核酸位点NR-21，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

所述第五引物对用于检测单核酸位点NR-24，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

所述第六引物对用于检测单核酸位点NR-27，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，每组引物对中至少一条引物的5’端含有荧光标记；

优选地，每组引物对的正向引物的5’端含有荧光标记。

3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，所述荧光标记选自FAM、ROX或JOE。

4.人微卫星不稳定MSI的PCR扩增试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1～3任一项所述的引物组合物，和PCR反应体系；

优选地，所述PCR反应体系包括DNA聚合酶、PCR buffer、MgCl₂和dNTP。

5.人微卫星不稳定MSI的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的PCR扩增试剂和质控品，

所述质控品包括阴性质控品、阳性质控品和质控位点检测引物对；

优选地，所述阴性质控品包括无核酸酶水；

优选地，所述阳性质控品包括细胞系HT-29基因组DNA；

优选地，所述质控位点包括至少一个五核苷酸重复位点；

优选地，所述五核苷酸重复位点包括Penta C或Penta D；

优选地，Penta C的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；

优选地，Penta D的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。

6.非诊断目的的MSI稳定性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括使用权利要求4所述PCR扩增试剂或权利要求5所述PCR扩增试剂盒分别对待测样本和对照样本进行PCR扩增，而后依据两种样本扩增产物中单核苷酸位点片段长度变化输出MSI稳定性检测结果；

优选地，所述PCR扩增试剂或PCR扩增试剂盒中含有第一引物对至第六引物对共计六组单核酸位点检测引物对；

优选地，所述PCR扩增试剂盒中含有Penta C的检测引物对和Penta D的检测引物对；

优选地，所述扩增的程序为95℃3分钟；95℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃30秒；60℃30分钟；4℃∞。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，两种样本扩增产物中每种单核苷酸位点片段长度变化差异大于2nt时，输出待测样本中该单核苷酸位点不稳定标识。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，待测样本中不稳定标识数量大于等于2时，输出该待测样本的MSI高度不稳定标识。

9.根据权利要求6～8任一项所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本包括疑似病灶组织、疑似病灶细胞、疑似病变外周血、施药后病灶组织、施药后病灶细胞或施药后病变外周血的核酸提取物；

所述对照样本包括癌旁组织、健康细胞或健康外周血的核酸提取物。

10.权利要求6～9任一项所述检测方法的如下(a)～(d)中任一项的应用：

(a)诊断结直肠癌试剂的开发；

(b)诊断结直肠癌试剂的效果评价；

(c)治疗结直肠癌药物的开发；

(d)治疗结直肠癌药物的药效评价。

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