CN115927623A - 检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115927623A CN115927623A CN202211161022.7A CN202211161022A CN115927623A CN 115927623 A CN115927623 A CN 115927623A CN 202211161022 A CN202211161022 A CN 202211161022A CN 115927623 A CN115927623 A CN 115927623A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- consecutive
- starting
- sequences
- homopolymer repeats
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，包括ACVR2A基因的Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列；还包括选自来源于DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、CENPQ、MRE11、PSIP1基因的生物标记物中的至少两种。本发明筛选到多个与结直肠癌和胃癌相关的生物标记物的组合，其中特别是8位点组合在结直肠癌和胃癌中均有较高的检出率，检测一致性高达97％。本发明构建了检测效果良好的结直肠癌和胃癌的试剂盒，可用于临床上的结直肠癌和胃癌无创检测，以及预后监控。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体是涉及检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用。
背景技术
微卫星(microsatellite，MS)是指细胞基因组中以少数几个核苷酸(一般为1～6个，多为单碱基或双碱基)为单位串联重复的DNA序列，又称短串联重复(short tandemrepeat，STR)。微卫星位点广泛存在于人类基因组中，约占基因组3％。
在正常状态下，微卫星的长度和排序保持不变，并且稳定遗传；DNA错配修复(mismatch repair，MMR)功能出现异常时，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，使得微卫星序列长度或碱基组成发生改变，称为微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)。MSI根据程度可以被分成3类：微卫星高度不稳定性(MSI-high，MSI-H)、微卫星低度不稳定性(MSI-low，MSI-L)、微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)。
MSI现象于1993年在结直肠癌中首次发现。随着研究深入，发现MSI现象不止存在于结直肠癌，在子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤中均有发生。MSI是错配修复功能缺陷导致的结果，用于结直肠癌预后评价和用药指导及结直肠癌中林奇综合征的辅助诊断。
免疫组织化学法(IHC)检测错配修复基因蛋白的表达，结果均为阳性即为错配修复功能完整(proficient mismatch repair，pMMR)，任一错配修复蛋白缺失即为错配修复功能缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)。IHC检测的优势是操作简便，检测平台普及性高，并可以直接鉴定出导致MSI-H发生的MMR缺陷基因。
存在的问题是IHC影响因素较为复杂，常因样本前处理不规范和结果判读主观依赖性高导致结果不准确。此外，罕见的情况下，MMR基因的错义突变可能导致MMR蛋白的氨基酸序列发生改变，酶促活性消失，但抗原性完整，表现为MMR功能缺陷但IHC染色仍呈现正常表达的“假阴性”结果。
毛细血管-多重荧光PCR技术可用于微卫星不稳定状态的DNA检测。本方法通过多重荧光PCR技术扩增同一患者的正常组织和肿瘤组织的微卫星等位基因，借助毛细管电泳仪分析扩增后的基因图谱，判断肿瘤组织的微卫星状态。该方法目前是检测MSI的方法学“金标准”。但也存在以下缺陷：
1.一代测序仪器价格昂贵，终端市场价格在150万左右，普及率低。仅因开展单一检测项目而采购其仪器，医院投入回报率低、建设可能性小；
2.操作十分繁琐，需要经历核酸提取、PCR、产物处理、测序分析等步骤，且对操作者能力要求高；
3.试剂成本高，在多重PCR试剂的基础上，需要配置额外的阳极/阴极缓冲液槽、高分子分离胶、甲酰胺溶剂等配套试剂；
4.仪器通量为96孔，样本通量高，不适合临床常规使用，实际使用中，为了控制成本和人力，凑样检测，导致报告周期长；
5.检测样本必须为同一患者来源的配对样本，即需要正常组织和肿瘤组织平行检测，报告结果需要人工比对正常组织和肿瘤组织检测峰图，结果判读难度较大。
NGS又称为第二代测序技术，是一种高通量测序技术，能一次性对几十万到几百万条基因分子进行序列测定。目前NGS方法已经成为检测MSI的新工具，其最大优势是可以实现多位点高通量检测。检测步骤需要对NGS Panel中的基因进行文库构建，使用二代测序仪对文库进行测序，最终利用生信算法分析各生物标志物的重复长度是否发生改变，进而判断MSI状态。NGS平台检测MSI正在不断成熟，但是由于NGS检测的成本高，检测周期长、不同检测试剂盒检测算法差异大等缺点，导致前景被限制。
胃肠(GI)道的癌症是常见的一类癌症，其中，特别是胃癌和结直肠癌更是非常常见。在世界范围内，每年有1400万人诊断出癌症，其中超过四分之一是胃肠道肿瘤(每年新病例超过400百万)；全世界每年有1820万人死于癌症，其中270万(33％)是死于胃肠道恶性肿瘤。胃肠道恶性肿瘤新发病例大于乳腺癌(160万)和肺癌(180万)的总和，且比其每年的死亡率多22％。胃肠道肿瘤包括至少10种不同疾病(取决于疾病的分类或分化)。而且，胃癌和结直肠癌，直到该疾病的自然史晚期仍然是相对无症状的。而这类癌症发现时通常处于晚期阶段并且预后不佳。因此，尽早检测或诊断是极其重要的。
分析人类结直肠癌和胃癌的微卫星不稳定的方法，以及找出合适的相关生物标记物，应用在对结直肠癌和胃癌的检测，以及监控和预后中，将会对结直肠癌和胃癌的无创检测具有巨大的应用前景。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合及其应用。
实现上述目的技术方案包括如下。
本发明的第一个方面，是提供一种检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合。
一种检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列；还包括选自以下生物标记物中的至少两种或至少三种：
针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列；
针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对PIM1基因的起始于Chr6:37143155，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对RPL22基因的起始于Chr1:6257784，包含8个连续T的同聚物重复的序列；
针对SULF2基因的起始于Chr20:46286320，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
针对KMT2C基因的起始于Chr7:151832596，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对SEC31A基因的并起始于Chr4:83785564，包含9个连续T的同聚物重复的序列。
在其中一些实施例中，所述组合包括包所述生物标记物中的至少三种或四种或五种或六种或七种或八种。
在其中一些实施例中，
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列的组合；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列和SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列。
在其中一些实施例中，
包括针对ACVR2A基因的所述生物标记物，以及选自针对PSIP1基因、SLC22A9基因、KMT2C基因、PIM1基因、ZNF2基因、DIDO1基因、LRIG2基因、RPL22基因、MRE11基因、TGFBR2基因、SEC31A基因、SULF2基因、CENPQ基因中所述生物标记物中的至少三种；优选地，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列。
在其中一些实施例中，包括针对ACVR2A基因的所述生物标记物，以及选自针对PSIP1基因、SLC22A9基因、KMT2C基因、PIM1基因、ZNF2基因、DIDO1基因、LRIG2基因、RPL22基因、MRE11基因、TGFBR2基因、SEC31A基因、SULF2基因、CENPQ基因中所述生物标记物中的至少四种；
优选地，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对KMT2C基因的起始于Chr7:151832596，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对PIM1基因的起始于Chr6:37143155，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列。
在其中一些实施例中，所述生物标记物组合是包括针对ACVR2A基因、CENPQ基因、和DIDO1基因的所述标记物，还包括选自针对SLC22A9基因、TGFBR2基因、LRIG2基因的所述生物标记物中的至少一种或至少两种；
或所述生物标记物组合是包括ACVR2A基因、CENPQ基因、和SLC22A9基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、PSIP1、TGFBR2、DIDO1基因、TGFBR2基因的所述标记物中的至少一种或至少两种；
或所述生物标记物组合是包括ACVR2A基因、TGFBR2、和SLC22A9基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、PSIP1、LRIG2、DIDO1基因的所述标记物中的至少一种或至少两种；
或所述生物标记物组合是包括CENPQ基因、和DIDO1基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、PSIP1、TGFBR2、LRIG2基因的所述标记物中的至少两种。
在其中一些实施例中，所述生物标记物组合是包括ACVR2A基因、CENPQ基因、DIDO1基因、和SLC22A9基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、TGFBR2、MRE11基因、LRIG2基因的所述标记物中的至少两种。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列，以及选自以下中的至少一种：针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列，针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列，针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列中的至少一种。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、和针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、和针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、和针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列的组合。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列，以及还包括选自针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列中的至少一种。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、和针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列的组合。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、和针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列的组合。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、和针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列的组合。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列，和针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列，以及还包括针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列中的至少一种。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列，和针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列，以及还包括针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列。
在其中一些优选的实施例中，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列，和针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列，还包括选自以下生物标记物中的至少一种：
KMT2C基因的起始于Chr7:151832596，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
PIM1基因的起始于Chr6:37143155，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
ZNF2基因起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的；
MARCKS基因的起始于Chr6:114181209，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
RPL22基因的起始于Chr1:6257784，包含8个连续T的同聚物重复的序列；
MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
STAT4基因的起始于Chr2:192011485，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
SEC31A基因的并起始于Chr4:83785564，包含9个连续T的同聚物重复的序列；
SULF2基因的起始于Chr20:46286320，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
TMC7基因的起始于Chr16:19073947，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
DDX27基因的起始于Chr20:47858503，包含8个连续A的同聚物重复的序列；
RYR3基因的起始于Chr15:34157541，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
TM6SF1基因的起始于Chr15:83805209，包含12个连续T的同聚物重复的序列；
SMAP1基因的起始于Chr6:71508369，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
SEC61G基因的起始于Chr7:54819993，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
KDM6A基因的起始于Chr1:159166612，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
CADM3基因的起始于Chr1:159166612，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
AIM2基因的起始于Chr1:159032486，包含10个连续T的同聚物重复的序列；
BTBD7基因的起始于Chr14:93708030，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
KIF14基因的起始于Chr1:200594041，包含8个连续T的同聚物重复的序列；
AVIL基因的起始于Chr12:58202496，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
CNR1基因的起始于Chr6:88853530，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
UPF3A基因的起始于Chr13:115057210，包含9个连续A的同聚物重复的序列。
本发明的第二个方面，还提供了检测上述生物标记物组合的试剂在制备检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒中的应用。
本发明的第三个方面，还提供了一种检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒。
一种检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，包括对上述生物标记物的组合的检测试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂盒采用焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合所使用的试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂盒采用荧光PCR熔解曲线法。
进一步地，所述试剂盒中针对各生物标记物的引物和探针选自如下：
针对ACVR2A基因的如SEQ IN NO.31所示的过量引物和SEQ IN NO.32所示的限制引物，如SEQ IN NO.93所示的分子信标探针；
针对PSIP1基因的SEQ IN NO.33所示的限制引物和SEQ IN NO.34所示的过量引物，如SEQ IN NO.94所示的分子信标探针；
针对SLC22A9基因的如SEQ IN NO.35和SEQ IN NO.36所示的过量引物和限制引物，如SEQ IN NO.95所示的分子信标探针；
针对ZNF2基因的如SEQ IN NO.41所示的限制引物和SEQ IN NO.42所示的过量引物，如SEQ IN NO.98所示的分子信标探针；
针对DIDO1基因的如SEQ IN NO.43所示的限制引物和SEQ IN NO.44所示的过量引物，如SEQ IN NO.99所示的分子信标探针；
针对LRIG2基因的如SEQ IN NO.45和SEQ IN NO.46所示的过量引物和限制引物，如SEQ IN NO.100所示的分子信标探针；
针对MRE11基因的如SEQ IN NO51和SEQ IN NO.52所示的过量引物和限制引物，如SEQ IN NO.103所示的分子信标探针；
针对TGFBR2基因的如SEQ IN NO.55和SEQ IN NO.56所示的限制引物和过量引物，如SEQ IN NO.105所示的分子信标探针；
针对CENPQ基因的如SEQ IN NO57和SEQ IN NO.58所示的过量引物和限制引物，如SEQ IN NO.106所示的分子信标探针。
在其中一些实施例中，所述分子信标探针的3’末端起的1至4个碱基具有硫代修饰。优选为所述分子信标探针的3’末端的2个碱基具有硫代修饰
在其中一些实施例中，所述每种限制引物和过量引物的在PCR反应体系中的分别为：0.05-0.2uM和0.6-1.0uM；和/或在PCR反应体系中分子信标探针的用量为0.15-0.25uM。
在其中一些实施例中，PCR反应体系中pH为8.7-8.9。
在其中一些实施例中，PCR反应体系中KCl的浓度为50±1mM，(NH4)2SO4的浓度为10±1mM，MgSO4的浓度为3±0.1mM，BSA的浓度为100±5ng/ul。
在其中一些实施例中，在PCR反应体系中分子信标探针的用量为0.1-0.2uM。
在其中一些实施例中，还包括有高保真DNA酶和Taq DNA聚合酶。进一步地，所述高保真DNA酶和Taq DNA聚合酶的比例为1:1～1:50，优选为1：5～1:30，进一步优选为1:20-1:40，更优选为：所述高保真DNA酶和Taq DNA聚合酶的比例为1:5或1:30。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选到多个微卫星不稳定性且与结直肠癌和胃癌相关的生物标记物的组合，可用于结直肠癌和胃癌的检测，其中特别是8位点组合(ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、MRE11、CENPQ、PSIP1)在结直肠癌和胃癌中均有较高的检出率，检测一致性高达97％。
2、本发明根据筛选到的生物标记物的组合，构建检测效果良好的结直肠癌和胃癌的试剂盒，可用于临床上的结直肠癌和胃癌无创检测，以及预后监控。
3.本试剂盒所用的探针为分子信标探针，所设计的发卡结构，利用环链自身的结合效率以及茎环二级结构的空间平衡，具有优异的特异性。
4.本发明所构建的Buffer成分，其pH控制在8.7-8.9，特异性更优，更能满足本试剂盒对特异性的需求。
5.本发明所构建的试剂盒和检测方法，其扩增体系中使用Taq酶和高保真聚合酶的混合，两种用量比例控制在1:20-1:40时即可满足37℃7天的加速稳定性实验要求。
附图说明
图1是现有扩增体系中ACVR2A、SEC61G、CENPQ和PIM1基因检测结果。
图2是扩增体系中的参数对检测结果影响的示意图。
图3是优化扩增体系后各生物标记物检测结果。
图4是实施例8中对试剂盒进行性能评估结果。
图5是实施例8中对试剂盒热稳定性进行评估，将试剂盒放入37℃加速恒温箱中，分辨放置3天和7天进行测试结果。
图6是实施例8中高保真酶和Taq酶的用量优化检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：NGS单点筛选
根据数据库NCBI、Ensemble、UCSC、TCGA等人类基因组数据库作为参考序列，对MS标志物进行分析，同步对MS标志物的初步筛选，共筛选出840个MS位点。然后对840个MS标志物进行NGS的二次筛选，主要方案如下：收集国内不同区域的结直肠癌组织样本(同步收集癌组织和癌旁组织)，并使用IHC方法学检测样本，确定样本的MSI状态。对所有结直肠癌的样本进行文库构建和NGS测序，并通过比较癌组织和癌旁组织的NGS生信数据及人类基因数据库提供的参考序列，确定MS标志物的重复长度的变化，而进一步通过比较MSS状态和MSI-H状态的NGS生信数据，对NGS检测位点数据进行ROC分析，筛选出AUC较高的位点。AUC的取值范围在0.5和1之间。AUC越接近1.0，检测方法真实性越高，所以选择AUC≥0.9的位点，选择出的标志物见表1：
实施例2：单位点-PCR体系位点检测体系确定
本实施例使用荧光PCR熔解曲线法对实施例1中获得的MS位点进行检测，熔解曲线检测时使用荧光探针进行分析。各标志物可参见下表中的序列：
根据需要检测的30个位点，对上述MS位点分别设置检测参考品，用于后续体系的性能评估。选择含10％肿瘤DNA的参考品作为检测限参考品，选择含40％肿瘤DNA的参考品作为阳性参考品，选择20ng全部含正常组织DNA的参考品作为阴性参考品。
针对上述NGS筛选出的MS位点的序列设计上下游引物。设计引物的Tm在58℃-61℃，且在3’端无发卡或者二聚体等次级结构，扩增子的长度在60-120bp。此次扩增的主要方式采用不对称扩增，其中一条引物为“限制性引物”，用量较少；另外一条引物为“过量引物”，用量较大。采用不对称PCR进行扩增目的是扩增出荧光探针杂交的单链模板，便于后续的熔解曲线分析。MS标志物引物设计序列如下：
针对实施例1中的NGS筛查出的MS标志物设计检测探针，探针针对突变型模板设计。综合探针的结合的特异性性和探针的结合效率，探针的Tm值控制在40℃-70℃之间。另探针为避免被3’-5’端的校正活性降解，可在3’端使用硫代保护，硫代碱基的修饰数量为1-4个。所述探针可为分子信标探针或者Taqman探针，且需要对探针进行报告基团和淬灭基团的修饰，报告基团修饰包括FAM、VIC、ROX、Cy5、RED、Cy3等，淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和Dabcyl等修饰。MS标志物探针设计序列如下(“*”为硫代修饰)：
使用上述设计的引物和探针组合进行检测单体系构建，并使用设置的检测参考品进行性能评估。首先使用引物和探针以及PrimeSTAR GXL DNA Polymerase进行体系构建，配置成PCR反应液。过量引物的用量为0.8uM，限制引物的用量为0.1uM，探针的用量为0.2uM，而酶的用量为0.5U。加入检测参考品进行上机检测。检测过程主要使用荧光定量PCR仪器，根据引物的Tm值设置退火温度，并设置扩增循环数为60个循环，设定熔解曲线的收集温度范围为40-70℃。检测过程是先进行PCR对单链Oligo富集，然后在升温过程检测单链Oligo模板与探针结合的荧光变化，并对荧光的变化求导，即得到熔解曲线峰图进行判读。上机程序为下表：
检测结果判读标准：阴性参考品的峰图为单峰，且Tm值偏小，说明体系特异性佳；阳性参考品的峰图为双峰，有两处Tm值，说明体系的准确性佳；检测限参考品的峰图为双峰，有两处Tm值，说明体系的灵敏度佳。如果上述的三个检测参考品的检测结果均相符合，则说明该PCR单体系的性能优。根据对30个位点单体系构建，并使用3种不同的参考品进行检测。根据检测结果表明，有部分体系检测阴性参考品具有非特异性扩增，而部分体系没有非特异性扩增，参见图1。对所有靶标的序列进行进一步分析，发现有非特的靶标的同聚物长度在10bp和9bp，而没有非特的靶标的同聚物的长度在8bp和7bp。说明在现有的扩增条件下进行扩增，针对不同长度的同聚物不能进行完全的高保真扩增，即需要对现有的体系条件进行优化，以达到所有靶标均能实现特异性扩增。
从上述结果，选择同聚物的长度为10bp的PIM1的单体系进行非特异性方面的优化。而众所周知，影响体系非特异性扩增的因素很多，例如Buffer中离子的组成、pH、程序、引物探针的设计等，任何因素的变化均能对体系的特异性造成较大的影响。针对特异性不佳的情况，重新调整Buffer的离子组成、pH、引物探针设计、程序等方面因素，根据大量试验发现，Buffer的组成和pH对体系的特异性影响最大，而出乎意料的发现当Buffer的pH在8.7-8.9时，对体系的特异性影响最大。重要成分的研究数据，参见图2。
综合所有的离子浓度的测试，Buffer-N的配方见下表：
使用新优化的Buffer-N的配方，进行体系配置，并进行阴性参考品、特异性参考品和阳性参考品进行检测，检测结果见图3。
从图3可以看出，所有单体系的检测结果均达标。
实施例3：PCR位点筛选
按照实施例2中建立的性能优良MS位点的PCR单体系进行样本的测试。选择华中地区湖北某肿瘤医院15例、华南地区广东某人民医院15例和华北地区吉林某肿瘤医院20例的结直肠癌样本，MSI-H和MSI-L/MSS的样本比例约为2:1。对此50例样本结果进行阳性率和特异性统计，样本的选择灵敏度≥80％且特异性为100％的位点进行下一步组合测试，检测结果见下表：
| 序号 | 基因 | 一致性 | 灵敏度 | 特异性 |
| 1 | ACVR2A | 94.0％ | 91.4％ | 100％ |
| 2 | PSIP1 | 88.0％ | 82.9％ | 100％ |
| 3 | SLC22A9 | 86.0％ | 80.0％ | 100％ |
| 4 | KMT2C | 84.0％ | 77.1％ | 100％ |
| 5 | PIM1 | 80.0％ | 71.4％ | 100％ |
| 6 | ZNF2 | 84.0％ | 77.1％ | 100％ |
| 7 | DIDO1 | 88.0％ | 82.9％ | 100％ |
| 8 | LRIG2 | 86.0％ | 80.0％ | 100％ |
| 9 | MARCKS | 84.0％ | 77.1％ | 93.3％ |
| 10 | RPL22 | 80.0％ | 71.4％ | 100％ |
| 11 | MRE11 | 90.0％ | 85.7％ | 100％ |
| 12 | STAT4 | 84.0％ | 77.1％ | 93.3％ |
| 13 | TGFBR2 | 84.0％ | 77.1％ | 100％ |
| 14 | CENPQ | 88.0％ | 82.9％ | 100％ |
| 15 | SEC31A | 80.0％ | 71.4％ | 100％ |
| 16 | SULF2 | 84.0％ | 77.1％ | 100％ |
| 17 | TMC7 | 76.0％ | 65.7％ | 100％ |
| 18 | DDX27 | 72.0％ | 60.0％ | 100％ |
| 19 | RYR3 | 74.0％ | 62.9％ | 100％ |
| 20 | TM6SF1 | 76.0％ | 65.7％ | 93.3％ |
| 21 | SMAP1 | 78.0％ | 68.6％ | 100％ |
| 22 | SEC61G | 76.0％ | 65.7％ | 93.3％ |
| 23 | KDM6A | 72.0％ | 60.0％ | 100％ |
| 24 | CADM3 | 78.0％ | 68.6％ | 100％ |
| 25 | AIM2 | 78.0％ | 68.6％ | 100％ |
| 26 | BTBD7 | 74.0％ | 62.9％ | 100％ |
| 27 | KIF14 | 72.0％ | 60.0％ | 100％ |
| 28 | AVIL | 68.0％ | 54.3％ | 100％ |
| 29 | CNR1 | 72.0％ | 60.0％ | 100％ |
| 30 | UPF3A | 68.0％ | 54.3％ | 100％ |
综上，满足灵敏度≥80％且特异性为100％的位点总共为以下14个位点：ACVR2A、PSIP1、SLC22A9、KMT2C、PIM1、ZNF2、DIDO1、LRIG2、RPL22、MRE11、TGFBR2、SEC31A、SULF2、CENPQ选择此14位点进行下一步测试。
实施例4：训练集测试
通过实施例3中的结果表明，如果针对单点进行试剂盒组成时，那么试剂盒的检测覆盖度会比较低。而且根据业内共识，不同组合MSI检测试剂盒的判读标准一致，检测结果为≥2个MS标志物突变，判为MSI-H；否则判为MSS或MSI-L。所以只能考虑不同MS标志物的组合，组合MSI检测试剂盒。而不同MS标志物组成试剂盒时，在保证灵敏度和特异性的同时，需要确保靶标组合数量的合适。过多靶标组合，会造成检测试剂盒的成本增加，检测样本的浪费；而过少靶标组合，可能会造成靶标的漏检。
所以我们通过实施例3筛选的14个靶标进行随机组合，组合成不同数量的靶标，针对的250例结直肠癌样本进行靶标组合效果的统计分析，并进行一致性评估。选择华中地区湖北某肿瘤医院80例、华南地区广东某人民医院80例和华北地区吉林某肿瘤医院90例的结直肠癌样本，MSI-H和MSI-L/MSS的样本比例约为2:1。选择IHC结果作为对照方法学，使用R语言进行组合效果计算。
从14个MS标志物中随机挑选2个进行组合，共91种组合，而最佳的组合共1组，结果见下表：
| 序号 | 组合 | 一致性 | 灵敏度 | 特异性 |
| 1 | ACVR2A、DIDO1 | 87.4％ | 82.6％ | 100％ |
从14个MS标志物中随机挑选3个进行组合，共364种组合，而最佳的组合共2组，结果见下表：
从14个MS标志物中随机挑选4个进行组合，共1001种组合，而最佳的组合共5组，结果见下表：
从14个MS标志物中随机挑选5个进行组合，共2002种组合，而最佳组合共113组，下表共列出其中6种组合：
根据上述结果表明，在结直肠中，4个MS标志物组合的一致性已经到达最大值，最大值为97.6％。继续增加组合MS标志物的数量，并不能提升该组合检测的一致性的最大值。
4个MS标志物的组合涉及的靶点分别是以下6个位点：ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、MRE11。
实施例5：胃癌样本测试
增加100例胃癌样本进行扩大样本类型测试，选择华中地区湖北某肿瘤医院40例、华南地区广东某人民医院30例和华北地区吉林某肿瘤医院30例的样本，MSI-H和MSI-L/MSS的样本比例约为2:1。进一步评估实施例3中性能较佳的14个MS标志物测试。选择IHC结果作为对照方法学，使用R语言进行组合效果计算。
从14个MS标志物中随机挑选2个进行组合，共91种组合，而最佳的组合共1组，结果见下表：
| 序号 | 组合 | 一致性 | 灵敏度 | 特异性 |
| 1 | DIDO1、TGFBR2 | 84.0％ | 75.0％ | 100％ |
从14个MS标志物中随机挑选3个进行组合，共364种组合，而最佳的组合共1组，结果见下表：
| 序号 | 组合 | 一致性 | 灵敏度 | 特异性 |
| 1 | LRIG2、TGFBR2、ZNF2 | 92.0％ | 87.5％ | 100％ |
从14个MS标志物中随机挑选4个进行组合，共1001种组合，而最佳的组合共10组，结果见下表：
| 序号 | 组合 | 一致性 | 灵敏度 | 特异性 |
| 1 | ACVR2A、CENPQ、DIDO1、SLC22A9 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 2 | ACVR2A、CENPQ、DIDO1、TGFBR2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 3 | ACVR2A、CENPQ、TGFBR2、ZNF2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 4 | ACVR2A、DIDO1、SLC22A9、TGFBR2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 5 | ACVR2A、LRIG2、TGFBR2、ZNF2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 6 | CENPQ、DIDO1、LRIG2、ZNF2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 7 | CENPQ、DIDO1、PSIP1、TGFBR2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 8 | CENPQ、DIDO1、TGFBR2、ZNF2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 9 | DIDO1、LRIG2、TGFBR2、ZNF2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
| 10 | LRIG2、PSIP1、TGFBR2、ZNF2 | 94.0％ | 90.6％ | 100％ |
从14个MS标志物中随机挑选5个进行组合，共2002种组合，而最佳的组合共5组，结果见下表：
从14个MS标志物中随机挑选6个进行组合，共3003种组合，而最佳的组合共60组，其中4组最优的结果见下表：
根据上述结果表明，在胃癌中，5个MS标志物组合的一致性已经到达最大值95％。继续增加组合MS标志物的数量，并不能提升该组合检测的一致性的最大值。
5个MS标志物的组合涉及的靶点分别是以下8个位点：ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、ZNF2、CENPQ、PSIP1。
实施例6：组合测试
根据实施例4和实施例5进行数据整合分析，发现在结直肠中，4个MS标志物即已经达到最大一致性，一致性最大值涉及的靶标是ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、MRE11，而在胃癌中，5个MS标志物的组合即已经达到最大一致性，一致性最大值涉及的靶标是ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、ZNF2、CENPQ、PSIP1。对上述最大一致性的MS标志物进行分析，结直肠癌和胃癌中总共有9个MS标志物，其中共有的标志物有5个，后续计划以此5点作为基础，逐步进行单位点的添加，计算组合的一致性。
限于篇幅，部分数据见下表：
试验结果表明：通过对数据统计分析，5个核心位点的一致性已经能达到最大值96.8％，并在次5个位点的基础上随意添加剩余4个MS标志物，总共16个组合，均能达到一致性最大。
实施例7：验证集测试
选择8基因组合(ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、CENPQ、MRE11、PSIP1)和5基因组合(ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2)进行样本验证测试，重新收集胃癌和结直肠癌的样本共75例进行验证测试，其中胃癌样本25例，结直肠癌样本50例，样本收集的分布为华中地区湖北某肿瘤医院25例、华南地区广东某人民医院25例和华北地区吉林某肿瘤医院25例，MSI-H和MSI-L/MSS的样本比例约为2:1。选用IHC结果作为对照。对实施例6中的最终确认的组合进行验证总符合率。
5基因组合(ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2)的验证数据：
一致性：96.0％；阳性符合率：93.9％；阴性符合率：100％。
8基因组合(ACVR2A、DIDO1、LRIG2、SLC22A9、TGFBR2、CENPQ、MRE11、PSIP1)的验证数据：
一致性：97.3％；阳性符合率：95.9％；阴性符合率：100％。
通过对75例胃癌和结直肠的检测结果表明，8基因的位点该组合的总符合率高，高达97.3％，说明该组合的检测结果优异，后续会以此组合作为试剂盒构建的基础。
实施例8：试剂盒构建
选择实施例7中的8位点作为最终检测MSI的试剂盒。为了减少检测样本量的投入，及综合多重反应体系之间的干扰，设计试剂盒的最终形式为3重4管联检产品，具体试剂盒中各管的组成见下表：
| FAM | VIC | Cy5 | |
| 1号管 | ACVR2A | CENPQ | 内参 |
| 2号管 | SLC22A9 | LRIG2 | 内参 |
| 3号管 | DIDO1 | MRE11 | 内参 |
| 4号管 | TGFBR2 | PSIP1 | 内参 |
而关于产品最终的内参的体现，有着以下的思考：因为目前市场上使用的IVD产品，内参均是扩增形式，其扩增信号的有/无可以用来判断是否加样，而扩增信号的前/后可以用来判断加样量的高低以及样本的质量。而如果本产品的内参采用熔解曲线形式，溶解峰的有/无可以用来判断是否加样，但是熔解峰的高低不能用来判断加样量的高低以及样本的质量，因为熔解峰是原始荧光信号进行二次求导的结果，无法起到直接的指示作用。所以综上：合管体系的内参选择体现扩增信号。
按照实施例2中的体系构建要求进行合管体系的构建。对试剂盒进行性能评估的结果，参见图4。
对试剂盒的热稳定性进行评估，将试剂盒放入37℃加速恒温箱中，分辨放置3天和7天进行测试，参见图5。
根据实验结果，试剂盒放入37℃3天后，性能方面即受到损害，说明现在体系的稳定性需要进行优化。而众所周知，影响酶的稳定性因素比较多，例如Buffer的离子组成、酶的结构、pH等等，任何因素的变化均可能对探针的稳定性造成较大的影响。
针对体系的热稳定性不佳的情况，重新调整Buffer的配方和pH值以及酶的组成等因素，根据大量试验发现，酶的组成对体系的热稳定性影响最大。因为Taq DNA聚合酶的稳定性较好，所以将Taq酶与高保真酶进行预混时，会提高试剂盒的稳定性，怀疑其基本原理是Taq酶和高保真酶的结构上存在某种能相互嵌合的结构域，导致二者的混合时能提升高保真酶的稳定性。我们对高保真酶和Taq酶的比例设置范围为1:1～1:50，观察结果并不是一个正太分布的趋势，而其在比例为1:5时达到峰值后又下降，而又在1:30达到最大值。其原理有可能是高保真酶和Taq酶之间存在不止一种嵌合体，有可能有2种，且2种嵌合体的稳定性不一样，在本发明检测系统中，1:30的比例组成的嵌合体的稳定性更高。具体测试结果，(使用1号合管进行评估)参见图6。
根据上述结果表明，酶配比在1:20-1:40时加速7天稳定性最优，而在1:30时最优。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (19)
1.一种检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列；还包括选自以下生物标记物中的至少两种或至少三种：
针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列；
针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对PIM1基因的起始于Chr6:37143155，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对RPL22基因的起始于Chr1:6257784，包含8个连续T的同聚物重复的序列；
针对SULF2基因的起始于Chr20:46286320，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
针对KMT2C基因的起始于Chr7:151832596，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
针对SEC31A基因的并起始于Chr4:83785564，包含9个连续T的同聚物重复的序列。
2.根据权利要求1所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列的组合；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列和SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列的组合。
3.根据权利要求1所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，包括针对ACVR2A基因的所述生物标记物，以及选自针对PSIP1基因、SLC22A9基因、KMT2C基因、PIM1基因、ZNF2基因、DIDO1基因、LRIG2基因、RPL22基因、MRE11基因、TGFBR2基因、SEC31A基因、SULF2基因、CENPQ基因中所述生物标记物中的至少三种；优选地，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列的组合；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列的组合；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列的组合；或
所述生物标记组合是包括针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列的组合。
4.根据权利要求1所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，包括针对ACVR2A基因的所述生物标记物，以及选自针对PSIP1基因、SLC22A9基因、KMT2C基因、PIM1基因、ZNF2基因、DIDO1基因、LRIG2基因、RPL22基因、MRE11基因、TGFBR2基因、SEC31A基因、SULF2基因、CENPQ基因中所述生物标记物中的至少四种；
优选地，所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对KMT2C基因的起始于Chr7:151832596，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列的组合；或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列的组合；
或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列的组合；
或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列的组合；
或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对PIM1基因的起始于Chr6:37143155，包含11个连续T的同聚物重复的序列、和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
或
所述生物标记组合是包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于CHR20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列的组合。
5.根据权利要求1所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，所述生物标记物组合包括针对ACVR2A基因、CENPQ基因、和DIDO1基因的所述标记物，还包括选自针对SLC22A9基因、TGFBR2基因、LRIG2基因的所述生物标记物中的至少一种或至少两种；
或所述生物标记物组合包括ACVR2A基因、CENPQ基因、和SLC22A9基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、PSIP1、TGFBR2、DIDO1基因、TGFBR2基因的所述标记物中的至少一种或至少两种；
或所述生物标记物组合包括ACVR2A基因、TGFBR2、和SLC22A9基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、PSIP1、LRIG2、DIDO1基因的所述标记物中的至少一种或至少两种；
或所述生物标记物组合是包括CENPQ基因、和DIDO1基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、PSIP1、TGFBR2、LRIG2基因的所述标记物中的至少两种。
6.根据权利要求1所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，
所述生物标记物组合包括ACVR2A基因、CENPQ基因、DIDO1基因、和SLC22A9基因的所述标记物，还包括选自针对ZNF2、TGFBR2、MRE11基因、LRIG2基因的所述标记物中的至少两种。
7.根据权利要求1所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列。
8.根据权利要求7所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列，以及选自以下中的至少一种：针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列，针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列，针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列中的至少一种。
9.根据权利要求8所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、和针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、和针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；或
所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列、针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列、和针对ZNF2基因的起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的序列。
10.根据权利要求8所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，
所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于CHR3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于CHR6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列，和针对MRE11基因的起始于CHR11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列，以及还包括针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列。
11.根据权利要求1所述检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合，其特征是，所述生物标记组合包括针对ACVR2A基因的起始于Chr2:148683685，包含8个连续A的同聚物重复的序列、针对DIDO1基因的起始于Chr20:61536691，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对LRIG2基因的起始于Chr1:113667282，包含11个连续T的同聚物重复的序列、针对SLC22A9基因的起始于Chr11:63149670，包含11个连续A的同聚物重复的序列、针对TGFBR2基因的起始于Chr3:30691871，包含10个连续A的同聚物重复的序列、针对CENPQ基因的起始于Chr6:49459994，包含10个连续T的同聚物重复的序列，和针对PSIP1基因的起始于Chr9:15472611，包含11个连续A的同聚物重复的序列，还包括选自以下生物标记物中的至少一种：
KMT2C基因的起始于Chr7:151832596，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
PIM1基因的起始于Chr6:37143155，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
ZNF2基因起始于Chr2:95848209，包含11个连续T的同聚物重复的；
MARCKS基因的起始于Chr6:114181209，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
RPL22基因的起始于Chr1:6257784，包含8个连续T的同聚物重复的序列；
MRE11基因的起始于Chr11:94212930，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
STAT4基因的起始于Chr2:192011485，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
SEC31A基因的并起始于Chr4:83785564，包含9个连续T的同聚物重复的序列；
SULF2基因的起始于Chr20:46286320，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
TMC7基因的起始于Chr16:19073947，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
DDX27基因的起始于Chr20:47858503，包含8个连续A的同聚物重复的序列；
RYR3基因的起始于Chr15:34157541，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
TM6SF1基因的起始于Chr15:83805209，包含12个连续T的同聚物重复的序列；
SMAP1基因的起始于Chr6:71508369，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
SEC61G基因的起始于Chr7:54819993，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
KDM6A基因的起始于Chr1:159166612，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
CADM3基因的起始于Chr1:159166612，包含11个连续T的同聚物重复的序列；
AIM2基因的起始于Chr1:159032486，包含10个连续T的同聚物重复的序列；
BTBD7基因的起始于Chr14:93708030，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
KIF14基因的起始于Chr1:200594041，包含8个连续T的同聚物重复的序列；
AVIL基因的起始于Chr12:58202496，包含10个连续A的同聚物重复的序列；
CNR1基因的起始于Chr6:88853530，包含11个连续A的同聚物重复的序列；
UPF3A基因的起始于Chr13:115057210，包含9个连续A的同聚物重复的序列。
12.检测权利要求1-11任一项所述生物标记物组合的试剂在制备检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒中的应用。
13.一种检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，其特征是，包括对权利要求1-11任一项所述生物标记物组合的检测试剂。
14.根据权利要求13所述的检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括采用焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、荧光PCR熔解曲线法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合所使用的试剂。
15.根据权利要求14所述的检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，其特征是，
所述试剂盒采用荧光PCR熔解曲线法，针对其中的生物标记物的引物和探针选自如下：
针对ACVR2A基因的如SEQ IN NO.31所示的过量引物和SEQ IN NO.32所示的限制引物，如SEQ IN NO.93所示的分子信标探针；
针对PSIP1基因的SEQ IN NO.33所示的限制引物和SEQ IN NO.34所示的过量引物，如SEQ IN NO.94所示的分子信标探针；
针对SLC22A9基因的如SEQ IN NO.35和SEQ IN NO.36所示的过量引物和限制引物，如SEQ IN NO.95所示的分子信标探针；
针对ZNF2基因的如SEQ IN NO.41所示的限制引物和SEQ IN NO.42所示的过量引物，如SEQ IN NO.98所示的分子信标探针；
针对DIDO1基因的如SEQ IN NO.43所示的限制引物和SEQ IN NO.44所示的过量引物，如SEQ IN NO.99所示的分子信标探针；
针对LRIG2基因的如SEQ IN NO.45和SEQ IN NO.46所示的过量引物和限制引物，如SEQIN NO.100所示的分子信标探针；
针对MRE11基因的如SEQ IN NO51和SEQ IN NO.52所示的过量引物和限制引物，如SEQIN NO.103所示的分子信标探针；
针对TGFBR2基因的如SEQ IN NO.55和SEQ IN NO.56所示的限制引物和过量引物，如SEQ IN NO.105所示的分子信标探针；
针对CENPQ基因的如SEQ IN NO57和SEQ IN NO.58所示的过量引物和限制引物，如SEQIN NO.106所示的分子信标探针。
16.根据权利要求15所述的检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，其特征是，
所述每种限制引物和过量引物的在PCR反应体系中的用量分别为：0.05-0.2uM和0.6-1.0uM；和/或在PCR反应体系中分子信标探针的用量为0.15-0.25uM。
17.根据权利要求13所述的检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，其特征是，PCR反应体系中pH为8.7-8.9；和/或PCR反应体系中KCl的浓度为50±1mM，(NH4)2SO4的浓度为10±1mM，MgSO4的浓度为3±0.1mM，BSA的浓度为100±5ng/ul。
18.根据权利要求15-17任一项所述的检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，其特征是，还包括有高保真DNA酶和Taq DNA聚合，所述高保真DNA酶和Taq DNA聚合酶的比例为1:1～1:50，优选为1:5～1:30，更优选为：所述高保真DNA酶和Taq DNA聚合酶的比例为1:5或1:30。
19.根据权利要求15-17任一项所述的检测结直肠癌和/或胃癌的试剂盒，其特征是，所述分子信标探针的3’末端起的1至4个碱基具有硫代修饰，优选为所述分子信标探针的3’末端的2个碱基具有硫代修饰。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211161022.7A CN115927623B (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211161022.7A CN115927623B (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115927623A true CN115927623A (zh) | 2023-04-07 |
| CN115927623B CN115927623B (zh) | 2023-08-29 |
Family
ID=86699493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211161022.7A Active CN115927623B (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115927623B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116640854A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-25 | 杭州布平医学检验实验室有限公司 | 分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111868262A (zh) * | 2018-01-23 | 2020-10-30 | 比奥卡尔齐斯股份有限公司 | 检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组和方法 |
-
2022
- 2022-09-22 CN CN202211161022.7A patent/CN115927623B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111868262A (zh) * | 2018-01-23 | 2020-10-30 | 比奥卡尔齐斯股份有限公司 | 检测癌症中微卫星不稳定性的生物标志物组和方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ISIDRO CORTES-CIRIANO: "A molecular portrait of microsatellite instability across multiple cancers", 《NATURE COMMUNICATIONS》, vol. 8, pages 15180, XP055598140, DOI: 10.1038/ncomms15180 * |
| TAE-MIN KIM: "Clonal origins and parallel evolution of regionally synchronous colorectal adenoma and carcinoma", 《ONCOTARGET》, vol. 6, no. 29, pages 27725 - 27735 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116640854A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-25 | 杭州布平医学检验实验室有限公司 | 分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物 |
| CN116640854B (zh) * | 2023-07-21 | 2023-11-07 | 杭州布平医学检验实验室有限公司 | 分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115927623B (zh) | 2023-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021128519A1 (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
| CN107447013B (zh) | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 | |
| CN115927623B (zh) | 检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用 | |
| CN108624697A (zh) | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 | |
| WO2022161272A1 (zh) | 检测人群微卫星不稳定性的生物标志物组及其应用 | |
| CN106498028B (zh) | Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒 | |
| CN115992245A (zh) | 用于人微卫星不稳定msi检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用 | |
| CN113846168B (zh) | 一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用 | |
| CN113564266B (zh) | Snp分型遗传标记组合、检测试剂盒及用途 | |
| CN116555423A (zh) | 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用 | |
| WO2017182656A1 (en) | Means and methods for anti-vegf therapy | |
| WO2020064006A2 (zh) | 乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群及诊断产品和应用 | |
| CN110904237A (zh) | 用于检测egfr基因突变的引物探针组合及试剂盒 | |
| CN110904203A (zh) | Egfr基因突变多重检测试剂盒 | |
| CN112522417A (zh) | 一种用于检测男性人类基因组dna的dna片段和引物对 | |
| US20220049313A1 (en) | Primer for detecting tumor microsatellite instability, use thereof and kit | |
| WO2022188776A1 (zh) | 可用于胃癌her2伴随诊断的基因甲基化标记物或其组合和应用 | |
| CN117701720B (zh) | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 | |
| CN112831558B (zh) | 克罗恩病易感基因的早筛方法及试剂盒 | |
| CN111378652B (zh) | 一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒 | |
| CN111172281B (zh) | 非小细胞肺癌多重基因突变检测试剂盒及方法 | |
| CN111020033A (zh) | 多重检测braf基因突变的试剂盒及方法 | |
| CN117625788A (zh) | 一种多重pcr结合分子标签测序文库的构建方法 | |
| Badalamenti et al. | Cell-free/circulating tumor DNA profiling: from next-generation sequencing-based to digital polymerase chain reaction-based methods | |
| CN116694763A (zh) | 一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |