CN111378652B - 一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了定量PCR扩增人Actin基因的引物对、探针及包含所述引物对和探针的试剂盒。本发明的引物对、探针和包含所述引物对和/或探针的试剂盒在定量PCR检测Actin基因中的重复性好，灵敏度高，特异性好，能够区分基因组中的Actin基因和其假基因，而且对人源Actin基因具有检测的通用性，为检测其他功能性基因的相对定量或绝对定量提供可靠地基础。

Description

一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体地，涉及一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒。
背景技术
荧光定量PCR(real-time PCR)因其对核酸分子定量准确、特异性高、灵敏度高和重复性好的特点，已成为定量分析基因表达水平最广泛使用的的技术之一。该技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。或者使用荧光染料SYBR，SYBR可以结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新合成的双链上面，随着PCR的进行，结合的SYBR染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。
荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量两种分析方法。绝对定量是用标准曲线来检测未知样本的精确拷贝数；相对定量是检测未知样本间基因表达的差异。相对定量要求不同组织和细胞样本中起始模板数量、基因片段的完整性和提取效率、酶的有效性和PCR扩增效率、转录活性等参数都相同，分析结果才真实可靠。
但实际上这些参数不可能完全相同，为了减少这种参数差异的影响，通常会选择看家基因作为内参基因与目的基因同时检测，对目的基因的检测结果进行校正和标准化，从而真实反映目的基因的表达量。因此选择合适的看家基因成为实验结果准确的关键。
β-actin基因编码的β-肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。存在于所有真核细胞中，在真核细胞进化过程中高度保守，其mRNA表达数量高且稳定。β-actin被广泛用作相对定量分析中的内参基因，已经在人和多种动物中建立了检测β-actin的real-time PCR方法。
假基因是哺乳动物基因在进化过程中形成的特有产物，由相应功能基因(fuctional gene)转录本的cDNA拷贝插入细胞基因组后形成，没有编码多肽的功能，被称为“假基因”。在许多哺乳动物的不同基因家族中都发现存在相应的假基因，细胞色素C基因家族、小鼠的α-管状蛋白、人的β-actin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等，其中β-actin至少存在20种以上的假基因。由于假基因与相应的具有编码功能的功能基因的转录本间具有高度同源性且片段大小相同，因而易被误认为是扩增到的目的基因的cDNA段，而造成real-time PCR法诊断时出现假阳性结果从而影响方法的可靠性。
在基因组中除了actin基因外，还有一些假基因与actin的序列同一性较高。因此，目前亟需针对于人源Actin基因特异性检测的实时荧光定量PCR引物探针及检测方法。
发明内容
本发明PCR扩增actin与通常的定量PCR扩增cDNA用actin的cDNA作为内参不同，扩增的是基因组DNA的actin。本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了检测基因组DNA中的Actin基因的引物对和探针。在此基础上，本发明人得到了荧光定量PCR测定Actin基因的检测方法和试剂盒。本发明的方法或试剂盒能够特异性检测人源内参Actin基因。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及实时荧光定量PCR检测人源Actin基因的引物对，其选自如下的4个引物对中的任意一个、两个、三个或四个：
引物对1，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；
引物对2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；
引物对3，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；和
引物对4，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对；
本发明的另一个方面涉及一种荧光定量PCR检测人源Actin基因的探针，其选自如下的3个探针中的一个、两个或者三个：
探针A：其核酸序列如SEQ IN NO：9所示；
探针B：其核酸序列如SEQ IN NO：10所示；和
探针C：其核酸序列如SEQ IN NO：11所示；
在本发明的一个或多个实施方案中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，优选地，所述荧光报告基团选自FAM、Hex、TET、VIC、ROX、TAMRA和Cy5中的任意一个，更优选地所述探针5’端标记荧光集团Hex；
在本发明的一个或多个实施方案中，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和MGB；更优选地，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
FAM的结构式以及连接方式如下面的式I所示。
BHQ1的结构式以及连接方式如下面的式II所示。
Hex的结构式以及连接方式如下面的式III所示。
TRAMA的结构式以及连接方式如下面的式IV所示。
MGB的结构式以及连接方式如下面的式V所示。
本发明的另一个方面涉及一种荧光定量PCR检测人源Actin基因的引物对和探针的组合；所述的引物对为选自前述引物对1、引物对2、引物对3和引物对4中的任意一个；所述的探针为选自前述探针A、探针B和探针C中的任意一个。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对1，所述的探针为前述探针A。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对2，所述的探针为前述探针A。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对3，所述的探针为前述探针A。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对4，所述的探针为前述探针C。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的引物对为前述引物对4，所述的探针为前述探针B。
本发明提供的用于人源Actin基因荧光定量PCR检测的引物对和探针组合，特异性强，重复性好，灵敏度高；且对含有人源Actin基因的样本检测具有通用性。
本发明的另一方面还提供了人源Actin基因的荧光定量PCR的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)制备Actin基因标准品，制作标准曲线；
(3)以前述的引物对1、引物对2、引物对3和引物对4中的任一引物对作为引物并以探针A、探针B和探针C中的任一探针作为探针进行组合，对待检测样本和标准品进行实时荧光定量PCR检测；
(4)进一步地，所述样品的荧光定量PCR检测结果与Actin标准品的拷贝数与Ct值的标准曲线进行对比得知；
优选地，步骤(1)所述的待测样品为人外周血样本；
进一步的，步骤(2)所述Actin基因标准品通过以下方法制备：
(a)提取人外周血细胞基因组；
(b)经在Genbank网站查找已公布的人源Actin基因序列(NG_007992.1)，设计得到特异性好灵敏度高的常规扩增Actin全长序列的引物对8，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对；扩增的目的片段为1023bp。
(c)以前述的引物对5对人外周血细胞基因组模板进行扩增，扩增后对目标片段回收；
(d)回收目标片段，连接到载体质粒上，然后进行质粒扩增，提取质粒，酶切进行质粒线性化，得到的线性化质粒即为标准品。
优选地，步骤(3)所述的人外周血细胞提取的基因组DNA与所述标准品以相同的反应体系和程序进行荧光定量PCR检测，得到的Ct值与所述标准曲线比对即可得到待测样本的Actin基因的表达量。
优选地，步骤(3)所述的实时荧光定量PCR扩增程序为95℃5min；95℃20s，60℃1min，共进行40个循环。
本发明提供的人源Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，特异型强、重复性好，灵敏性高。为采用荧光定量PCR方法对人基因组其他功能基因的表达定量分析奠定基础。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，其包含本发明的任一项所述的引物对，和/或本发明中任一项所述的探针。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的试剂盒，其包含：
引物对和探针
优选地，所述试剂盒中包含的引物对为引物对1、引物对2、引物对3或引物对4中的任一项引物对；更优选地，所述试剂盒中包含的引物对为引物对4；
优选地，所述试剂盒中包含的探针为探针A、探针B或探针C中的任一项；更优选地，所述试剂盒中包含的探针为探针C；
优选地，所述试剂盒还包含PCR反应所需的试剂，例如Mg2+、反应缓冲液、dNTP和Taq酶。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
术语“荧光定量PCR”(荧光qPCR)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
术语“看家基因”是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，表达水平受环境影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织持续表达，因此常被作为内参基因使用，理想的内参基因赢在各种类型的细胞、组织以及何种实验因素条件下均能恒定表达。
术语“内参”即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
发明的有益效果
本发明取得了如下技术效果中的至少一项：
(1)本发明提供了用于人源Actin基因的荧光定量PCR检测的多种引物对和探针，所述的任一引物对和探针，其重复性好，灵敏度高，特异性好，能够区分基因组中的Actin基因和其假基因，而且对人源Actin基因具有检测的通用性。
(2)本发明提供的一种人源Actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，该方法通过检测样本与标准曲线比对，得到Actin基因的含量，从而为检测其他功能性基因的相对定量或绝对定量提供可靠地基础。
(3)本发明还提供了人源Actin基因标准品曲线的具体制备方法。
附图说明
图1：Actin基因PCR扩增结果。
图2：pMD18-Actin质粒酶切验证结果。
M：DNA Maker，1：XbaI和BamHI内切酶的双酶切产物，2：ScaI和BamHI内切酶的双酶切产物，3：SpeI和ScaI内切酶的双酶切产物。
图3：引物对1和探针A的荧光PCR扩增曲线。
图4：引物对2和探针A的荧光PCR扩增曲线。
图5：引物对3和探针A的荧光PCR扩增曲线。
图6：引物对4和探针C的荧光PCR扩增曲线。
图7：引物探针特异性验证结果。
图8：非特异性引物扩增产物测序GenBank序列比对结果。
图9：非特异性引物探针扩增曲线。
图10：非特异性引物扩增标准曲线。
图11：特异性引物探针扩增曲线。
图12：特异性引物探针扩增标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：Actin DNA序列的扩增与载体构建、鉴定
参考GenBank中人源Actin基因序列(NG_007992.1)，经多次设计验证得到特异性好，灵敏性高的扩增Actin基因序列的扩增引物对8(Actin_clone_g2F和Actin_clone_g2R)，序列如表1所示，用于Actin标准品的制作。引物对8扩增的目的片段为1023bp。引物委托上海杰瑞生物科技有限公司合成。
表1 Actin扩增引物
量取1mL人外周血，利用基因组抽提试剂盒提取人基因组作为模板，以前述扩增引物对8对Actin基因进行常规PCR扩增。常规PCR扩增反应体系如表2：
表2常规PCR反应体系
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃20s，72℃1min，共进行40个循环；72℃延伸5min。
得到的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。其中M为DNAMaker，0为空白对照水，1为PCR产物。图1显示有符合预期大小的目的条带。
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察到符合预期大小的目标片段，用手术刀切下相应条带后置于2mL离心管中，采用DNA凝胶回收试剂盒进行溶解并按照操作说明书进行纯化处理。
将纯化后的目标片段与T载体pMD-18进行TA连接并命名为pMD18-Actin。
具体操作如下：
(1)在超净工作台上用移液枪量按表3所示含量分别取各个成分于0.5mL离心管中并轻轻吸打几次混匀后16℃连接12h；
表3 pMD18-Actin连接体系
pMD-18线性载体 1μL
纯化产物 2μL
DNA连接酶 1μL
10x Buffer 2μL
ddH2O 14μL
总体积 20μL
(2)吸取3μL连接产物加入到含有50μL大肠杆菌DH5α感受态的离心管中，轻柔吸打均匀后放置冰浴30min；42℃水浴30s，冰浴2min。随后加入300mL灭菌的LB培养基37℃，200转/min振荡培养1h；
(3)取适量抗生素溶液均匀涂在准备好的LB平板上，带液体被吸干后，取200mL菌液铺板，倒置培养皿，37℃培养8-14h；
(4)在转化平板上挑取适量单菌落置于加有抗生素的5mL液体LB培养基中37℃，200转/min振荡培养8-14h；
(5)采用质粒小量提取试剂盒对重组质粒进行提取，按照操作说明书提取到重组质粒pMD18-Actin后进行酶切验证，分别利用XbaI和BamHI内切酶、ScaI和BamHI内切酶以及SpeIhe ScaI内切酶对重组质粒pMD18-Actin按照表4反应体系进行双酶切验证处理。酶切结果的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。M是DNA Maker，1是XbaI和BamHI内切酶的双酶切产物，2是ScaI和BamHI内切酶的双酶切产物，3是SpeI和ScaI内切酶的双酶切产物。可以看出双酶切产物都有两条条带产生，分别为1055bp+2706bp、2834bp+927bp和1970bp+1791bp，其大小与目的基因理论大小一致。
表4酶切验证体系
质粒pMD18-Actin 4μL
酶1 1μL
酶2 1μL
Buffer 5μL
ddH2O 39μL
Total 50μL
(6)将提取质粒送至上海杰瑞生物科技有限公司进行测序。测序结果(SEQ IN NO：14)在NCBI网站上进行Blast分析，结果显示与人源Actin的基因序列一致，证明本研究克隆的质粒为人源Actin的序列片段。
实施例2：不同引物探针扩增效率对比
1、检测引物和探针的设计与合成
基于前述测序验证过的Actin基因序列作为模板进行设计多对荧光定量PCR引物对与探针，委托上海杰瑞科技有限公司合成。引物对与探针的序列如下面的表5所示。
表5引物序列与探针序列
人源Actin基因序列：
AACTTGCGCAGAAAACAAGATGAGATTGGCATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTGACTCAGGATTTAAAAACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCCCCAAAGTTCACAATGTGGCCGAGGACTTTGATTGCACATTGTTGTTTTTTTAATAGTCATTCCAAATATGAGATGCGTTGTTACAGGAAGTCCCTTGCCATCCTAAAAGCCACCCCACTTCTCTCTAAGGAGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTCCACACAGGGGAGGTGATAGCATTGCTTTCGTGTAAATTATGTAATGCAAAATTTTTTTAATCTTCGCCTTAATACTTTTTTATTTTGTTTTATTTTGAATGATGAGCCTTCGTGCCCCCCCTTCCCCCTTTTTTGTCCCCCAACTTGAGATGTATGAAGGCTTTTGGTCTCCCTGGGAGTGGGTGGAGGCAGCCAGGGCTTACCTGTACACTGACTTGAGACCAGTTGAATAAAAGTGCACACCTTAAAAATGAGGCCAAGTGTGACTTTGTGGTGTGGCTGGGTTGGGGGCAGCAGAGGGTGAACCCTGCAGGAGGGTGAACCCTGCAAAAGGGTGGGGCAGTGGGGGCCAACTTGTCCTTACCCAGAGTGCAGGTGTGTGGAGATCCCTCCTGCCTTGACATTGAGCAGCCTTAGAGGGTGGGGGAGGCTCAGGGGTCAGGTCTCTGTTCCTGCTTATTGGGGAGTTCCTGGCCTGGCCCTTCTATGTCTCCCCAGGTACCCCAGTTTTTCTGGGTTCACCCAGAGTGCAGATGCTTGAGGAGGTGGGAAGGGACTATTTGGGGGTGTCTGGCTCAGGTGCCATGCCTCACTGGGGCTGGTTGGCACCTGCATTTCCTGGGAGTGGGGCTGTCTCAGGGTAGCTGGGCACGGTGTTCCCTTGAGTGGGGGTGTAGTGGGTGTTCCTAGCTGCCACGCCTTTGCCTTCACCTATGGGATCG(SEQ IN NO：14)
2、引物探针扩增效率对比实验
样品、试剂、仪器
仪器：LightCycle480荧光定量PCR检测仪(罗氏)，
样本：质粒pMD18-Actin样品
试剂：基因组抽提试剂盒(厂家)，Taqman gene expression Master Mix试剂(厂家)。
取前述质粒pMD18-Actin作为模板，选择四种引物对和三种探针进行搭配组合；根据荧光定量PCR方法的反应体系配置反应液，获取不同引物对和探针组合对Actin基因的扩增效果。
具体步骤如下：
(1)将Actin基因标准品稀释至适宜浓度作为检测模板。
(2)荧光定量PCR检测：按表6配置定量PCR反应体系，该反应体系，其中引物对和探针的组合依次为：引物对1和探针A、引物对2和探针A、引物对3和探针A、引物对5和探针A、引物对7和探针A、引物对4和探针B、引物对6和探针B、引物对4和探针C。每个荧光扩增反应进行三次。反应为两步法：第一步95℃5min；第二步，95℃20s，60℃1min，共进行40个循环；从而获取不同引物对与探针Actin基因的扩增效率。PCR反应体系如下面的表6所示。
表6：Actin基因检测的荧光定量检测PCR反应体系
(3)扩增效率对比结果
由表7显示引物对1和探针A、引物对2和探针A、引物对3和探针A、引物对4结合探针C的组合其扩增效率(E＝10–1/斜率)较好，接近理论扩增效率2.0，其中引物对4结合探针C的的组合其扩增效率最优，为2.009，最接近2.0。图3、图4、图5和图6分别显示引物对1和探针A、引物对2和探针A、引物对3和探针A及引物对4和探针C各自3次重复实验(每次重复实验3个平行样品)的荧光定量PCR的扩增曲线。另外将引物对4在NCBI网站进行BlastX比对，其结果显示该引物对仅特异性扩增人源Actin基因，具有很好的特异性。
表7不同引物探针组合对Actin的扩增效率及Error值对比
实施例3：引物、探针特异性检测
由实施例2中得出引物对4和探针C的组合对Actin基因的检测效果最好，因此在特异性检测实验中，我们以人源细胞样本为检测对象，以鼠源细胞的基因组作为背景基因组，使用Actin基因引物对4、探针C进行扩增，检测引物探针组合的专属性。人源细胞样本进行2次重复反应，每次反应平行3个样品。反应中设置一个一个阴性对照和Actin阳性对照，即添加不含任何DNA模板的水和一个Actin标准品。
如图7所示，关于特异性扩增Actin基因序列的引物对4、探针C组合检测Actin阳性样本产生正常的扩增曲线，与Actin标准品的扩增结果相似；空白水和鼠源CHO细胞样本检测不到扩增曲线，说明Actin引物探针组合在扩增人源DNA Actin基因，不扩增非人源ActinDNA，显示本发明提供的Actin检测引物、探针不会与假基因片段或其他来源的非人Actin基因片段发生特异性结合，有良好的特异性。
对照实施例1一组非特异性结合人源Actin引物探针
取制备的含人源Actin基因的基因组DNA作为模板，根据荧光定量PCR方法的反应体系配置反应液，获取扩增曲线。作为对照，Actin基因样本使用一组非特异结合人源Actin的引物探针组合进行扩增。
具体步骤如下：
本发明人在研究过程中设计了多种引物、探针，这里列举其中有代表性的非特异引物探针作为对比实施例。
非特异的Actin引物(引物对9：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)，探针(探针D：SEQID NO:23)分别为：
Actin 01F：GCATGGGTCAGAAGGATTCCTAT(SEQ ID NO:21)
Actin 01R：TGTAGAAGGTGTGGTGCCAGATT(SEQ ID NO:22)
Actin 01 probe：Hex-TCGAGCACGGCATCGTCACCAA-Trama(SEQ ID NO:23)
设计的引物探针交由上海捷瑞生物公司合成。对此引物扩增的目的片段138bp；将此引物对在NCBI网站进行BlastX比对，可以看到非特异性引物结合多处Actin假基因。
对照实施例2非特异性扩增产物验证
以人外周血细胞基因组为模板，以上述引物作为扩增PCR引物对进行Actin基因常规扩增，扩增体系见表2；PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃20s，72℃1min，共进行40个循环；72℃延伸5min。将扩增产物纯化后进行测序验证并Blast比对。
图8所示为非特异性引物扩增人源DNA的克隆样本测序后在GenBank中的比对结果，两组克隆产物测序结果显示部分克隆序列与理论序列有少量碱基差异。另外对这两组克隆序列在NCBI里Blast，显示出其分别来自5号染色体和2号染色体基因组序列,与两条染色体序列预测序列相同。说明非特异性引物不仅扩增出了目标Actin基因片段，还扩增出人基因组上的假基因产物，假基因的存在严重影响Actin引物对Actin基因的特异性检测结果。
对照实施例3特异性引物扩增产物少于非特异性引物的扩增产物
1、分别使用前述非特异性引物探针组合，特异性引物对4和探针C引物探针组合，对三个相同的细胞样本，进行Actin基因扩增检测，对比不同引物探针组合扩增Actin结果差异。
由表8可以看出非特异性扩增人源Actin的引物探针组合其检测结果是特异性扩增人源Actin的引物组合的两倍，说明有部分假基因充当了非特异性引物扩增的模板致使拷贝数提高，从而表明假基因影响Actin基因的检测效果。
表8不同引物探针组合扩增Actin结果差异
2、分别使用含特异性和非特异性引物扩增片段的质粒，构建相应的标准品和构建标准曲线。步骤如下：
(1)以非特异性引物对9为常规扩增引物对人基因组进行扩增，得到的克隆产物构建非特异性质粒标准品命名为Actin-mRNA质粒，其操作步骤与实施例1中Actin DNA序列的扩增与载体构建相同。
(2)将非特异性引物对9扩增片段构建的Actin-mRNA质粒和前述已构建好的特异性引物对8扩增产物构建的pMD18-Actin质粒分别作为标准品，分别制备10梯度的稀释标准品
表9：Actin-mRNA标准品和pMD18-Actin标准品的制备
Actin-mRNA 拷贝数 pMD18-Actin 拷贝数
1 2.58E+09 1 2.46E+09
2 2.58E+08 2 2.46E+08
3 2.58E+07 3 2.46E+07
4 2.58E+06 4 2.46E+06
5 2.58E+05 5 2.46E+05
6 2.58E+04 6 2.46E+04
(3)以非特异性引物对9和探针D对制备的Actin-mRNA标准品系列进行荧光PCR检测，以特异性引物对4和探针C对制备的pMD18-Actin标准品系列进行荧光PCR检测；分别构建两者的标准曲线。
荧光PCR扩增Actin-mRNA标准品和pMD18-Actin标准品的扩增曲线图分别如图9和图11所示，标准曲线分别如图10和图12所示。从图10和12可看出特异性引物和探针组合与非特异性引物和探针组合对Actin基因扩增标准曲线线性良好，单通过图9和图11对比可看出非特异性引物和探针组合的扩增Ct值都小于特异性引物和探针组合的扩增Ct值，说明存在较多Actin假基因充当模板影响了引物和探针组合的扩增效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
上海细胞治疗研究院
<120> 一种Actin内参基因高灵敏检测方法及试剂盒
<130> 18B007
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacattgagc agccttagag gg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aactccccaa taagcaggaa ca 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acattgagca gccttagagg g 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggtacctgg ggagacatag aa 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttgacatt gagcagcctt aga 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggtacctgg ggagacatag a 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggtctctgt tcctgcttat tgg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagaaaaact ggggtacctg gg 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggggaggctc aggggtcagg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggagttcctg gcctggccct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagttcctg gcctggccct 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacttgcgca gaaaacaaga tga 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgatcccata ggtgaaggca aa 22
<210> 14
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacttgcgca gaaaacaaga tgagattggc atggctttat ttgttttttt tgttttgttt 60
tggttttttt tttttttttg gcttgactca ggatttaaaa actggaacgg tgaaggtgac 120
agcagtcggt tggagcgagc atcccccaaa gttcacaatg tggccgagga ctttgattgc 180
acattgttgt ttttttaata gtcattccaa atatgagatg cgttgttaca ggaagtccct 240
tgccatccta aaagccaccc cacttctctc taaggagaat ggcccagtcc tctcccaagt 300
ccacacaggg gaggtgatag cattgctttc gtgtaaatta tgtaatgcaa aattttttta 360
atcttcgcct taatactttt ttattttgtt ttattttgaa tgatgagcct tcgtgccccc 420
ccttccccct tttttgtccc ccaacttgag atgtatgaag gcttttggtc tccctgggag 480
tgggtggagg cagccagggc ttacctgtac actgacttga gaccagttga ataaaagtgc 540
acaccttaaa aatgaggcca agtgtgactt tgtggtgtgg ctgggttggg ggcagcagag 600
ggtgaaccct gcaggagggt gaaccctgca aaagggtggg gcagtggggg ccaacttgtc 660
cttacccaga gtgcaggtgt gtggagatcc ctcctgcctt gacattgagc agccttagag 720
ggtgggggag gctcaggggt caggtctctg ttcctgctta ttggggagtt cctggcctgg 780
cccttctatg tctccccagg taccccagtt tttctgggtt cacccagagt gcagatgctt 840
gaggaggtgg gaagggacta tttgggggtg tctggctcag gtgccatgcc tcactggggc 900
tggttggcac ctgcatttcc tgggagtggg gctgtctcag ggtagctggg cacggtgttc 960
ccttgagtgg gggtgtagtg ggtgttccta gctgccacgc ctttgccttc acctatggga 1020
tcg 1023
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgacattga gcagccttag ag 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccaggaactc cccaataagc a 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtcaggtctc tgttcctgct tat 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccagaaaaac tggggtacct gg 22
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cttgacattg agcagcctta gag 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccaggaactc cccaataagc a 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcatgggtca gaaggattcc tat 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgtagaaggt gtggtgccag att 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcgagcacgg catcgtcacc aa 22

Claims (8)

1.一种试剂盒，其包含如下所述的引物对和探针的组，
SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的引物对1和SEQ ID NO: 9所示的探针A，和/或
SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的引物对2和SEQ ID NO: 9所示的探针A，和/或
SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示的引物对3和SEQ ID NO: 9所示的探针A，和/或
SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的引物对4和SEQ ID NO: 11所示的探针C，
所述探针A和探针C的5’端标记有荧光报告基团Hex，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包含PCR反应所需的试剂。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应所需的试剂选自Mg2+、反应缓冲液、dNTP和Taq酶。
4.一种特异性检测人源actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）使用权利要求1-3中任一项中所记载的引物对和探针，对待测样品和Actin基因标准品系列进行实时荧光定量PCR检测；
（3）将待测样品的荧光定量PCR检测结果通过与有标准品的不同拷贝数的对数值与Ct值组成的标准曲线对比，得到待测样品的actin基因拷贝数。
5.根据权利要求4所述的人源actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述标准品通过以下方法制备：
（1）提取人外周血细胞基因组DNA；
（2）以引物对8对基因组DNA扩增，扩增后对目的片段回收，其中引物对8的碱基序列如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示；
（3）获取目的片段，连接至载体上，进行质粒扩增，扩增后提取质粒进行线性化，线性化的载体分子即为所述的标准品。
6.根据权利要求4所述的人源actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为：Realtime PCR Master Mix 10μL，引物各0.4μL，探针0.2μL，检测样本5μL，双蒸水补齐至20μL。
7.根据权利要求6所述的人源actin基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR扩增程序为：第一步95℃ 5min；第二步，95℃ 20s，60℃ 1min，共进行40个循环。
8.一种权利要求1-3中任一项所述的试剂盒在制备用于测定其他外源基因拷贝数的药物或者制备用于对外源基因进行质量控制的药物中的用途。
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