CN108866100A - 一种高效率的基因编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效率的基因编辑方法。揭示了一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法──同源介导的末端接合法(HMEJ)。本发明所述的HMEJ方法，利用带有单个向导RNA靶向位点和长同源臂的供体构建物，可实现精确的基因编辑，且基因编辑效率高。

Description

一种高效率的基因编辑方法
技术领域
本发明分子生物学领域，更具体地，本发明涉及一种高效率的基因编辑方法。
背景技术
本领域中，转基因中的定向整合通常采用的是同源重组(HomologousRecombination，HR)的方法。该方法需要一条含左右同源臂的修复模板，这样可以使得大DNA片段精确插入。订制化设计的核酸酶(CDNs)例如锌指核糖核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白-9核酸酶(Cas9)系统通过在基因组上定向形成DNA双链断裂(DSB)的方式极大地促进了转基因定向整合。一旦产生一个DSB，在细胞内部通过同源重组来进行修复时，外源的DNA片段会被引入该断裂位置的周围。然而，这种方法在动物胚胎和体内的效率通常很低，因为HR只在晚期S/G2期才激活。
非同源末端接合(Non-Homologous End Joining，NHEJ)是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活，实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ机制会将其连入双链断裂DSB位点，从而实现定点的基因敲入。
微同源臂介导的末端接合(Microhomology-Mediated End Joining，MMEJ)是一种利用5-25bp的微同源序列来介导易错配的末端连接的DNA双链断裂修复机制。在细胞周期中，不同于同源重组，MMEJ修复是在G1/早S期活跃。
最近报道，NHEJ或者MMEJ介导的方法能够做到大的外源DNA可高效插入基因组内。在这些方法中，靶向基因组位点和带有非同源臂或微同源臂(5～25bp)的供体载体同时被可控的核酸酶切割，然后通过NHEJ或者MMEJ方式将两者互相连接在一起，从而产生定向转基因整合。但是，NHEJ为基础的定向整合方式在整合位点会形成随机方向插入，在接合处也会引入多种插入缺失突变，这个特点使得很难将内外源基因同框整合融合成嵌合体蛋白。而MMEJ为基础的定向整合在培养的细胞中发生效率低。
因此，本领域还亟需提供新的或改进的转基因中的定向整合技术，以克服上述技术的一些缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效率的基因编辑方法，以及该高效率的基因编辑方法的应用，例如在基因治疗方面的应用。
在本发明的第一方面，提供一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法，所述方法包括：
(1)提供供体构建物，该构建物依次(5’→3’)包括：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的不小于200bp的序列互补；其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列；
(2)以(1)的构建物作为供体，以靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA切割细胞基因组的待编辑基因区域，以靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA分别切割sgRNA靶向序列1和sgRNA靶向序列2，通过CRISPR/Cas9方法对细胞基因组进行基因编辑。
在一个优选例中，所述的细胞包括但不限于：分裂细胞，非分裂细胞，体组织细胞。
在另一优选例中，所述的细胞包括但不限于：受精卵细，胞神经细胞(如神经元细胞，星型胶质细胞等)，瘤细胞(如神经瘤细胞等)，干细胞(如胚胎干细胞，骨髓干细胞等)，肝细胞。
在本发明的另一方面，提供一种制备基因组发生定向基因编辑的动物的方法，所述方法包括：
(1)提供供体构建物，该构建物依次(5’→3’)含有：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的不小于200bp的序列互补；其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列；
(2)以(1)的构建物作为供体，以靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA切割细胞基因组的待编辑基因区域，以靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA分别切割sgRNA靶向序列1和sgRNA靶向序列2，通过CRISPR/Cas9方法对动物受精卵进行基因编辑；
(3)使(2)的动物受精卵发育，获得基因组的待编辑基因区域发生精确编辑的动物。
在一个优选例中，所述的5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的300～3000bp的序列互补。
在另一优选例中，所述的5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的400～2500bp，如600bp、800bp、1000bp、1200bp、1400bp、1600bp、2000bp的序列互补。
在另一优选例中，所述的供体构建物中各元件是操作性连接的。
在另一优选例中，所述的对细胞基因组进行定向基因编辑方法为不以诊断或治疗为目的的方法。
在另一优选例中，所述的制备基因组发生定向基因编辑的动物的方法为不以诊断或治疗为目的的方法。
在另一优选例中，所述的动物为哺乳动物，包括：人，非人灵长类动物，鼠，家畜。
在另一优选例中，步骤(2)中，将(1)的供体构建物，靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物、靶向于sgRNA靶向序列1或能形成该sgRNA的构建物、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物，以及Cas9 mRNA或能形成Cas9蛋白的构建物共转入细胞中。
在另一优选例中，能形成靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA的构建物，能形成靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA的构建物，能形成靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA的构建物，能形成Cas9蛋白的构建物位于1、2或多个表达载体上。
在另一优选例中，所述的靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA、sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2是相同的sgRNA或不同的sgRNA。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括：针对细胞基因组的待编辑基因区域，进行：外源基因插入，基因片段删除，点突变，基因片段替换，基因修饰。
在另一优选例中，所述的外源基因插入包括：将外源基因设置于(1)的基因操作序列中，从而当将该基因操作序列被替换入细胞基因组后，该外源基因被定向地插入到细胞基因组中。
在另一优选例中，所述的基因片段删除包括：在(1)的基因操作序列中，设置与野生型基因序列相比发生基因片段缺失的序列，从而当该基因操作序列被替换入细胞基因组后，细胞基因组定向地发生基因片段的删除。
在另一优选例中，所述的外源基因插入包括(但不限于)：插入1～50Kb基因片段(如插入10bp，100bp，1Kb，10Kb，20Kb，30Kb片段)。
在另一优选例中，所述的基因片段删除包括(但不限于)：删除1bp-200kb基因片段(如删除10bp，100bp，1Kb，20Kb，50Kb，100Kb片段)。
在另一优选例中，所述的基因片段替换包括(但不限于)：1bp-200kb基因片段(如删除10bp，100bp，1Kb，20Kb，50Kb，100Kb片段)的替换。
在另一优选例中，通过所述的基因编辑，进行基因治疗。
在本发明的另一方面，提供一种用于对细胞基因组进行定向基因编辑或用于基因治疗的供体构建物，其用于对细胞基因组进行定向基因编辑，该构建物依次(5’→3’)包括：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的200～2000bp的序列互补；其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列。
在本发明的另一方面，提供所述的供体构建物的用途，用于作为对细胞基因组进行定向基因编辑的供体；或用于制备进行基因治疗的组合物。
在一个优选例中，所述的供体构建物的用途为不以诊断或治疗为目的的用途。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括：针对细胞基因组的待编辑基因区域，进行：外源基因插入，基因片段删除，点突变，基因片段替换。
在本发明的另一方面，提供一种用于对细胞基因组进行定向基因编辑或用于基因治疗的试剂盒，所述的试剂盒包括：前面所述的供体构建物；靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物；靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物；靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：Cas9 mRNA或能形成Cas9蛋白的构建物。
在另一优选例中，各个构建物建立于一个表达载体中，或存在于2个或多个表达载体中。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、HR、NHEJ、MMEJ和HMEJ介导基因敲入的示意图。
(A)HR介导方法需要相对长的同源臂(800bp)。
(B)NHEJ介导的方法需要sgRNA靶向位点但是不需要任何同源臂。NHEJ修复系统会在接合处引入多种类型的插入删除突变。
(C)MMEJ介导的方法需要sgRNA靶向位点和短同源臂(5-20bp)。
(D)HMEJ介导的方法需要sgRNA靶向位点和长同源臂(800bp)。HR和HMEJ信号通路可能在该方法中发挥作用。HAL/HAR，左/右同源臂。
图2、利用HMEJ介导的定向整合在体外进行基因组编辑。
(A)在Actb位点的四种基因打靶策略示意图。HAL/HAR，左/右同源臂。三角形，sgRNA靶向位点；OF/OR，外部正向/反向引物；IF/IR，内部正向/反向引物。
(B)在小鼠ES细胞中定向敲入Actb-2A-mCherry的实验示意图。
(C)通过统计所有细胞中mCherry+(GFP+细胞)的比例来计算小鼠ES细胞中多种位点中HR、NHEJ、MMEJ和HMEJ策略的基因敲入相对效率。
(D)在不同位点处插入片段的示意图。
(E)通过统计所有细胞中mCherry+(GFP+细胞)的比例来计算N2a细胞中多种位点中HR、NHEJ、MMEJ和HMEJ策略的基因敲入相对效率。
(F)统计GFP+细胞中mCherry+的比例来计算星形胶质细胞和神经元细胞中的基因敲入相对效率。C和F，结果用平均数±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，不配对T检验。
图3、在小鼠胚胎中HMEJ介导的定向整合。
(A)实验设计。Cas9 mRNA、sgRNA和供体载体共注射至小鼠受精卵中，然后注射后的受精卵培养至囊胚阶段，进行荧光观察和基因型分析。
(B)在囊胚阶段，基因编辑后的小鼠胚胎的具有代表性的荧光图片。Cas9 mRNA、sgRNA和每种供体载体(HR、MMEJ或HMEJ)共注射至小鼠受精卵中，然后注射后的受精卵培养至囊胚阶段，并进行荧光观察。对照组，HMEJ载体无Cas9。插入图，高放大倍数图。星号，ICM；箭头，TE。标尺，50μm。
(C)敲入效率通过mCherry+囊胚比例来说明。每个柱上数字，统计的囊胚总数。
(D)将p2A-mCherry精确整合入Sox2和Dbh位点的小鼠效率。每个柱上数字，统计的小鼠总数。C和D，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，卡方检验。
(E)用HMEJ方法获得的六周大的Dbh-p2A-mCherry小鼠大脑的具有代表性的荧光图片。TH，酪氨酸氢化酶。标尺，50μm。
图4、在猴子胚胎中HMEJ介导的定向整合。
(A)在猴子胚胎中针对Actb位点进行HMEJ介导的基因打靶策略示意图。猴子卵母细胞中进行胞浆内单精注射(ICSI)，六个小时后注射Cas9的混合物。注射后的胚胎培养6天至囊胚。
(B)在囊胚阶段，基因编辑后的猴子胚胎的具有代表性的荧光图片。方形，在右排展示更高分辨度的囊胚。标尺，100μm。标了号的囊胚进行基因型鉴定，并且在下面数据中用*标记。
(C)不同浓度的供体质粒(100ng/μl，50ng/μl)的敲入效率通过mCherry+囊胚的比例来说明。每个柱上数字，统计的囊胚总数。
(D)注射后的胚胎的基因型分析结果。7天的单个猴子胚胎的5’和3’接合处的PCR扩增产物进行测序。PC，以有Actb-p2A-mCherry敲入的COS-7细胞为阳性对照。*，在图4B中展示的mCherry+囊胚。
(E)敲入效率用对所有注射后胚胎的基因分析结果来说明。每个柱上数字，统计的胚胎总数。
(F)注射后的胚胎的基因型分析结果。CCT to GGT，将PAM序列中的CCT替换成GGT以避免重切割。上排：同源臂；紫色，4号内含子；红色，mCherry；蓝色，PAM序列。虚线表示省略的区域。
图5、通过HMEJ方法在体内进行基因组编辑。
(A)通过子宫内电转对胎儿大脑进行Actb-p2A-mCherry定向敲入的实验示意图。
(B)用四种基因打靶策略在Actb位点发生正确mCherry敲入的神经元细胞的具有代表性的荧光图片。标尺，100μm。GFP，转染后的细胞。
(C)通过统计在GFP+细胞中mCherry+细胞比例来说明相对敲入效率。
(D)通过高压尾静脉注射来定向敲入Actb-p2A-mCherry的实验示意图。
(E)注射后第7天，肝切片中具有代表性的肝细胞的荧光图。标尺，50μm。GFP，转染后的细胞。
(F)通过统计在GFP+细胞中mCherry+细胞比例来说明相对敲入效率。肝细胞在注射后7天进行收集分离。C和F，结果从至少3只小鼠中获得，并且以平均数±标准差表示。数据点用黑点表示。***P<0.001，不配对T检验。
(G)将p2A-mCherry敲入Actb基因最后一个密码子的HMEJ-AAV示意图。
(H)通过成年小鼠脑中定点注射进行在体HMEJ介导的敲入示意图。
(I)HMEJ-AAV注射后大脑切片中具有代表性的神经元荧光图。插入图，高放大倍数图。标尺，100μm。
(J)分别通过统计在GFP+细胞或所有DAPI+细胞中的mCherry+细胞比例来说明相对或绝对敲入效率。结果从两只动物中获得，并且以平均数±标准差表示。每张大脑切片中至少统计2000个细胞，每个动物中至少统计三张大脑切片。输入的数据点用黑色点表示。
图6、NHEJ抑制剂和HR抑制剂对于不同策略的敲入效率的影响。
(A-B)在小鼠ES细胞(A)和神经元(B)中四种方法在Actb位点发生mCherry敲入的效率通过流式细胞术的方法进行测量，并且与用NHEJ抑制剂(Scr7或NU7026)、HR抑制剂(咖啡因)或两者同时处理实验组相比较。结果用平均数±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，不配对T检验。
(C)HMEJ在快速分裂、慢速分裂和非分裂细胞中的HMEJ介导的基因敲入的示意图。
图7A-C、HMEJ和HR介导的在Actb位点定点整合的小鼠ES细胞的基因型分析结果。从5’和3’接合处获得的PCR扩增产物进行了测序。上排：同源臂；紫色，p2A；红色，mCherry；绿色，GFP；蓝色，PAM序列。
图8、在小鼠ES中定向整合位点和实验设计示意图。
(A)在Tubb3位点的四种基因打靶策略示意图。设计GFP插入至Tubb3的最后一个密码子来和Tubb3融合。
(B)靶向位点(包括Rosa26、Nanog和Sox2)的示意图。
图9、在小鼠ES细胞和N2a细胞中具有不同同源臂长度的HMEJ供体的敲入效率。
(A-B)一系列分别拥有200、400、800或1600bp同源臂长度的靶向Actb位点敲入p2A-mCherry的HMEJ供体载体和Cas9/sgRNA一起共转染至小鼠ES细胞(A)或N2a细胞(B)中，敲入效率通过流式细胞术来测定。结果用平均数±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，不配对T检验。
图10、在原代培养的星形胶质细胞和神经元中，通过慢病毒感染方式靶向Actb位点敲入2A-mCherry的示意图。
(A)通过慢病毒感染的方式使用四种基因打靶策略靶向Actb位点最后一个外显子敲入2A-mCherry的示意图。HAL/HAR，左/右同源臂。三角形，sgRNA靶向位点；OF/OR，外部正向/反向引物；IF/IR，内部正向/反向引物。
(B)在原代培养的星形胶质细胞和神经元细胞中靶向Actb位点敲入2A-mCherry的实验示意图。
(C)HMEJ和HR介导的在Actb位点定点整合的原代神经元细胞的基因型分析结果。从5’和3’接合处获得的PCR扩增产物进行了测序。上排：同源臂；紫色，p2A；红色，mCherry；绿色，GFP；蓝色，PAM序列。
图11、用不同策略获得的Actb位点敲入的囊胚的序列分析结果。
(A)NHEJ供体载体的示意图。
(B)通过NHEJ方法获得基因编辑囊胚的具有代表性的免疫荧光图。插入图，更大倍数图。
(C)mCherry+囊胚比例说明了NHEJ方法的基因敲入效率。每个柱上数字，统计的囊胚总数。
(D-F)通过HMEJ(D)、MMEJ(E)和NHEJ(F)方法定向整合获得的mCherry+囊胚的序列分析。从单个mCherry+囊胚中的5’和3’接合处获得的PCR扩增产物进行了测序。上排：同源臂；紫色，p2A；红色，mCherry；绿色，GFP；蓝色，PAM序列。HAL/HAR，左/右同源臂。虚线表示省略的区域。
图12、在小鼠胚胎中用HMEJ定向整合在Naong、Sox2和Cdx2位点的囊胚的序列分析结果。
(A)在小鼠胚胎中用HMEJ定向整合在Naong、Sox2和Cdx2位点的示意图。
(B-D)HMEJ介导的定向整合在Naong、Sox2和Cdx2位点的mCherry+囊胚的序列分析结果。从单个mCherry+囊胚中的5’和3’接合处获得的PCR扩增产物进行了测序。上排：同源臂；紫色，p2A；红色，mCherry；绿色，GFP；蓝色，PAM序列。HAL/HAR，左/右同源臂。虚线表示省略的区域。
图13、用HMEJ介导的在Dbh和Sox2位点发生定向整合的基因编辑小鼠。
(A)在Dbh位点利用HR、MMEJ和HMEJ策略获得的基因编辑小鼠示意图。
(B)用HR、MMEJ和HMEJ策略获得的基因编辑小鼠的出生率。每个柱上数字，移植的胚胎总数。
(C-D)在Dbh和Sox2位点发生基因编辑的小鼠的序列分析。上排：同源臂；紫色，p2A；红色，mCherry；绿色，GFP；蓝色，PAM序列。HAL/HAR，左/右同源臂。虚线表示省略的区域。
图14、在COS-7细胞的Actb位点处HMEJ介导的定向整合。
(A-B)在COS-7细胞中定向敲入Actb-2A-mCherry的实验示意图。11个不同的sgRNA并且表达Cas9和GFP的质粒，分别转染至COS-7细胞中，在第3天分选出GFP+细胞用于T7E1实验。具有相对比较高切割效率的sgRNA也同样和带有Actb-2A-mCherry定向整合的供体质粒一起共转染。
(C)Actb位点打靶效果用T7E1实验来鉴定。对照组是正常的COS-7细胞的基因组DNA。*，用于Actb-2A-mCherry定向整合实验的sgRNA。
(D)通过统计在所有转染成功的细胞中mCherry+细胞比例来说明在COS-7细胞中Actb-2A-mCherry的相对敲入效率。结果用平均数±标准差表示。输入的数据点用黑点表示。
图15、利用HMEJ方法将2A-mCherry敲入Actb位点后的肝细胞和神经元细胞的序列分析结果。
(A-C)利用HMEJ方法通过胚胎电转(A)，水动力注射(B)和AAV病毒定点注射(C)将2A-mCherry敲入Actb位点后的肝细胞的序列分析结果。从的5’和3’接合处获得的PCR扩增产物进行TA克隆，并且测序。HMEJ方法理应获得的敲入序列在顶部显示。上排：同源臂；紫色，p2A；红色，mCherry；蓝色，PAM序列。
具体实施方式
本发明揭示了一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法，命名为同源介导的末端接合法(HMEJ)。所述的HMEJ方法，利用带有单个向导RNA(sgRNA)靶向位点和长同源臂的供体构建物来实现精确的基因编辑。本发明人发现，在多种系统(包括培养中的细胞、动物胚胎和体内组织等)中，基于HMEJ方法的基因编辑(如基因敲入)，在分裂和非分裂细胞中均能实现精确且高效的基因整合，基因编辑且效率显著高于现有的其它基因编辑策略。
术语
如本文所用，所述“供体构建物”是指一条包含有多个操作性连接的元件的核酸构建物，在基于CRISPR/Cas9技术中，其应用于为基因组上所需进行基因编辑的区段提供合适的替换序列。
如本文所用，所述“基因操作序列”是指用于与细胞基因组的待编辑基因区域进行基因替换的序列，在基因编辑完成后，该“基因操作序列”的部分或全部将被替换到目标细胞的基因组中；在本发明中，其被设置于所述的供体构建物中。
如本文所用，所述“细胞基因组的待编辑基因区域”即细胞基因组中需要进行基因插入、基因敲除等操作的目标区域。
如本文所用，所述的“sgRNA”即“单独导向RNA(Single-guide RNA，sgRNA)”或“单导向RNA”，其是基于“目标基因上的靶位点”设计，其包含的序列足以与内切核酸酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA双链断裂。
如本文所用，所述“动物(mammal)”没有特别的限制，只要其细胞具有一般意义上的基因组，且CRISPR/Cas9体系在其细胞内具有活性。例如，所述的动物可以是哺乳纲的动物，包含人、非人灵长类动物(猴、猩猩)、家畜与农畜(例如，猪、绵羊、牛)，鼠(小鼠)，以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔)等等。
如本文所用，所述“细胞”是指具有一般意义上的基因组的细胞，且CRISPR/Cas9体系在其内具有活性。其可以是动物细胞，也可以是植物细胞或微生物细胞。所述的细胞包括(但不限于)：分裂细胞，非分裂细胞，体组织细胞。例如，所述的细胞包括(但不限于)：受精卵细，胞神经细胞(如神经元细胞，星型胶质细胞等)，瘤细胞(如神经瘤细胞等)，干细胞(如胚胎干细胞，骨髓干细胞等)，肝细胞。
如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”或“可操作性地构建”是指两个或多个核酸区域或核酸元件的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的核酸与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，所述的“元件”是指一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种构建物(构建体)。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，所述的“构建物”包括“质粒”。
基因编辑的供体
本发明的对细胞基因组进行定向基因编辑方法，即同源介导的末端接合法(HMEJ)，提供了特别涉及的供体构建物。
本发明的供体构建物，该构建物依次(5’→3’)包括：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的200～2000bp的序列互补；并且，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列。
本发明的供体构建物中，5’同源臂以及3’同源臂，是“长同源臂”，其序列长度约在200～2000bp，较佳地为300～1500bp，更佳地为500～1200bp，如600bp、800bp、1000bp。对于本领域技术人员而言，同源臂的设计是常规的技术，在本发明的揭示下，可以方便地获得所述同源臂。
本发明的供体构建物中，所述的sgRNA靶向序列1以及sgRNA靶向序列2，与位于基因组中待编辑基因区域区域的sgRNA靶向序列一样，均是能够被sgRNA所识别的序列，从而，配合Cas9蛋白的作用，能在相应的位点发生切割。根据实际操作所需，所述的sgRNA靶向序列1以及sgRNA靶向序列2可以设计为相同的序列，也可以设计为不同的序列。例如，为了操作简易的目的，可以将sgRNA靶向序列1以及sgRNA靶向序列2设计为相同或反向互补的序列，从而可以以同一sgRNA来对其进行切割。
本发明的供体构建物中，所述的“基因操作序列”设置有与野生型基因序列相比发生基因片段缺失的序列，从而当该基因操作序列被替换入细胞基因组后，细胞基因组定向地发生基因片段的删除；或者，所述的“基因操作序列”设置有与野生型基因序列相比发生外源基因片段插入的序列，从而当该基因操作序列被替换入细胞基因组后，细胞基因组定向地发生外源基因或基因片段的插入。也可以进行点突变、基因序列替换的操作。此外，所述的“基因操作序列”也可设置有与野生型基因序列相比基本相同，但部分碱基发生修饰的序列，从而当该基因操作序列被替换入细胞基因组后，细胞基因组定向地发生基因修饰。
应理解，本发明的供体构建物中的各个元件(即：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2)是根据所需进行基因编辑的细胞或物种的基因组序列进行设计的。在本发明所揭示的框架下，本领域技术人员可根据所需进行基因编辑的细胞或物种的不同，设计出序列不同的元件、组成序列不同的构建物，这也应被包含在本发明的范围内。
在供体构建物的构建中，基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。所述的质粒中各元件的上游以及下游的位置，还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。
通常，所述的供体构建物为一种质粒或被包含在质粒中，所述的质粒可被引入到细胞中。因此，本发明还包括一种质粒，其含有本发明所述的供体构建物，以及其它对于细胞转化、阳性转化子筛选有用的元件。
基因编辑方法及应用
基因的定向整合可以通过多种策略来实现，包括同源重组(HR)、微同源臂介导的末端接合(MMEJ)或者非同源末端接合(NHEJ)。在动物胚胎和组织中，常用的HR策略的基因定向整合效率低下，因为它通常只发生在细胞分裂时。这里，本发明人提出了HMEJ策略，使CRISPR/Cas9介导的DNA切断同时发生在转基因供体质粒(含有向导RNA靶向位置和长同源臂HA)和靶向基因组。
一方面，本发明提供了一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法，所述方法包括：在细胞内引入本发明所述的供体构建物，sgRNA或能形成所述sgRNA的构建物、Cas9mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的构建物，对细胞基因组进行基因编辑。
另一方面，本发明提供了一种制备基因组发生定向基因编辑的动物的方法，所述方法包括：在动物受精卵内引入本发明所述的供体构建物，sgRNA或能形成所述sgRNA的构建物、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的构建物，对动物受精卵基因组进行基因编辑；使动物受精卵发育产生所述的目标基因的基因功能完全敲除或大部分敲除的基因敲除动物。
本发明的高效的基因编辑方法可以应用于在基因组的特定位点插入各种外源基因。所述外源基因可以是任何本领域技术人员感兴趣的基因，包括报告基因(比如荧光蛋白基因)、结构基因、功能性基因等。本发明的方法也适用于给内源基因(目标基因)添加标签蛋白编码基因等。
本发明的高效的基因编辑方法也适用于在基因组的特定位点删除一个或多个基因或删除某个基因片段。
在本发明的具体实施例中，数据显示，在原代星形胶质细胞和神经元细胞中，HMEJ方法具有很高的DNA敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎或者体内的肝细胞和神经元中，该方法的效率均远高于以HR、NHEJ和MMEJ为基础的策略。因此，多种类型的细胞以及多种动物的实验结果表明，本发明的HMEJ方法还具有多种应用，譬如通过基因编辑来获得动物模型，靶向基因治疗等。
基于本发明的基因编辑方法可以实现精准的基因编辑，因此其一个重要的应用在于针对疾病的基因治疗。对于特定的导致疾病发生的基因，可以通过设计适当的基因操作序列，实现在基因组位置上的精确的基因编辑，消除致病因素。所述的操作例如可以在受精卵的阶段进行。传统的基因治疗通常是用基因同源重组或者慢病毒递送的方法进行，但是基因同源重组效率很低，慢病毒载体可以随机插入到受体基因组而存在安全隐患。本发明的基因编辑方法有望于克服这些问题，推进基因治疗技术的进一步发展。
对于一些遗传性疾病，例如地中海贫血、镰状细胞性贫血、杜氏营养不良等等已经确定为遗传性的疾病，可以藉由本发明的基因编辑技术，对于受精卵进行基因编辑，构建基因组中相应基因被编辑的个体。
对于致病基因已知的肿瘤，可以运用本发明的基因编辑方法，构建相应的基因突变的细胞或动物水平的模型，应用于进行肿瘤进展机制、治疗手段及效果方面的分析研究。对于致病机制不清楚的肿瘤，可以运用本发明的基因编辑方法，研究特定基因在疾病进程中的作用。
对于病毒感染性疾病，可以改造病毒宿主细胞使其免于感染，或者靶向病毒使其不能完成复制和传播。
本发明的基因编辑，也可与诱导多能干细胞技术相结合，基于患者定制个性化治疗方案。例如，将患者来源的皮肤细胞诱导分化为诱导型多能干细胞，再通过本发明的基因编辑技术修复血红蛋白β-球蛋白基因。
基因编辑试剂盒
本发明还提供了包含有所述供体构建物(包括：含有该供体构建物的质粒)的试剂盒。较佳地，该试剂盒中还可包括sgRNA或能形成sgRNA的构建物；以及Cas9 mRNA或能形成Cas9 mRNA的构建物。
其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用，例如显微注射用的试剂等。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
动物
所有操作步骤都经过中国科学院神经科学研究所的动物伦理委员会的许可。小鼠在神经科学研究所的动物设施中进行饲养和繁殖，昼夜周期为12小时的光-暗周期。C57BL/6小鼠从斯莱克实验动物公司购买。
引物
本发明的后续实施例中所使用的引物如表1。
表1
质粒构建
为了构建Cas9-sgRNA-EGFP表达质粒，本发明人用BbsI酶消化来线性化一个改进版pX330(Addgene，货号42230)，该质粒表达Cas9-CMV-EGFP和sgRNA，随后用胶纯化。每个靶向位点都合成一对寡核苷酸(用于连入pX330形成sgRNA)，经过磷酸化，变性，连接至这个线性化的pX330。
为了构建小鼠Actb基因的HMEJ供体(表2)，供体DNA(800bpHAL-p2A-mCherry-800bpHAR)两边带有23nt的Actb-sgRNA靶向序列，U6-Actb-sgRNA表达盒和EF1a-EGFP表达盒亚克隆至pAAV质粒(Addgene，货号37083)的ITR之间。
为了构建小鼠Actb基因的HR供体(表2)，mChery，EF1a-EGFP，5’和3’同源臂(800bp)从pAAV-EF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA(Addgene，货号37083)，CAG-GFP-IRES-CRE(Addgene，货号48201)或小鼠基因组获得，然后将供体片段(800bpHAL-p2A-mCherry-800bpHAR)、U6-Actb-sgRNA表达盒和EF1a-EGFP表达盒插入至pAAV载体(Addgene，货号37083)的ITR之间。
为了构建小鼠Actb基因的MMEJ供体(表2)，供体DNA(HAL-p2A-mCherry-HAR)两边带有23nt的Actb-sgRNA靶向序列，U6-Actb-sgRNA表达盒和EF1a-EGFP表达盒亚克隆至pAAV质粒(Addgene，货号37083)的ITR之间。
为了构建小鼠Actb基因的NHEJ供体(表2)，供体DNA(p2A-mCherry)两边带有23nt的Actb-sgRNA靶向序列，U6-Actb-sgRNA表达盒和EF1a-EGFP表达盒亚克隆至pAAV质粒(Addgene，货号37083)的ITR之间。
获得的片段或线性化质粒拒用胶回收试剂盒(Omega，D2500-02)进行纯化，用乙醇沉淀浓缩。所有的质粒抽提均使用Plasmid Mid Kit(Qiagen，12143)，并且用DNA测序来鉴定。
表2、靶向Actb位点敲入2A-mCherry的供体序列
细胞培养和转染
小鼠胚胎干细胞(129/Sv×C57BL/6ES细胞和E14细胞)用2i培养基，成分为DMEM培养基(Gibco，11965-02)、15％胎牛血清(FBS)(Gibco)、1000U/ml小鼠Lif、2mM谷氨酰胺(Sigma)、1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1μM PD0325901和3μM CHIR99021。N2A细胞用DMEM(Gibco，11965-02)加上10％FBS(Gibco)、1％非必需氨基酸和1％青霉素/链霉素进行培养。所有细胞都在5％CO2、37℃下培养。小鼠胚胎干细胞用Lipofectamine3000试剂(Invitrogen)根据说明书的指导进行转染。六孔板的每个孔，所使用的质粒总量为5μg(Cas9:MMEJ供体＝1:1)。48小时后，转染成功的ES细胞用BD FACS AriaII流式细胞仪分选种至六孔板，进行后续培养和分析。
原代星形胶质细胞的分离培养根据之前报道的方法进行操作。原代星形胶质细胞从P5-P7小鼠的背侧中脑中获得，并且用特定培养基培养，培养基成分为DMEM/F-12、10％胎牛血清(Invitrogen)、青霉素/链霉素(Invitrogen)并添加B27(Invitrogen)、10ng/ml表皮生长因子(EGF)、10ng/ml成纤维细胞因子(FGF2)。原代神经元细胞从E14.5的C57小鼠脑皮层中获得，然后以2×105细胞/孔的密度种到包被了多聚D,L鸟氨酸的盖玻片上，并且用含5％胎牛血清的培养基预孵育。1个小时后，培养基换成含有2％B27(Invitrogen)、1％Glutamax(Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)的无血清的Neurobasal培养基。所有细胞都在5％CO2、37℃下培养。每三天以半液的方式进行换液。
受精卵注射、胚胎培养和胚胎移植
为了获得基因编辑小鼠，超排B6D2F1(C57BL/6X DBA2J)母鼠(7-8周大)，然后与B6D2F1公鼠交配，然后从输卵管中获得受精卵。Cas9 mRNA(100ng/μl)、sgRNA(50ng/μl)和供体载体(100ng/μl)混合，注射到受精卵的胞浆内，受精卵在含有5μg/ml细胞松弛素(CB)的HEPES-CB操作液中，可观察到明显的原核。注射使用FemtoJet microinjector(Eppendorf)仪器，使用持续液流模式。注射后的胚胎在37℃、5％CO2的情况下在含氨基酸的KSOM培养基中培养至囊胚，随后进行荧光观察。为了获得基因敲入小鼠，注射后的受精卵培养至2-细胞阶段，然后25-30枚2-细胞胚胎移植至0.5天的ICR假孕母鼠的输卵管中。
为了在猴子(Macaca fascicularis)中基因编辑，利用腹腔镜来进行卵子采集。在hCG刺激的32-36小时后，从2-8mm直径的卵泡中吸出卵母细胞，收集到的卵母细胞培养在预平衡好的成熟培养基中。阻滞在减数分裂中期II的卵母细胞被用于胞浆内单精注射(ICSI)，然后观察两个原核的出现来判断其是否受精。受精卵中注射Cas9mRNA(100ng/μl)和sgRNA(50ng/μl)和HMEJ供体(50或100ng/μl)。在注射后，胚胎放置在HECM-9培养基中培养7天至桑葚或囊胚阶段，然后收集，抽取基因组并且分析。
子宫内电转
子宫内电转的实验步骤均根据之前文献报道的进行操作。用戊巴比妥钠(50mg/Kg，Sigma)麻醉E14.5怀孕母鼠。每个质粒(EFs-spCas9-NLS-SV40polyA，HDR供体质粒和MMEJ供体质粒)分别都是2μg/μl。质粒用0.005％fast green solution(Sigma)注射到小鼠胚胎的侧脑室。电转时，用仪器ECM830(BTX)，电压35V，时长50ms，间隔950ms电击5次。然后子宫角重新放回腹腔，让胚胎在子宫中继续发育至特定时间点。
高压尾静脉注射和肝细胞分离
所有高压尾静脉注射的质粒均用EndoFree-Midi Kit(Qiagen)制备。高压尾静脉注射时，质粒DNA都用2ml生理盐水重悬，在5-7秒之内通过尾静脉打入到8周龄的雄/雌鼠(C57BL/6J或Fah-/-)。DNA注射量为30μg HDR供体质粒+30μg spCas9，30μgMMEJ供体质粒+30μg spCas9。每次实验的对照为注射等量的HDR供体质粒或MMEJ供体质粒。在注射的5-9天后，C57小鼠处死。分离出的肝叶用于基因组DNA提取或者用4％多聚甲醛固定。肝细胞分离时，原代小鼠肝细胞用标准的两步胶原酶灌注法来获得。然后肝细胞用40％Percoll(Sigma)低速离心(1000rpm，10分钟)来纯化。
免疫染色
免疫染色实验中，小鼠通过蠕动泵(Gilson)用先0.9％生理盐水后4％多聚甲醛进行心脏灌流，然后在4℃固定过夜。然后组织用30％的蔗糖脱水直到沉到管子底部。用LeicaCM1950-Cryostat将大脑组织切成40μm的厚度，肝脏组织切成10μm。切片用0.1M磷酸缓冲液(PB)洗三遍，然后用5％NGS稀释的一抗兔抗mCherry(1:3000，GeneTex)在4℃孵育过夜。第二天，切片用PB洗三遍，然后在回转式摇床上用二抗Cy3-AffiniPure羊抗兔IgG(1：500，Jackson Immunoresearch)室温孵育两小时。最后切片用DAPI复染20分钟，在载玻片上用SlowFade Diamond Antifade Mountant(Life)进行封片。
胚胎基因型分析
在体视显微镜下用玻璃管进行收集和转移单个胚胎。单个胚胎转移至一个PCR管中。1.5μl裂解液(0.1％吐温20、0.1％TritonX-100和4μg/ml蛋白酶K)加入PCR管中。混合物在56℃中反应30分钟，随后95℃反应5分钟。PCR扩增使用巢式引物(补充材料表S2)。ExTaq在95℃、3分钟的条件下被激活，然后PCR的程序为95℃30s，62℃30s和72℃1分钟，这样反复34个循环后，最终72℃延伸5分钟。第二轮PCR反应用上一轮的1μl PCR产物为模板，PCR反应体系与上轮一样。最终的PCR产物割胶回收，并且测序。
数据分析
所有数据值都以平均值±标准差的形式来展示。数据之间的差异显著性用p<0.05来判断。
实施例1、在体外通过HMEJ方法进行基因组编辑
本发明人首先用CRISPR/Cas9的技术来检测HMEJ介导的方式在体外是否会比HR、NHEJ和MMEJ介导的方式具有更强的敲入能力。
本发明人用四种类型的供体来比较敲入效率：一个HMEJ供体(sgRNA靶向位置序列加上800bp长度的同源臂)、一个HR供体(只有长同源臂)、一个NHEJ供体(只有sgRNA靶向位置序列)以及一个MMEJ供体(sgRNA靶向位置加上20bp的微同源臂)(图1)。为了评估敲入效率，在小鼠胚胎干细胞(ES)中将一个p2A-mCherry报告基因融合到Actb基因的最后一个编码子处，通过mCherry+细胞的比例来呈现敲入效率(图2A和2B)。在小鼠ES细胞转染了供体质粒和Cas9/sgRNA后的第7天，本发明人观察到用HMEJ供体(7.54±0.37％)和HR供体(7.55±0.22％)比MMEJ供体(1.14±0.16％)和HR供体(0.21±0.04％)有显著更高的敲入效率(图2C)。并且，基因型鉴定结果显示，HMEJ和HR介导的基因敲入方式可以做到在5’和3’接合处实现精确的同框整合(图7)。
接下来本发明人检测了其他位点上(Tubb3、Rosa6、Sox2和Nanog)的敲入效率，并且使用不同大小的插入片段(尺寸从0.7至6.1kb)，观察到了同样的趋势(图2C、2D和图8)。此外，本发明人还检测，N2a细胞(小鼠神经瘤细胞株)内的Actb、Tubb3和Rosa26位点处的HMEJ方法效率，也观察到了HR或者HMEJ方法比NHEJ和MMEJ方法具有显著更高的敲入效率(图2E)。
为了探究在运用HMEJ方法时同源臂(HA)长度是否会影响敲入效率，本发明人设计了一系列HMEJ供体来将p2A-mCherry敲入Actb位点，HA长度在200-1600bp不等。结果发现，800bp和1600bp长度的HA比200bp和400bp长度的HA会有更高的敲入效率(图9)。因为在体内应用和载体构建方面对长度具有限制，用带800bp长度HA的HMEJ供体来进行后续的实验。
本发明人也同样在原代的星形胶质细胞和神经元中比较了上述四种供体在Actb位点的敲入效率。在用慢病毒感染五天后，通过荧光激活细胞分选技术(FASC)检测GFP+细胞中的mCherry+的比例，发现用HR供体的话极少的细胞有敲入情况(图2F)。相反，另外三种用带sgRNA靶向位点供体的方法在原代的星形胶质细胞和神经元中都能有效地将mCherry敲入(图2F)。基因型鉴定结果也确认了通过HMEJ方法可在神经元中做到精确的整合(图10)。
总之，这些结果表明，以HMEJ为基础的策略在小鼠ES细胞和N2a细胞中与HR方法具有相近的转基因敲入效率，但是在原代星形胶质细胞和神经元细胞中却具有出乎意料地更高的DNA敲入效率。
实施例2、通过HMEJ方法在小鼠和猴子胚胎中进行基因组编辑
为了探究HMEJ策略是否能在获得基因修饰小鼠方面提高敲入效率，本发明人注射Cas9 mRNA、靶向Actb基因的sgRNA和一个HMEJ供体至小鼠受精卵中(图3A)。这些注射后的受精卵培养至囊胚阶段，然后通过统计囊胚中mCherry荧光信号来评估敲入效率。有意思的是，本发明人观察到用HMEJ供体(22.7％)比MMEJ供体(11.9％)、HR供体(3.3％)和NHEJ供体(1.4％)能获得更高比例的mCherry+的囊胚(图3B、3C和图11A-C)。此外，基因型检测分析单个通过HMEJ和MMEJ介导方法获得的在Actb位点敲入mCherry+囊胚，可以发现所有检测到的整合均为在5’和3’接合处实现精确的同框整合(图11D-E)。相反，NHEJ介导的方法其基因敲入效率很低，并且在接合处会引入插入删除突变(图11F)。本发明人也检测了HMEJ在其他位点的敲入效率，包括Nanog(多能性标记基因)、Sox2(多能性标记基因)和Cdx2(滋养外胚层标记基因)，同样也是将p2A-mCherry报告基因融合到靶向基因的最后一个密码子处。本发明人发现在所有的这些位点处HMEJ介导的方法具有最高的敲入效率(图3B和3C)。值得注意的是，在mCherry+囊胚中，Nanog和Sox2敲入后mCherry严格地在内细胞团(ICM)中表达而Cdx2敲入后mCherry严格地在滋养外胚层(TE)中表达，说明是正确的整合(图3B)。相反，在Actb敲入的囊胚中，在ICM和TE中都可以观察到mCherry+细胞(图3B)。基因型检测分析单个mCherry+囊胚同样也证实通过HMEJ介导的方法在Nanog、Sox2和Cdx2处的5’和3’接合处能实现精确的同框整合(图12)。
下一步，本发明人通过靶向多巴胺-β-羟化酶(Dbh)基因(该基因是表达酪氨酸羟化酶的神经元的标志性基因)和Sox2，同样是将p2A-mCherry报告基因融合到靶向基因的最后一个密码子处，来评估HMEJ在获得基因修饰小鼠方面的效率(图13A)。在将基因编辑过的胚胎移植入假孕母鼠中后，本发明人用HMEJ方法获得的基因编辑小鼠出生率正常，而且成功地获得了在Dbh(12.1％)和Sox2(26.9％)位点的敲入小鼠，这些效率高于HR和MMEJ介导的方法的效率(图3D和图13B和表3)。对Dbh敲入小鼠的大脑组织进行免疫染色发现，mCherry特异性地在TH+神经元中标达，说明发生了正确的整合(图3E)。接着用基因型鉴定和DNA测序的方法来进一步验证这些敲入小鼠(Dbh和Sox2)体内是精确整合(图13C和D)。总之，这些结果说明，HMEJ介导的方法在获得基因修饰小鼠方面比另外三种方法具有更高的DNA整合效率。
表3、通过HMEJ介导定向整合获得基因敲入小鼠
表注：Cas9 mRNA(100ng/μl)、sgRNA(50ng/μl)和载体(100ng/μl)共注射至受精卵里；发育至2-细胞胚胎后移植入受体体内，获得的新生小鼠进行基因型鉴定。
很有可能是在猴子胚胎中sgRNA的DNA剪切效率低下，导致了至今未有报道成功获得基因敲入猴子的出生。因此，本发明人研究HMEJ介导的方法是否在获得基因敲入猴子会更有效。本发明人把Actb-Intron 4-Exon 5-2A-mCherry插入到Actb的4号内含子中，这样mCherry可以在Actb启动子的控制下进行表达了(图4A)。首先在猴子COS-7细胞中检测sgRNA(sgRNA-1至11)的剪切效率(图14A和B)。根据T7E1实验结果，共注射Cas9 mRNA、相对剪切效率较高的sgRNA5(图14C和D)和HMEJ供体质粒至猴子胚胎中，发现9个囊胚中有5个表达了mCherrry(图4B和4C)。基因型鉴定和测序分析证实了在猴子胚胎中发生了精确整合(图4D至4F)。因此，HMEJ是一种获得基因敲入猴子的有效方法。
实施例3、通过HMEJ方法在体内进行基因组编辑
之前报道中，广泛采用HR为基础的靶向基因组编辑方法在体内的应用效果很差。因此本发明人研究HMEJ是否能应用于在体内的DNA整合。本发明人首先通过子宫内胚胎电转的方法将Actb-HMEJ载体转入E14.5小鼠大脑中(图5A)。电转7天后，大脑切片进行染色和统计。结果发现10.0±0.7％的电转细胞(mCherry+/GFP+，相对效率)其中有mCherry表达(图5B和5C)。反之，分别用HR、NHEJ和MMEJ载体打靶后只有0.8±0.2％、3.6±0.2％和1.3±0.1％的电转细胞为mCherry阳性(图5B和5C)。下一步，本发明人通过尾静脉高压注射将HR、NHEJ、MMEJ和HMEJ的载体传递至小鼠肝脏中，结果发现注射后第7天分别有4.5±0.5％、17.4±1.3％、18.0±1.7％和48.0±2.9％的转染后肝细胞(mCherry+/GFP+，相对效率)有mCherry表达(图5D至5F)。HMEJ在肝细胞中的精确整合在基因型鉴定和DNA测序中得到进一步证实(图15)。
在体内应用方面，本发明人研究HMEJ介导的定向整合是否能通过装载着Cas9和sgRNA/HMEJ载体的腺相关病毒(AAV)来实现。在将HMEJ-AAV注射至成年小鼠的视觉皮层(V1)的三周后，大脑切片染色并且统计(图5G和5H)。与未感染的细胞不同，感染的GFP+细胞中有52.8±11.3％的细胞为mCherry+，并且大部分与NeuN(一种神经元标记)可以共定位，说明HMEJ介导的定向整合可以在非分裂细胞中能高效实现(图5I至5J)。因此，HMEJ为基础的方法在体内比HR、NHEJ和MME方法具有更高的DNA整合效率。
实施例4、HMEJ方法的机制
本发明人研究HMEJ方法是否依赖于HMEJ和HR信号通路(图1)。小鼠ES细胞和神经元细胞在mCherry敲入Actb位点时用NHEJ抑制剂(Scr7或NU7026)和HR抑制剂(咖啡因，一种HR中ATM和ATR激酶的非特异性抑制剂)进行处理(图6A和6B)。本发明人发现，无论是在小鼠ES细胞还是神经元中，分别NHEJ抑制剂或HR抑制剂处理后，能阻碍或促进NHEJ的敲入(图6A和6B)。而在HMEJ介导的敲入实验中，本发明人发现HR抑制剂在小鼠ES细胞中能极大地降低HMEJ介导的基因敲入，但在神经元中没有效果。相反，NHEJ抑制剂在神经元中能够明显的降低HMEJ介导的基因敲入，但是在小鼠ES细胞中没有效果(图6A和6B)。这些结果说明，HMEJ介导的基因敲入在快速分裂细胞中大部分是由HR信号通路介导的，而NHEJ抑制剂在慢分裂或非分裂细胞中影响着HMEJ信号通路(图6C)。这可能是为何HMEJ在分裂和非分裂细胞中均有高的基因敲入效率的原因。
讨论
本发明揭示一种HMEJ为基础的策略，本发明人的上述实施例数据显示，该策略在很多系统中(包括培养中的细胞、动物胚胎和体内组织)是现有的策略中敲入效率最高的。与HR方法相比较，HMEJ方法在小鼠ES细胞和N2a细胞中具有相似的转基因定向敲入效率，并且也受HR抑制剂的影响。然而，HMEJ方法在非分裂细胞、胚胎和体内组织中比HR方法其敲入效率要高很多(6-15倍)，并且不受HR抑制剂影响。MMEJ发生于G1/早S期而NHEJ发生于整个细胞周期，而HR仅发生在S/G2期。该结果提示，HMEJ可能在G1/早S期活化，单链变性(SSA)可能参与在该信号通路中。与MMEJ相比较，HMEJ带有更长可能更稳定的HA，使得整合效率很高。正如图6C中总结的那样，本发明人提出这样一个模型，就是HMEJ方法在分裂细胞中主要是由HR信号通路介导的，而在非分裂细胞、胚胎和体内组织中由HMEJ信号通路介导。想要阐明该方法的具体分子机制需要进一步研究。
最近，一种NHEJ为基础的方法被提出来可以在体内做到有效的基因敲入。然而，本发明人的研究表明NHEJ的修复系统会在接合处引入各式各样的插入删除突变，使得这种方法难以做到同框地将内外源基因融合形成嵌合体蛋白。更重要的是，NHEJ为基础的定向整合只会将载体DNA片段引入切割位点，使得不适合将突变序列(比如点突变)替换成正确的。相反，HMEJ策略能够凭借同源臂依赖方式导入定向整合，使得DNA片段在基因组内的替换变得具有可操作性。因此，这种HMEJ策略可能可以提供更广阔的基因治疗应用思路。与小鼠ES细胞和N2a细胞相比，人iPSCs可能采用的是HR信号通路和HMEJ信号通路来诱导基因敲入，导致用双切载体比无切口载体的DNA敲入效率要高。
总的来说，本发明的HMEJ方法展示了在小鼠和猴子胚胎中强大的DNA敲入能力，这样可显著的减少实验中所需要的动物数量，特别是对非人灵长类模型来说。因为比NHEJ方法具有更高效更精确的编辑能力，HMEJ方法在体内基因替换治疗方面具有更大的前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 一种高效率的基因编辑方法
<130> 173955
<160> 75
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 2385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> HR供体序列
<400> 72
ccgggacctg acagactacc tcatgaagat cctgaccgag cgtggctaca gcttcaccac 60
cacagctgag agggaaatcg tgcgtgacat caaagagaag ctgtgctatg ttgctctaga 120
cttcgagcag gagatggcca ctgccgcatc ctcttcctcc ctggagaaga gctatgagct 180
gcctgacggc caggtcatca ctattggcaa cgagcggttc cgatgccctg aggctctttt 240
ccagccttcc ttcttgggta agttgtagcc tagtcctttc tccatctaaa ggtgacaaaa 300
ctcctgaggc catagtacaa gttaagtctg atttctgtca ctcttctctt aggtatggaa 360
tcctgtggca tccatgaaac tacattcaat tccatcatga agtgtgacgt tgacatccgt 420
aaagacctct atgccaacac agtgctgtct ggtggtacca ccatgtaccc aggcattgct 480
gacaggatgc agaaggagat tactgctctg gctcctagca ccatgaagat caaggtaagc 540
taagcatcct tagcttggtg agggtgggcc ctgtggttgt cagagcaacc ttctaggttt 600
aaggggaatc ccagcaccca gagagctcac cattcaccat cttgtcttgc tttcttcaga 660
tcattgctcc tcctgagcgc aagtactctg tgtggatcgg tggctccatc ctggcctcac 720
tgtccacctt ccagcagatg tggatcagca agcaggagta cgatgagtcc ggcccctcca 780
tcgtgcaccg caagtgcttc ttaattaacg ccactaactt ctccctgttg aaacaagcag 840
gggatgtcga agagaatccc gggccaatgg tgagcaaggg cgaggaggat aacatggcca 900
tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc acatggaggg ctccgtgaac ggccacgagt 960
tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc gccaagctga 1020
aggtgaccaa gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtcccct cagttcatgt 1080
acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacttg aagctgtcct 1140
tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggtgaccg 1200
tgacccagga ctcctccctg caggacggcg agttcatcta caaggtgaag ctgcgcggca 1260
ccaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcct 1320
ccgagcggat gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga gatcaagcag aggctgaagc 1380
tgaaggacgg cggccactac gacgctgagg tcaagaccac ctacaaggcc aagaagcccg 1440
tgcagctgcc cggcgcctac aacgtcaaca tcaagttgga catcacctcc cacaacgagg 1500
actacaccat cgtggaacag tacgaacgcg ccgagggccg ccactccacc ggcggcatgg 1560
acgagctgta caagtaaggc gcgccgcgga ctgttactga gctgcgtttt acaccctttc 1620
tttgacaaaa cctaacttgc gcagaaaaaa aaaaaataag agacaacatt ggcatggctt 1680
tgttttttta aatttttttt aaagtttttt tttttttttt tttttttttt tttaagtttt 1740
tttgttttgt tttggcgctt ttgactcagg atttaaaaac tggaacggtg aaggcgacag 1800
cagttggttg gagcaaacat cccccaaagt tctacaaatg tggctgagga ctttgtacat 1860
tgttttgttt tttttttttt ttggttttgt ctttttttaa tagtcattcc aagtatccat 1920
gaaataagtg gttacaggaa gtccctcacc ctcccaaaag ccacccccac tcctaagagg 1980
aggatggtcg cgtccatgcc ctgagtccac cccggggaag gtgacagcat tgcttctgtg 2040
taaattatgt actgcaaaaa tttttttaaa tcttccgcct taatacttca tttttgtttt 2100
taatttctga atggcccagg tctgaggcct cccttttttt tgtcccccca acttgatgta 2160
tgaaggcttt ggtctccctg ggagggggtt gaggtgttga ggcagccagg gctggcctgt 2220
acactgactt gagaccaata aaagtgcaca ccttacctta cacaaacagc ttgtggctct 2280
gtggctttgc tgggtgtggg gagcaggttg ggtgggtgtg gagctctatt ggggggggca 2340
tctagggtgg gctaggcctt gctgatggta tctagtggga gggct 2385
<210> 73
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> NHEJ供体序列
<400> 73
agtccgccta gaagcacttg cggcgccact aacttctccc tgttgaaaca agcaggggat 60
gtcgaagaga atcccgggcc aatggtgagc aagggcgagg aggataacat ggccatcatc 120
aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag 180
atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg 240
accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc 300
tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acttgaagct gtccttcccc 360
gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc 420
caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac 480
ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctcctccgag 540
cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca agcagaggct gaagctgaag 600
gacggcggcc actacgacgc tgaggtcaag accacctaca aggccaagaa gcccgtgcag 660
ctgcccggcg cctacaacgt caacatcaag ttggacatca cctcccacaa cgaggactac 720
accatcgtgg aacagtacga acgcgccgag ggccgccact ccaccggcgg catggacgag 780
ctgtacaagt aaagtccgcc tagaagcact tgcgg 815
<210> 74
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> NHEJ供体序列
<400> 74
agtccgccta gaagcacttg cggcgccact aacttctccc tgttgaaaca agcaggggat 60
gtcgaagaga atcccgggcc aatggtgagc aagggcgagg aggataacat ggccatcatc 120
aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag 180
atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg 240
accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc 300
tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acttgaagct gtccttcccc 360
gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc 420
caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac 480
ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctcctccgag 540
cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca agcagaggct gaagctgaag 600
gacggcggcc actacgacgc tgaggtcaag accacctaca aggccaagaa gcccgtgcag 660
ctgcccggcg cctacaacgt caacatcaag ttggacatca cctcccacaa cgaggactac 720
accatcgtgg aacagtacga acgcgccgag ggccgccact ccaccggcgg catggacgag 780
ctgtacaagt aaagtccgcc tagaagcact tgcgg 815
<210> 75
<211> 2431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> HMEJ供体序列
<400> 75
agtccgccta gaagcacttg cggccgggac ctgacagact acctcatgaa gatcctgacc 60
gagcgtggct acagcttcac caccacagct gagagggaaa tcgtgcgtga catcaaagag 120
aagctgtgct atgttgctct agacttcgag caggagatgg ccactgccgc atcctcttcc 180
tccctggaga agagctatga gctgcctgac ggccaggtca tcactattgg caacgagcgg 240
ttccgatgcc ctgaggctct tttccagcct tccttcttgg gtaagttgta gcctagtcct 300
ttctccatct aaaggtgaca aaactcctga ggccatagta caagttaagt ctgatttctg 360
tcactcttct cttaggtatg gaatcctgtg gcatccatga aactacattc aattccatca 420
tgaagtgtga cgttgacatc cgtaaagacc tctatgccaa cacagtgctg tctggtggta 480
ccaccatgta cccaggcatt gctgacagga tgcagaagga gattactgct ctggctccta 540
gcaccatgaa gatcaaggta agctaagcat ccttagcttg gtgagggtgg gccctgtggt 600
tgtcagagca accttctagg tttaagggga atcccagcac ccagagagct caccattcac 660
catcttgtct tgctttcttc agatcattgc tcctcctgag cgcaagtact ctgtgtggat 720
cggtggctcc atcctggcct cactgtccac cttccagcag atgtggatca gcaagcagga 780
gtacgatgag tccggcccct ccatcgtgca ccgcaagtgc ttcttaatta acgccactaa 840
cttctccctg ttgaaacaag caggggatgt cgaagagaat cccgggccaa tggtgagcaa 900
gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga 960
gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga 1020
gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga 1080
catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat 1140
ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt 1200
cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat 1260
ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa 1320
gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg 1380
cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac 1440
cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt 1500
ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg 1560
ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa ggcgcgccgc ggactgttac 1620
tgagctgcgt tttacaccct ttctttgaca aaacctaact tgcgcagaaa aaaaaaaaat 1680
aagagacaac attggcatgg ctttgttttt ttaaattttt tttaaagttt tttttttttt 1740
tttttttttt ttttttaagt ttttttgttt tgttttggcg cttttgactc aggatttaaa 1800
aactggaacg gtgaaggcga cagcagttgg ttggagcaaa catcccccaa agttctacaa 1860
atgtggctga ggactttgta cattgttttg tttttttttt tttttggttt tgtctttttt 1920
taatagtcat tccaagtatc catgaaataa gtggttacag gaagtccctc accctcccaa 1980
aagccacccc cactcctaag aggaggatgg tcgcgtccat gccctgagtc caccccgggg 2040
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ccttaatact tcatttttgt ttttaatttc tgaatggccc aggtctgagg cctccctttt 2160
ttttgtcccc ccaacttgat gtatgaaggc tttggtctcc ctgggagggg gttgaggtgt 2220
tgaggcagcc agggctggcc tgtacactga cttgagacca ataaaagtgc acaccttacc 2280
ttacacaaac agcttgtggc tctgtggctt tgctgggtgt ggggagcagg ttgggtgggt 2340
gtggagctct attggggggg gcatctaggg tgggctaggc cttgctgatg gtatctagtg 2400
ggagggctcc gcaagtgctt ctaggcggac t 2431

Claims (18)

1.一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供供体构建物，该构建物依次包括：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；
其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的不小于200bp的序列互补；
其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列；
(2)以(1)的构建物作为供体，以靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA切割细胞基因组的待编辑基因区域，以靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA分别切割sgRNA靶向序列1和sgRNA靶向序列2，通过CRISPR/Cas9方法对细胞基因组进行基因编辑。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括：分裂细胞，非分裂细胞，体组织细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括：受精卵细，胞神经细胞，瘤细胞，干细胞，肝细胞。
4.一种制备基因组发生定向基因编辑的动物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供供体构建物，该构建物依次含有：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；
其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的不小于200bp的序列互补；
其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列；
(2)以(1)的构建物作为供体，以靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA切割细胞基因组的待编辑基因区域，以靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA分别切割sgRNA靶向序列1和sgRNA靶向序列2，通过CRISPR/Cas9方法对动物受精卵进行基因编辑；
(3)使(2)的动物受精卵发育，获得基因组的待编辑基因区域发生精确编辑的动物。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的300～3000bp的序列互补。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的动物为哺乳动物，包括：人，非人灵长类动物，鼠，家畜。
7.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将(1)的供体构建物，靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物、靶向于sgRNA靶向序列1或能形成该sgRNA的构建物、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物，以及Cas9mRNA或能形成Cas9蛋白的构建物共转入细胞中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，能形成靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA的构建物，能形成靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA的构建物，能形成靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA的构建物，能形成Cas9蛋白的构建物位于1、2或多个表达载体上。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA、sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2是相同的sgRNA或不同的sgRNA。
10.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的基因编辑包括：针对细胞基因组的待编辑基因区域，进行：外源基因插入，基因片段删除，点突变，基因片段替换，基因修饰。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的外源基因插入包括：将外源基因设置于(1)的基因操作序列中，从而当将该基因操作序列被替换入细胞基因组后，该外源基因被定向地插入到细胞基因组中。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的基因片段删除包括：在(1)的基因操作序列中，设置与野生型基因序列相比发生基因片段缺失的序列，从而当该基因操作序列被替换入细胞基因组后，细胞基因组定向地发生基因片段的删除。
13.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，通过所述的基因编辑，进行基因治疗。
14.一种用于对细胞基因组进行定向基因编辑或用于基因治疗的供体构建物，其用于对细胞基因组进行定向基因编辑，该构建物依次包括：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；
其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的200～2000bp的序列互补；
其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列。
15.权利要求14所述的供体构建物的用途，用于作为对细胞基因组进行定向基因编辑的供体；或用于制备进行基因治疗的组合物或试剂盒。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的基因编辑包括：针对细胞基因组的待编辑基因区域，进行：外源基因插入，基因片段删除，点突变，基因片段替换。
17.一种用于对细胞基因组进行定向基因编辑或用于基因治疗的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
权利要求11或12所述的供体构建物；
靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物；
靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物；
靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：Cas9mRNA或能形成Cas9蛋白的构建物。
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Applicant after: Huida (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd.

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