CN104334017B - 尿激酶型纤溶酶原激活剂转基因小鼠 - Google Patents

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Abstract

本发明提供虽然以杂合体型具有uPA基因，但是对来源于小鼠的肝细胞的损伤度高的肝损伤小鼠及其高效的制作方法。以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠的制作方法，包括以下工序：(i)利用DNA片段转化小鼠ES细胞的工序，所述DNA片段含有肝特异性启动子/增强子以及在它们的控制下可驱动地被连接的编码尿激酶型纤溶酶原激活剂的cDNA；(ii)将工序(i)得到的转化了的小鼠ES细胞注入宿主胚胎的工序；(iii)将工序(ii)得到的注入了ES细胞的宿主胚胎移植到代孕母小鼠的子宫获得嵌合体小鼠的工序；以及(iv)将工序(iii)得到的嵌合体小鼠交配，得到以杂合体型导入了该DNA片段的转基因小鼠的工序。

Description

尿激酶型纤溶酶原激活剂转基因小鼠
技术领域
本发明涉及将含有肝特异性启动子/增强子和在它们的控制下可驱动地被连接的编码尿激酶型纤溶酶原激活剂的cDNA的DNA片段导入ES细胞并使用该ES细胞制作的以杂合体型导入该DNA片段的肝损伤小鼠。
背景技术
通常，在人疾病的研究中期望使用人的细胞进行实验。特别是，在确认物种特异性的多个药物代谢酶、宿主局限于人的病毒等所参与的疾病的研究中，需要使用人细胞，特别是人肝细胞。但是，人肝细胞的供给受到限制，维持人肝细胞的分化状态的状态下在体外(invitro)进行增殖是非常困难的。对于人肝细胞的增殖，利用生物体内的环境是比较高效的。即，尝试通过将人肝细胞移植到对以免疫缺陷化的小鼠作为遗传背景的小鼠导入促进小鼠肝细胞死亡的基因而成的转基因小鼠，使人肝细胞增殖，从而大量地将小鼠肝细胞置换为人肝细胞。
病毒对人的肝脏感染所引起的肝疾病是近年来医疗领域所面对的难以治疗的疾病之一。对这些感染人肝细胞的病毒具有感受性的动物种类局限于人、猩猩。为了开发针对这些病毒感染的治疗药，需要使用人的肝细胞的试验。另外，也认为肝细胞对药物代谢发挥重要的作用，各个药物在人体中的代谢途径的阐明与新的医药品的开发相关。但是，很多的药物代谢酶存在物种特异性，为了阐明人体中的药物代谢途径，需要使用人肝细胞进行试验。
对于丙型肝炎病毒(HCV)，据推测在日本丙型肝炎病毒的持续感染者(HCV携带者)有约150万人，除此以外约40-50万人正在接受治疗，据说接受干扰素给药的丙型慢性肝炎的患者一年有3-4万人。最近，将病毒基因组的各种部位作为靶标的新的抗病毒药正在开发中，但是，由于没有可信性、再现性高的HCV用动物模型，因此其进展受到很大阻碍。这并不局限于HCV，也可以说乙型肝炎病毒(HBV)等其它病毒性肝炎也是同样的。由于这些病毒仅以人和猩猩作为宿主，因此在使用动物的大规模抗病毒药的开发研究中，人肝细胞与宿主肝细胞置换的小型模型动物的开发受到期待。
脂肪肝是以中性脂肪向肝脏的蓄积为原因而发病，但是，近年来通过脂肪在肝脏中蓄积而引起的肝炎，即非酒精性脂肪性肝炎(NASH：Non-alcoholicsteatohepatitis)增加，这一疾病是有可能发展为慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌等预后不良疾病的疾病。另一方面，指出不存在对这样的肝疾病有效的治疗药(非专利文献1)。在这一治疗药开发中也需要最合适的动物模型的存在。
对于以上的疾病研究，如果能够利用置换为人肝细胞的模型动物，则有助于很多药物开发研究。但是，对于该模型动物的制作而言，将人肝细胞移植到作为宿主的动物之后，需要人肝细胞高效地增殖，与宿主的肝细胞进行置换。
目前为止，通过使尿激酶型纤溶酶原激活剂(以下简称“uPA”)基因肝脏特异性表达，制作了若干对小鼠肝细胞造成损伤的转基因小鼠，报告了若干对该小鼠移植人肝细胞的例子。报告了使用uPA基因组序列制作的uPA转基因小鼠(非专利文献2)、使用uPA的cDNA制作的uPA转基因小鼠(非专利文献3)。这些uPA转基因小鼠均以杂合体型具有uPA基因的情况下，被移植的人肝细胞生存是困难的，因此需要以纯合体型具有uPA基因。但是，为了制作以纯合体型具有uPA基因的转基因小鼠，需要至少2代，最短也需要6个月，而且相对得到的小鼠的总数，仅能以约25％的比例得到纯合体型小鼠，在短时间内制作大量的以纯合体型具有uPA基因的转基因小鼠是困难的。另外，基于同样的理由，制作与其它的转基因小鼠的杂交系是困难的。而且，以往使用uPA基因组序列的转基因小鼠随着时间的经过，肝脏中导入的uPA基因发生重组，观察到uPA基因的脱落，uPA基因脱落的小鼠细胞再生为二次肝细胞，因此即使将人肝细胞移植入杂合体型小鼠，生存也是困难的。此外，即使是纯合体型，也频繁发现由于uPA基因的脱落所致的小鼠肝细胞的再生而引起生存的人肝细胞渐渐减少的小鼠。在本领域期望能够高效地大量生产的以及能够容易制作与其它转基因小鼠的杂交系的uPA转基因小鼠。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:NEnglJMed.346：1221-31(2002)
非专利文献2:Cell66：245-256(1991)
非专利文献3:BBRC377：248-252(2008)
发明内容
本发明提供虽然以杂合体型具有uPA基因，但是对来源于小鼠的肝细胞的损伤度高的肝损伤小鼠及其高效的制作方法。
本发明人等为了解决上述课题进行锐意研究，结果发现将可驱动地连接有肝特异性启动子/增强子和在它们的控制下编码尿激酶型纤溶酶原激活剂的cDNA的DNA片段导入小鼠ES细胞，通过利用该ES细胞，能够高效制作虽然以杂合体型具有uPA基因但是对来源于小鼠的肝细胞的损伤度高的转基因小鼠。另外，发现该转基因小鼠中，即使经过时间，导入的uPA基因也不发生或基本不发生脱落。
进而发现，使用该转基因小鼠制作的免疫缺陷肝损伤小鼠，能够使移植的人肝细胞生存。
本发明是基于这些发现的发明。
即，本发明包含以下内容。
[1]一种以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠的制作方法，其具有以下工序：
(i)利用DNA片段转化小鼠ES细胞的工序，所述DNA片段含有肝特异性启动子/增强子和在它们的控制下可驱动地被连接的编码尿激酶型纤溶酶原激活剂的cDNA；
(ii)将工序(i)得到的转化了的小鼠ES细胞注入宿主胚胎的工序；
(iii)将工序(ii)得到的注入了ES细胞的宿主胚胎移植到代孕母小鼠的子宫获得嵌合体小鼠的工序；以及
(iv)将工序(iii)得到的嵌合体小鼠交配，得到以杂合体型导入该DNA片段的转基因小鼠的工序。
[2]根据[1]所述的方法，进一步具有(v)获得2～3周龄的血清ALT值是30(Karmen单位)以上的转基因小鼠的工序。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，肝特异性启动子是白蛋白启动子。
[4]利用[1]～[3]的方法制作的肝损伤小鼠及其一部分。
[5]一种免疫缺陷肝损伤小鼠，是通过将[4]所述的肝损伤小鼠与SCID小鼠交配而得到的。
[6]一种嵌合体小鼠的制作方法，其特征在于，包括将人肝细胞移植到[5]所述的免疫缺陷肝损伤小鼠，该嵌合体小鼠具有含有人肝细胞的嵌合体肝。
[7]一种嵌合体小鼠，其特征在于，具有利用[6]所述的方法制作的含有人肝细胞的嵌合体肝。
[8]一种嵌合体小鼠，其特征在于，其免疫缺陷，以杂合体型具有DNA片段，且具有含有人肝细胞的嵌合体肝，所述DNA片段含有肝特异性启动子/增强子以及在它们的控制下可驱动地被连接的编码尿激酶型纤溶酶原激活剂的cDNA。
[9]根据[7]或[8]所述的嵌合体小鼠，其中，人肝细胞占嵌合体肝的肝细胞的至少10％。
[10]根据[7]或[8]所述的嵌合体小鼠，其中，人肝细胞在嵌合体肝中保持其功能和特性至少2周以上。
[11]一种对人肝功能产生影响的物质的筛选方法，具有以下的(a)～(c)工序：
(a)将被检物质给予到[7]～[10]中任一项所述的嵌合体小鼠的工序；
(b)对在(a)中给予了该被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的一个以上进行测定的工序；以及
(c)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、和总胆红素值进行比较，选择(b)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的任意一个以上产生增减的被检物质的工序。
[12]一种评价被检物质对人肝细胞的毒性的方法，具有以下的(a)～(c)工序：
(a)将被检物质给予到[7]～[10]中任一项所述的嵌合体小鼠的工序；
(b)对在(a)中给予了该被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的一个以上进行测定的工序；以及
(c)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值进行比较，将(b)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的任意一个以上的增减作为指标，评价该被检物质对人肝细胞的影响的工序。
[13]一种对病毒性肝炎的治疗有效的物质的筛选方法，具有以下的(a)～(d)工序：
(a)对[7]～[10]中任一项所述的嵌合体小鼠接种肝炎病毒的工序；
(b)对在(a)中接种了肝炎病毒的该嵌合体小鼠给予被检物质的工序；
(c)对在(b)中给予了被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量中的一个以上进行测定的工序；以及
(d)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒蛋白质量进行比较，选择在(c)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量中的任意一个以上产生变化的被检物质的工序。
[14]根据[13]所述的方法，其中，肝炎病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2012-102814号的说明书和/或附图记载的内容。
附图说明
图1是表示受精卵用的uPA基因插入用载体“mAlbuPAInt2”的示意图。SV40pA：SV40polyA信号；mAlbPro/En：小鼠白蛋白的增强子/启动子；uPAcDNA：小鼠uPA的ORF部分；exon-intron-exon：兔β球蛋白的第2外显子、内含子、第3外显子；polyA+约50bp：兔β球蛋白的第3外显子中的polyA信号。
图2是表示ES细胞用的uPA基因插入用载体“mAlbuPAInt2ES”的示意图。SV40pA：SV40polyA信号；mAlbPro/En：小鼠白蛋白的增强子/启动子；uPAcDNA：小鼠uPA的ORF部分；exon-intron-exon：兔β球蛋白的第2外显子、内含子、第3外显子；polyA+约50bp：兔β球蛋白的第3外显子中的polyA信号。
图3表示介由ES细胞制作的uPA转基因小鼠中的ALT值等的测定结果。
图4表示向#1C2小鼠移植人肝细胞后14周龄前的小鼠血中人白蛋白浓度(上)和体重(下)的测定结果。实线表示纯合小鼠，点线表示杂合小鼠。
图5表示向#2C7小鼠移植人肝细胞后14周龄前的小鼠血中人白蛋白浓度(上)和体重(下)的测定结果。实线表示纯合小鼠，点线表示杂合小鼠。
图6表示使用#1C2纯合小鼠、杂合小鼠、#2C7纯合小鼠制作的嵌合体小鼠肝脏切片的利用人细胞角蛋白8/18抗体的免疫染色照片。
图7表示使用14周龄(上)和30周龄(下)的#1C2纯合小鼠、杂合小鼠、#2C7纯合小鼠制作的嵌合体小鼠肝脏的置换率和小鼠血中人白蛋白浓度的测定结果。
图8-1表示使用#1C2纯合小鼠、杂合小鼠制作的嵌合体小鼠的、接种HCV前的小鼠血中人白蛋白浓度(左)和接种后的小鼠血清中各病毒的拷贝数(右)。实线表示纯合小鼠，点线表示杂合小鼠。
图8-2表示使用#1C2纯合小鼠、杂合小鼠制作的嵌合体小鼠的、接种HBV前的小鼠血中人白蛋白浓度(左)和接种后的小鼠血清中各病毒的拷贝数(右)。实线表示纯合小鼠，点线表示杂合小鼠。
图9-1表示使用#2C7纯合小鼠制作的嵌合体小鼠的、接种HCV前的小鼠血中人白蛋白浓度(左)和接种后的小鼠血清中HCV拷贝数(右)。
图9-2表示使用#2C7纯合小鼠制作的嵌合体小鼠的、接种HBV前的小鼠血中人白蛋白浓度(左)和接种后的小鼠血清中HBV拷贝数(右)。
图10表示向#1C2小鼠移植人肝细胞后30周龄前的小鼠血中人白蛋白浓度(上)和体重(下)的测定结果。实线表示纯合小鼠，点线表示杂合小鼠。
图11表示向#2C7小鼠移植人肝细胞后30周龄前的小鼠血中人白蛋白浓度(上)和体重(下)的测定结果。实线表示纯合小鼠，点线表示杂合小鼠。
具体实施方式
以下，对本发明做详细说明。
本发明的肝损伤小鼠，以杂合体型具有DNA片段，该DNA片段含有肝特异性启动子/增强子和在它们的控制下可驱动地被连接的编码尿激酶型纤溶酶原激活剂的cDNA，由此uPA被肝脏特异性表达，来源于小鼠的肝脏细胞(特别是肝细胞)至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或其以上受到损伤，增殖被抑制和/或发生坏死。
本发明的肝损伤小鼠虽然以杂合体型具有uPA基因，但是对来源于小鼠的肝细胞的损伤度高，与已有公知的uPA转基因小鼠不同，可以不以纯合体型具有uPA基因。
本发明的肝损伤小鼠，按照已有公知的转基因动物的制作方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：7380-7384(1980))，将含有肝特异性启动子/增强子和在它们的控制下可驱动地被连接的编码uPA的cDNA的DNA片段导入小鼠ES细胞，使用得到的ES细胞而能够制作。
“启动子/增强子”是指具有能够提供启动子和增强子两种功能的序列的DNA。
作为“肝特异性启动子”，只要能够肝脏特异性诱导与其3’端连接的基因的表达即可，没有特别限制，例如可举出白蛋白启动子、α-胎蛋白启动子、α1-抗胰蛋白酶启动子、转铁蛋白转甲状腺素蛋白启动子、血清淀粉样蛋白A启动子、转甲状腺素蛋白启动子、肝细胞核因子6(HNF-6)启动子等。优选为白蛋白启动子。
“肝特异性启动子/增强子”能够肝脏特异性表达目的基因即可，可以是内源性、外源性、同种、异种、人工的任意一个启动子，优选使用来源于小鼠的肝特异性启动子/增强子。来源于小鼠的肝特异性启动子/增强子在本领域是公知的，例如可以利用白蛋白启动子/增强子。来源于小鼠的白蛋白启动子/增强子是公知的(HerbstRSetal，ProcNatlAcadSciUSA.1989Mar；86(5)：1553-7；HeckelJLetal.，Cell1990Aug10；62(3)：447-56)，通过进行对该白蛋白启动子/增强子使用特异性引物，以小鼠基因组文库作为模板的PCR而能够得到。
编码uPA的cDNA，可以是内源性、外源性、同种、异种的任意一个，优选使用来源于小鼠的编码uPA的cDNA。编码uPA的cDNA，通过本领域技术人员公知的常用的方法就能够得到，即，通过以从肝脏提取的RNA为模板，对编码uPA的基因使用特异性引物进行逆转录PCR就能够得到。编码uPA的基因，在上述公开的数据库中以登录号：NM008873被登录，本发明中可以利用该基因信息(本说明书中，记载了编码uPA的基因作为序列号11)。应予说明，本说明书中，关于本发明而记载的uPA基因是指编码uPA的cDNA，这些术语可以相互交换使用。
“肝特异性启动子/增强子和在它们的控制下可驱动地被连接的编码uPA的cDNA”是指肝特异性启动子/增强子和以在它们的控制下uPA被表达的方式配置编码uPA的cDNA。
将含有肝特异性启动子/增强子和在它们的控制下可驱动地被连接的编码uPA的cDNA的DNA片段导入ES细胞(胚胎干细胞)。
DNA片段导入ES细胞的方法，可以通过磷酸钙法、电脉冲法、脂转染法、凝集法、微注射法、粒子枪法、DEAE-葡聚糖法等(不受这些方法的限制)进行。
导入了DNA片段的ES细胞能够在体外培养，由此能够筛选出导入成功的和/或导入的DNA片段不脱落的细胞。接下来，将得到的ES细胞注入宿主胚胎、优选小鼠胚泡，然后，移植到代孕母小鼠的子宫角，通过使其发育从而诞生转基因小鼠(嵌合体小鼠)。代孕母小鼠，通常利用与切断输精管的雄鼠交配并处于假妊娠状态的雌鼠。
在确认出生的转基因小鼠(嵌合体小鼠)引入上述DNA片段的基础上，为了F1小鼠的诞生，使其与野生型小鼠交配。该交配的结果为，在诞生的F1小鼠中，体细胞中具有上述DNA片段的小鼠(杂合体型)是能将上述DNA片段传给生殖细胞的转基因小鼠。
本发明的肝损伤小鼠只要是导入的上述DNA片段是杂合体型，则可以是上述转基因小鼠的任意一个代小鼠。杂合体型的选择，例如，将从F1小鼠尾部分离提取的染色体DNA利用SouthernHybridization或PCR法进行筛选从而能够检测。
而且，对于得到的转基因小鼠，选择血清ALT(丙氨酸氨基转移酶)值在2～3周龄是30(Karmen单位)以上的小鼠。优选在3周龄或4周龄血清ALT值为30(Karmen单位)以上的小鼠，进一步优选在6周龄血清ALT值为45、50或55(Karmen单位)以上的小鼠，特别优选在8周龄血清ALT值为60、65、或70(Karmen单位)以上的小鼠。血清ALT值成为肝损伤程度的指标，该值越高表示肝损伤程度越高。
本发明的肝损伤小鼠制作中使用的上述ES细胞、胚泡，没有特别限制，能够利用来源于各种小鼠系统的细胞，例如，能够利用来源于129SvEv小鼠、C57BL/6J小鼠等的细胞。
根据本发明的肝损伤小鼠的制作方法，由于能够以杂合体型具有导入基因，因此能够高效地大量制作该转基因小鼠，虽然得到的转基因小鼠以杂合体型具有uPA基因，但是通过筛选肝损伤度高的小鼠，能够高效选择·制作期望的转基因小鼠。
另外，由于本发明的肝损伤小鼠能够以杂合体型具有uPA基因，因此与以纯合体型具有uPA基因的已有转基因小鼠相比，小鼠的生产率高。即，为了得到大量纯合体型小鼠，首先一度需要大量生产杂合体型雌小鼠。然后，需要通过该杂合体型小鼠之间的体外受精、自然交配来获得纯合体型小鼠，这一过程需要2代，最短也要6个月。而且相对于得到的小鼠总数，仅以约25％的比例得到纯合体型小鼠。与此相对，杂合体型小鼠与由饲养员多次购入的野生型小鼠进行体外受精或自然交配，在次代(1代)中得到大量杂合体型小鼠。这一过程需要的时间最短是3个月。而且，其中得到的小鼠总数的约50％是杂合体型小鼠，其能够在短时间内高率地大量生产必要的小鼠。另外，使用与其它基因突变小鼠(基因缺失、导入的基因等)的杂交系进行实验时，在能够使用杂合体型uPA转基因小鼠的情况下，能够高效得到可用于实验的小鼠。例如，使用导入的uPA基因是杂合体型且另1种基因突变也是杂合体型的小鼠彼此，生产该uPA基因和另1种基因突变两者是纯合体型小鼠的情况下，得到两基因是纯合体型小鼠的比例只不过是得到的小鼠中的约6％，而且，为了得到实验中使用的总计数量的小鼠，在得到雌雄纯合体型小鼠的基础上，有必要进行繁殖、生产。另一方面，得到uPA基因是杂合体型且另1种基因突变是纯合体型的小鼠的比例为约12.5％，与制作两基因为纯合体型的小鼠相比能够以高的制作效率在该时刻得到实验必要的小鼠。这比制作两基因是纯合体型的小鼠早1代，得到仅供实验中使用的总计数量的小鼠。如上文所述，能够使用杂合体型小鼠的情况能够得到高的制作效率，作为其结果，对为了得到实验必要的小鼠而进行饲养的动物室的节省空间化有贡献，且与制作前的时间缩短，使用的小鼠数量大幅削减，实验者的劳力减轻相关。
本发明中，“肝损伤小鼠”也包括该小鼠的一部分。“小鼠的一部分”是指，例如来源于小鼠的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物等(不特别地受到这些的限制)。作为组织，可举出心脏、肺、肾脏、肝脏、胆囊、胰脏、脾脏、肠、肌肉、血管、脑、精巢(睾丸)、卵巢、子宫、胎盘、髓、甲状腺、胸腺、乳腺等，但是不特别地受到这些的限制。作为体液，可举出血液、淋巴液、尿，但是不特别受到这些限制。作为细胞，是指包含于上述组织或体液的细胞，也包括从这些组织分离和培养得到的培养细胞、精子、卵子、受精卵。作为培养细胞，包括初代培养细胞及其细胞系细胞。发展阶段(胚胎期)中的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物等也包含于该小鼠的一部分。应予说明，来源于本发明的肝损伤小鼠的细胞系细胞，能够利用公知的方法建立(胎仔细胞的初代培养方法(新生化学实验讲座、18卷、125页～129页东京化学同人、和小鼠胚的操作指南、262页～264页、近代出版))。
此外，本发明提供免疫缺陷肝损伤小鼠。本发明的免疫缺陷肝损伤小鼠能够作为用于移植人肝细胞的宿主小鼠来利用。本发明的免疫缺陷肝损伤小鼠，通过上述肝损伤小鼠与免疫缺陷小鼠交配能够得到。
作为“免疫缺陷小鼠”，是对来源于异种动物的肝细胞(特别是人肝细胞)没有排斥反应的小鼠即可，例如，可举出显示T细胞和B细胞系缺陷的重症复合免疫缺陷症(SCID：severecombinedimmunodeficiency)小鼠、因遗传性的胸腺缺失而丧失T细胞功能的小鼠(NUDE小鼠)、利用公知的基因靶向法(Science，244：1288-1292，1989)将RAG2基因敲除的小鼠(RAG2敲除小鼠)等，不受到这些限制。优选为SCID小鼠。
本发明的免疫缺陷肝损伤小鼠，以纯合体型具有规定免疫缺陷性状的基因。另外，可以以杂合体型也可以以纯合体型具有包含来源于上述肝损伤小鼠的上述uPA基因的DNA片段。本发明的免疫缺陷肝损伤小鼠即使以杂合体型具有uPA基因，移植的人肝细胞也能够长期生存。作为本发明的免疫缺陷肝损伤小鼠的基因型，例如，可举出uPA(+/－)/SCID(+/+)、uPA(+/+)/SCID(+/+)等。但是不受到这些的限制。
杂合体型和纯合体型的选择，如上文所述，将从得到的仔鼠的尾部分离提取的染色体DNA利用SouthernHybridization或PCR法来筛选从而能够进行。
本发明中，“免疫缺陷肝损伤小鼠”也包括该小鼠的一部分。“小鼠的一部分”如上文定义所示。
进而，本发明提供具有人肝细胞的嵌合体小鼠。本发明的嵌合体小鼠免疫缺陷，以杂合体型导入DNA片段，且具有含有人肝细胞的嵌合体肝，所述DNA片段含有肝特异性启动子/增强子以及在它们的控制下可操作地被连接的编码尿激酶型纤溶酶原激活剂的cDNA。
本发明的嵌合体小鼠，能够通过对上述本发明的免疫缺陷肝损伤小鼠移植人肝细胞而制作。
用于移植的人肝细胞，可以使用从正常的人肝组织，通过胶原酶灌流法这样的常规方法而分离的肝细胞。另外，也可以将分离的肝细胞暂时冷冻保存后解冻使用。或者，也可以将使用胶原酶灌流法这样的方法从用人肝细胞置换的嵌合体小鼠肝脏分离的人肝细胞(嵌合体小鼠肝细胞)以新鲜的状态或将冷冻保存的嵌合体小鼠肝细胞融解使用。
这样的人肝细胞能够经由上述免疫缺陷肝损伤小鼠的脾脏而移植入肝脏。另外，也能够直接从门静脉移植。移植的人肝细胞的数量可以为1～200万个左右，优选为20万～100万个左右。免疫缺陷肝损伤小鼠的性别没有特别限制。另外，移植时的免疫缺陷肝损伤小鼠的日龄没有特别限制，但是在小鼠低周龄时移植人肝细胞，则伴随小鼠的成长人肝细胞会更活跃地增殖，基于这一点，使用出生后0～40天左右、其中优选使用出生后8～40天左右的小鼠。
移植后的小鼠，能够利用常用方法饲养。移植后定期从小鼠尾部采取血液，测定小鼠血中人白蛋白浓度。由于人白蛋白浓度与小鼠肝脏的人肝细胞的置换率相关，因此能够推测人肝细胞的生存、增殖的程度。由小鼠血中人白蛋白浓度推测置换率为70％以上的小鼠，作为高置换嵌合体小鼠，能够用于药物动态试验、肝炎病毒感染实验等。对于小鼠的情况而言，移植1～10×105个左右人肝细胞时，通过饲养40～100天左右，能够获得10万～3000万ng/mL的血中人白蛋白浓度。
被移植的人肝细胞占该嵌合体小鼠的肝脏中肝细胞的至少10％、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、或其以上。
被移植的人肝细胞在该嵌合体小鼠的肝脏中，至少2周以上、3周以上、4周以上、5周以上、10周、20周、30周、40周、最优选小鼠生存期间保持正常人肝细胞的功能和特性。
作为“人肝细胞的功能和特性”，可举出药物代谢功能、蛋白质合成、糖异生、尿素合成、胆汁合成、脂质合成、糖代谢、解毒、对肝炎病毒的感染等，但是不局限于此。
被移植的人肝细胞将上述的功能和特性保持人正常肝脏内的功能和特性的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、或其以上。
另外，本发明提供一种使用上述嵌合体小鼠筛选对人肝功能产生影响的物质的方法。
本方法例如能够举出包含以下工序的评价方法。
(a)将被检物质给予到上述嵌合体小鼠的工序；
(b)对(a)中给予该被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值的一个以上进行测定的工序；以及
(c)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、和总胆红素值进行比较，选择在(b)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的任意一个以上产生增减的被检物质的工序。
作为本发明的方法中的“被检物质”，没有特别限制，例如，能够举出天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、抗体、肽、氨基酸等单一化合物、核酸、以及化合物文库、基因文库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产生物、海洋生物提取物、植物提取物、原核细胞提取物、真核单细胞提取物或动物细胞提取物等。这些可以是精制物，另外也可以是植物、动物或微生物等的提取物等这类粗精制物。而且被检物质的制造方法没有特别限制，可以是从天然物分离的被检物质，可以是化学或生物化学合成的被检物质，还可以是基因工程所制备的被检物质。
上述被检物质根据需要可以进行适宜标记来使用。作为标记，例如，可举出放射标记、荧光标记等。此外，除上述被检试样之外，也包含将这些被检试样多种混合的混合物。
本方法中，被检物质对小鼠的给予方法没有特别限制。根据给予被检物质的种类，可以适宜选择经口给予或皮下、静脉、局部、经皮或者经肠(直肠)等非经口给予。
通过利用ELISA、免疫比浊法等测定小鼠血中的人白蛋白浓度，能够预测小鼠肝脏中人肝细胞的置换率。为了预测，预先有必要制作如下所述的人白蛋白浓度与置换率的相关曲线。嵌合体小鼠剖检前采取血液，求出人白蛋白浓度。制作剖检中采取的肝脏的全部或部分叶的冷冻切片或石蜡切片，使用人特异性细胞角蛋白8/18(hCK8/18)抗体等对人肝细胞特异性抗体，进行免疫染色。在显微镜下对切片进行照片拍摄，求出每个肝脏切片的hCK8/18阳性面积比例，将其作为置换率。将人白蛋白的浓度和置换率绘制成图求出相关式。相关式中通过输入小鼠血中人白蛋白浓度，能够计算大致的置换率。另外，通过经时测定体重，能够预测小鼠的健康状态。通过进行剖检时采取的血液的生化学检查，例如总白蛋白值、总蛋白值等的测定，能够获知小鼠的健康状态。通过测定肝重量体重、ALT、AST、总胆红素值等，能够获知嵌合体小鼠肝脏的损伤程度。即，将这些数值的增减作为指标，能够判定被检物质对人肝细胞的影响。
另外，本发明提供使用上述嵌合体小鼠的评价被检物质对人肝细胞的肝毒性的方法。
本方法例如，可举出包含以下工序的评价方法。
(a)将被检物质给予到上述嵌合体小鼠的工序；
(b)对(a)中给予了该被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的一个以上进行测定的工序；以及
(c)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、和总胆红素值进行比较，将(b)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的任意一个以上的增减作为指标，评价被检物质对肝细胞的影响的工序。
作为“被检物质”和其“给予方法”，可举出上述定义的内容。
如上文所述，由人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值能够获知嵌合体小鼠肝脏损伤的程度，将这些数值的增减作为指标，能够判定·评价被检物质对人肝细胞的毒性。
进而本发明提供使用上述嵌合体小鼠的筛选对病毒性肝炎治疗有效的物质的方法。
本方法例如，可举出包含以下工序的评价方法。
(a)对上述嵌合体小鼠接种肝炎病毒的工序；
(b)对(a)中接种肝炎病毒的该嵌合体小鼠给予被检物质的工序；
(c)对(b)中给予被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量中的一个以上进行测定的工序；以及
(d)与未给予被检物质该的上述嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量进行比较，选择(c)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量中的任意一个以上发生变化的被检物质的工序。
作为接种的肝炎病毒，可举出甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。病毒能够由脉、腹腔内给予而接种。
本方法中使用的上述嵌合体小鼠优选为满足以下任意一个以上的小鼠：人肝细胞移植后经过3周以上的血中人白蛋白浓度为1mg/mL以上，肝细胞全体的10％以上是人肝细胞。
“被检物质”和其“给予方法”可举出上面定义的内容。
由人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量，能够获知肝炎病毒所致的肝脏的损伤程度，将这些数值的变化作为指标，能够判定·评价被检物质在病毒性肝炎的治疗中的有效性。
应予说明，本说明书中引用的全部现有技术文献，作为参照引入本说明书。
由以下实施例进一步具体说明本发明。
实施例1
使用DNA微注射法的uPA转基因小鼠的制作
(1)含有uPA基因和白蛋白启动子的载体的制作
uPA基因，从小鼠肝脏用AGPC法(acid-guanidinium-isothiocyanate-phenol-chloroform)提取总RNA，溶解于RNase-free水。使用上述得到的总RNA，利用由公开的数据库登录的uPA基因序列(登录号：NM008873(序列号11))制成的uPA基因特异性引物(从第1341号碱基开始1360碱基长的反义序列)和LongRangeReverseTranscriptase(Qiagen公司生产)进行逆转录反应，在25℃进行10分钟，然后在42℃进行90分钟，在85℃进行逆转录酶非活化处理5分钟后，添加RNaseH(Invitrogen公司生产)在37℃处理20分钟，消化mRNA，仅使cDNA残存。将合成的cDNA作为PCR反应的模板进行PCR。添加总量的1/10的上述反应液，酶使用PhusionDNApolymerase(Fynnzymes公司生产)。PCR引物(从第39号碱基开始61碱基长的正义序列)，由uPA基因序列(登录号：NM008873)制作。扩增的片段是PCR反应中碱基号39-1360的长度。将得到的DNA片段导入后述的具有小鼠白蛋白启动子/增强子的表达质粒，构建“mAlbuPAInt2。”“mAlbuPAInt2”基因的构成由图1示出。在小鼠白蛋白的增强子/启动子的下游，结合兔β球蛋白的第2外显子、内含子、第3外显子·小鼠uPA的ORF部分·兔β球蛋白的第3外显子中的polyA信号。
(2)DNA向受精卵原核的微注射
将DNA片段的浓度制备为3ng/μL之后，注入到从CB-17/Icr和Scid-beige杂交系小鼠采取的原核期受精卵。利用微注射法向受精卵注入DNA。注入DNA的受精卵748个中生存635个，其中469个分化为2细胞期胚。将该2细胞期胚移植入预先假妊娠了的受胚小鼠ICR系统的输卵管内。得到产仔108只。得到的产仔是否含有uPA基因，利用PCR法解析(临床研究)。PCR的结果，确认1个体中含有目的DNA。基于这1只小鼠确立了1line的uPA转基因小鼠系统。
(3)uPA转基因小鼠的血清中ALT值的测定解析
从得到的保有uPA基因的小鼠采血，得到血清。然后，通过测定ALT值，解析肝脏中的uPA基因表达所引起的影响，即，肝细胞的损伤。ALT值的测定方法使用和光纯药工业“TransaminaseCⅡ‐TestWakou”cat#431-30901进行。样品血清在采取后测定之前，以－80℃保存。
ALT测定方法按照“TransaminaseCⅡ‐TestWakou”添加的标准操作法1的1/20规模实施。首先，ALT用底物酶液：ALT用酶剂1瓶中添加ALT用底物缓冲液10mL，溶解。进一步添加显色试液：显色剂1瓶中添加显色剂溶解液40mL，溶解。
接下来，在冰上准备CORNING2585096wellU底板。将样品血清1μL加入板中。将板从冰上移开，添加底物酶液25μL，在37℃加温5分钟。将STND(×1/2稀释：1μL，×1：1，2μL)加入空的well中，将显色试液25μL添加到各well。STND的well中添加底物酶液25μL，在37℃加温20分钟。向各well添加反应终止液100μL，用板搅拌机充分搅拌之后，测定60分钟以内570nm处的吸光度。用STND的测定值制作标准曲线，计算样品的活性值。
测定的小鼠中不能确认ALT值为高值的小鼠。作为目的的uPA转基因小鼠，uPA基因的表达量必须是对之后的肝细胞移植显示最佳条件的表达量，在制作多个uPA转基因小鼠基础上，有必要选择显示最佳表达量的小鼠，本方法中，从转基因小鼠的制作效率的界限出发，可知不适合于按照概率论制作这次这样的最佳的小鼠的方法。
实施例2
介由ES细胞的uPA转基因小鼠的制作
(1)插入uPA基因的ES细胞的建立
本实施例中，构建uPA基因插入用载体“mAlbuPAInt2ES”(图2)并使用。该载体是，为了赋予ES细胞的药剂选择性，对“mAlbuPAInt2”质粒进一步导入由SV40启动子表达的新霉素耐性基因的载体。利用电穿孔法导入到由129SvEv小鼠得到的ES细胞，接下来利用G418进行选择培养。关于得到的G418耐性集落，利用PCR进行基因导入的ES细胞的测试。以下，做具体说明。
利用限制性内切酶将相同的重组用载体(uPA)DNA25-30μg切断从而使其线状化，精制。将该DNA混悬于含有小鼠ES细胞3×106个的电穿孔用缓冲液(20mMHEPESpH7.0、137mMNaCl、5mMKCl、6mMD-glucose、0.7mMNa2HPO4)中，在FieldStrength185V/cm、Capacitance500μF的条件下，进行基因导入。从导入经过24小时后，用终浓度200μg/mL的G418(Geniticin)(SIGMA公司G-9516)进行选择培养。ES细胞的培养中，使用Dulbecco'sModifiedEagle's培养基(DMEM)(Gibco/BRL公司11965-084)培养液中添加终浓度15％的胎牛血清(Hyclone公司SH30071)、终浓度2mM的L-谷氨酰胺(Gibco/BRL公司25030-081)、终浓度分别为100μM的非必需氨基酸(Gibco/BRL公司11140-050)、终浓度10mM的HEPES(Gibco/BRL公司15630-080)、终浓度分别为100U/mL的青霉素/链霉素(Gibco/BRL公司15140-122)、终浓度100μM的β-巯基乙醇(SiGMA公司M-7522)、以及终浓度1000U/mL的ESGRO(LiF)(Gibco/BRL公司13275-029)而得的培养基(以下简写为ES培养基)。
此外，作为ES细胞用的饲养细胞，使用从E14.5胚分离的MEF(MouseEmbryonicFibroblast)细胞，培养液使用DMEM(Gibco/BRL公司11965-084)培养液中添加终浓度10％的胎牛血清(Hyclone公司SH30071)、终浓度2mM的L-谷氨酰胺(Gibco/BRL公司25030-081)、终浓度分别为100μM的非必需氨基酸(Gibco/BRL公司11140-050)、终浓度分别为100U/mL的青霉素/链霉素(Gibco/BRL公司15140-122)而得的培养基(以下简写为MEF培养基)。将150cm2培养瓶中铺满为止地培养的MEF细胞用胰蛋白酶/EDTA(0.05％/1mM、Gibco/BRL公司25300-047)进行剥离，分别以最佳的浓度重新播种到4个10cm培养皿、2块24孔板、2块6孔板、6个25cm2培养瓶、2个75cm2培养瓶。
(2)基因型解析用ES细胞的制备
基因导入后第5天开始，按照以下方式，将出现的G418耐性集落在24孔板上传代。即，使用移液枪(Gilson)，将G418耐性集落转移至含有150μL胰蛋白酶/EDTA溶液的96孔微孔板，在20分钟37℃的孵育器内处理之后，通过使用移液枪移液得到单一细胞。将该细胞悬浮液转移至24孔板继续培养。2天后，将24孔板上的细胞分为冷冻保存用和DNA提取用2批。即，细胞中添加胰蛋白酶/EDTA500μL，在37℃孵育器内处理20分钟，添加ES培养基500μL，通过用移液枪轻轻移液得到单一细胞。然后，向加入1mLES培养基的24孔板移入细胞悬浮液的一半，向原24孔板也添加ES培养基1mL。进而在2天后，去除一侧的24孔板的培养基，向ES培养基加入添加有终浓度为10％的胎牛血清和终浓度为10％的二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司D-5879)的冷冻用培养基1mL，密封后－70℃冷冻保存。
基因导入ES细胞的测试，利用PCR按照以下所示的方式进行。即，从细胞增殖到铺满的状态的24孔板的各孔去除培养基，用PBS清洗后添加溶解缓冲液(1％SDS、20mMEDTA、20mMTrispH7.5)250μL和ProteinaseK(20mg/mL)5μL，充分振荡，52℃加温溶解。从溶解的样品，通过苯酚/氯仿提取来提取DNA，作为PCR用的模板DNA使用。
(3)ES细胞的基因型解析方法：按照uPA基因导入ES细胞的选择如下的顺序进行。
使用的PCR引物在兔β球蛋白中设定。序列是正义引物：GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG(序列号1)、反义引物：GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA(序列号2)。反应按照AmpiTaqGold(ABI公司)的添加方法进行。95℃经过9分钟使酶活化后，重复94℃、30秒钟(变性)，63℃、30秒钟(退火)，72℃、1分钟(延伸)的反应40次。终止后将反应液用2％琼脂糖凝胶泳动，进行PCR产物的确认。
由PCR解析被确认基因导入的克隆，通过将冷冻保存的96孔板加温至37℃进行融解，传代至24孔板。该24孔板在37℃培养24小时后，交换培养基除去DMSO和液体石蜡。各个克隆达到75～90％铺满的时刻，从24孔传代至6孔板。进而，在6孔板中得到2孔份增殖到75～90％铺满的克隆，冷冻保存1孔份，剩余的1孔份用于注入胚泡和DNA提取。
冷冻保存按照以下方式进行。即，用PBS将细胞清洗2次后，添加0.5mL的Trypsin，在37℃保温15～20分钟进行胰蛋白酶处理后，进而添加0.5mL的ES细胞培养基，进行35～40次移液，将ES细胞块完全解离。将该细胞悬浮液移入15mL离心管，进而用1mL的ES细胞培养基清洗孔回收到管中。将管以1000rpm离心7分钟，去除培养基再次混悬于0.25mLES细胞培养基，添加0.25mL的2×冷冻培养基。将孔的内容物移入冻存管，－80℃冷冻，在液氮中保存。
用于注入胚泡和DNA提取的细胞，在将ES细胞块完全解离后，细胞的四分之一用于注入胚泡，剩余细胞的三分之一和三分之二分别在明胶覆盖的60mm培养皿中传代。前者在细胞增殖到铺满为止的后提取PCR解析用的基因组DNA，后者细胞在增殖到铺满为止后，分为3个冷冻。
(4)利用具有uPA基因的ES细胞的嵌合体小鼠的制作
关于被确认基因导入的ES细胞克隆，将C57BL/6J系小鼠的胚泡作为宿主胚胎制作嵌合胚，将其移植到假妊娠小鼠的子宫角得到产仔。宿主胚胎的采取，可通过怀孕第3天用添加100μM胰蛋白酶/EDTA的Whitten’s培养基，对输卵管和子宫灌流来进行。用Whitten’s培养基培养8细胞期胚或桑椹胚24小时，将得到的胚泡用于注入。用于注入的ES细胞，在传代开始第2天或者第3天通过TE处理使其分散，用于显微操作前4℃下静置。作为ES细胞注入用移液器，使用Sutter公司生产的glasscapillarytubing(内径约20μm)。作为胚固定用移液器，将外径1mm微小玻璃管(NARISHIGE)使用微小电极制作器(Sutter公司P-97/IVF)延伸拉细后，使用显微拉制仪(DeFonburun)在外径50～100μm的部分切断，进而使用将口径加工为10～20μm的玻璃管。注入用移液器和固定用移液器与连接有压电系统(PRIMETECHPAMS-CT150)的微型操作器(Lica)连接。作为用于显微操作的容器，使用在开孔载玻片用蜜蜡粘结盖玻片的容器，在该容器上放置2个添加约10μL的0.3％BSA的Hepes-bufferedWhitten’s培养基液滴，用矿物油(Sigma)覆盖上面。在一个液滴中，添加约100个ES细胞，在另一个添加20个左右扩张胚泡，每个胚注入约15个ES细胞。显微操作均在倒置显微镜下进行。将操作胚移植到假妊娠第2天的ICR系受孕雌鼠的子宫角。对于即使到了分娩预期日也不娩出产仔的受孕雌鼠，实施剖腹产，由义亲哺育。在C57BL/6J系小鼠的胚泡中注入45克隆的ES细胞，结果39克隆中得到雄嵌合体小鼠。
(5)uPA基因向生殖系列传递的测试
使嵌合体小鼠与C57BL/6J系小鼠交配，测试是否得到来源于ES细胞的产仔。如果嵌合体小鼠的生殖细胞来源于ES细胞，则被娩出的产仔的毛色呈野生色，如果来源C57BL/6J系小鼠的胚泡则呈黑色。通过交配在25line中诞生野生色小鼠，确认ES细胞向生殖系列传递。
接下来，从这些野生色小鼠的尾部的一部分提取DNA，利用PCR确认uPA基因是否被传递。其结果确认在14line的来源于ES细胞的产仔中uPA基因被传递。
(6)uPA转基因小鼠的血清中的ALT值的测定解析
从得到的保有uPA基因的小鼠采血，得到血清。然后，通过测定ALT值，解析肝脏中由uPA基因表达引起的影响，即肝细胞的损伤。ALT值的测定方法，使用和光纯药工业“TransaminaseCⅡ‐TestWakou”cat#431-30901进行。样品血清在采取后测定之前－80℃保存。
ALT测定方法按照“TransaminaseCⅡ‐TestWakou”添加的标准操作法1的1/20规模实施。首先，ALT用底物酶液：在ALT用酶剂1瓶中添加ALT用底物缓冲液10mL，溶解。另外显色试液：在显色剂1瓶中添加显色剂溶解液40mL，溶解。
接下来，在冰上准备CORNING2585096wellU底板。板中加入样品血清1μL。将板从冰上移开。添加底物酶液25μL，37℃加温5分钟。将STND(×1/2稀释：1μL，×1：1，2μL)加入空的well。各well添加显色试液25μL。向STND的well添加底物酶液25μL，37℃加温20分钟。向各well添加反应终止液100μL，用板搅拌器充分搅拌后，60分钟以内测定570nm处吸光度。用STND的测定值制成标准曲线，计算样品的活性值。
确认测定的14line小鼠中，3line杂合小鼠的ALT值是高值的小鼠(图3)。
得到的3line中，使用ALT值为高值的2line(#1C2和#2C7)，进行以下的人肝细胞的移植实验。
实施例3
嵌合体小鼠的制作
(1)免疫缺陷肝损伤小鼠
使上述实施例2中制作的uPA-Tg小鼠(hemizygote，+/－)与SCID-bg小鼠2次回交，得到具有uPA-Tg(+/－)SCID(+/+)基因型的小鼠。从该小鼠的雄体采取精子，与SCID小鼠(homozygote，+/+)的未受精卵体外受精后，返回借腹。选择在诞生的仔小鼠体内植入Tg基因的小鼠，通过自然交配，得到具有两方特性的小鼠uPA-Tg(+/－)/SCID(+/+)。uPA-Tg(+/－)和uPA-Tg(－/－)的识别是将对导入基因特异性序列应用于引物，通过基因组PCR法进行。
正向引物：5’-GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’(序列号3)
反向引物：5’-GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3’(序列号4)。
另外，SCID(+/+)、SCID(+/－)和SCID(－/－)的识别是通过PCR-RFLP法进行。
接下来，使得到的uPA-Tg(+/－)/SCID(+/+)之间交配，得到uPA－Tg(+/+)/SCID(+/+)和uPA-Tg(+/－)/SCID(+/+)。uPA-Tg(+/+)和uPA-Tg(+/－)的识别利用Southernblot法实施。将出生后第8～10天的小鼠的尾部切断约5mm，利用3SDS、proteinaseK溶液将其可溶化，利用苯酚和氯仿提取除去混杂的蛋白质成分。使用DNase-freeRNaseA将混杂的RNA分解后，通过异丙醇沉淀使高分子基因组DNA析出。用70％乙醇将上述的基因组DNA清洗并风干后，再溶解于TE。用EcoR1完全消化从样本提取的基因组DNA、阳性和阴性对照的基因组DNA各自5μg，将生成的DNA片段通过琼脂糖电泳分离，转移至尼龙膜。使用限制性内切酶EcoR1，从uPAcDNA探针/TA精制(379bp)适用于SouthernHybridization探针的DNA片段。利用随机引物法，将上述的DNA片段进行[32P]标记。使转移到尼龙膜的DNA片段与RI标记的uPAcDNA探针杂交。通过清洗去除非特异结合的探针，将来源于导入至mAlb-uPA-Int2Tg小鼠候选个体的外来基因的放射活性信号对X射线膜感光来检测。检测来源于野生型基因位点的1.5kb的特异性信号和来源于突变型基因位点的0.4kb(wt：1.5kb)的特异性信号，判定mAlb-uPA-Int2Tg小鼠个体的基因型。
(2)人肝细胞移植
作为人肝细胞，使用从BDGentest公司购入的肝细胞(LotNo.BD85、男孩、5岁)。该冷冻肝细胞按照已有公知的方法(ChiseTatenoetal，Near-completelyhumanizedliverinmiceshowshuman-typemetabolicresponsestodrugs.AmJPathol165：901-912，2004)融解使用。
用乙醚麻醉出生后2～4周龄的#1C2纯合小鼠7只、杂合小鼠4只、#2C7纯合小鼠4只、杂合小鼠7只的uPA-Tg/SCID小鼠，将肋腹切开约5mm，从脾头注入2.5×105个人肝细胞后，将脾脏放回腹腔缝合。#1C2纯合小鼠1只在移植后第30天死亡。
移植后3、6周，然后每周从小鼠尾静脉采取2μL血液，添加到LX-Buffer200μL。通过免疫比浊法使用自动分析装置JEOLBM6050(日本电子)，测定小鼠血中的人白蛋白浓度。结果发现#1C2纯合小鼠、杂合小鼠、#2C7纯合小鼠中人白蛋白增加，发现人白蛋白＞7mg/mL(图4、图5)。#2C7杂合小鼠没有发现人白蛋白的增加(图5)。均观察到顺利的体重增加，但是#2C7杂合小鼠中总体上体重是高值(图5)。
移植后10-12周后(13-15周龄)解剖嵌合体小鼠，采取肝脏、血液。制作肝脏7个叶的冷冻切片，使用人特异性细胞角蛋白8/18(hCK8/18)抗体进行免疫染色(图6)。求出冷冻切片单位面积的hCK8/18阳性面积，作为置换率。其结果可确认#1C2纯合小鼠、#2C7纯合小鼠中置换率70％以上(图7)。#1C2的杂合小鼠观察到60％以上的置换率(图7)。发现小鼠血中人白蛋白浓度和置换率与已有公知的嵌合体小鼠(ChiseTatenoetal，如上文所述)的血中人白蛋白浓度和置换率有同样的相关关系(图7)。另外，在相关关系中，#1C2和#2C7之间，以及杂合小鼠和纯合小鼠之间没有发现明显的差异(图7)。
向出生后2～4周龄的#1C2纯合小鼠28只、杂合小鼠28只、#2C7纯合小鼠18只、杂合小鼠15只uPA-Tg/SCID小鼠移植人肝细胞。其结果为，成为小鼠人白蛋白浓度是7mg/mL以上的高置换嵌合体小鼠的是#1C2纯合小鼠61％、杂合小鼠是36％、#2C7纯合小鼠28％、杂合小鼠0％(图8-1，2、图9-1，2、图10、图11)。
一部分小鼠(#1C2纯合小鼠6只、杂合小鼠6只、#2C7纯合小鼠4只)在14或15周龄时从眼窝静脉窦以1×104拷贝/每只接种HBV或HCV(图8-1，2、9-1，2)。接种后第1周开始，每周从眼窝静脉窦采取血液，利用real-timequantitativePCR法和real-timequantitativeRT-PCR法求出HBV和HCV病毒滴度。
对从接种HCV的小鼠采取的血清5μL使用SepaGeneRV-R(三光纯药株式会社，东京)进行RNA提取，将RNA溶解于含有1mMDTT(Promega株式会社、东京)和0.4U/μLribonucleaseinhibitor(Takara-bio株式会社、滋贺)的10μLNuclease-freewater(LifeTechnologiesCorporation，Carlsbad，CA，USA)。溶解的RNA在定量血清中HCVRNA之前－80℃保存。
PCR反应液，使用溶解的RNA原液或者稀释的RNA2.5μL通过TaqManEZRT-PCRCoreReagents(LifeTechnologiesCorporation)进行。PCR反应按照50℃2分钟(Uracil-N-Glycosylase处理)→60℃30分钟(逆转录反应)→95℃5分钟(PCR初期活化)→[95℃20秒钟(变性)→62℃1分钟(退火·延伸反应)]×50循环进行，利用ABIPrism7500(LifeTechnologiesCorporation)进行反应和解析。使用引物和探针如以下所示。
正向引物：5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’(序列号5)
反向引物：5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’(序列号6)
探针：5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(序列号7)
(5末端：FAM、3末端：TAMRA)
HCVRNA标准品使用从HCV感染嵌合体小鼠得到的血清。该血清是由人工HCVRNA确定HCVRNA量的血清，在血清中HCVRNA定量之前－80℃保存。血清中HCVRNA浓度测定时，从该血清进行RNA提取，将梯度稀释10倍的RNA作为HCVRNA标准品使用。使用该HCVRNA标准品的血清中HCVRNA定量的定量范围是血清中2.1×104copies/ml～2.1×107copies/mL。
对从接种HBV的小鼠采取的血清10μL，使用SMITESTEX-R&D(Code：R-35、株式会社医学生物学研究所、长野)进行DNA提取，将DNA溶解于20μL的Nuclease-freewater。溶解的DNA，在HBVDNA定量之前在－20℃以下保存。
PCR反应液，使用溶解的DNA5μL，通过TaqManPCRCoreReagentsKitwithAmpliTaqGold(AppliedBiosystemsJapan株式会社、东京)进行。PCR反应按照50℃2分钟(引物的退火)→95℃10分钟(PCR初期活化)→[95℃20秒钟(变性)→60℃1分钟(退火·延伸反应)]×53循环进行，通过ABIPrism7500(AppliedBiosystemsJapan株式会社、东京)进行反应。另外，解析中以2孔的平均值计算HBVDNA量。应予说明，计算值大于0且小于4.0×104copies/mL时设为PCR阳性，计算值为0时设为PCR阴性，测定对象的2孔中均是PCR阳性时：记为“+”(HBV阳性)、2孔中均为PCR阴性时：记为“－”(HBV阴性)、2孔中某一个为阳性时：记为“±”(HBV假阳性)。
使用引物和探针按照以下序列进行。
正向引物：5-CACATCAGGATTCCTAGGACC-3(序列号8)
反向引物：5-AGGTTGGTGAGTGATTGGAG-3(序列号9)
探针：5-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3(序列号10)
(5末端：FAM、3末端：TAMRA)
HBV标准品使用插入HBV基因(nucleotides1～2182)的质粒，使用由OD260nm浓度换算拷贝数的物质。血清中HBVDNA定量的测定界限是4.0×104copies/mL～4.0×109copies/mL。另外关于显示4.0×109copies/mL以上的样本，进行稀释在测定范围实施。
其结果，感染的全部小鼠中，确认HBV、HCV的感染(图8-1，2、图9-1，2)。接种HCV的小鼠中，7/8例在接种后第1周开始发现HCV，第4周左右开始达到坪值(图8-1、图9-1)。1/8例在第4周开始检出HCV(图8-1、图9-1)。HBV中7/8例在接种后3周中小鼠血清中检出HBV，第4周全部小鼠感染。接种后第8周达到坪值(图8-2、图9-2)。关于感染效率、病毒的增殖速度，#1C2和#2C7之间，以及#1C2的杂合小鼠和纯合小鼠之间没有发现明显差异(图8-1，2、图9-1，2)。应予说明，#2C7杂合小鼠中由于没有得到小鼠人白蛋白浓度为7mg/mL以上的高置换嵌合体小鼠，因此没有用于感染实验。
剩余的小鼠(#1C2纯合小鼠22只、杂合小鼠22只、#2C7纯合小鼠14只、杂合小鼠15只)饲养至30周龄，1周进行1次人白蛋白浓度的测定，第30周解剖，同样求出肝脏的置换率。人白蛋白浓度，即使超过14周龄也继续增加(图10、11)。30周前，大多数动物中，没有发现小鼠血中人白蛋白浓度的降低。解剖时的人白蛋白浓度和置换率之间观察到相关关系(图7)。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供虽然以杂合体型具有uPA基因，但是对来源于小鼠的肝细胞的损伤度高的肝损伤小鼠及其高效的制作方法。
本说明书中引用的全部期刊、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书。

Claims (16)

1.一种以杂合体型具有尿激酶型纤溶酶原激活剂基因即uPA基因的肝损伤小鼠的制作方法，其特征在于，具有以下工序：
(i)利用DNA片段转化小鼠ES细胞的工序，所述DNA片段含有肝特异性启动子/增强子以及在它们的控制下可驱动地被连接的编码uPA的cDNA；
(ii)将工序(i)得到的转化了的小鼠ES细胞注入宿主胚胎的工序；
(iii)将工序(ii)得到的注入了ES细胞的宿主胚胎移植到代孕母小鼠的子宫获得嵌合体小鼠的工序；
(iv)将工序(iii)得到的嵌合体小鼠交配，得到以杂合体型导入了该DNA片段的转基因小鼠的工序；以及
(v)得到在从6周龄到8周龄血清ALT值增加的转基因小鼠的工序。
2.一种以杂合体型具有尿激酶型纤溶酶原激活剂基因即uPA基因的肝损伤小鼠的制作方法，其特征在于，具有以下工序：
(i)利用DNA片段转化小鼠ES细胞的工序，所述DNA片段含有肝特异性启动子/增强子以及在它们的控制下可驱动地被连接的编码uPA的cDNA；
(ii)将工序(i)得到的转化了的小鼠ES细胞注入宿主胚胎的工序；
(iii)将工序(ii)得到的注入了ES细胞的宿主胚胎移植到代孕母小鼠的子宫获得嵌合体小鼠的工序；
(iv)将工序(iii)得到的嵌合体小鼠交配，得到以杂合体型导入了该DNA片段的转基因小鼠的工序；以及
(v)得到6周龄或8周龄的血清ALT值与不具有uPA基因的小鼠的血清ALT值相比高的转基因小鼠的工序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述工序(v)中，得到6周龄或8周龄的血清ALT值与不具有uPA基因的小鼠的血清ALT值相比为至少2倍高的转基因小鼠。
4.一种肝损伤小鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述肝损伤小鼠是利用权利要求1～3中任一项所述的方法制作的，以杂合体型具有uPA基因。
5.一种以杂合体型具有uPA基因的免疫缺陷肝损伤小鼠的制作方法，其特征在于，包含将以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙与免疫缺陷小鼠交配的工序，
所述以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的特征在于以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，在从6周龄到8周龄血清ALT值增加，
或者，所述以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的特征在于以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，6周龄或8周龄的血清ALT值与不具有uPA基因的野生型小鼠的血清ALT值相比高。
6.一种免疫缺陷肝损伤小鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述免疫缺陷肝损伤小鼠是利用权利要求5所述的方法制作的。
7.一种嵌合体小鼠的制作方法，其特征在于，包括对利用权利要求5所述的制作方法制作的以杂合体型具有uPA基因的免疫缺陷肝损伤小鼠或其子孙注入人肝细胞，该嵌合体小鼠具有含有人肝细胞的嵌合体肝。
8.一种嵌合体小鼠的制作方法，其特征在于，包括对免疫缺陷的以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙注入人肝细胞，该嵌合体小鼠具有含有人肝细胞的嵌合体肝，
所述免疫缺陷的以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的特征在于以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，在从6周龄到8周龄血清ALT值增加，
或者，所述免疫缺陷的以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的特征在于以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，6周龄或8周龄的血清ALT值与不具有uPA基因的野生型小鼠的血清ALT值相比高。
9.一种对人肝功能产生影响的物质的筛选方法，其特征在于，包括以下的(a)～(c)工序：
(a)将被检物质给予到利用权利要求7或8所述的制作方法制作的嵌合体小鼠的工序；
(b)对在(a)中给予了该被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的一个以上进行测定的工序；以及
(c)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、和总胆红素值进行比较，选择(b)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的任意一个以上产生增减的被检物质的工序。
10.一种评价被检物质对人肝细胞的毒性的方法，其特征在于，包括以下的(a)～(c)工序：
(a)将被检物质给予到利用权利要求7或8所述的制作方法制作的嵌合体小鼠的工序；
(b)对在(a)中给予了该被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的一个以上进行测定的工序；以及
(c)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值进行比较，将(b)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值和总胆红素值中的任意一个以上的增减作为指标，评价该被检物质对人肝细胞的影响的工序。
11.一种对病毒性肝炎的治疗有效的物质的筛选方法，其特征在于，包括以下的(a)～(d)工序：
(a)对利用权利要求7或8所述的制作方法制作的嵌合体小鼠接种肝炎病毒的工序；
(b)对在(a)中接种了肝炎病毒的该嵌合体小鼠给予被检物质的工序；
(c)对在(b)中给予了被检物质的该嵌合体小鼠的选自人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量中的一个以上进行测定的工序；以及
(d)与未给予该被检物质的该嵌合体小鼠的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量进行比较，选择在(c)中测定的人白蛋白浓度、体重曲线、肝重量体重比、总白蛋白值、总蛋白值、ALT值、AST值、总胆红素值、病毒量和来源于病毒的蛋白质量中的任意一个以上产生变化的被检物质的工序。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，肝炎病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
13.一种以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，在从6周龄到8周龄血清ALT值增加。
14.一种以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，6周龄或8周龄的血清ALT值与不具有uPA基因的野生型小鼠的血清ALT值相比高。
15.一种免疫缺陷的以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述免疫缺陷的以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，在从6周龄到8周龄血清ALT值增加。
16.一种免疫缺陷的以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述免疫缺陷的以杂合体型具有uPA基因的肝损伤小鼠或其子孙以杂合体型导入了包含编码uPA的cDNA的DNA片段，6周龄或8周龄的血清ALT值与不具有uPA基因的野生型小鼠的血清ALT值相比高。
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