WO2021132117A1 - ヒト肝細胞キメラ動物におけるヒト肝細胞置換率の測定方法 - Google Patents

ヒト肝細胞キメラ動物におけるヒト肝細胞置換率の測定方法 Download PDF

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animal
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晋輔 青山
真史 古川
雅和 加国
知世 向谷
島田　卓
達也 松見
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積水メディカル株式会社
株式会社フェニックスバイオ
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the replacement rate of the liver by human hepatocytes in a rodent animal in which the liver is replaced with human hepatocytes (hereinafter referred to as "human hepatocyte chimeric rodent animal").
  • the present invention also relates to a method for measuring the abundance ratio of human albumin and rodent animal albumin in rodent animals in which the liver is replaced with human hepatocytes.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Non-Patent Document 1
  • This model has been shown to be useful in drug metabolism and hepatitis research (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • a method of estimating the human hepatocyte replacement rate from the ratio of the human albumin concentration to the total of the human albumin concentration and the recipient animal albumin concentration in the serum of the human hepatocyte chimeric animal can be considered. There is no method for obtaining the albumin concentration of animals by exactly the same measuring means, and therefore, there is a problem that the sum of the human albumin concentration and the recipient animal albumin concentration obtained by different measuring means does not match the total albumin concentration.
  • Tachibana A Tateno C, Yoshizato K. Repopulation of the Immunosuppressed Retrorsine-treated Infant Rat Liver with Human Hepatocytes.
  • Xenotransplantation (2013) 20 (227-38) Katoh M, Matsui T, Nakajima M, Tateno C, Kataoka M, Soeno Y, Horie T, Iwasaki K, Yoshizato K and Yokoi Y: Expression of Human CYPs in Meta 2004 Tsuge M, Hiraga N, Takaishi H, Noguchi C, Oga H, Imamura M, Takahashi S, Iwao E, Fujimoto Y, Ochi H, Chayama K, Tateno C and Yoshizato K: Infection virus. Hepatology 42: 1046-1054, 2005
  • the present invention is a method for measuring the human hepatocyte replacement rate in the liver of a human hepatocyte chimeric rodent animal, which can accurately measure the human hepatocyte replacement rate without killing the chimeric animal.
  • the challenge is to provide.
  • a method for measuring a human hepatocyte replacement rate which comprises a step of obtaining a human hepatocyte replacement rate by applying it to a regression equation. [2] The method according to [1], wherein an analysis combining liquid chromatography and tandem mass spectrometry is performed using a triple quadrupole mass spectrometer. [3] The method according to [1] or [2], wherein the proteolytic enzyme contains trypsin.
  • a regression equation is prepared between the above peak area ratio and the human hepatocyte replacement rate determined by observing liver sections of human hepatocyte chimeric rodents using the same type of recipient animal. 1] The method according to any one of [3]. [5] A second step of treating the body fluid of a human hepatocyte chimeric rodent animal with a proteolytic enzyme and subjecting the treated product with this proteolytic enzyme to an analysis combining liquid chromatography and tandem mass spectrometry.
  • a step of treating rodent animal body fluid with a proteolytic enzyme and a product treated with this proteolytic enzyme are subjected to an analysis combining liquid chromatography and tandem mass spectrometry, and selected by a second mass spectrometer.
  • a method for measuring rodent animal albumin peptide concentration which comprises a step of measuring the peak area of a peptide in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added in LVQEVTDFAK or LVQEVTDFAK.
  • a method for measuring human albumin peptide concentration comprising measuring the peak area of a peptide in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added in LVNEVTEFAK or LVNEVTEFAK selected by meter.
  • an analysis combining liquid chromatography and tandem mass spectrometry is performed using a triple quadrupole mass spectrometer.
  • the proteolytic enzyme comprises trypsin.
  • the method of the present invention is a method for estimating the human hepatocyte replacement rate from the ratio of the concentration of human albumin-derived peptide to the total concentration of a specific human albumin-derived peptide and the corresponding peptide derived from recipient animal albumin, and this peptide ratio. And the human hepatocyte replacement rate obtained by observing the liver section are in a proportional relationship, so that the human hepatocyte replacement rate can be accurately obtained.
  • the albumin-derived peptide concentration is measured using a mass spectrometer, the measured value does not fluctuate depending on the donor or antibody, and the reproducibility is high. Moreover, since the human albumin-derived peptide concentration and the recipient animal albumin-derived peptide concentration can be obtained by exactly the same measuring means, the human hepatocyte replacement rate can be accurately grasped.
  • the method of the present invention is to perform a tandem mass spectrometer and select the peak of human albumin-derived peptide (LVNEVTEFAK) and the peak of rodent animal albumin-derived peptide (LVQEVTDFAK) with a second mass spectrometer.
  • LVNEVTEFAK human albumin-derived peptide
  • LVQEVTDFAK rodent animal albumin-derived peptide
  • the method of the present invention can determine the human hepatocyte replacement rate without killing the human hepatocyte chimeric animal. Therefore, for example, in the process of producing a chimeric animal, the replacement rate by human hepatocytes can be monitored over time.
  • a step of treating the body fluid of a human hepatocyte chimeric rodent animal with a proteolytic enzyme and a product treated with this proteolytic enzyme are subjected to LC / MS / MS analysis.
  • This method includes a step of determining the human hepatocyte replacement rate.
  • LVNEVTEFAK peptides in which one or two amino acids, particularly one amino acid is deleted, substituted, or added (hereinafter, may be referred to as "homolog") can also be used.
  • LVNEVTEFAK is a peptide derived from human albumin and LVQEVTDFAK is a corresponding peptide derived from rodent animal albumin.
  • Human hepatocyte chimeric rodent animal is a rodent animal in which some or all of the liver cells are replaced with human hepatocytes. This chimeric rodent can be produced by transplanting human hepatocytes into an immunodeficient liver-damaged rodent.
  • the subject of the present invention is also a subcultured chimeric rodent animal obtained by transplanting human hepatocytes proliferated in the body of this primary chimeric rodent animal into the same species of rodent animal having an immunodeficient liver disorder. It becomes.
  • the subcultured chimeric rodent animal may be a chimeric animal obtained by one subculture or a chimeric animal obtained by two or more subcultures.
  • mice and rats such as rats, guinea pigs, squirrels, and hamsters, but mice and rats such as rats, which are widely used as experimental animals, are preferable.
  • Immunodeficiency liver disorder A rodent animal is an animal that has immunodeficiency that does not show rejection of cells derived from a heterologous animal and that the original liver cells of the rodent animal are damaged.
  • human hepatocytes When human hepatocytes are transplanted because the original cells of the animal are damaged, the liver function is maintained by the transplanted human hepatocytes, and the animal accurately reflects the intra-individual function of the human hepatocytes. Become. In addition, the transplanted human hepatocytes are likely to proliferate.
  • liver-damaged animal can be produced by subjecting the same individual to a liver-damage-inducing treatment and an immunodeficiency-inducing treatment.
  • Liver damage-inducing treatments include administration of liver-damage-inducing substances such as carbon tetrachloride, yellow phosphorus, D-galactosamine, 2-acetylaminofluorene, and pyrrorosin alkaloids, irradiation, and surgical partial resection of the liver.
  • liver-damage-inducing substances such as carbon tetrachloride, yellow phosphorus, D-galactosamine, 2-acetylaminofluorene, and pyrrorosin alkaloids, irradiation, and surgical partial resection of the liver.
  • immunodeficiency-inducing treatment include administration of immunosuppressive agents and thymectomy.
  • immunodeficient liver-damaged animals can also be produced by subjecting animals with genetic immunodeficiency to liver-damage-inducing treatment.
  • Known genetic immunodeficiency animals include animals with severe combined immunodeficiency (SCID) showing T cell system deficiency, animals that have lost T cell function due to genetic thymic deficiency, and RAG2 gene. Examples include animals knocked out by the gene targeting method (Science, 244: 1288-1292, 1989) and genome editing technology.
  • immunodeficient rats obtained by transplanting the bone marrow of SCID mice into SCID mice, RAG2 knockout mice, IL2Rgc / Rag2 knockout mice, NOD mice, NOG mice, nude mice, nude rats, and X-ray irradiated nude rats.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2007-228962
  • Patent Document 3 Transplantation. 60 (7): 740-7, 1995
  • An immunodeficient liver-damaged animal can also be produced by subjecting a genetically-deficient liver-damaged animal to an immunodeficiency-inducing treatment.
  • a genetically modified animal a known transgenic method (Proc. Natl. Acad.) Is used using a hepatocyte-specifically expressed protein enhancer and / or a liver injury-inducing protein gene linked under the control of a promoter. Examples include transgenic animals produced by Sci.USA 77; 7380-7384, 1980). In such animals, the liver injury-inducing protein is expressed in a liver-specific manner, so that the animal has liver injury. Examples of liver-specifically expressed proteins include serum albumin, cholinesterase, and Hagemann factor.
  • liver damage-inducing protein examples include urokinase plasminogen activator (uPA) and tissue plasminogen activator (tPA).
  • uPA urokinase plasminogen activator
  • tPA tissue plasminogen activator
  • An animal having a genetic liver disorder can also be obtained by knocking out a gene responsible for liver function, such as the fumalyl acetoacetate hydrase gene.
  • administration of ganciclovir to mice into which the thymidine kinase gene has been introduced under the albumin enhancer promoter can cause liver damage.
  • immunodeficient liver-damaged animals can also be produced by mating a genetically immunodeficient animal with a genetically-deficient animal of the same species.
  • a genetically immunodeficient liver-damaged animal an animal in which the liver-damaging gene is homozygous or heterozygous can be used.
  • human hepatocytes used for transplantation those isolated from human liver tissue by a conventional method such as collagenase perfusion method can be used. High substitution rates by human hepatocytes are achieved, for example, by using human hepatocytes in children under 14 years of age.
  • proliferative hepatocytes that have active proliferative capacity in vivo, a human hepatocyte population that can rapidly proliferate in the body of recipient rodent animals and exert normal liver function can be obtained in a short time. Can be formed.
  • proliferative human hepatocytes include small human hepatocytes invented by the present inventors (Japanese Patent Laid-Open No. 8-112092, etc.).
  • Human hepatocytes can be transplanted into the liver via the spleen of immunodeficient liver-damaged animals. It can also be transplanted directly from the portal vein.
  • the number of human hepatocytes to be transplanted can be about 1 to 2 million.
  • the sex of immunocompromised liver-damaged animals is not particularly limited.
  • the age of immunodeficient liver-damaged animals at the time of transplantation is not particularly limited, but if human hepatocytes are transplanted when the mice are young, the human hepatocytes may proliferate more actively as the mice grow. From the point of view, it is preferable to use animals about 0 to 40 days old.
  • the transplanted animal may be bred by a conventional method. For example, by breeding for about 40 to 200 days after transplantation, a primary chimeric animal in which some or all of hepatocytes are replaced with human hepatocytes can be obtained.
  • Human hepatocytes grown in the chimeric animal body can be recovered, for example, by treating the liver tissue of the chimeric animal with collagenase. Since the cytotoxicity of collagenase is higher for rodent animal hepatocytes than for human hepatocytes, adjusting the collagenase treatment time damages the hepatocytes of chimeric animals and substantially only human hepatocytes. Can be separated.
  • the recovered hepatocytes include a small amount of non-parenchymal hepatocytes and hepatocytes of recipient animals in addition to human hepatocytes proliferated in chimeric animals.
  • the recovered hepatocytes may be used as they are for transplantation, but the purity of human hepatocytes can also be increased by using a monoclonal antibody that specifically recognizes human hepatocytes or recipient animal hepatocytes.
  • the method of transplanting and proliferating human hepatocytes isolated from the primary chimeric animal into the liver of the rodent animal is the same as that for producing the primary chimeric animal.
  • the body fluid of the chimeric rodent animal used as the body fluid measurement target of the chimeric animal is not limited as long as it contains albumin.
  • the collected body fluid may be fractionated so as to contain albumin.
  • albumin For example, blood, serum, plasma, urine, saliva, lymph, sweat, tears and the like can be used. Serum and plasma are easy to use because they are easy to collect and have few components other than albumin.
  • endopeptidase As the treatment with a proteolytic enzyme or digestive proteolytic enzyme, endopeptidase may be used, and serine protease is particularly preferable.
  • serine proteases include trypsin, chymotrypsin, and alkaline proteases derived from Bacillus subtilis. Of these, trypsin is preferable.
  • the collected body fluid may be used as it is, but it may also be diluted with a buffer solution such as purified water, physiological saline, or a buffer solution so that the protein or peptide concentration becomes about 50 to 100 ⁇ g. ..
  • the amount of the proteolytic enzyme used can be about 0.1 to 5 ⁇ g, particularly about 1 ⁇ g, with respect to 100 ⁇ g of the protein or peptide contained in the body fluid.
  • the enzymatic reaction may be carried out at about 30 to 40 ° C., particularly about 37 ° C. for about 1 to 24 hours, especially about 16 hours.
  • the target peptide can be efficiently produced by treating with a plurality of proteolytic enzymes.
  • a protease such as LysC or ProteinMAX prior to trypsin digestion
  • the target peptide can be efficiently produced in the subsequent trypsin treatment.
  • One or more proteases for pretreatment can be used.
  • the amount of the protease used for the pretreatment can be about 0.1 to 5 ⁇ g, particularly about 1 ⁇ g, with respect to 100 ⁇ g of the protein or peptide contained in the body fluid.
  • the reaction temperature may be about 30 to 40 ° C., particularly 37 ° C., and the reaction time may be about 1 to 24 hours, particularly about 16 hours, although the reaction temperature varies depending on the type of enzyme.
  • LC / MS / MS Analysis Since the molecular weights of the human albumin-derived peptide (LVNEVTEFAK) and the rodent animal albumin-derived peptide (LVQEVTDFAK) are the same, in the method of the present invention, first, a sample digested with a proteolytic enzyme is subjected to liquid chromatography (LC). ) Is separated, and then the specific fraction in the peptide is subjected to a tandem mass spectrometer (MS / MS) to select and quantify the specific peptide ion. LC and MS / MS may be performed separately, but it is convenient to use an LC / MS / MS device in which the LC device and the MS / MS device are directly connected.
  • LC liquid chromatography
  • MS / MS tandem mass spectrometer
  • a peptide in which one or two amino acids are deleted, substituted, or added in a human albumin-derived peptide (LVNEVTEFAK) or a rodent animal albumin-derived peptide (LVQEVTDFAK) human albumin is used.
  • LVNEVTEFAK human albumin-derived peptide
  • LVQEVTDFAK rodent animal albumin-derived peptide
  • both peptides can be quantified with high accuracy by performing LC before MS / MS.
  • Liquid chromatography The type of liquid chromatography is not limited. For example, silica gel whose surface is modified with an octadecylsilyl group is used as a stationary phase, and a water / methanol mixed solution is used as a moving layer, and separation is performed by utilizing hydrophobic interaction. Reverse phase chromatography, gel filtration (GFC) chromatography, in which dextrin gel, agarose gel, etc. are used as the stationary phase, and buffer solution, etc. is used as the mobile phase, and separation is performed using the penetration of the peptide into the pores of the gel.
  • GFC gel filtration
  • Ion exchange chromatography that separates using an ion exchange resin as a stationary phase using electrical affinity
  • affinity chromatography that uses a specific bond with a carrier that has a ligand that specifically binds to a peptide as a stationary phase, etc. are used. Can be done. Of these, reverse phase chromatography is preferred.
  • the human albumin-derived peptide (LVNEVTEFAK or its homolog) fraction and the rodent animal albumin-derived peptide (LVQEVTDFAK or its homolog) fraction are separated, and this peptide is subjected to a tandem mass spectrometer.
  • Tandem-type mass spectrometry In tandem-type mass spectrometry, one of the purified ion species is selected as a precursor ion by the first mass spectrometer, and then the ion is cleaved to generate a product ion, and the second mass is generated. Detect and quantify product ions with an analyzer.
  • Types of ion sources for mass spectrometers include atmospheric ionization such as electrospray, atmospheric chemical ionization, and atmospheric photoionization; thermospray, particle beam, and vacuum ionization such as flow FAB. Of these, electrospray is preferable.
  • Types of mass spectrometers include quadrupole mass spectrometers (particularly triple quadrupole mass spectrometers), hybrid tandem mass spectrometers, Fourier-converted ion cyclotron mass spectrometers, magnetic field mass spectrometers, and ion traps. Examples include mass spectrometers and flight time mass spectrometers. Among them, a quadrupole mass spectrometer (particularly, a triple quadrupole mass spectrometer) is preferable in that it has good quantitativeness, a wide dynamic range, and good linearity.
  • 575.3 m / z ion can be selected as the precursor ion of LVNEVTEFAK or LVQEVTDFAK, and 185.2 m / z ion can be selected as the product ion.
  • any mass-to-charge ratio (m / z) ion can be selected as long as it is a precursor ion or product ion derived from LVNEVTEFAK or LVQEVTDFAK.
  • a precursor ion and a product ion having a mass-to-charge ratio (m / z) suitable for the mass spectrometer can be appropriately selected. The same applies when using the homolog of LVNEVTEFAK or LVQEVTD FAK.
  • ions of a specific human albumin-derived peptide (LVNEVTEFAK or its homolog) and a specific rodent animal albumin-derived peptide (LVQEVTDFAK or its homolog) are selected by the first mass spectrometer, and the second
  • the peak areas of the human albumin-derived peptide (LVNEVTEFAK or its homolog) and the peak area of the rodent animal albumin-derived peptide (LVQEVTDFAK or its homolog) are measured by a mass spectrometer of the above.
  • the chromatogram for each of the peak of the human albumin-derived peptide and the peak of the rodent animal albumin-derived peptide, the chromatogram from the baseline before the peak to the baseline after the peak.
  • the area between the peak and the baseline is defined as the peak area.
  • the ratio of the peak area of LVNEVTEFAK or its homolog to the sum of the peak area of LVNEVTEFAK or its homolog and the peak area of LVQEVTDFAK or its homolog is applied to a regression equation prepared in advance to obtain the human hepatocyte replacement rate.
  • the regression equation is, for example, the ratio of the peak area of LVNEVTEFAK or its homolog to the sum of the peak area of LVNEVTEFAK or its homolog and the peak area of LVQEVTDFAK or its homolog obtained as described above for a plurality of human hepatocyte chimeric animals. It can be prepared with the human hepatocyte replacement rate determined by tissue staining for the chimeric animal of the same individual.
  • Tissue staining can be performed by collecting a section from the liver of a chimeric animal and performing tissue staining such as hematoxylin / eosin staining or immunostaining using an anti-human cytokeratin 8/18 antibody or the like.
  • tissue staining such as hematoxylin / eosin staining or immunostaining using an anti-human cytokeratin 8/18 antibody or the like.
  • the area ratio of human hepatocytes measured by tissue staining reflects the human hepatocyte replacement rate.
  • tissue staining such as hematoxylin / eosin staining or immunostaining using an anti-human cytokeratin 8/18 antibody or the like.
  • the area ratio of human hepatocytes measured by tissue staining reflects the human hepatocyte replacement rate.
  • human albumin and rodent animal albumin may be dissolved in water in separate containers and then diluted to the specified concentration.
  • a regression sample for human albumin was prepared by adding a human albumin solution to rodent animal plasma, and a rodent was prepared by adding a rodent animal albumin solution to human plasma. It is desirable to use it as a regression sample for animal albumin.
  • the present invention presents a step of treating the body fluid of a human hepatocyte chimeric rodent animal with a proteolytic enzyme, and LC / MS for a product treated with this proteolytic enzyme.
  • a method for batch quantification of human albumin peptide and rodent animal albumin peptide which comprises a step of measuring the peak area of the peak of LVNEVTEFAK and the peak area of the peak of LVQEVTDFAK selected by a second mass spectrometer for / MS analysis. (Second method of the present invention).
  • peptides in which one or two amino acids, particularly one amino acid, are deleted, substituted, or added in LVNEVTEFAK and LVNEVTEFAK, respectively, can also be used.
  • Human hepatocyte chimeric rodents, usable body fluids, types of proteolytic enzymes, digestion methods with proteolytic enzymes, pretreatment methods, liquid chromatography, tandem mass spectrometry, etc. are described in the humans of the present invention described above. It is the same as the method for measuring the hepatocyte replacement rate.
  • a peptide derived from human albumin and a corresponding protein or peptide derived from recipient animal albumin can be collectively quantified by a single analysis. Therefore, the human albumin concentration and the recipient animal albumin concentration in the chimeric animal can be grasped by one analysis.
  • a method for specifically separating and measuring albumin derived from an animal and human albumin in the body fluid of a rodent animal has not been known, but according to the second method of the present invention, rodents
  • the albumin concentration derived from the animal and the human albumin concentration in the body fluid of the animal can be specifically separated and measured.
  • Human hepatocyte chimeric animals can be used, for example, to assess the toxicity of drugs to the human liver, but since albumin is produced in the liver, by ascertaining the amount of human albumin and the amount of recipient animal albumin. , It is possible to determine whether the site of liver damage is derived from humans or recipient animals.
  • the human hepatocyte replacement rate can be easily and accurately measured without killing the chimeric animal.
  • the present invention also comprises a step of treating the body fluid of a human or human hepatocyte chimeric animal (particularly, human hepatocyte chimeric rodent animal) with a proteolytic enzyme.
  • a method for measuring human albumin peptide concentration which comprises a step of subjecting the treated product with this proteolytic enzyme to LC / MS / MS analysis and measuring the peak area of the peak of LVNEVTEFAK selected by a second mass spectrometer.
  • the process of treating the body fluid of rodents (particularly human hepatocyte chimeric rodents) with a proteolytic enzyme and the processed product with this proteolytic enzyme were subjected to LC / MS / MS analysis, and a second mass spectrometer was used.
  • a method for measuring rodent animal albumin peptide concentration comprising the step of measuring the peak area of the peak of LVQEVTDFAK selected in (third method of the invention).
  • peptides in which one or two amino acids, particularly one amino acid, are deleted, substituted, or added in LVNEVTEFAK and LVNEVTEFAK, respectively can also be used.
  • Human hepatocyte chimeric rodents, usable body fluids, types of proteolytic enzymes, digestion methods with proteolytic enzymes, pretreatment methods, liquid chromatography, tandem mass spectrometry, etc. are described in the humans of the present invention described above. It is the same as the method for measuring the hepatocyte replacement rate.
  • mice Preparation of human hepatocyte chimeric mouse
  • the uPA-Tg (+ / +) / SCID (+ / +) mice used as recipient animals were bred by PhoenixBio Co., Ltd. This mouse was produced by the following method.
  • uPA-Tg mice (hemizygote, +/-) were prepared by the methods described in Examples 1 and 2 of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-230093 (Patent Document 1).
  • uPA gene total RNA was extracted from mouse liver by the AGPC method (acid-guanidinium-isothiocyanate-phenol-chloroform) and dissolved in RNase-free water.
  • RNA obtained above the sequence of the uPA gene registered in the published database (acsession number: uPA gene-specific primer prepared from NM008873 (antisense sequence with a length of 1341 to 1360) and The reverse transcription reaction by LongRange Reverse Transcriptase (manufactured by Qiagen) was performed at 25 ° C for 10 minutes, then at 42 ° C for 90 minutes, and the reverse transcriptase inactivation treatment was performed at 85 ° C for 5 minutes, followed by RNaseH ( Invitrogen) was added and treated at 37 ° C. for 20 minutes to digest the mRNA, leaving only the cDNA. PCR was performed using the synthesized cDNA as a template for the PCR reaction.
  • Phusion DNA polymerase manufactured by Fynnzymes
  • the PCR primer sense sequence having a length of 39 to 61 bases
  • the amplified fragment has a length of base number 39-1360 in the PCR reaction.
  • the obtained DNA fragment was introduced into an expression plasmid having a mouse albumin promoter / enhancer described later to construct "m Alb uPAInt 2".
  • “mAlb uPAInt2” is a combination of the polyA signal in the second exon and intron of rabbit ⁇ -globin, the ORF portion of mouse uPA, and the third exon of rabbit ⁇ -globin downstream of the enhancer / promoter of mouse albumin. is there.
  • the plasmid "mAlb uPAInt2" was introduced into ES cells obtained from 129SvEv mice by the electroporation method, and then selectively cultured with G418.
  • the obtained G418-resistant colonies were tested for ES cells into which genes were introduced by PCR as follows.
  • Homologous recombination vector (uPA) DNA 25-30 ⁇ g was digested with restriction enzymes to linearize and purify.
  • the DNA was suspended mouse ES cells 3 ⁇ 10 electroporation buffer containing six (20mM HEPES pH7.0,137mM NaCl, 5mM KCl , 6mM D-glucose, 0.7mM Na 2 HPO 4) in, Field Strength Gene transfer was performed under the conditions of 185 V / cm and Capacitance 500 ⁇ F. Twenty-four hours after the introduction, selective culture was performed with G418 (Geniticin) (SIGMA G-9516) having a final concentration of 200 ⁇ g / mL.
  • G418 Geneiticin
  • Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco / BRL 11965-084) culture medium with a final concentration of 15% bovine fetal serum (Hyclone SH30071) and a final concentration of 2 mM L-glutamine (Gibco /) BRL 25030-081), non-essential amino acids with a final concentration of 100 ⁇ M (Gibco / BRL 11140-050), HEPES with a final concentration of 10 mM (Gibco / BRL 15630-080), and penicillin with a final concentration of 100 U / mL, respectively.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • ES medium Streptomycin (Gibco / BRL 15140-122), ⁇ -mercaptoethanol (SIGMA M-7522) with a final concentration of 100 ⁇ M, and ESGRO (LIF) with a final concentration of 1000 U / mL (Gibco / BRL 13275-029) are added.
  • ES medium Streptomycin (Gibco / BRL 15140-122), ⁇ -mercaptoethanol (SIGMA M-7522) with a final concentration of 100 ⁇ M, and ESGRO (LIF) with a final concentration of 1000 U / mL (Gibco / BRL 13275-029)
  • MEF Mae Embryonic Fibroblast
  • DMEM Mae Embryonic Fibroblast
  • Fetal bovine serum Hyclone SH30071
  • L-glutamine with a final concentration of 2 mM
  • non-essential amino acids with a final concentration of 100 ⁇ M
  • a final concentration of 100 ⁇ M respectively.
  • MEF medium A medium supplemented with 100 U / mL penicillin / streptomycin (Gibco / BRL 15140-122) was used (hereinafter referred to as MEF medium).
  • MEF cells cultured to confluence in a 150 cm 2 flask were peeled off with trypsin / EDTA (0.05% / 1 mM, Gibco / BRL 25300-047), 4 10 cm dishes, 2 24-well plates, 2 sheets. 6-well plate, 6 25 cm 2 flasks, and 2 75 cm 2 flasks were re-sprinkled at the optimum concentration.
  • ES cells for genotyping were prepared as follows. From the 5th day after gene transfer, the emerging G418-resistant colonies were subcultured into a 24-hole plate as follows. That is, G418-resistant colonies were transferred to a 96-well microplate containing 150 ⁇ L of trypsin / EDTA solution using Pipetman (Gilson), treated in an incubator at 37 ° C for 20 minutes, and then pipetted with Pipetman. Made into one cell. The cell suspension was transferred to a 24-well plate and the culture was continued. Two days later, the cells on the 24-well plate were split into two, one for cryopreservation and one for DNA extraction.
  • Pipetman Pipetman
  • the assay of transgenic ES cells was performed by PCR as follows. That is, the medium was removed from each well of the 24-well plate in which the cells had grown to the confluent state, washed with PBS, and then 250 ⁇ L of lysis buffer (1% SDS, 20 mM EDTA, 20 mM Tris pH 7.5) and proteinase K (20 mg / 20 mg /) were added. mL) 5 ⁇ L was added, shaken well, and heated at 52 ° C to dissolve. DNA was extracted from the lysed sample by phenol / chloroform extraction and used as template DNA for PCR.
  • lysis buffer 1% SDS, 20 mM EDTA, 20 mM Tris pH 7.5
  • proteinase K 20 mg / 20 mg /
  • uPA transgenic ES cells were selected by the following procedure.
  • the PCR primers used were set in rabbit ⁇ -globin.
  • the sequence is Sense Primer: GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG (SEQ ID NO: 1), Antisense Primer: GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA (SEQ ID NO: 2).
  • the reaction was carried out according to the attachment method of Ampi Taq Gold (ABI). After activating the enzyme at 95 ° C. for 9 minutes, the reaction was repeated 40 times at 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), at 63 ° C. for 30 seconds (annealing), and at 72 ° C. for 1 minute (extension). After completion, the reaction solution was run on a 2% agarose gel to confirm the PCR product.
  • the clones whose gene transfer was confirmed by PCR analysis were thawed by warming the cryopreserved 96-well plate to 37 ° C and subcultured into a 24-well plate. After culturing this 24-well plate at 37 ° C. for 24 hours, the medium was changed to remove DMSO and liquid paraffin. When each clone reached 75-90% confluence, it was subcultured from a 24-well plate to a 6-well plate. Furthermore, when 2 holes of 75-90% confluent were obtained on a 6-well plate, 1 hole was cryopreserved and the remaining 1 hole was used for injection into the blastocyst and DNA extraction. ..
  • Cryopreservation was performed as follows. That is, after rinsing the cells twice with PBS, add 0.5 mL of Trypsin, keep the cells warm at 37 ° C for 15 to 20 minutes for trypsin treatment, and then add another 0.5 mL of ES cell medium, and pip 35 to 40 times. Petting was performed to completely dissociate the mass of ES cells. The cell suspension was transferred to a 15 mL centrifuge tube, and the wells were washed with 1 mL of ES cell medium and collected in the tube.
  • the tube was centrifuged at 1,000 rpm for 7 minutes, the medium was removed, resuspended in 0.25 mL ES cell medium, and 0.25 mL of 2 x frozen medium was added. The contents of the wells were transferred to cryogenic vials, frozen at -80 ° C and stored in liquid nitrogen.
  • Chimeric mice were prepared as follows using ES cells having the uPA gene.
  • chimeric embryos were prepared using blastocysts of C57BL / 6J mice as host embryos, and these were transplanted into the uterine horns of pseudopregnant mice to obtain offspring.
  • Host embryos were collected on day 3 of gestation by perfusing the oviduct and uterus with Whitten's medium supplemented with 100 ⁇ M trypsin / EDTA. Eight-cell stage embryos or morulas were cultured in Whitten's medium for 24 hours and the resulting blastocysts were used for injection.
  • the ES cells used for injection were dispersed by TE treatment on the 2nd or 3rd day after passage, and allowed to stand at 4 ° C. until they were subjected to microoperation.
  • a glass capillary tubing inner diameter of about 20 ⁇ m
  • a micro glass tube NARISHIGE
  • a portion cut at a portion of 50 to 100 ⁇ m and further processed to a diameter of 10 to 20 ⁇ m was used.
  • the injection pipette and the retention pipette were connected to a micromanipulator (Lica) to which a piezo system (Primetech PAMS-CT150) was connected.
  • the chamber used for the microscopic operation was a perforated slide glass with a cover glass bonded with beeswax, and two drops of Hepes-buffered Whitten's medium containing about 10 ⁇ L of 0.3% BSA were placed on it, and the top surface was placed.
  • About 100 ES cells were placed in one drop, about 20 expanded blastocysts were placed in the other, and about 15 ES cells were injected per embryo. All microscopic operations were performed under an inverted microscope.
  • Manipulated embryos were transplanted into the uterine horns of ICR-receptive females on day 2 of pseudopregnancy. Recipient females who did not deliver their offspring by the expected delivery date underwent cesarean section and were fed to foster parents. As a result of injecting 45 clones of ES cells into the blastocysts of C57BL / 6J strain mice, male chimeric mice were obtained in 39 clones.
  • the uPA-Tg mouse (hemizygote, +/-) thus obtained was backcrossed twice with the SCID-bg mouse to obtain a mouse having the uPA-Tg (+/-) SCID (+/+) genotype. Obtained.
  • Sperm were collected from the male of the mouse, fertilized with an unfertilized egg of a SCID mouse (homozygote, +/+) and in vitro fertilized, and then returned to the fetal belly.
  • mice containing the Tg gene were selected, and mice with both traits uPA-Tg (+/-) / SCID (+ / +) were obtained by natural mating.
  • uPA-Tg (+/-) and uPA-Tg (-/-) were performed by genomic PCR using a sequence specific to the transgene as a primer.
  • SCID (+ / +), SCID (+/-) and SCID (-/-) were distinguished by the PCR-RFLP method.
  • uPA-Tg (+/-) / SCID (+/+) are mated with each other, and uPA-Tg (+ / +) / SCID (+/+) and uPA-Tg (+/-) I got / SCID (+ / +).
  • the distinction between uPA-Tg (+ / +) and uPA-Tg (+/-) was performed by Southern blotting. Approximately 5 mm of the tail of mice 8 to 10 days after birth was cut, solubilized with 3 SDS, proteinase K solution, and mixed protein components were removed by extraction with phenol and chloroform.
  • genomic DNA was precipitated by isopropanol precipitation.
  • the above genomic DNA was washed with 70% ethanol, air-dried, and then redissolved in TE. 5 ⁇ g of each of the genomic DNA extracted from the sample and the positive and negative control genomic DNA was completely digested with EcoR1, and the resulting DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis and transferred to a nylon membrane.
  • the restriction enzyme EcoR1 was used to purify DNA fragments suitable for Southern hybridization probes from uPA cDNA probes / TAs (379 bp). The above DNA fragment was [32P] labeled by the random prime method.
  • the DNA fragment transferred to the nylon membrane was hybridized with the RI-labeled uPA cDNA probe.
  • Non-specifically bound probes were removed by washing, and radioactivity signals derived from foreign genes introduced into candidate individuals of mAlb-uPA-Int2 Tg mice were detected by exposing them to X-ray film. Detecting a 1.5 kb specific signal from the wild-type locus and a 0.4 kb (wt: 1.5 kb) specific signal from the mutant locus, genotypes of mAlb-uPA-Int2 Tg mouse individuals was judged.
  • Human hepatocyte transplantation As human hepatocytes, hepatocytes (Lot No. BD195, girl, 2 years old) purchased from BD Gentest were used. These frozen hepatocytes are Chise Tateno, Yasumi Yoshizane, mecanic Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely. humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165: 901-912, 2004 was thawed and used according to the method described.
  • mice 3-5 week old uPA-Tg (+/-) / SCID (+/+) mice were anesthetized with isoflurane, the left abdomen was incised about 5 mm, and 10.0x10 5 human hepatocytes were removed from the splenic head. After injection, the spleen was returned to the abdominal cavity and sutured. After transplantation, the animals were bred for about 100 days by free intake of tap water containing CRF-1 (Oriental Yeast Co., Ltd.) and sodium hypochlorite solution 0.0125%.
  • CRF-1 Oriental Yeast Co., Ltd.
  • the SCID / c.b-17 mouse used for crossing does not have T cells and B cells, but is known to have NK cells. Therefore, an antibody that inhibits NK activity was intraperitoneally administered the day before transplantation so that the transplanted human hepatocytes would not be attacked by mouse NK cells.
  • a standard solution prepared at a predetermined concentration of human serum albumin and mouse serum albumin was diluted with purified water to prepare a regression sample.
  • 50 ⁇ L was taken from 10 ⁇ L of plasma or a mixture of the prepared regression sample and 490 ⁇ L of purified water, and used as a digestion sample.
  • 50 ⁇ L of the digested sample 50 ⁇ L of the above pretreatment enzyme solution was added, stirred, and then incubated at 37 ° C. for 6 hours. Then, 10 ⁇ L of the trypsin-treated solution was mixed and incubated at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, it was lightly tapped and mixed.
  • LVNEVTEFAK human albumin-derived peptide
  • LVQEVTDFAK mouse albumin-derived peptide
  • Table 1 shows the human hepatocyte replacement rate (%) determined by immunostaining and the peptide ratio (%) in the plasma of LC / MS / MS chimeric mice.
  • Table 2 shows the measured values (human albumin concentration and mouse albumin concentration) and the calculated values (peptide ratio in chimeric mouse plasma) of LC / MS / MS.
  • Figure 2 shows an example of the chromatogram obtained by the analysis of the third quadrupole of the mass spectrometer.
  • FIG. 3 shows a graph in which the human hepatocyte replacement rates obtained by immunostaining are plotted against the human albumin concentration obtained by LC / MS / MS for 11 human hepatocyte chimeric mice.
  • Human hepatocyte mouse blood human albumin concentration and human hepatocyte replacement rate are determined by conventionally known human hepatocyte chimeric mice (C.Tateno, Y.Kawase, Y.Tobita, S.Hamamura, H.Ohshita, H.Yokomichi, H.Sanada, M.Kakuni, A.Shiota, Y.Kojima, Y.Ishida, H.Shitara, NAWada, H.Tateishi, M.Sudoh, S.Nagatsuka, K.Jishage, M.Kohara, Generation of Novel Chimera Similar correlations were observed in Mice with Humanized Livers by Using Hemizygous cDNA-uPA
  • the human hepatocyte replacement rate can be easily and accurately measured without killing the human hepatocyte chimeric rodent animal.
  • the instrument since the instrument is used, there is no variation in the results between measurement facilities, and the human hepatocyte replacement rate can be measured stably and with good reproducibility.
  • the human albumin concentration and the recipient animal albumin concentration in human hepatocyte chimeric rodent animals can be measured collectively, so that the hepatotoxicity of the drug can be measured in humans and recipient animals. It can be easily determined which hepatocyte it is occurring in.

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Abstract

ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液をトリプシン消化する工程と、このトリプシン消化物を液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析装置を組み合わせた分析に供して、第２の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積とLVQEVTDFAK又はLVQEVTDFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積の合計に対するLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積の比率を求める工程と、このピーク面積比率を回帰式に当てはめてヒト肝細胞置換率を求める工程を含む、ヒト肝細胞置換率の測定方法によれば、キメラ動物をと殺することなく、かつ正確にヒト肝細胞置換率を測定することができる。

Description

ヒト肝細胞キメラ動物におけるヒト肝細胞置換率の測定方法
　本発明は、肝臓がヒト肝細胞で置換されたげっ歯類動物（以下、「ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物」という）におけるヒト肝細胞による肝臓の置換率を測定する方法に関する。また、本発明は、肝臓がヒト肝細胞で置換されたげっ歯類動物におけるヒトアルブミンとげっ歯類動物アルブミンの存在比を測定する方法に関する。
　医薬品開発では、前臨床試験においてラットやマウスなどの多くの実験動物が使われている。しかし、ヒトと動物では薬物動態が大きく異なることから、動物実験と臨床試験との間で、薬効や毒性に差がある場合が多い。臨床試験の段階で開発が中止になることは、医薬品業界においては大きな損失となる。このことから、ヒトの薬物動態をより正確に調べる試験系が望まれてきた。発明者らは、これまで、マウスやラットの肝臓のほとんど又は一部がヒト肝細胞で置換されたヒト肝細胞キメラ動物の開発を行ってきた（特許文献１、２、非特許文献１）。このモデルは、薬物代謝や肝炎研究に有用であることが示されている（非特許文献２、３）。また、近年、医療を行う上で薬剤等の効果が人種差、個人差、年齢差、性差、病歴などにより大きく異なることから、テーラーメイド医療が注目されている。このヒト肝細胞キメラ動物は、肝疾患の治療をテーラーメイド化するために利用することもできる。
　このようなヒト肝細胞キメラ動物の作製や利用に当たり、キメラ動物の肝臓がどの程度ヒト肝細胞で置換されているかを把握する必要がある。
　最も正確なヒト肝細胞置換率測定方法として、キメラ動物肝臓の全ての7つの葉から切片を採取し、ヘマトキシリン・エオジンなどの染色によりヒト肝細胞の面積比から置換率を求める方法や、キメラ動物肝臓の全ての7つの葉から切片を採取し、抗ヒトサイトケラチン8/18抗体陽性面積比から置換率を求める方法が知られている（特許文献１）。しかし、これらの方法は、動物をと殺する必要があるため、経時的なデータを採取することが不可能であり、望ましくない。
　ヒト肝細胞キメラ動物の血清中の、ヒトアルブミン濃度とレシピエント動物アルブミン濃度の合計に対するヒトアルブミン濃度の比率から、ヒト肝細胞置換率を推測する方法が考えられるが、ヒトのアルブミン濃度とレシピエント動物のアルブミン濃度を全く等しい測定手段で求める方法が存在せず、従って、別々の測定手段で求めたヒトアルブミン濃度とレシピエント動物アルブミン濃度の合計が総アルブミン濃度と一致しないなどの問題がある。
特開2013-230093号 特開2007-228962号
Tachibana A, Tateno C, Yoshizato K. Repopulation of the Immunosuppressed Retrorsine-treated Infant Rat Liver with Human Hepatocytes. Xenotransplantation (2013) 20 (227-38) Katoh M, Matsui T, Nakajima M, Tateno C, Kataoka M, Soeno Y, Horie T, Iwasaki K, Yoshizato K and Yokoi Y: Expression of Human CYPs in Chimeric Mice with Humanaized Liver. Drug Metab Dispos 32:1402-1410, 2004 Tsuge M, Hiraga N, Takaishi H, Noguchi C, Oga H, Imamura M, Takahashi S, Iwao E, Fujimoto Y, Ochi H, Chayama K, Tateno C and Yoshizato K: Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetially engineered hepatitis B virus. Hepatology 42:1046-1054, 2005
　本発明は、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の肝臓におけるヒト肝細胞置換率を測定する方法であって、キメラ動物をと殺することなく、かつ正確にヒト肝細胞置換率を測定できる方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液（特に、血漿）をタンパク質分解酵素で処理して、液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析装置を組み合わせた分析（以下、「LC/MS/MS分析」という）に供した場合、タンデム型質量分析装置の第2の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAKのピークとLVQEVTDFAKのピークが、対応する、ヒトアルブミン由来ペプチドのピークとレシピエント動物アルブミン由来ペプチドのピークである。
(ii)　ヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）のピーク面積とげっ歯類動物アルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK）のピーク面積の合計に対するヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）のピーク面積の比率は、免疫染色法で求めたヒト肝細胞置換率と比例する。従って、ヒト肝細胞置換率を正確に測定できる。
　本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記方法を提供する。
〔１〕　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析に供して、第２の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積とLVQEVTDFAK又はLVQEVTDFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積の合計に対するLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積の比率を求める工程と、このピーク面積比率を回帰式に当てはめてヒト肝細胞置換率を求める工程とを含む、ヒト肝細胞置換率の測定方法。
〔２〕　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕　回帰式を、上記ピーク面積比率と、同種のレシピエント動物を用いたヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の肝臓切片の観察により求めたヒト肝細胞置換率との間で作成する、〔１〕～〔３〕の何れかに記載の方法。
〔５〕　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析を組み合わせた分析に供して、第２の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積とLVQEVTDFAK又はLVQEVTDFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積を測定する工程とを含む、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物におけるヒトアルブミン濃度とげっ歯類アルブミン濃度の一括測定方法。
〔６〕　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、〔５〕に記載の方法。
〔７〕　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、〔５〕又は〔６〕に記載の方法。
〔８〕　げっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析を組み合わせた分析に供し、第２の質量分析計で選択されるLVQEVTDFAK又はLVQEVTDFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積を測定する工程を含む、げっ歯類動物アルブミンペプチド濃度の測定方法
〔９〕　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕　ヒト又はヒト肝細胞キメラ動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析を組み合わせた分析に供し、第２の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積を測定する工程を含む、ヒトアルブミンペプチド濃度の測定方法。
〔１２〕　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、〔１１〕又は〔１２〕に記載の方法。
　本発明方法は、特定のヒトアルブミン由来ペプチドと、レシピエント動物アルブミン由来の対応するペプチドの合計濃度に対するヒトアルブミン由来ペプチドの濃度の比率からヒト肝細胞置換率を推測する方法であり、このペプチド比率と、肝臓の切片を観察することで求めたヒト肝細胞置換率とが比例関係にあるため、ヒト肝細胞置換率を正確に求めることができる。
　本発明方法は、質量分析装置を用いてアルブミン由来ペプチド濃度を測定対象とするため、ドナーや抗体による測定値の変動がなく再現性が高い。また、ヒトアルブミン由来ペプチド濃度とレシピエント動物アルブミン由来ペプチド濃度を全く等しい測定手段により求めることができるため、ヒト肝細胞置換率を正確に把握することができる。
　また、タンデム型質量分析装置であっても、一般に、アルブミンなどの種間相同性が高いタンパク質について、ヒトとげっ歯類動物に由来するペプチドを明確に区別して検出することは非常に難しい。この点、本発明方法は、タンデム型質量分析装置を行い、第2の質量分析計で、ヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）のピークとげっ歯類動物アルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK）のピークを選択することにより、ヒトアルブミン由来のペプチドと、レシピエント動物由来のペプチドを、一度の分析で区別して検出し、定量できるため、非常に簡便である。
　また、本発明方法は、ヒト肝細胞キメラ動物をと殺することなく、ヒト肝細胞置換率を求めることができる。従って、例えば、キメラ動物を作製する過程で、ヒト肝細胞による置換率を経時的にモニタリングすることができる。
ヒト肝細胞キメラマウスの血漿のトリプシン消化物のLC/MS/MSのQ3で選択されるヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）のピーク面積とマウスアルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK）のピーク面積の合計に対するヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）のピーク面積の比率と、免疫染色法で求めたヒト肝細胞置換率との間の関係を示すグラフである。 ヒト肝細胞キメラマウスの血漿のトリプシン消化物をLC/MS/MSに供して得た第3四重極（Q3）のクロマトグラムである。 ヒト肝細胞キメラマウスの血液中のLC/MS/MSで求めたヒトアルブミン濃度と、免疫染色法で求めたヒト肝細胞置換率との間の関係を示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ヒト肝細胞置換率の測定方法
　本発明のヒト肝細胞置換率の測定方法は、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素で処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物をLC/MS/MS分析に供して、第2の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAKのピークのピーク面積とLVQEVTDFAKのピークのピーク面積の合計に対するLVNEVTEFAKのピークのピーク面積の比率を求める工程と、このピーク面積比率を回帰式に当てはめてヒト肝細胞置換率を求める工程を含む方法である。
　また、LVNEVTEFAK及びLVNEVTEFAKにおいて、それぞれ1又は2個、特に1個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチド（以下、「ホモログ」ということがある）も使用できる。
　LVNEVTEFAKはヒトアルブミン由来のペプチドであり、LVQEVTDFAKは対応するげっ歯類動物アルブミン由来のペプチドである。
ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物
　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物は、肝臓の細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換されたげっ歯類動物である。このキメラげっ歯類動物は、免疫不全肝障害げっ歯類動物にヒト肝細胞を移植することにより作製することができる。また、この初代キメラげっ歯類動物の体内で増殖したヒト肝細胞を、免疫不全肝障害を有する同種のげっ歯類動物に移植して得られる継代移植キメラげっ歯類動物も本発明の対象となる。継代移植キメラげっ歯類動物は、1回継代移植して得られるキメラ動物でもよく、2回以上継代移植して得られるキメラ動物でもよい。
　げっ歯類動物としては、マウス、ラットのようなネズミ、モルモット、リス、ハムスターなどが挙げられるが、実験動物として汎用されているマウス、ラットのようなネズミが好適である。
　免疫不全肝障害げっ歯類動物は、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない免疫不全であるとともに、そのげっ歯類動物本来の肝臓の細胞が障害を受けている動物である。その動物本来の細胞が障害を受けていることにより、ヒト肝細胞を移植すれば、その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれ、ヒト肝細胞の個体内機能を正確に反映した動物となる。また、移植するヒト肝細胞が増殖し易くなる。
　免疫不全肝障害動物は、同一個体に、肝障害誘発処理を施すとともに、免疫不全誘発処理を施すことにより作製することができる。肝障害誘発処理としては、四塩化炭素、黄リン、D-ガラクトサミン、2-アセチルアミノフルオレン、ピロロジンアルカロイドのような肝障害誘発物質の投与や、放射線照射、外科的な肝臓の部分切除などが挙げられる。免疫不全誘発処理としては、免疫抑制剤の投与や胸腺摘出などが挙げられる。
　また、免疫不全肝障害動物は、遺伝的免疫不全症の動物に、肝障害誘発処理を施すことによっても作製できる。遺伝的免疫不全症動物としては、Ｔ細胞系不全を示す重症複合免疫不全症（SCID：severe combined immunodeficiency）の動物、遺伝的な胸腺の欠損によりT細胞機能を失った動物、RAG2遺伝子を公知のジーンターゲッティング法（Science,244:1288-1292,1989)やゲノム編集技術によりノックアウトした動物などが挙げられる。具体的には、SCIDマウス、RAG2ノックアウトマウス、IL2Rgc/Rag2ノックアウトマウス、NODマウス、NOGマウス、ヌードマウス、ヌードラット、X線照射したヌードラットにSCIDマウスの骨髄を移植して得られる免疫不全ラット（特開2007-228962号（特許文献２）、Transplantation. 60(7):740-7, 1995）などが挙げられる。
　また、免疫不全肝障害動物は、遺伝的肝障害動物に免疫不全誘発処理を施すことによっても作製できる。遺伝的肝障害動物としては、肝細胞特異的に発現するタンパク質のエンハンサー、及び／又はプロモーターの支配下に連結された肝障害誘発タンパク質遺伝子を用い、公知のトランスジェニック法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77;7380-7384,1980)により作製したトランスジェニック動物が挙げられる。このような動物では、肝障害誘発タンパク質が肝臓特異的に発現するため、肝障害を有するものとなる。肝臓特異的に発現するタンパク質としては、血清アルブミン、コリンエステラーゼ、ハーゲマン因子などが挙げられる。肝障害誘発タンパク質としては、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(uPA)、ティッシュープラスミノーゲンアクチベーター(tPA)などが挙げられる。また、例えばフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子のような肝機能を担う遺伝子をノックアウトすることによっても遺伝的肝障害を有する動物を得ることができる。また、アルブミンエンハンサープロモーター下にチミジンキナーゼ遺伝子を導入したマウスにガンシクロビルを投与することにより肝障害を起こすこともできる。
　さらに、免疫不全肝障害動物は、遺伝的免疫不全動物と、それと同種の遺伝的肝障害動物とを交配させることによっても作製することができる。
　遺伝的免疫不全肝障害動物としては、肝障害遺伝子がホモまたはヘテロ接合体である動物を用いることができる。
　移植に用いるヒト肝細胞は、ヒト肝組織から、コラゲナーゼ灌流法のような常法によって単離したものを用いることができる。例えば14歳以下の小児のヒトの肝細胞を使用することにより、ヒト肝細胞による高置換率が達成される。また、in vivoで活発な増殖能を有する増殖性肝細胞を使用すれば、レシピエントげっ歯類動物の体内で急速に増殖し、正常な肝機能を発揮しうるヒト肝細胞集団を短時間で形成することができる。このような増殖性ヒト肝細胞としては、本発明者らが発明したヒト小型肝細胞（特開平8-112092号など）などが挙げられる。
　ヒト肝細胞は、免疫不全肝障害動物の脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、直接門脈から移植することもできる。移植するヒト肝細胞の数は、1～200万個程度とすることができる。
　免疫不全肝障害動物の性別は特に限定されない。また、移植時の免疫不全肝障害動物の日齢は、特に限定されないが、マウスが低週齢のときにヒト肝細胞を移植すると、マウスの成長とともにヒト肝細胞がより活発に増殖することができる点で、生後0～40日程度の動物を使用するのが好ましい。
　移植後の動物を、常法により、飼育すればよい。例えば移植後40～200日間程度飼育することにより、肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換された初代キメラ動物が得られる。
　次に、継代移植キメラ動物の作製方法について説明する。キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞は、例えば、キメラ動物の肝臓組織をコラゲナーゼ処理することにより回収することができる。コラゲナーゼの細胞毒性は、げっ歯類動物肝細胞に対する方が、ヒト肝細胞に対するより高いため、コラゲナーゼ処理時間を調節することにより、キメラ動物の肝細胞に障害を与え、実質的にヒト肝細胞だけを分離することができる。
　回収された肝細胞の中には、キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞の他、肝非実質細胞や、レシピエント動物の肝細胞も少量含まれる。従って、回収した肝細胞をそのまま移植に使用してもよいが、ヒト肝細胞あるいはレシピエント動物肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いてヒト肝細胞の純度を上げることもできる。
　初代キメラ動物から分離したヒト肝細胞のげっ歯類動物の肝臓への移植、増殖方法は、初代キメラ動物の作製と同様である。
キメラ動物の体液
　測定対象として用いるキメラげっ歯類動物の体液は、アルブミンを含むものであればよく、制限されない。また、採取した体液を、アルブミンを含むように分画したものであってもよい。例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、リンパ液、汗、涙などを使用できる。採取し易く、またアルブミン以外の成分が少ない点で、血清、血漿が使い易い。
タンパク質分解酵素による処理又は消化
　タンパク質分解酵素は、エンドペプチダーゼを用いればよく、中でもセリンプロテアーゼが好ましい。セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、Bacillus subtilis由来のアルカリ性プロテアーゼなどが挙げられる。中でも、トリプシンが好ましい。
　採取した体液はそのまま使用してもよいが、精製水、生理食塩水、緩衝液などの緩衝液を用いて、タンパク質又はペプチド濃度が50～100μg程度となるように希釈したものを用いることもできる。
　タンパク質分解酵素の使用量は、体液に含まれるタンパク質又はペプチドの100μgに対して、約0.1～5μgとすることができ、中でも約1μgとすることができる。
　また、酵素反応は、約30～40℃、特に、約37℃で、約1～24時間、特に、約16時間行えばよい。
　また、複数のタンパク質分解酵素で処理することにより目的とするペプチドを効率よく生成することができる。例えば、トリプシン消化に先立ち、Lys C、Protease MAXなどのプロテアーゼで体液中のタンパク質を前処理しておくことにより、後のトリプシン処理で目的とするペプチドを効率的に生成することができる。前処理用のプロテアーゼは1種又は2種以上を使用できる。前処理に用いるプロテアーゼの使用量は、体液に含まれるタンパク質又はペプチドの100μgに対して、約0.1～5μgとすることができ、中でも約1μgとすることができる。また、反応温度は、酵素の種類によって異なるが、約30～40℃、特に、37℃とすればよく、反応時間は、約1～24時間、特に、約16時間とすればよい。
LC/MS/MS分析
　ヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）とげっ歯類動物アルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK）の分子量は等しいため、本発明方法では、先ず、タンパク質分解酵素で消化したサンプルを液体クロマトグラフィー（LC）に供して、ペプチドを分離し、次いで、その中の特定画分を、タンデム型質量分析装置（MS/MS）に供して、特定ペプチドイオンを選択して定量する。LCとMS/MSは別個に行ってもよいが、LC装置とMS/MS装置が直結したLC/MS/MS装置を用いて行うのが簡便である。
　また、ヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）又はげっ歯類動物アルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK）において、1又は2個、特に1個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドを用いる場合は、ヒトアルブミン由来ペプチドとげっ歯類動物アルブミン由来ペプチドとで分子量が異なる場合もあるが、本発明方法では、MS/MSの前にLCを行うことで両ペプチドを高精度に定量できる。
液体クロマトグラフィー
　液体クロマトグラフィーの種類は限定されず、例えば、オクタデシルシリル基で表面が修飾されたシリカゲルなどを固定相とし、水／メタノール混液などを移動層として、疎水性相互作用を利用して分離する逆相クロマトグラフィー、デキストリンゲルやアガロースゲルなどを固定相とし、緩衝液などを移動相として、ゲルの細孔へのペプチドの浸透を利用して分離するゲルフィルトレーション（GFC）クロマトグラフィー、イオン交換樹脂を固定相として電気親和力を利用して分離するイオン交換クロマトグラフィー、ペプチドに特異的に結合するリガンドを固定した担体を固定相とし、特異的結合を利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを用いることができる。中でも、逆相クロマトグラフィーが好ましい。
　逆相クロマトグラフィーを行う場合の条件として、実施例に記載の条件が挙げられるが、分析カラムの種類、移動相、流速、カラム温度、注入量などの条件は、適宜最適化することができる。
　液体クロマトグラフィーにおいて、ヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK又はそのホモログ）画分とげっ歯類動物アルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK又はそのホモログ）画分を分離し、このペプチドをタンデム型質量分析装置に供する。
タンデム型質量分析
　タンデム型質量分析では、第1の質量分析計で、精製したイオン種のうち1つを前駆イオンとして選択し、次いで、イオンを開裂してプロダクトイオンを生成し、第2の質量分析計でプロダクトイオンを検出及び定量する。
　質量分析装置のイオン源の種類としては、エレクトロスプレー、大気圧化学イオン化、大気圧光イオン化のような大気圧イオン化；サーモスプレー、パーティクルビーム、フローFABのような真空中イオン化などが挙げられる。中でも、エレクトロスプレーが好ましい。
　質量分析計の種類としては、四重極質量分析計（特に、三連四重極質量分析計）、ハイブリッドタンデム質量分析計、フーリエ変換イオンサイクトロン質量分析計、磁場型質量分析計、イオントラップ質量分析計、飛行時間質量分析計などが挙げられる。中でも、定量性が良く、ダイナミックレンジが広く、直線性が良好である点で、四重極質量分析計（特に、三連四重極質量分析計）が好ましい。
　三連四重極質量分析計を用いる場合、LVNEVTEFAK又はLVQEVTDFAKの前駆イオンとして575.3m/zのイオン、プロダクトイオンとして185.2m/zのイオンを選択することができる。なお、これらに限らず、LVNEVTEFAK又はLVQEVTDFAKに由来する前駆イオン及びプロダクトイオンであれば、どのような質量電荷比(m/z)のイオンでも選択することができる。用いる質量分析計により、その質量分析計に合った質量電荷比(m/z)の前駆イオン及びプロダクトイオンを、適宜選択することができる。LVNEVTEFAK又はLVQEVTDFAKのホモログを使用するときも同様である。
　本発明方法では、第1の質量分析計で特異的なヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK又はそのホモログ）及び特異的なげっ歯類動物アルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK又はそのホモログ）のイオンを選択し、第2の質量分析計でヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK又はそのホモログ）のピークとげっ歯類動物アルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK又はそのホモログ）のピークのピーク面積をそれぞれ測定する。
　本発明では、LC/MS/MSクロマトグラムにおいて、ヒトアルブミン由来ペプチドのピーク、及びげっ歯類動物アルブミン由来ペプチドのピークのそれぞれについて、ピーク前のベースラインからピーク後のベースラインまでの、クロマトグラムピークとベースラインとの間の面積をピーク面積とする。
　LVNEVTEFAK又はそのホモログのピーク面積とLVQEVTDFAK又はそのホモログのピーク面積の合計に対するLVNEVTEFAK又はそのホモログのピーク面積の比率を、予め作成した回帰式に当てはめて、ヒト肝細胞置換率を求める。
　回帰式は、例えば、複数のヒト肝細胞キメラ動物について上記のようにして求めたLVNEVTEFAK又はそのホモログのピーク面積とLVQEVTDFAK又はそのホモログのピーク面積の合計に対するLVNEVTEFAK又はそのホモログのピーク面積の比率と、同個体のキメラ動物について組織染色で求めたヒト肝細胞置換率との間で作成することができる。組織染色は、キメラ動物の肝臓から切片を採取して、ヘマトキシリン・エオジン染色のような組織染色や、抗ヒトサイトケラチン8/18抗体などを用いた免疫染色などで行うことができる。組織染色で測定されたヒト肝細胞の面積比はヒト肝細胞置換率を反映している。
　キメラ動物の肝臓から切片を採取する場合、肝臓の全ての7つの葉から、それぞれ切片を採取し、各葉のヒト肝細胞面積比を平均するのが好ましい。また、肝臓の外側右葉から採取した切片を用いて求めたヒト肝細胞置換率は、全7葉から採取した切片を用いて求めたヒト肝細胞置換率の平均値に近似しているため、外側右葉の切片を用いることもできる。
　免疫染色法に限らず、ヒト肝細胞置換率を正確に測定できる方法であれば、回帰式作成に用いることができる。
　回帰式の作成に当たっては、ヒトアルブミン及びげっ歯類動物アルブミンを別々の容器で水に溶解後、規定濃度に希釈したものをそれぞれ作成すればよい。酵素反応の影響差をなくすため、ヒトアルブミン溶液をげっ歯類動物の血漿に添加したものをヒトアルブミン用の回帰式試料とし、げっ歯類動物アルブミン溶液をヒト血漿に添加したものをげっ歯類動物アルブミン用の回帰式試料として使用するのが望ましい。
（２）ヒト及びげっ歯類動物アルブミンペプチドの一括定量方法
　本発明は、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素で処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物をLC/MS/MS分析に供し、第2の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAKのピークのピーク面積とLVQEVTDFAKのピークのピーク面積を測定する工程を含む、ヒトアルブミンペプチドとげっ歯類動物アルブミンペプチドの一括定量方法を包含する（本発明の第2の方法）。また、LVNEVTEFAK及びLVNEVTEFAKにおいて、それぞれ1又は2個、特に1個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドも使用できる。
　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物、使用可能な体液、タンパク質分解酵素の種類、タンパク質分解酵素による消化方法、前処理方法、液体クロマトグラフィー、タンデム型質量分析などについては、上記説明した本発明のヒト肝細胞置換率の測定方法と同じである。
　従来、キメラ動物が有するタンパク質又はペプチドであって、ヒト由来タンパク質又はペプチドとレシピエント動物由来の対応するタンパク質又はペプチドを一括して定量できる方法は知られていなかった。この点、本発明の第2の方法によれば、一度の分析により、ヒトアルブミン由来のペプチドと、レシピエント動物アルブミン由来の対応するペプチドを一括して定量することができる。従って、キメラ動物におけるヒトアルブミン濃度とレシピエント動物アルブミン濃度を一度の分析により把握できる。
　また、従来、げっ歯類動物の体液中のその動物由来のアルブミンとヒトアルブミンを特異的に分離測定する方法は知られていなかったが、本発明の第2の方法によれば、げっ歯類動物の体液中のその動物由来のアルブミン濃度とヒトアルブミン濃度を特異的に分離測定することができる。
　ヒト肝細胞キメラ動物は、例えば、薬物のヒト肝臓への毒性を評価するために用いることができるが、アルブミンは肝臓で産生されるため、ヒトアルブミン量とレシピエント動物アルブミン量を把握することにより、肝障害が起こっている部位がヒト由来なのか、レシピエント動物由来なのかを判定することができる。
　また、前述した通り、本発明の第2の方法によれば、キメラ動物をと殺することなく、簡単かつ正確にヒト肝細胞置換率を測定することができる。また、ドナー間、測定者間で結果に差が無く、再現性良く、ヒト肝細胞置換率を測定することができる。
（３）ヒト及びげっ歯類動物アルブミンペプチドの測定方法
　また、本発明は、ヒト又はヒト肝細胞キメラ動物（中でも、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物）の体液をタンパク質分解酵素で処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物をLC/MS/MS分析に供し、第2の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAKのピークのピーク面積を測定する工程を含む、ヒトアルブミンペプチド濃度の測定方法、及びげっ歯類動物（中でもヒト肝細胞キメラげっ歯類動物）の体液をタンパク質分解酵素で処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物をLC/MS/MS分析に供し、第2の質量分析計で選択されるLVQEVTDFAKのピークのピーク面積を測定する工程を含む、げっ歯類動物アルブミンペプチド濃度の測定方法を包含する（本発明の第3の方法）。また、LVNEVTEFAK及びLVNEVTEFAKにおいて、それぞれ1又は2個、特に1個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドも使用できる。
　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物、使用可能な体液、タンパク質分解酵素の種類、タンパク質分解酵素による消化方法、前処理方法、液体クロマトグラフィー、タンデム型質量分析などについては、上記説明した本発明のヒト肝細胞置換率の測定方法と同じである。
　以下、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（１）ヒト肝細胞キメラマウスの作製
免疫不全肝障害マウスの作製
　レシピエント動物として使用したuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスは、株式会社フェニックスバイオにて繁殖させたものを用いた。このマウスは、下記方法により作製したものである。
　先ず、特開2013-230093号（特許文献1）の実施例1、2に記載した方法でuPA-Tgマウス（hemizygote, +/-）を作製した。
　uPA遺伝子は、マウス肝臓からAGPC法（acid-guanidinium-isothiocyanate-phenol-chloroform）で全RNAを抽出し、RNase-free水に溶解した。前記で得た全RNAを用いて、公開されたデータベースに登録されるuPA遺伝子の配列（アクセッション番号：NM008873より作成したuPA遺伝子特異的プライマー（1341番塩基から1360塩基長のアンチセンス配列）及びLongRange Reverse Transcriptase（Qiagen社製）による逆転写反応を、25℃にて10分間、次いで、42℃にて90分間行い、逆転写酵素不活化処理を85℃にて5分間行った後、RNaseH（Invitrogen社製）を添加して37℃にて20分間処理してmRNAを消化し、cDNAのみを残存させた。合成されたcDNAをPCR反応の鋳型としてPCRを行った。上記反応液を全量の1/10添加し、酵素はPhusion DNA polymerase（Fynnzymes社製）を用いた。PCRプライマー（39番塩基から61塩基長のセンス配列）は、uPA遺伝子配列（アクセッション番号：NM008873）より作製した。増幅される断片は、PCR反応では塩基番号39-1360の長さである。えられたDNA断片を後述のマウスアルブミンプロモーター/エンハンサーを持った発現プラスミドに導入し「mAlb uPAInt2」を構築した。「mAlb uPAInt2」は、マウスアルブミンのエンハンサー/プロモーターの下流にラビットβグロビンの第2エキソン、イントロン、第3エキソン・マウスuPAのORF部分・ラビットβグロビンの第3エキソン中のpolyAシグナルを結合したものである。
　プラスミド「mAlb uPAInt2」を、エレクトロポレーション法により129SvEvマウスより得られたES細胞に導入し、次いでG418により選択培養を行った。得られたG418耐性コロニーについて、下記のようにして、PCRにより遺伝子が導入されたES細胞の検定を行った。
  相同組み換え用ベクター（uPA）DNA 25-30μｇを制限酵素で切断することにより線状化し、精製した。このDNAをマウスES細胞3×106個を含むエレクトロポレーション用緩衝液（20mM HEPES pH7.0、137mM NaCl、5mM KCl、6mM D-glucose、0.7mM Na2HPO4）に懸濁し、Field Strength 185V/cm、Capacitance 500μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入から24時間経過後、終濃度200μg/mLのG418(Geniticin)(SIGMA社 G-9516)で選択培養を行った。ES細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco/BRL社 11965-084)培養液に終濃度15％の牛胎児血清(Hyclone社 SH30071)、終濃度2mMのL-グルタミン(Gibco/BRL社 25030-081)、終濃度がそれぞれ100μＭの非必須アミノ酸(Gibco/BRL社 11140-050)、終濃度10mMのHEPES(Gibco/BRL社 15630-080)、終濃度がそれぞれ100U/mLのペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/BRL社 15140-122)、終濃度100μＭのβ－メルカプトエタノール(SIGMA社 M-7522)、そして終濃度1000U/mLのESGRO(LIF)(Gibco/BRL社 13275-029)を添加したものを用いた(以下ES培地と記す)。
  また、ES細胞用のフィーダー細胞としては、E14.5の胚から単離したMEF（Mouse Embryonic Fibroblast）細胞を用い、培養液はDMEM(Gibco/BRL社 11965-084)培養液に終濃度10%の牛胎児血清(Hyclone社 SH30071)、終濃度2mMのL-グルタミン(Gibco/BRL社 25030-081)、終濃度がそれぞれ100μＭの非必須アミノ酸(Gibco/BRL社 11140-050)、終濃度がそれぞれ100U/mLのペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/BRL社 15140-122)を添加したものを用いた(以下MEF培地と記す）。150cm2のフラスコでコンフルエントにまで培養させたMEF細胞をトリプシン／EDTA(0.05%/1mM、Gibco/BRL社 25300-047)ではがし、4枚の10cmディッシュ、2枚の24穴プレート、2枚の6穴プレート、6個の25cm2フラスコ、2個の75cm2フラスコにそれぞれ至適な濃度で撒きなおした。
　遺伝子型解析用ES細胞を以下のようにして調整した。
　遺伝子導入後5日目から、以下のようにして、出現したG418耐性コロニーを24穴のプレートに継代した。即ち、ピペットマン（ギルソン）を用いてG418耐性コロニーを150μLのトリプシン／EDTA溶液を含む96穴のマイクロプレートに移し換え、20分間37℃のインキュベーター内で処理した後、ピペットマンでピペッティングすることによって単一細胞にした。この細胞懸濁液を24穴のプレートに移し換え培養を継続した。2日後、24穴のプレート上の細胞を凍結保存用とDNA抽出用の2つに分割した。即ち、細胞にトリプシン／EDTAを500μL加えて20分間37℃のインキュベーター内で処理し、ES培地を500μL加えてピペットマンで静かにピペッティングすることによって単一細胞にした。その後、1mLのES培地の入った24穴プレートに細胞懸濁液の半分を移し、元の24穴プレートにもES培地を1mL加えた。さらに2日後、片方の24穴プレートの培地を抜いてから、ES培地に終濃度が10％の牛胎児血清と終濃度が10％のジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma社 D-5879)を添加した凍結用培地を1mL入れて、シールした後-70℃で凍結保存した。
  遺伝子導入ES細胞の検定は、PCRによって以下の通りに行った。即ち、コンフルエントの状態まで細胞が増殖した24穴プレートの各ウェルから培地を取り除き、PBSで洗浄した後溶解バッファー(1% SDS、20mM EDTA、20mM Tris pH7.5)を250μLとプロテイナーゼ K（20mg／mL）5μLを加えてよく振り、52℃で加温して溶解した。溶解したサンプルからフェノール／クロロホルム抽出によりDNAを抽出し、PCR用の鋳型DNAとして用いた。
　uPA遺伝子導入ES細胞は、以下の手順で選択した。
  使用したPCRプライマーはラビットβグロビン中に設定した。配列は、センスプライマー：GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG（配列番号1）、アンチセンスプライマー：GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA（配列番号2）である。反応はAmpiTaqGold(ABI社)の添付方法に従って行った。95℃で9分間かけて酵素を活性化した後に94℃にて30秒間（変性）、63℃にて30秒間（アニーリング）、72℃にて1分間（伸長）の反応を40回繰り返した。終了後反応液を2%アガロースゲルで泳動してPCRプロダクトの確認を行った。
  PCR解析で遺伝子導入が確認されたクローンは、凍結保存してあった96穴プレートを37℃に温めることにより融解し、24穴プレートに継代した。この24穴プレートを24時間、37℃で培養後、DMSOと流動パラフィンを除くために培地を交換した。それぞれのクローンが75～90％コンフルエントに達した時点で24穴から6穴プレートに継代した。さらに、６穴プレートに75～90％コンフルエントまで増殖したものが2穴分得られたところで、１穴分は凍結保存し、残りの１穴分は胚盤胞への注入及びDNA抽出に使用した。
  凍結保存は以下の如く行った。即ち、細胞をPBSで2回リンスした後、0.5mLのTrypsinを加え、37℃で15～20分間保温しトリプシン処理を行った後、さらに0.5mLのES細胞培地を加え、35～40回ピペッティングを行いES細胞の塊を完全に解離させた。この細胞懸濁液を15mL遠心チューブに移し、さらに1mLのES細胞培地でウェルを洗ってチューブに回収した。チューブを1,000rpmで7分間遠心し、培地を取り除き0.25mL ES細胞培地に再懸濁し、0.25mLの2 ｘ凍結培地を加えた。クライオジェニックバイアルにウェルの中身を移し、－80℃で凍らせ、液体窒素中で保存した。
  胚盤胞への注入及びDNA抽出用の細胞は、ES細胞の塊を完全に解離させた後、その四分の一を胚盤胞への注入に用い、残りの細胞の三分の一、及び三分の二をそれぞれゼラチンコートした60mmディッシュに継代した。前者は細胞がコンフルエントにまで増殖したところでPCR解析用のゲノムDNAを抽出し、後者の細胞はコンフルエントにまで増殖したところで３本に分けて凍結した。
　uPA遺伝子を持つES細胞を用いて、以下のようにしてキメラマウスを作製した。
  遺伝子導入が確認されたES細胞クローンについて、C57BL/6J系マウスの胚盤胞をホスト胚としてキメラ胚を作製し、それを偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。ホスト胚の採取は、妊娠3日目に、100μＭトリプシン/EDTAを添加したWhitten’s培地で、卵管と子宮を灌流することによって行った。8細胞期胚または桑実胚を24時間Whitten’s培地で培養し、得られた胚盤胞を注入に用いた。注入に用いたES細胞は、継代してから2あるいは3日目にTE処理により分散させ、顕微操作に供するまで4℃で静置した。ES細胞の注入用ピペットとしては、Sutter社製のglass capillary tubing（内径約20μｍ）を用いた。胚保定用ピペットとしては、外径1mmの微小ガラス管（NARISHIGE）を微小電極作製器（Sutter社P-97/IVF）を用いて細く引き延ばした後、マイクロフォージ（De Fonburun）を用いて外径50～100μｍの部分で切断し、さらに口径を10～20μｍに加工したものを用いた。注入用ピペットと保定用ピペットは、ピエゾシステム（プライムテックPAMS-CT150）を接続したマイクロマニピュレーター（Lica）に接続した。顕微操作に用いたチャンバーとしては、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜蝋で接着したものを用い、その上に約10μLの0.3%BSAを加えたHepes-buffered Whitten’s培地のドロップを2個置き、上面をミネラルオイル（シグマ）で覆った。一方のドロップには、約100個のES細胞を入れ、他方には拡張胚盤胞を20個程度入れ、胚1個あたり約１５個のES 細胞を注入した。顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、偽妊娠2日目のICR系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。C57BL/6J系マウスの胚盤胞に、45クローンのES細胞を注入した結果、39クローンにおいて雄キメラマウスが得られた。
　このようにして得たuPA-Tgマウス（hemizygote, +/-）をSCID-bgマウスに2回バッククロスさせ、uPA-Tg(+/-)SCID(+/+)の遺伝子型を持つマウスを得た。そのマウスの雄より精子を採取し、SCIDマウス（homozygote, +/+）の未受精卵と体外受精後、仮腹に戻した。生まれた子マウスの内、Tg遺伝子の入ったマウスを選択肢、自然交配にて、両方の形質を持つマウスuPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)を得た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、導入遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により行った。
フォワードプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’（配列番号3）
リバースプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3’（配列番号4）
　また、SCID (+/+)、SCID (+/-)とSCID(-/-)の識別は、PCR-RFLP法により行った。
　次に、得られたuPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)同士を交配させ、uPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)とuPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)を得た。uPA-Tg(+/+)とuPA-Tg(+/-)の識別はサザンブロット法により実施した。生後8～10日目のマウスの尾を約5 mm切断し、3 SDS, proteinase K溶液により可溶化し、フェノールおよびクロロホルム抽出により混在するタンパク質成分を除去した。 DNase-free RNase Aを用いて混在するRNAを分解した後、イソプロパノール沈澱により高分子ゲノムDNAを析出させた。上記のゲノムDNAを70%エタノールで洗浄して風乾させた後、TEに再溶解させた。検体から抽出したゲノムDNA、陽性および陰性コントロールのゲノムDNA、それぞれ５μgをEcoR1で完全消化させ、生成するDNA断片をアガロース電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。制限酵素EcoR1を用いて、uPA cDNAプローブ/TAからサザンハイブリダイゼーションのプローブに適したDNAフラグメントを精製した(379 bp)。ランダムプライム法により、上記のDNAフラグメントを[32P]ラベルした。ナイロンメンブレンにトランスファーされたDNAフラグメントを、RIラベルしたuPA cDNAプローブとハイブリダイズさせた。洗浄により非特異的に結合したプローブを取り除き、mAlb-uPA-Int2 Tgマウスの候補の個体に導入されている外来遺伝子に由来する放射活性シグナルを、X線フィルムに感光して検出した。野生型遺伝子座由来の1.5 kbの特異的なシグナル、および変異型遺伝子座由来の0.4 kb(wt:1.5kb)の特異的なシグナルを検出して、mAlb-uPA-Int2 Tgマウス個体のジェノタイプを判定した。
　uPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスとSCID/c.b-17マウス（日本チャールスリバー）を掛け合わせ、uPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)マウスを得た。このマウスをホストマウスとして用いた。
ヒト肝細胞移植
　ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した肝細胞（Lot No.BD195、女児、2才）を使用した。この凍結肝細胞はChise Tateno, Yasumi Yoshizane, Naomi Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004に記載の方法に従って融解して用いた。
　生後3～5週齢のuPA-Tg(+/-) /SCID(+/+)マウスをイソフルランで麻酔し、左側腹部を約5 mm切開し、脾頭より10.0x105個のヒト肝細胞を注入した後、脾臓を腹腔に戻し縫合した。
　移植後、CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125％添加水道水の自由摂取により約100日間飼育した。
　掛け合わせに用いたSCID/c.b-17マウスは、T細胞、B細胞は持たないが、NK細胞を持つことが知られている。そこで、移植したヒト肝細胞がマウスのNK細胞に攻撃されないように、NK活性を阻害する抗体を移植前日に腹腔内に投与した。
（２）血液サンプルの採取
　上記のようにして得たヒト肝細胞キメラマウス11匹について、移植後13-14週令（16～17週齢）で剖検し、ヘパリンコート注射針、注射筒を用いて心臓から採血した。一部の血液を1000ｇｘ10分で遠心分離し血漿を得た。
（３）アルブミンペプチド比率を用いたヒト肝細胞置換率の測定
トリプシン消化
　トリプシン消化を促進するための前処理酵素液として、0.5μg/μL濃度のエンドプロテイナーゼLys C（シグマアルドリッチ）を20μL、1% Protease MAX（プロメガ社）を50 μL、及び0.1M Tris-HCl(pH8.5)を930 μL混合したものを用意した。また、トリプシン処理溶液として、0.5 μg/μL Trypsin（シグマアルドリッチ）を20 μLと、0.1M Tris-HCl(pH8.5)を180 μLとを混合したものを用意した。
　ヒト血清アルブミンとマウス血清アルブミンを所定濃度に調製した標準溶液を精製水で希釈して回帰式試料とした。10μLの血漿又は調製した回帰式試料と精製水490μLの混合液から50μL採り、消化試料とした。
　消化試料50μＬに上記の前処理酵素液50μLを添加し、攪拌した後、37℃で6時間インキュベートした。次いで、トリプシン処理溶液を10 μL混合し、37℃で24時間インキュベートした。インキュベート後、軽くタッピングして混和した。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
　消化処理後の試料10 μL、内部標準として10 μg/mL安定同位体標識型ペプチド（LVNEVTEFA(K)及びLVQEVTDFA(K)）（Proteomedix Frontiers）水溶液20μL、及び精製水70 μLを混合したものを分析試料とし、LC/MS/MSシステム（SCIEX API4000）へ10μL注入した。
（LC条件）
分析カラム:XBridge Shield RP18（3.5 μm, 2.1 mm × 50 mm, Waters）
移動相A:0.1%ギ酸
移動相B:0.1%ギ酸含有アセトニトリル
流速:0.6 mL/min　（A:B = 90:10）
カラム温度:40°C
オートサンプラー温度:15°C
注入量:5 μL
（MS/MS 条件）
イオン化モード：エレクトロスプレー法
スキャンモード：マルチプルリアクションモニタリング
イオン極性：ポジティブ
カーテンガス：50 psi（窒素）
ガス1 (GS1)：50 psi（空気）
ガス2 (GS2)：50 psi（空気）
イオン電圧：5000
ターボガス温度：500°C
Ihe：オン
コリジョンガス：レベル 5（窒素）
モニターイオン，[コリジョン電圧]:
　　　アルブミン(ペプチド)　m/z = 575.3 → 185.2 [35 eV]
　　　内部標準(ペプチド)　m/z = 579.4 → 213.2 [27 eV]
　各試料について、ヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）の面積とマウスアルブミン由来ペプチド（LVQEVTDFAK）の面積を測定し、両ピーク面積の合計に対するヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）の面積の比率を算出した。
免疫染色とペプチド比率の相関の評価
　同じヒト肝細胞キメラマウス11匹の肝臓の7葉の凍結切片を作製し、ヒト肝細胞特異的なサイトケラチン8/18抗体（ICN Pharmaceuticals, Inc.）を用いて免疫染色を行い、面積当たりのhCK8/18陽性面積を求め、その平均値をヒト肝細胞置換率とした。
　ヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）のピーク面積とマウスアルブミン由来ペプチド（LVQEVTEFAK）のピーク面積の合計に対するヒトアルブミン由来ペプチド（LVNEVTEFAK）のピーク面積の比率に対して、免疫染色により求めたヒト肝細胞置換率をプロットしたグラフを図1に示す。グラフは直線となり、その回帰式は y = 0.8498x+14.018となった。このように、免疫染色とペプチド比率の相関において、このペプチド比率と、免疫染色により求めた正確なヒト肝細胞置換率が比例することから、被験キメラ動物のペプチド比率をその回帰式に当てはめると正確にヒト肝細胞置換率を求めることができることが分かる。
　免疫染色により求めたヒト肝細胞置換率（％）とLC/MS/MSのキメラマウス血漿中のペプチド比率（％）を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、LC/MS/MSの測定値（ヒトアルブミン濃度とマウスアルブミン濃度）と算出値（キメラマウス血漿中のペプチド比率）を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　質量分析計の第３四重極の分析で得られたクロマトグラムの1例を図2に示す。
（４）ヒトアルブミン濃度を用いたヒト肝細胞置換率の測定
　ヒト肝細胞キメラマウス11匹について、移植後13-14週令（16～17週齢）で剖検し、ヘパリンコート注射針、注射筒を用いて心臓から採血した。一部の血液を1000ｇｘ10分で遠心分離し血漿を得た。「（３）アルブミンペプチド比率を用いたヒト肝細胞置換率の測定」の項目に記載の条件で、LC/MS/MSにより、ヒト肝細胞キメラマウス血漿中のヒトアルブミン濃度を測定した。
　ヒト肝細胞キメラマウス11匹について、LC/MS/MSにより求めたヒトアルブミン濃度に対して、免疫染色により求めたヒト肝細胞置換率をプロットしたグラフを図３に示す。
　ヒト肝細胞マウス血中ヒトアルブミン濃度とヒト肝細胞置換率は、従来公知のヒト肝細胞キメラマウス（C.Tateno, Y.Kawase, Y.Tobita, S.Hamamura, H.Ohshita, H.Yokomichi, H.Sanada, M.Kakuni, A.Shiota, Y.Kojima, Y.Ishida, H.Shitara, N.A.Wada, H.Tateishi, M.Sudoh, S.Nagatsuka, K.Jishage, M.Kohara, Generation of Novel Chimeric Mice with Humanized Livers by Using Hemizygous cDNA-uPA/SCID Mice, PLoS One,10,e0142145,2015）におけるそれらと同様、相関が認められた。
　本発明の第1の方法によれば、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物をと殺することなく、簡単かつ正確にヒト肝細胞置換率を測定することができる。また、機器を用いるため、測定施設間の結果のバラツキが無く、安定して、再現性良く、ヒト肝細胞置換率を測定することができる。
　また、本発明の第2の方法によれば、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物におけるヒトアルブミン濃度とレシピエント動物アルブミン濃度を一括して測定できるため、薬物の肝毒性がヒト及びレシピエント動物の何れの肝細胞に生じているかを簡単に判定できる。

Claims (13)

  1. 　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析に供して、第２の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積とLVQEVTDFAK又はLVQEVTDFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積の合計に対するLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積の比率を求める工程と、このピーク面積比率を回帰式に当てはめてヒト肝細胞置換率を求める工程とを含む、ヒト肝細胞置換率の測定方法。
  2. 　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、請求項１に記載の方法。
  3. 　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　回帰式を、上記ピーク面積比率と、同種のレシピエント動物を用いたヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の肝臓切片の観察により求めたヒト肝細胞置換率との間で作成する、請求項１～３の何れかに記載の方法。
  5. 　ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析を組み合わせた分析に供して、第２の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積とLVQEVTDFAK又はLVQEVTDFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積を測定する工程とを含む、ヒト肝細胞キメラげっ歯類動物におけるヒトアルブミン濃度とげっ歯類アルブミン濃度の一括測定方法。
  6. 　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、請求項５に記載の方法。
  7. 　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　げっ歯類動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析を組み合わせた分析に供し、第２の質量分析計で選択されるLVQEVTDFAK又はLVQEVTDFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積を測定する工程を含む、げっ歯類動物アルブミンペプチド濃度の測定方法
  9. 　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、請求項８に記載の方法。
  10. 　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　ヒト又はヒト肝細胞キメラ動物の体液をタンパク質分解酵素により処理する工程と、このタンパク質分解酵素による処理物を液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析を組み合わせた分析に供し、第２の質量分析計で選択されるLVNEVTEFAK又はLVNEVTEFAKにおいて1又は2個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたペプチドのピークのピーク面積を測定する工程を含む、ヒトアルブミンペプチド濃度の測定方法。
  12. 　液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析を組み合わせた分析を三連四重極型質量分析計を用いて行う、請求項１１に記載の方法。
  13. 　タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
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