JP2011507543A - 改善されたフィブロネクチンベースの結合分子およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2007年12月27日に出願した米国仮出願第61/009,361号の優先権の利益を主張する。本明細書を通じて言及されているあらゆる特許、特許出願および文献は、それらの全体について、参照により本明細書の一部とする。
所望の標的エピトープと特異的に結合することができる分子は、治療および医学的診断ツールとして極めて重要である。このクラスの分子の例は、モノクローナル抗体である。ほぼあらゆる構造エピトープと特異的に、そして高い親和性で結合する抗体が、選択され得る。その結果、抗体は研究ツールおよびFDA承認治療薬として日常的に使用されており、治療用および診断用モノクローナル抗体の世界市場は現在約30,000,000,000ドルにも上る。
本発明は、フィブロネクチンベースの結合分子、ならびにフィブロネクチンベースの結合足場、特にFn3にドナーCDRを導入する方法を提供することによって、上記課題を解決する。本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、半減期および安定性の改善のために、操作されるか、あるいはさらに別の部分、例えばPEG、Fc、HSA、抗HSAと結合していてもよい。本発明はまた、かかる分子を標的抗原との結合についてスクリーニングして候補バインダーを製造および精製する方法を提供する。さらに、本発明は、Fn3ベースの結合分子をインビボで、特に哺乳類細胞、例えばラット、マウス、ハムスター、ヒト細胞またはそれらに由来する細胞系において成功裏に発現することを初めて示している。さらにまた、本発明は、操作されたかあるいは別の部分、例えばPEG、Fc、HSA、抗HSAと結合したFn3ベースの結合分子が哺乳類細胞においても成功裏に発現されること、そして該分子の延長された半減期という望ましい生理的効果を示すことを示している。
− フィブロネクチンベースの結合分子、例えばサイズが小さく、免疫原性がないために治療薬として好適な修飾フィブロネクチンベースの結合分子を提供すること;
− 延長された半減期を有するフィブロネクチンベースの結合分子を提供すること;
− ブロッキング部分、検出可能部分、診断部分または治療部分のような望まれる機能的部分と結合するための部位をも提供しつつ、フィブロネクチンベースの結合分子を提供すること;そして
− 診断用または治療用フィブロネクチンベースの結合分子を必要とする対象を処置する方法。
本明細書および特許請求の範囲の理解を明確にするため、次の定義が簡便には提供される。
本明細書において使用するとき、用語「フィブロネクチンタイプIIIドメイン」または「Fn3ドメイン」は、いずれかの生物由来の野生型Fn3ドメインならびに2個以上の異なるFn3ドメイン由来のベータ鎖から構築したキメラFn3ドメインを意味する。当該技術分野において知られているとおり、天然に生じるFn3ドメインはAB、BC、CD、DE、EFおよびFGループと称される6個のループで結合した、A、B、C、D、E、FおよびGと称される7個のベータ鎖から成るベータサンドイッチ構造を有する(例えば、Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:8990, 1992; Bork et al, Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990; Main et al, 1992; Leahy et al., 1992; Dickinson et al., 1994; 米国特許第6,673,901号; PCT公報WO/03104418;および米国特許出願第2007/0082365号参照、これらの全教示を参照により本明細書の一部とする)。3個のループはドメインの上部に存在し(BC、DEおよびFGループ)、3個のループはドメインの下部に存在する(AB、CDおよびEFループ)(図1参照)。本発明の特定の態様において、該Fn3ドメインはヒトフィブロネクチンの第10Fn3ドメイン(10Fn3)に由来する(配列番号1)。
本発明は、フィブロネクチンベースの結合分子、ならびにフィブロネクチンベースの結合足場、特にFn3にドナーCDRを導入する方法を提供する。さらに以下に記載のとおり、本発明はまた、フィブロネクチンベースの結合分子または足場に、ある部分に結合するために適しているアミノ酸残基を導入する方法も提供する。この利点によって、本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、他のかかる分子とさらなる複合体を形成して、二重および多重特異的結合分子を構築することができ、そして/または半減期および安定性を改善するために、PEGのようなある部分と結合することができる。
一つの局面において、本発明は、結合分子を作成するための改善された足場を提供する。本発明の使用に好適な足場は、アンキリン反復足場またはイムノグロブリンスーパーファミリーの1つ以上のメンバー、例えば抗体またはフィブロネクチンドメインを含むが、これらに限定されない。
一つの局面において、本発明は、他のIgスーパーファミリー分子由来の超可変領域を本発明のフィブロネクチンベースの結合足場に移植する改善された方法を特徴とする。
上記技術によって、超可変領域またはCDRの選択および提示のために好適な足場ループを同定することができる。しかし、Fn3ドメインおよびドナー抗体の構造モデリングに基づいた超可変領域のフィットおよび提示をさらに改善するため、さらなる基準が敷かれ得る。
別の局面において、本発明は、元のフィブロネクチンベースの分子と比較して異なる特性を有するように修飾されたフィブロネクチンベースの結合分子を特徴とする。修飾は、別の分子との該分子の結合または融合、ならびに該分子の化学的修飾または該分子構造のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの変化を含む。
本発明のフィブロネクチンベースの結合分子は、別の分子と融合または結合されていてもよい。かかる複合体は、「Fn融合体」と本明細書において称する。例えば、Fn融合体は、結合分子の安定性または半減期を上昇させる分子(例えばFc領域、HSAまたは抗HSA結合分子)と融合したフィブロネクチンベースの結合分子を含む。
別の局面において、本発明は、例えば分子の生物学的(例えば血清)半減期を延長するため、ペグ化によって修飾されたフィブロネクチンベースの結合分子を提供する。分子をペグ化するため、該分子またはそのフラグメントは典型的には、1個以上のPEG基が該分子に結合する条件下で、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコール(PEG)部分と反応させる。用語「ペグ化部分」、「ポリエチレングリコール部分」または「PEG部分」は、ポリアルキレングリコール化合物、あるいはカップリング剤またはカップリングもしくは活性化部分での誘導体化(例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジンまたは好ましくはマレイミド部分と、例えばPEG−マレイミド)ありまたはなしでのその誘導体を含む。他の適切なポリアルキレングリコール化合物は、マレイミドモノメトキシPEG、活性化PEGポリプロピレングリコール、あるいは次のタイプの荷電もしくは中性ポリマーを含むが、これらに限定されない:デキストラン、コロミン酸または他の糖ベースのポリマー、アミノ酸のポリマーおよびビオチン誘導体。
1個以上のアミノ酸またはヌクレオチド修飾(例えば変化)を有する本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子は、多様な既知の方法によって作成することができる。かかる修飾された分子は、例えば、組換え法によって作成することができる。さらに、遺伝子コードの縮重のため、多様な核酸配列を用いて各々所望の分子をコードすることができる。
多様なスクリーニングアッセイを使用して、改善された本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子を同定することができる。一つの態様において、フィブロネクチンベースの結合分子は所望の抗原に対する改善された結合親和性についてスクリーニングされる。所望の抗原に対する改善された結合について選択するあらゆるインビトロまたはインビボスクリーニング法が意図される。
本発明の組換えフィブロネクチンベースの結合分子は典型的には、組み換え発現によって作成する。該分子をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。該分子をコードするDNAセグメントは、それらの発現を確実に行うため発現ベクターの調節配列と作動可能に連結している。発現調節配列は、プロモーター(例えば天然関連または異種プロモーター)、シグナル配列、エンハンサー要素および転写終止配列を含むが、これらに限定されない。好ましくは、発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター内の真核プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に取り込まれると、該宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、交叉反応するフィブロネクチンベースの結合分子を回収および精製する。
本発明のフィブロネクチンベースの結合分子(およびその変異体、融合体および複合体)は、インビトロおよびインビボで診断および治療上有用性を有する。したがって、本発明はまた、薬学的に許容される担体と共に製剤された、フィブロネクチンベースの結合分子(またはその変異体、融合体および複合体)の1種以上の組合せを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はまた、組合せ療法で、すなわち他の薬物と組み合わせて投与してもよい。例えば、組合せ療法は、本発明の組成物と少なくとも1種以上のさらなる治療薬物、例えば抗炎症剤、抗癌剤および化学療法剤を含んでいてもよい。
本明細書に記載のフィブロネクチンベースの結合分子は、いずれかの目的の抗原に結合するように構築することができ、そして増加した安定性および半減期、ならびにさらなる機能的部分を有するように修飾することができる。したがって、これらの分子は、研究、治療および診断分野を含む、抗体が使用されているあらゆる領域において抗体の代わりに使用することができる。さらに、これらの分子は抗体よりも優れた溶解性および安定性を有するため、本明細書に記載の抗体模倣物はまた、抗体分子を破壊もしくは不活性化する条件下で使用することもできる。
本明細書に記載のフィブロネクチンベースの結合分子は、いずれかの目的の抗原または標的と結合するように構成することができる。かかる標的は、クラスタードメイン、細胞受容体、細胞受容体リガンド、成長因子、インターロイキン、タンパク質アレルゲン、細菌またはウイルスを含むが、これらに限定されない(例えば図7A〜C参照)。本明細書に記載のフィブロネクチンベースの結合分子はまた、増加した安定性および半減期、ならびにさらなる機能的部分を有するように修飾することができる。したがって、これらの分子は、研究、治療および診断分野を含む抗体が使用されるあらゆる分野において、抗体の代わりに使用することができる。さらに、これらの分子は抗体よりも優れた溶解性および安定性を有するため、本明細書に記載の抗体模倣物はまた、抗体分子を破壊しまたは不活性化する条件下で使用することができる。
実施例を通じて、特に定めのない限り、次の物質および方法を用いた。
一般に、特に定めのない限り、本発明の実施は、化学、分子生物学、組換えDNA技術、免疫学(例えば特に抗体技術)およびポリペプチド調製における標準的な技術を使用する。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999);および Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley&Sons (1992)を参照されたい。本発明の実施に使用するのに好適な他の方法、技術および配列は、米国特許7,153,661; 7,119,171; 7,078,490; 6,703,199; 6,673,901; および 6,462,189に見出すことができる。
次の配列を使用した。
野生型Fn3配列
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)
野生型Fn3配列(RGD→RGA)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(配列番号2)
TNF結合Fn3配列
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(配列番号3)
TNF結合Fn3(R18L&I56T)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(配列番号4)
VEGFR結合Fn3
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(配列番号76)
MKKIWLALAGLVLAFSASA(配列番号5)
CD33シグナル配列+TNF結合Fn3配列
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(配列番号6)
CD33シグナル配列+TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(配列番号7)
CD33シグナル配列+野生型Fn3
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号8)
CD33シグナル配列+野生型Fn3(RGD→RGA)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(配列番号9)
CD33シグナル配列+VEGFR結合Fn3
MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(配列番号77)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS(配列番号10)
TNF結合シングルドメイン抗体
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(配列番号11)
抗HSAバインダー
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYNMSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSS(配列番号12)
抗MSAバインダー
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKR(配列番号13)
抗RSAバインダー
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYRVPPTFGQGTKVEIKR(配列番号78)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(配列番号14)
EAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMSQRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALA(配列番号79)
hIgG1 Fc
KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号15)
(1)5’gggcggaccgatgctcataaatctgaagtcgc3’(F)(配列番号16)
(2)5’gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgcaaaccaagtgcggcctgactggccgc3’(R)(配列番号17)
(3)5’cagactagatctgtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(配列番号18)
(4)5’cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagttaatgctgatcgg3’(R)(配列番号19)
(5)5’cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagttaatgctaatcggtttg3’(R)(配列番号20)
(6)5’cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(配列番号21)
(8)5’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(配列番号23)
(9)5’cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(配列番号24)
(10)5’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc3’(R)(配列番号25)
(11)5’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(配列番号26)
(12)5’cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(配列番号27)
(13)5’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc3’(R)(配列番号28)
(14)5’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(配列番号29)
(15)5’cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(配列番号30)
(17)5’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(配列番号32)
(18)5’gggcggaccggcaaatcttgtgacaaaactcacacatgc3’(F)(配列番号33)
(19)5’gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgtttacccggagacagggagaggc3’(R)(配列番号34)
(20)5’cgtgcgagccagagcattagctcttacctgaactggtatcagcagaaaccg3’(F)(配列番号80)
(21)5’cggtttctgctgataccagttcaggtaagagctaatgctctggctcgcacg3’(R)(配列番号81)
(22)5’cgaaactgctgatttatcgcaacagcccgctgcagagcggtgtgcc3’(F)(配列番号82)
(23)5’ggcacaccgctctgcagcgggctgttgcgataaatcagcagtttcg3’(R)(配列番号83)
(24)5’cctattattgccagcagacttaccgtgttccgccgacctttggccagggcacc3’(F)(配列番号84)
(25)5’ggtgccctggccaaaggtcggcggaacacggtaagtctgctggcaataatagg3’(R)(配列番号85)
(26)5’gggcggaccgaagcacacaagagtgagatcgc3’(F)(配列番号86)
(27)5’gggtttaaacgggccctctagatcatcaatgatgatgatgatggtgggctaaggcttctttgcttctagc3’(R)(配列番号87)
(28)5’atggattccaaaacgccgttctggttcgatacacc3’(F)(配列番号88)
(29)5’ggtgtatcgaaccagaacggcgttttggaatccat3’(R)(配列番号89)
(30)5’accaaattggcaacagacgtcaccaaaatcaacaagg3’(F)(配列番号90)
(31)5’ccttgttgattttggtgacgtctgttgccaatttggt3’(R)(配列番号91)
CDRグラフティング
コンピューターモデリングを用いて、TNF結合ナノ抗体(配列番号10)由来のCDRループ1(SGFTFSDYWM−配列番号35)およびループ3(RSPSGFNR−配列番号36)を、ヒトフィブロネクチンタイプIIIモジュールの野生型第10ドメインのフレームワーク(10Fn3または野生型Fn3)に移植した。TNF結合ナノ抗体および野生型Fn3分子のアミノ酸配列は次のとおりである:
TNF結合ナノ抗体(配列番号10)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS
野生型Fn3(配列番号1)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
TNF結合シングルドメイン抗体(配列番号40)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Leu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro PheThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
フォーマット:
1)TNF結合ナノ抗体由来のCDR1およびCDR3ループを有する野生型Fn3−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(配列番号41)
2)最初の8アミノ酸を除いた、TNF結合ナノ抗体由来のCDR1およびCDR3ループを有する野生型Fn3−Hisタグ(pET9a)
EVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(配列番号42)
3)TNF結合シングルドメイン抗体由来のCDR1およびCDR3ループを有する野生型Fn3−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDASQAIDSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYQVVWRPFTPISINYRTHHHHHH(配列番号43)
4)最初の8アミノ酸を除いた、TNF結合シングルドメイン抗体由来のCDR1およびCDR3ループを有する野生型Fn3−Hisタグ(pET9a)
EVVAATPTSLLISWDASQAIDSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYQVVWRPFTPISINYRTHHHHHH(配列番号44)
フィブロネクチン分子内のアミノ酸修飾位置の同定
野生型Fn3配列のレビューに基づいて、アミノ酸修飾、例えばPEG化を促進するためのシステインまたは天然には生じないアミノ酸残基による置換の可能性のある位置として、部位を同定した。例えば、セリン残基(合計11個、次の配列において下線を付した;セリン残基のスティック提示を有する野生型Fn3分子を示す図1も参照されたい)を次のとおり分析した。
野生型Fn3
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)
Ser53−Ser55 − これらの残基はDEループに属する(次に下線を付した)。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)
Ser81−Ser84−Ser85 − これらの残基はFGループに属する(次に下線を付した)。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)
Ser17およびSer21は、それぞれB鎖の最初および末端に位置する。Ser60はE鎖の末端に位置する。
Ser21およびSer60は、フィブロネクチンの3鎖シートを形成する2本の隣接鎖に位置する。
Ser89はG鎖の中央に位置し、これはまた、4鎖シートを形成する最後の鎖でもある。したがって、Ser89は溶媒にも曝されており、外部の分子と接触可能である。
Ser43は分子の底部に位置し、溶媒に向かって折り曲げられているループの末端でCDループに属する(図2参照)。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)
鎖Aの開始点近くに位置するVal11は、フィブロネクチン分子配列において保存されていないと思われる。
鎖Bの中央に位置するLeu19も保存された位置ではない。
Thr58は鎖Eの末端に位置する。
該分子に結合するPEG分子のサイズに依存して、該分子のこの側面はPEG化を受けることができない
Fn3配列のPEG化
Fnの半減期を延長するため、TNF結合Fn3(配列番号3)、TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)(配列番号4)、野生型Fn3(配列番号1)および野生型Fn3(RGD→RGA)(配列番号2)のPEG化を、(1)システインおよび(2)非天然アミノ酸を用いて、次のとおりに実施した。
TNF結合Fn3
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(配列番号3)
TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(配列番号4)
野生型Fn3
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)
野生型Fn3配列(RGD→RGA)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(配列番号2)
上記TNF結合Fn3および野生型Fn3配列に対応するDNA配列を大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。C末端システイン残基の挿入のために、プライマー6(配列番号21)および7(配列番号22)を用いてTNF結合配列を増幅し、プライマー6(配列番号21)および8(配列番号23)を用いて野生型配列を増幅した(物質および方法の項の上記プライマー参照)。PCR生成物をNdeI/BamHIで消化して、pET9aの対応する部位にクローン化した。さらに、プライマー9(配列番号24)および10(配列番号25)を用いてTNF結合配列を増幅し、プライマー9(配列番号24)および11(配列番号26)を用いて野生型配列を増幅した。PCR生成物をBamHI/HindIIIで消化し、dsbAシグナル配列を有するpQE−80Lの対応する部位にクローン化した。
1)TNF結合Fn3配列−3xAリンカー−C−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号48)
2)TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)配列−3xAリンカー−C−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号49)
3)野生型Fn3配列−3xAリンカー−C−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号50)
4)野生型Fn3(RGD→RGA)配列−3xAリンカー−C−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号51)
4)dsbAシグナル配列−TNF結合Fn3配列−3xAリンカー−C−3xAリンカー−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号52)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号53)
6)dsbAシグナル配列−野生型Fn3配列−3xAリンカー−C−3xAリンカー−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号54)
7)dsbAシグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)配列−3xAリンカー−C−3xAリンカー−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(配列番号55)
8)野生型Fn3配列−(RGD→RGA)Hisタグ(pET9a)
MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTHHHHHH(配列番号37)
TNF結合Fn3(配列番号3および配列番号4)および野生型Fn3配列(配列番号1および配列番号2)に対応する上記DNA配列を大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。C末端アンバーコドンの挿入のために、プライマー12(配列番号27)および13(配列番号28)を用いて、TNF結合配列(配列番号3および配列番号4)を増幅し、プライマー12(配列番号27)および14(配列番号29)を用いて野生型配列(配列番号1および配列番号2)を増幅した。PCR生成物をNdeI/BamHIで消化し、pET9aの対応する部位にクローン化した。さらに、プライマー15(配列番号30)および16(配列番号31)を用いてTNF結合配列(配列番号3および配列番号4)も増幅し、プライマー15(配列番号30)および17(配列番号32)を用いて野生型配列(配列番号1および配列番号2)を増幅した。PCR生成物をBamHI/HindIIIで消化し、dsbAシグナル配列を有するpQE−80Lの対応する部位にクローン化した。
1)TNF結合Fn3配列−3xAリンカー−アンバーコドン−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号56)
2)TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)配列−3xAリンカー−アンバーコドン−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号57)
3)野生型Fn3配列−3xAリンカー−アンバーコドン−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号58)
4)野生型Fn3(RGD→RGA)配列−3xAリンカー−アンバーコドン−3xAリンカー−Hisタグ(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号59)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号60)
6)dsbAシグナル配列−TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)配列−3xAリンカー−アンバーコドン−3xAリンカー−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号61)
7)dsbAシグナル配列−野生型Fn3配列−3xAリンカー−アンバーコドン−3xAリンカー−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号62)
8)dsbAシグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)配列−3xAリンカー−アンバーコドン−3xAリンカー−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAA*AAAHHHHHH(配列番号63)
*は非天然アミノ酸の位置を示す
Fn3配列のヒト血清アルブミン(HSA)融合体
上記の、TNF結合Fn3配列(配列番号3)、TNF−結合Fn3(R18LおよびI56T)(配列番号4)、野生型Fn3配列(配列番号1)、野生型Fn3(RGD→RGA)(配列番号2)またはVEGFR結合FN3(配列番号76)を抗HSA(配列番号12)、抗MSA(配列番号13)、抗RSA結合分子(配列番号78)、RSA(配列番号79)またはHSA(配列番号14)と組合せて、フィブロネクチン−血清アルブミン融合分子を作成した。
抗HSAバインダー(配列番号12)または抗MSAバインダー(配列番号13)のDNA配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。BamHI/HindIIIを用いて、dsbAシグナル配列を有するpQE−80Lに得られたDNAフラグメントをライゲートした(適切な隣接DNA配列を加えた)。TNF結合Fn3配列(配列番号3および配列番号4)および野生型Fn3配列(配列番号1および配列番号2)に対応するDNA配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。TNF結合Fn3配列(配列番号3および配列番号4)について、プライマー3(配列番号18)および4(配列番号19)を用いて、野生型Fn3配列(配列番号1および配列番号2)について、プライマー3(配列番号18)および5(配列番号20)を用いて得られたDNAフラグメントフラグメントを増幅して、BamHI/HindIIIで消化して、pQE−80L−dsbA−抗HSAまたはpQE−80L−dsbA−抗MSAのBamHI部位にをライゲートした。野生型Fn3(RGD→RGA)−GSリンカー−抗RSA His(配列番号92)は、pQE−80L中の野生型Fn3(RGD→RGA)−GSリンカー−抗MSA His(配列番号71)から部位特異的突然変異誘発によって作成した。IKHLKからSSYLNへの第一の突然変異誘発は、プライマー20(配列番号80)および21(配列番号81)で実施し;GASRからRNSPへの第二の突然変異誘発は、プライマー22(配列番号82)および23(配列番号83)で実施し;そしてGARWPQからTYRVPPへの第三の突然変異誘発は、プライマー24(配列番号84)および25(配列番号85)を用いて実施した。
1)dsbAシグナル配列−TNF結合Fn3配列−GSリンカー−抗−HSA−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYNMSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(配列番号64)
2)dsbAシグナル配列−TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)配列−GSリンカー−抗HSA−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYNMSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(配列番号65)
3)dsbAシグナル配列−野生型Fn3配列−GSリンカー−抗HSA−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYNMSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(配列番号66)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYNMSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(配列番号67)
5)dsbAシグナル配列−TNF結合Fn3配列−GSリンカー−抗MSA−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(配列番号68)
6)dsbAシグナル配列−TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)配列−GSリンカー−抗MSA−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(配列番号69)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(配列番号70)
8)dsbAシグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)配列−GSリンカー−抗MSA−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(配列番号71)
9)dsbAシグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)配列−GSリンカー−抗RSA−Hisタグ(pQE−80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYRVPPTFGQGTKVEIKRHHHHHH(配列番号92)
CD33 SS−TNF結合Fn3配列(配列番号6)、CD33 SS−TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)(配列番号7)、CD33 SS−野生型Fn3配列(配列番号8)およびCD33 SS−野生型Fn3(RGD→RGA)(配列番号9)に対応するDNA配列を、大腸菌での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。BlpI/XbaIを用いて、得られたDNAフラグメントをpRS5aにライゲートした(適切な隣接DNA配列、例えばKozakをベクターに導入した)。プライマー1(配列番号16)および2(配列番号17)(プライマー2はHisタグをコードする)を用いてHSAをPCRで増幅して、RsrII/XbaIを用いてpRS5a(CD33−TNF結合Fn3配列(配列番号6および配列番号7)またはCD33−野生型Fn3配列(配列番号8および配列番号9))に挿入した。プライマー26(配列番号86)および27(配列番号87)を用いてベクターIRBPp993CO328D(RZPD)からRSAをPCRで増幅し、次いでRsrII/XbalでpRS5a−CD33シグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)−HSA−His(配列番号99)にクローン化した。プライマー28(配列番号88)および29(配列番号89)を用いて部位特異的突然変異誘発によってI431Vを組み込み、プライマー30(配列番号90)および31(配列番号91)を用いて部位特異的突然変異誘発によってL262Vを組み込んだ。VEGFR結合Fn3(配列番号77)のDNA配列を哺乳類細胞での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。RsRII/CelIIでDNAを消化して、pRS5a−CD33シグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)−HSA−His(配列番号99)の対応する部位にクローン化した。ベクターpRS5a−CD33シグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)−RSA−His(配列番号100)からRSAを単離して、RsrII/XbaIでpRS5a−CD33シグナル配列−VEGFR結合Fn3−HSA−His(配列番号101)にクローン化した。
1)CD33シグナル配列−TNF結合Fn3配列−HSA−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH(配列番号96)
2)CD33シグナル配列−TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)配列−HSA−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH(配列番号97)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSIATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH(配列番号98)
4)CD33シグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)配列−HSA−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSIATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH(配列番号99)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTEAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMSQRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALAHHHHHH(配列番号100)
6)CD33シグナル配列−VEGFR結合Fn3−HSA−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH(配列番号101)
7)CD33シグナル配列−VEGFR結合Fn3−RSA−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMSQRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALAHHHHHH(配列番号102)
RSA複合化Fn3分子の半減期の平均増加倍数は、Fn3−RSA複合体の平均(19.6)を非複合化Fn3の平均(0.52)で割って、インビボでのFn3−RSA複合体の半減期は約38倍の増加となる。これはHSAを用いてヒトに外挿して予期される。
この複合化Fn3分子の半減期の平均増加倍数は、VEGFR結合Fn3−RSA複合体の平均(41.6)を非複合化Fn3の平均(0.52)で割って、インビボでのFn3−RSA複合体の半減期は約80倍の増加となる。これはHSAを用いてヒトに外挿して予期される(データは示さず)。
抗HSA複合化Fn3分子の半減期の平均増加倍数は、Fn3−抗HSA複合体の平均(7.7)を非複合化Fn3の平均(0.52)で割って、インビボでのFn3−抗HSA複合体の半減期は約15倍の増加となる。
Fc/フィブロネクチン融合体
CD33 SS−TNF結合Fn3配列(配列番号6)、CD33 SS−TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)(配列番号7)、CD33 SS−野生型Fn3配列(配列番号9)およびCD33 SS−野生型Fn3(RGD→RGA)に対応するDNA配列を哺乳類細胞での発現に最適化して、Geneart AG, Germanyで調製した。BlpI/XbaIを用いて得られたDNAフラグメントをpRS5aにライゲートした(Kozakのような適切な隣接DNA配列をベクターに加えた)。プライマー18(配列番号33)および19(配列番号34)(プライマー19はHisタグをコードする)を用いて増幅し、RsrII/XbaIを用いてpRS5a(CD33−TNF結合Fn3配列(配列番号6および配列番号7)またはCD33−野生型Fn3配列(配列番号8および配列番号9))に挿入した。
1)CD33シグナル配列−TNF結合Fn3配列−Fc−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTGKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(配列番号72)
2)CD33シグナル配列−TNF結合Fn3(R18LおよびI56T)配列−Fc−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTGKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(配列番号73)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTGKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(配列番号74)
4)CD33シグナル配列−野生型Fn3(RGD→RGA)配列−Fc−Hisタグ(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTGKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(配列番号75)
Fcが融合したFn3分子の半減期の平均増加倍数は、Fn3−Fc融合体の平均(9.4)を非複合化Fn3の平均(0.52)で割って、インビボでのFn3−Fc融合体の半減期は約18倍の増加となる。
キメラフィブロネクチン分子
フィブロネクチンのタイプIIIモジュールおよびU.S. 6,673,901 B2に記載のβ鎖の配列分析を用いて、キメラFn3分子を作成するためのフィブロネクチン鎖を交換する方法を、ここに説明する。
(a)鎖の類似性;
(b)疎水性コア相互作用に関与すると定義された位置のみの類似性;および
(c)疎水性相互作用には関与しないが、溶媒に曝される部分の類似性。
表1
当業者は、常套未満の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多様な均等を認識し、あるいは確認することができる。かかる均等は、特許請求の範囲に含まれることを意図する。
Claims (62)
- 非Fn3部分と結合したフィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含む複合体であって、該Fn3ベースの結合分子が少なくとも2個のFn3ベータ鎖ドメイン配列と、各Fn3ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、ここで、該ループ領域配列が特定の標的と結合する、複合体。
- 非Fn3部分が第二の標的と結合することができる、請求項1の複合体。
- 非Fn3部分が、インビボで投与したときFnベースの結合分子の半減期を延長する、請求項1の複合体。
- 非Fn3部分が抗体Fc領域を含む、請求項1の複合体。
- 抗体Fc領域が、N末端領域およびC末端領域から成る群から選択される領域で、Fn3ベースの結合分子と融合している、請求項4の複合体。
- 抗体Fc領域が、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、C末端領域、C末端と最もC末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、N末端領域およびN末端と最もN末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Fn3ベースの結合分子と融合している、請求項4の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも5倍、10倍、15倍、20倍、少なくとも25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍または1000倍長い、請求項4の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも5〜30倍長い、請求項4の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも2〜5時間、5〜10時間、10〜15時間、15〜20時間、20〜25時間、25〜30時間、35〜40時間、45〜50時間、50〜55時間、55〜60時間、60〜65時間、65〜70時間、75〜80時間、80〜85時間、85〜90時間、90〜95時間、95〜100時間、100〜150時間、150〜200時間、200〜250時間、250〜300時間、350〜400時間、400〜450時間、450〜500時間、500〜550時間、550〜600時間、600〜650時間、650〜700時間、700〜750時間、750〜800時間、800〜850時間、850〜900時間、900〜950時間、950〜1000時間、1000〜1050時間、1050〜1100時間、1100〜1150時間、1150〜1200時間、1200〜1250時間、1250〜1300時間、1300〜1350時間、1350〜1400時間、1400〜1450時間、1450〜1500時間長い、請求項4の複合体。
- 複合体のインビボでの半減期が、少なくとも9.4時間である、請求項4の複合体。
- 非Fn3部分が血清アルブミン(SA)もしくはトランスフェリンまたはその部分を含む、請求項1の複合体。
- 血清アルブミン(SA)またはその部分が、ヒト血清アルブミン(HSA)である、請求項1の複合体。
- HSAが、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、C末端領域、C末端と最もC末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、N末端領域およびN末端と最もN末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Fn3ベースの結合分子と融合している、請求項12の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも5倍、10倍、15倍、20倍、少なくとも25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍または1000倍長い、請求項12の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも25〜50倍長い、請求項12の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも2〜5時間、5〜10時間、10〜15時間、15〜20時間、20〜25時間、25〜30時間、35〜40時間、45〜50時間、50〜55時間、55〜60時間、60〜65時間、65〜70時間、75〜80時間、80〜85時間、85〜90時間、90〜95時間、95〜100時間、100〜150時間、150〜200時間、200〜250時間、250〜300時間、350〜400時間、400〜450時間、450〜500時間、500〜550時間、550〜600時間、600〜650時間、650〜700時間、700〜750時間、750〜800時間、800〜850時間、850〜900時間、900〜950時間、950〜1000時間、1000〜1050時間、1050〜1100時間、1100〜1150時間、1150〜1200時間、1200〜1250時間、1250〜1300時間、1300〜1350時間、1350〜1400時間、1400〜1450時間、1450〜1500時間長い、請求項12の複合体。
- 複合体のインビボでの半減期が、少なくとも19.6時間である、請求項12の複合体。
- 血清アルブミン(SA)もしくはトランスフェリンまたはその部分と結合するポリペプチドが、抗ヒト血清アルブミン(HSA)ポリペプチドまたは抗トランスフェリンポリペプチドである、請求項12の複合体。
- 抗ヒト血清アルブミン(HSA)ポリペプチドまたは抗トランスフェリンポリペプチドが、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、C末端領域、C末端と最もC末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、N末端領域およびN末端と最もN末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Fn3ベースの結合分子と結合している、請求項18の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも5倍、10倍、15倍、20倍、少なくとも25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍または1000倍長い、請求項18の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも10〜35倍長い、請求項18の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも2〜5時間、5〜10時間、10〜15時間、15〜20時間、20〜25時間、25〜30時間、35〜40時間、45〜50時間、50〜55時間、55〜60時間、60〜65時間、65〜70時間、75〜80時間、80〜85時間、85〜90時間、90〜95時間、95〜100時間、100〜150時間、150〜200時間、200〜250時間、250〜300時間、350〜400時間、400〜450時間、450〜500時間、500〜550時間、550〜600時間、600〜650時間、650〜700時間、700〜750時間、750〜800時間、800〜850時間、850〜900時間、900〜950時間、950〜1000時間、1000〜1050時間、1050〜1100時間、1100〜1150時間、1150〜1200時間、1200〜1250時間、1250〜1300時間、1300〜1350時間、1350〜1400時間、1400〜1450時間、1450〜1500時間長い、請求項18の複合体。
- 複合体のインビボでの半減期が、少なくとも7.7時間である、請求項18の複合体。
- 非Fn3部分がポリエチレングリコール(PEG)を含む、請求項1の複合体。
- PEG部分がチオール基またはアミン基と結合している、請求項24の複合体。
- PEG部分がペグ化指示部位によってFn3ベースの結合分子と結合している、請求項24の複合体。
- PEG部分がCys残基と結合している、請求項24の複合体。
- PEG部分が非天然アミノ酸残基と結合している、請求項24の複合体。
- PEG部分が、ループ領域、ベータ鎖領域、ベータ様鎖、C末端領域、C末端と最もC末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間、N末端領域およびN末端と最もN末端のベータ鎖もしくはベータ様鎖間から成る群から選択される領域で、Fn3ベースの結合分子と融合している、請求項24の複合体。
- PEG部分が約2kDa〜約100kDaの分子量を有する、請求項24の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも5倍、10倍、15倍、20倍、少なくとも25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍または1000倍長い、請求項24の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも5〜25倍長い、請求項24の複合体。
- 複合体の半減期が、複合体ではないFn3ベースの結合分子のものよりも、少なくとも2〜5時間、5〜10時間、10〜15時間、15〜20時間、20〜25時間、25〜30時間、35〜40時間、45〜50時間、50〜55時間、55〜60時間、60〜65時間、65〜70時間、75〜80時間、80〜85時間、85〜90時間、90〜95時間、95〜100時間、100〜150時間、150〜200時間、200〜250時間、250〜300時間、350〜400時間、400〜450時間、450〜500時間、500〜550時間、550〜600時間、600〜650時間、650〜700時間、700〜750時間、750〜800時間、800〜850時間、850〜900時間、900〜950時間、950〜1000時間、1000〜1050時間、1050〜1100時間、1100〜1150時間、1150〜1200時間、1200〜1250時間、1250〜1300時間、1300〜1350時間、1350〜1400時間、1400〜1450時間、1450〜1500時間長い、請求項24の複合体。
- 複合体のインビボでの半減期が、少なくとも3.6時間である、請求項24の複合体。
- 改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、抗体Fc領域と結合するポリペプチドと結合した、フィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含み、該Fn3ベースの結合分子は、少なくとも2個のFn3ベータ鎖ドメイン配列と、各Fn3ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも9.4時間の血清半減期を有する、複合体。
- 改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、ヒト血清アルブミン(HSA)部分と結合した、フィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含み、該Fn3ベースの結合分子は、少なくとも2個のFn3ベータ鎖ドメイン配列と、各Fn3ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも19.6時間の血清半減期を有する、複合体。
- 改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、ヒト血清アルブミン(HSA)部分と結合するポリペプチドと結合した、フィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含み、該Fn3ベースの結合分子は、少なくとも2個のFn3ベータ鎖ドメイン配列と、各Fn3ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも7.7時間の血清半減期を有する、複合体。
- 改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、PEG部分と結合した、フィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含み、該Fn3ベースの結合分子は、少なくとも2個のFn3ベータ鎖ドメイン配列と、各Fn3ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は特定の標的と結合し、少なくとも3.6時間の血清半減期を有する、複合体。
- 改善された薬物動態特性を有する複合体であって、該複合体は、抗FcRn部分と結合した、フィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含み、該Fn3ベースの結合分子は、少なくとも2個のFn3ベータ鎖ドメイン配列と、各Fn3ベータ鎖ドメイン配列間を結合するループ領域配列を含み、該複合体は、新生児FcR受容体と酸性pHで高い親和性で結合し、中性pHで低い親和性で結合する、複合体。
- 酸性pHが約1〜約7の範囲である、請求項39の複合体。
- 酸性pHが約6である、請求項39の複合体。
- 中性pHが約7〜約8の範囲である、請求項39の複合体。
- 中性pHが約7.4である、請求項39の複合体。
- Fn3ドメインが少なくとも2個のフィブロネクチンモジュールに由来する、請求項1〜43のいずれかのFn3ベースの結合分子または複合体。
- Fn3ドメインが少なくとも3個またはそれ以上のフィブロネクチンモジュールに由来する、請求項1〜44のいずれかのFn3ベースの結合分子または複合体。
- 請求項1〜45のいずれかのFn3ベースの結合分子または複合体をコードする配列を含む、核酸。
- プロモーターと作動可能に連結した請求項46の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項47の核酸を含む細胞。
- 細胞が哺乳類細胞である、請求項48の細胞。
- 哺乳類細胞がヒト哺乳類細胞である、請求項49の細胞。
- 哺乳類細胞がCHO細胞である、請求項49の細胞。
- 標的と結合する請求項1〜45のいずれかのFn3ベースの結合分子または複合体を製造する方法であって、標的と結合する請求項1〜45のいずれかのFn3ベースの結合分子または複合体をコードする配列を含む核酸を発現させることを含む、方法。
- さらに哺乳類細胞中で核酸を発現させることを含む、請求項52の方法。
- 哺乳類細胞がヒト哺乳類細胞である、請求項53の方法。
- 哺乳類細胞がCHO細胞である、請求項53の方法。
- 請求項1〜45のいずれかのFn3ベースの結合分子または複合体と担体を含む組成物。
- 対象の自己免疫疾患、炎症、がん、感染症、心血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神疾患、眼疾患および移植拒絶から成る群から選択される疾患を処置する方法であって、当該対象に請求項1〜56のいずれかの結合分子、複合体または組成物を投与することを含む方法。
- サンプル中のタンパク質を検出する方法であって、請求項1〜45のいずれかのFn3ベースの結合分子または複合体を標識化し、該標識化結合分子または複合体とサンプルとを接触させ、そして結合分子または複合体とタンパク質間の複合体形成を検出することを含む、方法。
- 自己免疫疾患、炎症、がん、感染症、心血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神疾患、眼疾患および移植拒絶から成る群から選択される疾患を処置するための、複合体を含む組成物の使用であって、該複合体は非Fn3部分と結合したフィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含み、該複合体は特定の標的と結合し、複合体ではないFnベースの結合分子のものと比較して少なくとも3.6倍長い半減期を有する、使用。
- 非Fn3部分がPEG、HSA、抗HSAおよび抗体Fc領域から成る群から選択される、請求項59の使用。
- 自己免疫疾患、炎症、がん、感染症、心血管疾患、胃腸疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、筋骨格疾患、神経変性疾患、精神疾患、眼疾患および移植拒絶から成る群から選択される疾患の処置用医薬の製造における組成物の使用であって、該組成物が非Fn3部分と結合したフィブロネクチンタイプIII(Fn3)ベースの結合分子を含んでなる複合体を含み、該複合体は特定の標的と結合し、複合体ではないFnベースの結合分子のものと比較して少なくとも3.6倍長い半減期を有する、使用。
- 非Fn3部分がPEG、HSA、抗HSAおよび抗体Fc領域から成る群から選択される、請求項61の使用。
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