CN101965198A - 改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于纤连蛋白的结合分子，以及将供体CDR引入到基于纤连蛋白的结合支架尤其是Fn3中的方法。本发明基于纤连蛋白的结合分子可以进一步与其他部分例如Fc、抗FcRn、HSA、抗HSA、和PEG缀合，以，尤其是在哺乳动物细胞中，提高半衰期和稳定性。本发明还提供了筛选此类分子与靶抗原的结合以及制备和纯化候选结合剂的方法。

Description

改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途
相关信息
本申请要求2007年12月27日递交的美国临时申请号61/009,361的优选权。本说明书通篇引述的任何专利、专利申请和参考文献的内容在此全文并入作为参考。
发明背景
能够与期望的靶表位特异性结合的分子作为治疗剂和医学诊断工具均具有极大意义。此类分子的实例是单克隆抗体。对于几乎任何结构表位，都可以选择出特异性地并以高亲和力与之结合的抗体。所以，抗体常规地用作为研究工具和FDA批准的治疗剂，从而治疗性和诊断性单克隆抗体的全球市场目前价值约$300亿。
然而，单克隆抗体具有许多缺点。例如，经典抗体是大而复杂的分子。它们具有杂四聚体结构，含有通过分子间二硫键和分子内二硫键连接在一起的两条轻链和两条重链。这种结构复杂性使得不能容易地表达抗体或多特异性抗体，例如含有对两个不同分子治疗靶标的结合特异性的分子。大分子抗体也限制了其治疗效力，因为它们往往不能够有效穿透某些组织间隙。另外，治疗性抗体因为拥有Fc区，偶尔会触发不期望的效应子细胞功能和/或凝血级联反应。
从而本领域需要能够以高亲和力和特异性与期望靶标特异性结合的可选结合分子。
发明概述
本发明通过提供基于纤连蛋白的结合分子以及将供体CDR引入到基于纤连蛋白的结合支架尤其是FN3中的方法，而解决了前述问题。本发明基于纤连蛋白的结合分子可以进一步工程化或缀合其他部分例如PEG、Fc、HSA、抗HSA，以提高半衰期和稳定性。本发明还提供了筛选与靶抗原结合的此类分子以及制备和纯化候选结合剂的方法。此外，本发明首次证实，Fn3基结合分子可以成功地体内表达，尤其是在哺乳动物细胞，例如大鼠、小鼠、仓鼠、人细胞或源于其的细胞系中表达。再者，本发明证实，工程化或缀合其它部分例如PEG、Fc、HSA、抗HSA的Fn3基结合分子也可以成功地在哺乳动物细胞中表达并显示出增加该分子的半衰期的期望生理学效应。
从而本发明具有多个优点，包括但不限于如下：
-提供了基于纤连蛋白的结合分子，例如修饰的基于纤连蛋白的结合分子，所述结合分子由于分子小而且没有免疫原性而适于作为治疗剂；
-提供了基于纤连蛋白的结合分子，所述结合分子具有延长的半衰期；
-提供了基于纤连蛋白的结合分子，同时还提供了用于与期望的功能部分例如阻断部分、可检测部分、诊断部分或治疗部分相连的位点；和
-以基于纤连蛋白的结合分子处理有需要的受试者用于诊断或治疗的方法。
一方面，本发明提供了基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，包含至少两个Fn3β链结构域序列以及连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中环区序列包含与特异性靶标结合的非Fn3结合序列(即外源结合序列)。一般与野生型III型纤连蛋白(Fn3)分子(SEQ ID NO：1)相比，所述结合分子还包含至少一个修饰的氨基酸残基用于连接功能部分。
在特别的实施方案中，在基于Fn3的结合分子中该非Fn3结合序列包含互补决定区(CDR)的全部或部分，例如抗体、特别是单链抗体、单域抗体或驼类(camelid)纳米抗体的CDR。CDR可选自CDR1、CDR2、CDR3区及其组合。可选择此类非Fn3结合序列以结合各种靶标，包括但不限于细胞受体、细胞受体配体、生长因子、白介素、细菌或病毒。
基于Fn3的结合分子内的该修饰氨基酸残基可包括，例如，添加和/或将至少一个Fn3氨基酸残基取代为至少一个半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基。在一个实施方案中，半胱氨酸或非天然氨基酸残基位于环区、β链区、β样链、C-末端区域、位于C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、和/或N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。在特别的实施方案中，修饰的氨基酸残基包括一个或多个如下残基的取代：Ser 17、Ser 21、Ser 43、Ser 60、Ser 89、Val 11、Leu 19、Thr 58和Thr 71。另一方面，本发明提供了缀合物，其包括与非Fn3多肽相连的基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中基于Fn3的结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中环区序列结合特定的靶标。在另一实施方案中，环区包含与特定靶标结合的外源结合序列。
一般而言，非Fn3多肽能够结合第二靶标，和/或增加基于Fn3的结合分子在体内给药时的稳定性(即，半衰期)。适宜的非Fn3多肽包括但不限于：抗体Fc区、人血清白蛋白(HSA)(或其部分)和/或与HSA结合的多肽、或其他具有增加的半衰期的血清蛋白质例如转铁蛋白。
非Fn3部分增加缀合物的半衰期，使得缀合物的半衰期大于未缀合的Fn3基结合分子的半衰期。缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、85-90小时、90-95小时、95-100小时、100-150小时、150-200小时、200-250小时、250-300小时、350-400小时、400-450小时、450-500小时、500-550小时、550-600小时、600-650小时、650-700小时、700-750小时、750-800小时、800-850小时、850-900小时、900-950小时、950-1000小时、1000-1050小时、1050-1100小时、1100-1150小时、1150-1200小时、1200-1250小时、1250-1300小时、1300-1350小时、1350-1400小时、1400-1450小时、1450-1500小时。缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、或1000倍。
一个实施方案中，非Fn3部分是与Fn3基结合分子融合的抗体Fc区。该缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的大至少5-30倍，且该缀合物的体内半衰期为至少9.4小时。另一实施方案中，非Fn3部分是与Fn3基结合分子连接的血清白蛋白或转铁蛋白、或其部分。该缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的大至少20-25倍，且该缀合物的体内半衰期为至少19.6小时。另一实施方案中，非Fn3部分是与Fn3基结合分子连接的抗血清白蛋白或抗转铁蛋白、或其部分。该缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的大至少10-35倍，且该缀合物的体内半衰期为至少7.7小时。另一实施方案中，非Fn3部分是与Fn3基结合分子连接的聚乙二醇(PEG)。该缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的大至少5-25倍，且该缀合物的体内半衰期为至少3.6小时。
一个实施方案中，非Fn3部分包含融合在Fn3基结合分子的N末端区或C末端区的抗体Fc区。抗体Fc区也可以在选自如下的区域与Fn3基结合分子融合：环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、和/或N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。Fc缀合物的体内半衰期增加至少大约9.4小时。
另一实施方案中，非Fn3部分包含血清白蛋白(SA)，例如人血清白蛋白(HSA)、或其部分、或结合SA的多肽，例如抗HSA。SA缀合物的体内半衰期为至少大约19.6小时，而抗SA缀合物的体内半衰期为至少大约7.7小时。
再一实施方案中，非Fn3部分包含聚乙二醇(PEG)。PEG部分可以结合至巯基基团或胺基团。PEG部分可以通过定点PEG化连接到Fn3基结合分子上，例如Cys残基或非天然氨基酸残基上。PEG部分可以连接在Fn3基结合分子中的选自如下的区域上：环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、和N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。PEG部分具有大约2kDa至大约100kDa之间的分子量。PEG缀合物的体内半衰期增加至少大约3.6小时。
另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物包含：与结合抗体Fc区的多肽连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特定的靶标，具有至少9.4小时的血清半衰期。
另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物包含：与血清白蛋白(SA)部分连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特定的靶标，具有至少19.6小时的血清半衰期。
另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物包含：与结合血清白蛋白(SA)部分的多肽连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特定的靶标，具有至少7.7小时的血清半衰期。
另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物包含：与PEG部分连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特定的靶标，具有至少3.6小时的血清半衰期。
另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物包含：与抗FcRn部分连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物在酸性pH以高亲和性而在中性pH以低亲和性结合新生儿FcR受体(FcRn)。酸性pH可以为大约1至大约7，中性pH可以为大约7.0至大约8.0。一个实施方案中，酸性pH为大约pH 6.0，中性pH为大约pH 7.4。
Fn3基结合分子或缀合物可以具有源自至少两个相同或不同纤连蛋白组件的Fn3结构域，其中所述纤连蛋白组件来自1Fn至17-Fn组件之任一，并可以以任何组合方式组合，例如，10Fn3-10Fn3；10Fn3-9Fn3，10Fn3-8Fn3，9Fn3-8Fn3。缀合物，例如10Fn3-10Fn3-HSA或抗-HSA或Fc或PEG；10Fn3-9Fn3-HSA或抗HSA或Fc或PEG；10Fn3-8Fn3-HSA或抗-HSA或Fc或PEG；9Fn3-8Fn3-HSA或抗-HSA或Fc或PEG，也考虑落入本发明范围。
Fn3基结合分子或缀合物可以具有源自至少三个或三个以上相同或不同纤连蛋白组件的Fn3结构域，例如，10Fn3-10Fn3-10Fn3(-10Fn3)n，其中n是2-10中任意个数的10Fn3结构域；10Fn3-9Fn3-8Fn3(-Fn3)n，其中n是2-10中任意个数的Fn3结构域；9Fn3-8Fn3-7Fn3(-Fn3)n，其中n是2-10中任意个数的Fn3结构域。这些分子的缀合物也在本发明范围内。
本发明还涉及包含编码Fn3基结合分子或缀合物的序列的核酸、包含与启动子可操作连接的该核酸的表达载体、包含该核酸的细胞、和通过在细胞中，尤其是在体内细胞中，表达包含编码Fn基结合分子或缀合物的序列的核酸，生产结合靶标的Fn3基结合分子或缀合物的方法。在一个特定实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如大鼠、小鼠、仓鼠、人细胞或源自其的细胞系。
本发明基于Fn3的结合分子可以基于(例如人)野生型Fn3序列，以及该序列的修饰形式，如本文所讨论的那样。例如，基于Fn3的结合分子可以是嵌合体，其具有来自至少两个不同纤连蛋白组件的Fn3β链。可能的嵌合体的实例示于图6。
本发明还提供了组合物，包含本发明基于Fn3的结合分子和缀合物，用适宜的载体配制。
本发明基于Fn3的结合分子和缀合物可用在多种治疗和诊断应用中，包括但不限于任何可以使用抗体的应用。例如，此类应用包括治疗和诊断疾病或病症，包括但不限于，自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢疾病、肌肉骨骼疾病、神经变性疾病、精神性疾病、眼科疾病和移植物排斥。
本发明的其他特征和优点将会因如下详细说明和权利要求书而变得显而易见。
发明详述
为了确保清楚地理解说明书和权利要求书，下文便利地提供了如下定义。
定义
如本文所用，术语“III型纤连蛋白结构域”或“Fn3结构域”是指，来自任何生物体的野生型Fn3结构域、以及从两种或两种以上不同的Fn3结构域的β链构建的嵌合Fn3结构域。本领域已知，天然Fn3结构域具有β夹心结构，该结构由7个称作A、B、C、D、E、F和G的β链组成，其中这7个β链通过称作AB、BC、CD、DE、EF和FG环的6个环连接(见例如，Bork和Doolittle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89：8990，1992；Bork等，Nature Biotech.15：553，1997；Meinke等，J.Bacteriol.175：1910，1993；Watanabe等，J.Biol.Chem.265：15659，1990；Main等，1992；Leahy等，1992；Dickinson等，1994；美国专利6,673,901；专利协作条约公布WO/03104418；以及美国专利申请2007/0082365，上述文献的所有教导特此并入此处作为参考)。三个环(BC、DE和FG环)位于结构域的顶部，而三个环(AB、CD和EF环)位于结构域的底部(见图1)。在一个特定实施方案中，Fn3结构域来自人纤连蛋白的第10个Fn3结构域(10Fn3)(SEQ IDNO：1)。
本文中，术语“Fn3基结合分子”或“基于III型纤连蛋白的结合分子”是指已经经过改变而包含了一个或多个非Fn3结合序列的Fn3结构域。
术语“非Fn3结合序列”是指不存在于天然(例如，野生型)Fn3结构域中的氨基酸序列，其与特定靶标结合。非Fn3结合序列典型地可以通过修饰野生型Fn3结构域(例如，通过替代和/或添加)而引入。这可以例如通过随机突变或预先确定的突变野生型Fn3结构域中的氨基酸残基来实现。此外或者备选地，非Fn3结合序列可以是部分地或者完全地外源的，即，源自不同遗传或氨基酸来源。例如，该外源序列可以源自对于已知靶抗原具有已知结合特异性的抗体的高变区，例如一个或多个CDR区。该CDR可以来自单抗体链(例如，轻链或重链的可变区)或来自不同抗体链的组合。CDR还可以来自两种不同抗体(例如，具有不同特异性)。在一个特定实施方案中，CDR来自纳米抗体，例如，驼样重链。
术语“互补决定区(CDR)”是指来自抗体可变结构域或T细胞受体的高变环。CDR在抗体可变区中的定位已有精确定义(参见Kabat，E.A.等Sequences of Proteins of Immunological  Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，1991，和Chothia，C.等，J.Mol.Biol.196：901-917，1987，其并入本文作为参考)。
术语“单域抗体”是指任何天然存在的单可变结构域抗体或相应的工程化结合片段，包括如Domantis(Domantis/GSK(Cambridge，UK)所述(see，e.g.，Ward et al.，1989，Nature 341(6242)：484-5；WO04058820)的人结构域抗体、或如下文所定义的驼类纳米抗体。
术语“单链抗体”是指由(例如利用重组方法)通过合成接头连接在一起的轻链可变区抗原结合部分和重链可变区抗原结合部分组成的抗体，其中所述接头使得所述链形成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85：5879-5883)。
术语“驼类纳米抗体”(camelid nanobody)是指这样的驼类抗体区域，该区域为缺乏轻链的小单可变结构域，其可以通过遗传工程化产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质而获得，从而导致小分子量的抗体衍生蛋白质。参见例如WO07042289和1998年6月2日授权的美国专利No.5,759,808；还请参见Stijlemans，B.等，2004，J Biol.Chem.279(2)：1256-61。工程化的驼类抗体及抗体片段文库可商购获得，例如来自Ablynx，Ghent，比利时。同其他非人源抗体一样，驼类抗体的氨基酸序列可以重组改变，以获得与人序列更密切类似的序列，即，该纳米抗体可以“人源化”。因而能够进一步降低驼类抗体施用于人时已经天然低的抗原性。
术语“靶标”是指本发明Fn3基结合分子所识别(即，结合)的抗原或表位。靶标包括，但不限于，蛋白质、肽、糖和/或脂质上存在的表位。
术语“缀合物”是指化学或遗传连接一个或多个非Fn3部分的Fn3基结合分子。
术语“非Fn3部分”是指赋予与之结合的分子额外的功能性的生物或化学实体。在一个特定实施方案中，非Fn3部分是多肽，例如血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或其变体或突变体、抗HSA或其片段或突变体、抗体Fc或其片段或突变体、或化学实体，例如聚乙二醇(PEG)，其可以增加Fn3基结合分子的体内半衰期。
术语“非天然氨基酸残基”是指不存在于天然(野生型)Fn3结构域中的氨基酸残基，包括例如化学修饰的氨基酸。此类非天然氨基酸残基可以通过取代天然氨基酸和/或通过插入到天然Fn3氨基酸序列中而引入(见例如，Sakamoto et al.，2002，Nucleic Acids Research，30(21)4692-4699)。还可以掺入非天然氨基酸残基，以赋予Fn3基结合分子期望的功能，例如连接功能性部分(例如PEG)的能力。
术语“聚乙二醇”或“PEG”指聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，有或无偶联剂、或以偶联或活化部分衍生。
术语“特异性结合”或“与……特异性地结合”是指，按照表面等离子体共振测量，在标准生理盐和pH条件下于室温，Fn3基结合分子以至少1×10-6M的亲和力与靶标结合、和/或以比其对非特异性抗原的亲和力高至少2倍、优选至少10倍的亲和力与靶标结合的能力。
附图的简短说明
图1A显示野生型纤连蛋白分子III型的第10组件，其中枝权表示丝氨酸残基；图1B于二级结构背景中显示Fn3的氨基酸序列。β链中的残基以白圈显示。侧链形成疏水核的那些残基以加粗线圈起来。环残基以阴影显示。箭头标示环中的位置，在所述位置处Fn3被分开以产生互补片段。
图2显示了野生型纤连蛋白分子III型的第10组件以及提出的可用来修饰的丝氨酸残基(Ser17-Ser 21-Ser 43-Ser 60-Ser 89)。
图3显示了野生型纤连蛋白分子III型第10组件的三链片层(链A-B-E)。候选残基Ser 17和Ser 60在片层底部。候选残基Ser 21位于顶部。排除了Ser 55，因为其靠近结合表面。显示了其他潜在的候选残基，即Val 11、Leu 19和Thr 58。
图4显示了野生型纤连蛋白分子III型第10组件的四链片层(支架的另一侧)。Thr 71靠近Ser 89，也是潜在的修饰候选物。
图5显示了野生型纤连蛋白分子III型第10组件的FG和CD环。
图6A-B显示了野生型纤连蛋白分子III型第7、8、9和10组件的β链的多种组合，以产生基于纤连蛋白的结合分子嵌合体(β链交换)。
图7A-C提供了关于示例性靶标的信息。
图8显示野生型10Fn3(RGD至RGA)和野生型10Fn3(RGD至RGA)cys(无还原剂(图8A))、以及野生型10Fn3(RGD至RGA)30kDaPEG(有还原剂(图8B))的SDS PAGE分析结果。
图9显示使用大肠杆菌(E.coli)表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)在Lewis大鼠中的PK(药代动力学)。
图10显示使用大肠杆菌表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)-PEG在Lewis大鼠中的PK。
图11显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3(RGD至RGA)和野生型10Fn3(RGD至RGA)-PEG的计算半衰期。
图12显示野生型10Fn3(RGD至RGA)-RSA(有还原剂(图12a))和野生型10Fn3(RGD至RGA)-HSA(有还原剂(图12b))的SDS PAGE分析结果。
图13显示使用哺乳动物表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)-RSA在Lewis大鼠中的PK。
图14显示使用哺乳动物表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)-HSA在Lewis大鼠中的PK。
图15显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3(RGD至RGA)和野生型10Fn3(RGD至RGA)-RSA和HSA的计算半衰期。
图16显示VEGFR 10Fn3结合剂-RSA(有还原剂(图16a))和VEGFR10Fn3结合剂-HSA(有还原剂(图16b))的SDS PAGE分析结果。
图17显示VEGFR 10Fn3结合剂-HSA和RSA的ELISA结果。
图18显示使用哺乳动物表达系统，VEGFR结合性Fn3-HSA在Lewis大鼠中的PK。
图19显示使用哺乳动物表达系统，VEGFR结合性Fn3-RSA在Lewis大鼠中的PK。
图20显示使用WinNonLin软件分析，VEGFR结合性Fn3-HSA和VEGFR结合性Fn3-RSA的计算半衰期。
图21显示有还原剂时野生型10Fn3(RGD至RGA)-抗RSA的SDSPAGE分析结果。
图22显示使用大肠杆菌表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)-抗RSA在Lewis大鼠中的PK。
图23显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3(RGD至RGA)和野生型10Fn3(RGD至RGA)-抗RSA的计算半衰期。
图24显示有还原剂时野生型10Fn3(RGD至RGA)-Fc的SDS PAGE分析结果。
图25显示使用哺乳动物表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)-Fc在Lewis大鼠中的PK。
图26显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3(RGD至RGA)和野生型10Fn3(RGD至RGA)-Fc的计算半衰期。
概述
本发明提供了基于纤连蛋白的结合分子，以及将供体CDR引入到基于纤连蛋白的结合支架，特别是Fn3中的方法。如下文进一步讨论的那样，本发明还提供了向基于纤连蛋白的结合分子或支架中引入适于与部分缀合的氨基酸残基的方法。此优点允许本发明基于纤连蛋白的结合分子进一步与其他此类分子缀合，以构建双和多特异性结合分子，和/或允许连接诸如PEG等部分以提高半衰期和稳定性。
本发明还提供了筛选与靶标(一般是蛋白质抗原)特异性结合的此类结合分子以及在例如原核或真核系统中制备所述分子的方法。
另外，本发明提供了纯化候选结合分子及其配制的方法。
另外，本发明提供了在多种诊断和治疗应用中使用此类配制的结合分子的方法，尤其是用于诊断或治疗人类疾病。
基于纤连蛋白的结合支架及其修饰
一方面，本发明提供了用于制备结合分子的改良的支架。适合于在本发明中使用的支架包括但不限于：锚蛋白重复支架或免疫球蛋白超家族的一个或多个成员，例如抗体或纤连蛋白结构域。
在一个实施方案中，纤连蛋白III型结构域(Fn3)作为支架分子(美国专利No.6,673,901，PCT公开WO/03104418以及美国专利申请20070082365)。此结构域在蛋白质序列数据库中出现过400次以上，并且据估计存在于迄今测序的2％蛋白质中，包括纤连蛋白、生腱蛋白、细胞内细胞骨架蛋白以及原核细胞酶(Bork和Doolittle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 89：8990，1992；Bork等，Nature Biotech.15：553，1997；Meinke等，J.Bacteriol.175：1910，1993；Watanabe等，J.Biol.Chem.265：15659，1990)。Fn3的三维结构已经通过NMR(Main等，1992)和X射线结晶学(Leahy等，1992；Dickinson等，1994)确定。所述结构描述为类似于抗体VH结构域的β夹心，除了Fn3具有7个β链而不是9个。每个Fn3结构域的每一端有3个环；BC、DE和FG环的位置分别大致对应于抗体VH结构域的CDR1、2和3的位置(美国专利6,673,901，PCT公开WO/03104418)。来自任何物种的任何Fn3结构域均适合于在本发明中使用。
在另一实施方案中，Fn3支架是人类Fn3的第10组件(10Fn3)，其含有94个氨基酸残基。10Fn3中对应于IgG重链的抗原结合环的3个环，位于如下氨基酸残基之间：21-31(BC)、51-56(DE)和76-88(FG)(美国专利申请号20070082365)。这些BC、DE和FG环可以分别直接被抗体可变区的CDR1、2和3环，尤其是单域抗体的CDR，所取代。
尽管10Fn3是用于产生Fn3基结合分子的Fn3支架的一个实施方案，但是在本文描述的分子中可以用其它分子替代10Fn3。这些分子包括但不限于，人纤连蛋白组件1Fn3-9Fn3和11Fn3-17Fn3以及来自非人动物和原核生物的相关Fn3组件。此外，来自具有与10Fn3同源的序列的其它蛋白质，例如，生腱蛋白和undulins，的Fn3组件也可以使用。来自不同生物和亲本蛋白的组件可能最适用于不同的应用；例如，在设计抗体模拟物时，可能最期望从治疗性或诊断性分子预期使用的生物所天生的纤连蛋白或纤连蛋白样分子出发来产生该蛋白质。
在另一实施方案中，Fn3来自非人物种。如果向人类患者给药非人Fn3，可能会引起有害的免疫反应。为预防之，非人Fn3可以遗传工程化，以除去抗原性氨基酸或表位。鉴定非人Fn3抗原性区域的方法包括但不限于美国专利No.6,673,580中所述的方法。
在另一实施方案中，Fn3支架是从一个或多个Fn3(例如至少两个不同Fn3，例如10Fn3和9Fn3)的部分构建的嵌合体。利用Fn3结构域已知的氨基酸序列和三维结构，技术人员能够容易地鉴定不同Fn3分子中能够组合起来以产生功能性嵌合Fn3分子的区域。此类嵌合Fn3结构域可以以多种方法构建，包括但不限于：基于PCR的或酶介导的基因工程化，从头开始DNA或RNA合成，或者盒诱变。
上述基于纤连蛋白的结合支架可以从头构建，或者通过应用芯片(insilico)分子建模而获得信息。芯片或计算机辅助建模可以包括简单的核酸或氨基酸序列比对或应用例如Ras-Mol进行三维建模。就支架的哪些区域或环能够选择用来呈递高变区而言，支架建模造就一种理性方法。建模还使得可以最好地修饰支架以最佳地呈递一个或多个高变区。
将高变区/CDR移植到基于纤连蛋白的结合支架上的方法
一方面，本发明描述了将高变区从其他Ig超家族分子上移植到本发明基于纤连蛋白的结合支架上的改进方法。
在一个实施方案中，来自抗体可变区(例如重链可变区、轻链可变区或两者)的一个或多个CDR被移植到一种上述结合支架的一个或多个环中。任何抗体可变区的CDR区或其抗原结合片段均适合于移植。CDR可从任何动物的抗体谱(repertoire)中获得，包括但不限于：啮齿类动物、灵长类动物、驼类动物或鲨鱼。在特别的实施方案中，CDR从单域抗体例如纳米抗体的CDR1、CDR2和CDR3获得。在更具体的实施方案中，单域抗体例如纳米抗体的CDR1、2和3移植到Fn3结构域的BC、DE和FG环中，由此向基于纤连蛋白的结合分子提供原纳米抗体的靶结合特异性。驼类抗体和抗体片段的工程化文库可商购获得，例如Ablynx，Ghent，比利时。抗体谱可来自用一种或多种抗原刺激的动物，或来自未用抗原刺激过的幼稚动物。另外或者可选地，CDR可从通过体外或体内文库筛选方法所产生的抗体或其抗原结合片段获得，所述方法包括但不限于体外多聚核糖体或核糖体展示、噬菌体展示或酵母展示技术。这包括非由体外或体内文库筛选方法最初产生的、而是利用体外或体内筛选方法随后经历了诱变或一个或多个亲和力成熟步骤而获得的抗体。此类体外或体内文库筛选方法或亲和力成熟方法的实例描述在美国专利No.7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；5,922,545；5,830,721；5,605,793，5,830,650；6,194,550；6,699,658；7,063,943；5866344以及PCT公开WO06023144中。
鉴定抗体CDR的方法在本领域公知(参见Kabat等，U.S.Dept.ofHealth and Human Services，″Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest″(1983)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))。可以分离和测序编码特定抗体的核酸，并通过相对于确立的抗体序列命名法来检查所编码的蛋白质而推出CDR序列。例如，将高变区或CDR移植到本发明基于纤连蛋白的结合支架中的方法包括基因工程化法、从头核酸合成或基于PCR的基因组装(参见例如美国专利No.5,225.539)。
鉴定基于纤连蛋白的结合支架中适合于修饰以提高CDR呈递/结合的残基 的方法
上述技术允许鉴定适宜的支架环，用来选择和呈递高变区或CDR。不过，可以调用其他法则，基于Fn3结构域和供体抗体的结构建模，进一步改进高变区的合身性以及呈递。
一方面，可以突变Fn3支架上任一β链中的特定氨基酸残基，以允许CDR环采取保留或提高抗原结合的构象。这种方法可应用结构建模和序列比较的组合，通过类似于将CDR移植到异源抗体构架中的方式进行。在一个实施方案中，邻近CDR的Fn3残基以类似于Queen等(参见美国专利No.6,180,370；5,693,762；5,693,761；5,585,089；7,022,500)实施的方式进行突变。在另一实施方案中，落在CDR残基一个范德华半径范围内的Fn3残基以类似于Winter等(参见美国专利No.6,548,640；6,982,321)实施的方式进行突变。在另一实施方案中，不靠近CDR残基、但根据Fn3结构域和供体抗体的结构建模预测将调节CDR残基构象的Fn3残基，以类似于Carter等或Adair等(见美国专利No.6,407,213；6,639,055；5,859,205；6,632,927)实施的方式进行突变。
另一方面，对含有一个或多个移植的抗体CDR的Fn3支架进行一个或多个体外或体内亲和力成熟步骤。可采用任何亲和力成熟方法，引起Fn3支架或CDR中的氨基酸变化，提高Fn3/CDR与期望抗原的结合。这些氨基酸变化可以例如，借助于随机诱变、“巡视式诱变(walk throughmutagenesis)”和“浏览式诱变(look through mutagenesis)”而实现。例如，monobody的此类诱变可利用易错PCR，利用酵母或细菌“增突”株，在从头合成所有或部分monobody期间掺入随机或确定的核酸变化而实现。实施亲和力成熟和/或诱变的方法描述在例如，美国专利No.7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；5,922,545；5,830,721；5,605,793，5,830,650；6,194,550；6,699,658；7,063,943；5866344和PCT公开WO06023144中。包含最小必需结合决定簇的新CDR序列还可以利用如US20050255552中所述的Kalobios技术来筛选。
工程化和修饰的基于纤连蛋白的结合分子
另一方面，本发明描述了基于纤连蛋白的结合分子，与原始基于纤连蛋白的分子相比，其已经被修饰而具有改变的性能。修饰包括该分子与其他分子缀合或融合、以及化学修饰该分子或改变分子结构的氨基酸残基或核苷酸。
纤连蛋白融合物
本发明基于纤连蛋白的结合分子可以与其他分子融合或缀合。此类缀合物在本文称为“Fn融合物”。例如，Fn融合物包括与增加结合分子的稳定性或半衰期的分子融合的基于纤连蛋白的结合分子(例如，Fc区、HSA或抗HSA结合分子)。
例如，可以通过IgG恒定区(Fc)与10Fn3组件(优选地通过10Fn3的C末端)融合，而使Fn融合物与人免疫应答结合。在该10Fn3-Fc融合分子中Fc激活免疫应答的补体成分，并增加该抗体模拟物的治疗价值。类似地，10Fn3与补体蛋白如C1q的融合可以用于靶向细胞，10Fn3与毒素的融合可以用于特异地破坏带有特定抗原的细胞。此外，任何形式的10Fn3都可以与白蛋白融合以增加在血流中的半衰期和其组织穿透性。这些融合物均可以通过标准技术产生，例如使用公众可得的基因序列构建重组融合基因，从该融合基因表达融合蛋白。
Fn融合物还可以使用新生儿Fc受体(FcRn)(也称作“Brambell受体”)产生，所述受体参与延长白蛋白在循环中的寿命(见Chaudhury等(2003)J.Exp.Med.3：315-322；Vaccarao等，(2005)Nature Biotech.23：1283-1288)。FcRn受体是整合膜糖蛋白，由β2微球蛋白可溶性轻链与43kDα链非共价结合组成，所述α链具有三个胞外结构域、一个跨膜区和一个大约50个氨基酸的胞质尾。胞质尾含有涉及受体内在化的、基于二核苷酸基序的胞吞信号。该α链是非经典MHC I蛋白家族的成员。β2m与α链的结合对于FcRn正确折叠和退出内质网以运送至内体(endosome)和细胞表面是关键的。
FcRn的整体结构类似于I类分子的整体结构。α-1和α-2区类似于一个平台，由8个反平行β链组成，这些β链形成顶部为两个反平行α螺旋的单个β折叠，极为类似于MHC I分子中的肽裂隙。天然地，FcRn结合IgG并跨胎盘合胞体滋养层自母体循环转运IgG至胎儿循环并在成体中保护IgG免遭降解。除了体内稳态，FcRn还控制IgG在组织中的胞转。FcRn定位在上皮细胞、内皮细胞和肝细胞中。
研究显示，白蛋白结合FcRn，和IgG形成三分子复合物。白蛋白和IgG两者非协同地结合在FcRn的不同部位。人FcRn与Sepharose-HSA和Sepharose-hIgG的结合是pH依赖性的，在pH5.0最大，在pH7.0-pH8为零。观察到FcRn结合白蛋白与FcRn结合IgG具有相同的pH依赖方式，这提示白蛋白与FcRn相互作用以及由此受保护而免遭降解的机制与IgG的相同，由类似地与FcRn的pH敏感性相互作用介导。FcRn和白蛋白通过白蛋白的D-III结构域在不同于IgG结合位点的位点以pH依赖性方式相互作用。
本发明的Fn融合物也包括Fn-FcRn融合蛋白或Fn-抗-FcRn融合分子。一个实施方案中，Fn融合物是Fn-抗-FcRn融合分子，其中抗FcRn融合分子可以在酸性pH(例如pH6.0)以高亲和力而在中性pH(例如，pH7.4)以低亲和力结合新生儿FcR受体(FcRn)，类似于IgG与FcRn的结合。Fn-抗-FcRn融合物的体内半衰期增加，由此提供改良的治疗应用。
使分子与Fc结构域(例如IgG1的Fc结构域)融合的方法在本领域已知(参见例如U.S.5,428,130)。此类融合物由于Fc结合FcRn的能力而具有增加的循环半衰期，该能力在IgG稳态中起着关键作用，防止与之结合的分子代谢(参见例如US20070269422)。
其他融合物包括与人血清白蛋白(HSA或HA)融合的基于纤连蛋白的结合分子。人血清白蛋白成熟形式为585个氨基酸的蛋白质，负责重大比例的血清渗透压，而且也可以作为内源和外源配体的载体起作用。白蛋白作为载体分子的作用及其惰性性质对于作为体内多肽载体和转运蛋白的用途而言是期望的性能。作为白蛋白融合蛋白组分的白蛋白用作多种蛋白质的载体的用途已经在WO 93/15199、WO 93/15200和EP 413622中提出。此外，也已经提出(EP 399666)使用HSA的N-末端片段与多肽融合。因此，可以通过将本发明的分子与白蛋白、或白蛋白的片段(部分)或变体、或能够结合HSA、足以稳定所述蛋白质和/或其活性的分子(“抗HSA结合剂”)基因或化学融合或缀合，使得本发明分子得以稳定以延长保质期，和/或使得分子的活性在溶液中、在体外、和/或在体内得以保留延长的时间。
白蛋白与其他蛋白质的融合可以通过基因操纵实现，将编码HSA的DNA或其片段与编码蛋白质的DNA相连。然后用融合的核苷酸序列转化或转染适宜的宿主，其中所述融合的核苷酸序列在适宜的质粒上的排列使得可以表达融合的多肽。表达可以由例如原核或真核细胞在体外实现，或由例如转基因生物在体内实现。与HSA融合相关的其他方法可见于例如WO 2001077137和WO 200306007，并入本文作为参考。在一个具体实施方案中，融合蛋白质的表达在哺乳动物细胞系中进行。哺乳动物细胞系的实例包括但不限于，人胚胎肾细胞(例如HEK Freestyle，HEK293，HEK293T)；中国仓鼠卵巢细胞(例如CHO)；仓鼠肾细胞(例如BHK)；人胚胎视网膜细胞(例如PERC6)；小鼠骨髓瘤(Sp/20)；HEK293和人B细胞系的杂种(例如HKB11)；宫颈癌细胞(例如HeLa)；和猴肾细胞(例如COS).
本发明的其他融合物包括使基于纤连蛋白的结合分子与其他功能分子例如其他肽或蛋白质(例如抗体或受体的配体)相连以生成“双特异性分子”。双特异性分子结合至少两个不同的结合位点或至少两个不同的靶分子，例如纤连蛋白分子靶向的结合位点和抗HSA结合剂，所述抗HSA结合剂来自基于纤连蛋白的分子(如上文所述)或来自其他非纤连蛋白支架，例如来自单域抗体(参见例如WO2004041865(Ablynx)和EP1517921(Domantis))。本发明基于纤连蛋白的结合分子还可以衍生或连接不止一个其他功能分子，以生成结合同一靶分子上两个以上不同的结合位点和/或两个不同靶分子上的两个分开的结合位点、或其各种排列组合的多特异性分子。一个实施方案中，Fn3基多特异性结合分子可以包含例如连接在一起并缀合了半衰期延长结构部分例如HSA的至少两个Fn3结构域，其中每个Fn3结构域分别结合相同治疗靶标的不同位点，例如，TNF上的不同位点。另一实施方案中，Fn3基多特异性结合分子可以包含例如连接在一起并缀合了半衰期延长结构部分例如HSA的至少两个Fn3结构域，其中每个Fn3结构域分别结合不同的治疗靶标，例如第一Fn3结构域结合Her3而第二Fn3结构域结合Her2。再一实施方案中，Fn3基多特异性结合分子可以包含例如连接在一起并缀合了半衰期延长结构部分例如HSA的至少两个Fn3结构域，其中每个Fn3结构域分别结合不同治疗靶标上的不同位点，例如，第一Fn3结构域结合Her3的位点1，第二Fn3结构域结合Her3的位点2，第三Fn3结构域结合Her2的位点1，而第四Fn3结构域结合Her2的位点2，及其各种排列组合。此类多特异性分子也旨在为如本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。
本发明的双特异性分子可利用本领域已知的方法通过缀合组分结合特异性而制备。例如，双特异性分子的每个结合特异性可分开生成，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用来进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78，118-132；Brennan等(1985)Science 229：81-83)和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中所述的那些。优选的缀合剂是SATA和sulfo-SMCC，两者均可购自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
如果结合特异性包括一个以上抗体(例如，在多特异性构建体中)，缀合可以借助于两个重链C-末端铰链区的巯基键合而实现。在尤其优选的实施方案中，在缀合之前修饰铰链区，以含有奇数个巯基残基，优选1个。
可选地，两种结合特异性均可在同一载体上编码并在同一宿主细胞中表达和组装。制备双特异性分子的方法描述在例如美国专利No.5,260,203；美国专利No.5,455,030；美国专利No.4,881,175；美国专利No.5,132,405；美国专利No.5,091,513；美国专利No.5,476,786；美国专利No.5,013,653；美国专利No.5,258,498和美国专利No.5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过多种测定法来确认，例如，可以放射性标记融合物并用在放射性免疫测定法(RIA)中(参见例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，并入本文作为参考)。放射性同位素可通过诸如应用γ-计数器或闪烁计数器或者通过放射自显影法等方法来检测。
本发明的其他融合物包括使基于纤连蛋白的结合分子与标签(例如生物素)或化学品(例如免疫毒素或化疗剂)相连。此类化学品包括细胞毒性剂，即，任何对细胞有害(例如杀伤)的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，以及它们的类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)，烷化剂(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(例如，柔红霉素(以前称作道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称作放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。能够与本发明基于纤连蛋白的结合分子缀合的治疗性细胞毒素的其他实例包括duocarmycins、刺孢霉素、美登素和auristatins，以及它们的衍生物。
细胞毒素可以利用本领域可用的接头技术与本发明基于纤连蛋白的结合分子缀合。已经用来与细胞毒素缀合的接头类型的实例包括但不限于：腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。例如，接头可以选择为易被溶酶体区室内的低pH断裂、或者易被蛋白酶(例如优选在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))断裂的接头。
有关细胞毒素、接头类型以及治疗剂缀合方法的更多讨论还参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)CancerImmunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer.C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本发明基于纤连蛋白的结合分子还可以与放射性同位素缀合以生成细胞毒性放射性药物，也称为放射性免疫缀合物。能够与基于纤连蛋白的结合分子缀合用于诊断或治疗用途的放射性同位素的实例包括但不限于：碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性免疫缀合物的方法在本领域已经确立。基于抗体的放射性免疫缀合物的实例可商购获得，包括替伊莫单抗、tiuxetan和托西莫单抗，且类似的方法可用来应用本发明的分子制备放射性免疫缀合物。
本发明的Fn融合物可用来调节给定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有期望生物学活性的蛋白质或多肽。例如，此类蛋白质可以包括酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌内毒素或白喉毒素；诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ等蛋白质；或生物学反应调节剂，例如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
缀合此类治疗性部分的技术公知，并且可应用于本发明的分子，参见例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(编辑)，623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，475-506页(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of Th e Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
化学修饰
另一方面，本发明提供了通过聚乙二醇化修饰的基于纤连蛋白的结合分子，以例如增加分子的生物学(例如血清)半衰期。为使分子聚乙二醇化，所述分子或其片段一般与聚乙二醇(PEG)部分，例如PEG的活性酯或醛衍生物，在一个或多个PEG基团可以与所述分子连接起来的条件下反应。术语“聚乙二醇化部分”、“聚乙二醇部分”或“PEG部分”包括聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，有或无偶联剂或以偶联或活化部分衍生(例如，以硫醇、三氟甲磺酸(triflate)、tresylate、氮杂环丙烷(azirdine)、环氧乙烷(oxirane)，或优选以马来酰亚胺部分衍生，例如PEG-马来酰亚胺)。其他适当的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于马来酰亚胺基单甲氧基聚乙二醇、活化的聚乙二醇聚丙二醇，而且还包括如下类型的荷电或中性聚合物：葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸、或其他基于糖的聚合物、氨基酸聚合物、和生物素衍生物。
选择适宜官能团用于PEG衍生物可以以该分子上或将与PEG偶联的分子上可利用的反应基团的类型为基础来进行。对于蛋白质而言，典型的反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。还可以利用N-末端氨基基团和C-末端羧酸。
优选，聚乙二醇化借助于与活性PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应而进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用来衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇，或聚乙二醇-马来酰亚胺。聚乙二醇化蛋白质的方法在本领域已知，并且可应用于本发明。参见例如WO 2005056764、U.S.7,045,337、U.S.7,083,970、U.S.6,927,042、Nishimura等的EP 0154316和Ishikawa等的EP 0401384。基于纤连蛋白的结合分子可以工程化以纳入至少一个半胱氨酸氨基酸或至少一个非天然氨基酸以促进聚乙二醇化。
本发明基于纤连蛋白的结合分子还可以通过羟乙基淀粉化修饰，其利用与药物相连的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物以修饰药物特征。HES是可以被机体酶代谢的、衍生自蜡质玉米淀粉的、修饰的天然聚合物。这种修饰通过增加分子的稳定性以及减小肾脏清除而使循环半衰期延长，导致增加的生物学活性。此外，HES化潜在地改变免疫原性或变应原性。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制范围广泛的HES药物缀合物。
DE 19628705和DE 10129369描述了在无水二甲基亚砜(DMSO)中借助于羟乙基淀粉的相应醛糖内酯使羟乙基淀粉分别与血红蛋白和两性霉素B的游离氨基偶联的可行方法。由于因为溶解度的原因或者是蛋白质变性的原因使用无水非质子溶剂往往是不可行的(特别是在蛋白质的情况下)，故也可利用HES在水性介质中偶联的方法。例如，通过水溶性碳化二亚胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)的介导，可以偶联已在链还原端选择性氧化为醛糖酸的羟乙基淀粉(PCT/EP 02/02928)。可应用于本发明的其他羟乙基淀粉化方法描述在例如U.S.20070134197、U.S.20060258607、U.S.20060217293、U.S.20060100176和U.S.20060052342中。
本发明基于纤连蛋白的结合分子还可利用糖残基来修饰。修饰蛋白质的糖残基或使蛋白质糖基化的方法在本领域已知(参见例如Borman(2006)Chem.&Eng.News 84(36)：13-22和Borman(2007)Chem.&Eng.News85：19-20)，并且可应用于本发明的分子。此类糖修饰还可通过：例如改变纤连蛋白基结合分子序列内部的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，以消除一个或多个可变区构架糖基化位点，由此消除在该位点的糖基化。这样的无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法在Co等的美国专利No.5,714,350和6,350,861中有更详细的说明。
另外地或可选地，可制备本发明基于纤连蛋白的结合分子，其具有改变的糖基化类型，例如岩藻糖残基量减小的低岩藻糖基化模式，或平分型GlcNac结构增加的基于纤连蛋白的结合分子。此类糖修饰可通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达基于纤连蛋白的结合分子来实现。具有改变的糖基化机器的细胞在本领域已有描述，并且可用作为宿主细胞表达本发明重组的基于纤连蛋白的结合分子，由此产生糖基化改变的本发明基于纤连蛋白的结合分子。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因被功能性破坏了的细胞系，从而在这样的细胞系中表达的抗体呈现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其使岩藻糖与Asn(297)连接的糖相连的能力下降，也导致该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(还请参见Shields，R.L.等，2002J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等的PCT公开WO 99/54342描述了经工程化表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而该工程化细胞系中表达的抗体呈现出增加的平分型GlcNac结构，导致抗体ADCC活性增加(还请参见Umana等，1999Nat.Biotech.17：176-180)。产生具有人样糖基化模式的多肽的方法也已经由EP1297172B1以及源于Glycofi的其他同族专利描述过。
氨基酸/核苷酸修饰
本发明具有一个或多个氨基酸或核苷酸修饰(例如，改变)的基于纤连蛋白的结合分子可通过多种已知方法生成。例如，此类修饰分子可通过重组方法产生。而且，由于遗传密码的简并性，可利用多种核酸序列来编码每个期望的分子。
例示性的本领域公认的制备编码起始分子的氨基酸序列变体的核酸分子的方法包括但不限于，通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变以及盒诱变早先制备的编码分子的DNA来制备。
定点诱变是制备取代变体的优选方法。此技术在本领域公知(参见例如Carter等Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：488(1987))。简言之，在进行DNA定点诱变时，亲本DNA通过如下方式改变：首先使编码期望突变的寡核苷酸与此类亲本DNA的单链杂交。杂交后，利用杂交的寡核苷酸作为引物，而利用该亲本DNA单链作为模板，利用DNA聚合酶合成完整的第二链。从而，编码期望突变的寡核苷酸被掺入到所得的双链DNA中。
PCR诱变也适合于制备起始分子的氨基酸序列变体。参见Higuchi，inPCR Protocols，177-183页(Academic Press，1990)；和Vallette等，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。简言之，当小量模板DNA在PCR中用作为起始材料时，可利用在序列上与模板DNA相应区域稍有差异的引物来生成相对大量的特异性DNA片段，其仅在引物有别于模板的位置上与模板序列存在差异。
另一种制备变体的方法，即盒诱变，是以Wells等Gene 34：315-323(1985)描述的技术为基础的。起始材料是含有待突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定亲本DNA中待突变的密码子。所鉴定的突变位点的每一侧必需有独特的限制性内切酶位点。如果不存在这样的限制性位点，则可以利用上述寡核苷酸介导的诱变方法将其引入在起始多肽DNA的适当位置上。在这些位点切割质粒DNA以使之线性化。利用标准方法合成编码两限制性位点之间的DNA序列但含有期望突变的双链寡核苷酸，其中两条寡核苷酸链分开合成，然后利用标准技术杂交在一起。这种双链寡核苷酸称为盒。此盒设计为具有与线性化质粒末端适配的5’和3’端，从而能够直接连接到质粒中。这样该质粒含有突变的DNA序列了。
可选地，或另外地，可确定编码分子的多肽变体的期望氨基酸序列，并合成产生编码此氨基酸序列变体的核酸序列。
本领域普通技术人员将会理解，可以进一步修饰本发明基于纤连蛋白的结合分子，从而其氨基酸序列改变(例如与野生型不同)，但期望的活性不变。例如，可对蛋白质进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的其他核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以替换为相同侧链家族的其他氨基酸残基。在另一实施方案中，一段氨基酸链可以替换为结构上类似的、仅在侧链家族成员的顺序和/或组成方面有别的链，即可进行保守取代，其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。
具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已经定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
除了氨基酸取代，本发明还考虑起始分子氨基酸序列的其他修饰，以生成功能上等同的分子。例如，可以缺失一个或多个氨基酸残基。一般而言，根据本发明的此实施方案，将会缺失不超过1个至约10个残基。本文包含一个或多个氨基酸缺失的纤连蛋白分子将优选保留起始多肽分子的至少约80％、优选至少约90％、最优选至少约95％。
还可以制备氨基酸插入变体，其保留原始纤连蛋白分子的功能。例如，可以将至少一个氨基酸残基(例如，1个至2个氨基酸残基，一般不超过10个残基)引入到分子中，在另一实施方案中，可以在单个纤连蛋白分子中组合种种氨基酸修饰。
在一个实施方案中，对3型纤连蛋白结构域进行氨基酸取代，以包括半胱氨酸或其他非天然氨基酸，从而适合于通过公知的缀合方法使部分与该基于纤连蛋白的结合分子缀合。尤其是，本发明涉及具Fn3支架的基于纤连蛋白的结合分子的特定氨基酸变体，其中一个或多个丝氨酸残基被半胱氨酸或非天然氨基酸取代。能够取代的丝氨酸残基包括但不限于：Ser 17，Ser 21，Ser 43，Ser 60，和Ser 89。能够取代的Fn3支架的其他氨基酸位置包括但不限于Val11，Leu19，Thr58和Thr71。非天然存在的氨基酸可利用例如Ambrex技术(参见例如US 7,045,337；7,083,970)取代到Fn3支架中。
用于鉴定改进的基于纤连蛋白的结合分子的筛选测定法
可采用多种筛选测定法来鉴定本发明改进的基于纤连蛋白的结合分子。在一个实施方案中，筛选基于纤连蛋白的结合分子对期望抗原提高的结合亲和力。可以考虑能够选择对期望抗原的提高结合性的任何体外或体内筛选方法。
在另一实施方案中，在细胞、病毒或噬菌体表面展示基于纤连蛋白的结合分子，并利用固定化抗原对其进行选择。适宜的筛选方法描述在美国专利No.7,063,943；6,699,658；7,063,943和5866344中。此类表面展示可能要求创建基于纤连蛋白的结合分子和正常存在于细胞、病毒或噬菌体外表面上的适宜蛋白质之间的融合蛋白质。适宜制备此类融合物的蛋白质在本领域公知。
在另一实施方案中，利用体外表型-基因型关联展示例如核糖体或多核糖体展示来筛选基于纤连蛋白的结合分子。此类“分子进化”方法为本领域公知(参见例如美国专利No.6,194,550和7,195,880)。
本发明采用的筛选方法可能需要在基于纤连蛋白的结合分子中引入一个或多个氨基酸突变。可以考虑任何本领域公认的突变方法。在一个实施方案中，创建基于纤连蛋白的结合分子的文库，其中随机突变Fn3支架或移植CDR中的一个或多个氨基酸。在另一实施方案中，创建基于纤连蛋白的结合分子的文库，其中Fn3支架或移植CDR中的一个或多个氨基酸被突变为一个或多个预定的氨基酸。
本发明采用的筛选方法可能还需要增加抗原结合筛选测定法的严谨度，以选择抗原亲和力提高的基于纤连蛋白的结合分子。此处可使用本领域公认的增加蛋白质-蛋白质相互作用测定法的严谨度的方法。在一个实施方案中，改变一种或多种测定条件(例如，测定缓冲液的盐浓度)以降低基于纤连蛋白的结合分子对期望抗原的亲和力。在另一实施方案中，缩短允许基于纤连蛋白的结合分子与期望抗原结合的时间长度。在另一实施方案中，在蛋白质-蛋白质相互作用测定法中增添竞争性结合步骤。例如，首先使基于纤连蛋白的结合分子与期望的固定化抗原结合。然后添加特定浓度的非固定化抗原，其起与固定化抗原竞争结合的作用，从而抗原亲和力最低的基于纤连蛋白的结合分子从固定化抗原上洗脱掉，导致选择出抗原结合亲和力提高的基于纤连蛋白的结合分子。测定条件的严谨度可进一步通过增加添加到测定中的非固定化抗原的浓度来增加。
本发明的筛选方法还可能需要多轮选择，以富集抗原结合性提高的一种或多种基于纤连蛋白的结合分子。在一个实施方案中，在每一轮选择中，向基于纤连蛋白的结合分子中引入进一步的氨基酸突变。在另一实施方案中，在每一轮选择中，增加与期望抗原结合的严谨度，以选择抗原亲和力增加的基于纤连蛋白的结合分子。
制备方法
本发明基于纤连蛋白的结合分子一般通过重组表达产生。编码所述分子的核酸插入到表达载体中。编码所述分子的DNA区段于表达载体中有效连接确保其表达的控制序列。表达控制序列包括但不限于：启动子(例如天然相伴或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体已经掺入到适当的宿主中，则宿主在适合于高水平表达所述核苷酸序列、以及收集和纯化交叉反应的基于纤连蛋白的结合分子的条件下维持。
这些表达载体一般可作为游离体或者宿主染色DNA的整合部分而在宿主生物体中复制。通常表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)，以允许检测转化了期望的DNA序列的那些细胞(参见例如Itakura等，美国专利4,704,362)。
大肠杆菌是一种尤其可用于克隆本发明多核苷酸(例如DNA序列)的原核宿主。其他适合于应用的微生物宿主包括芽孢杆菌属(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，以及其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。
其他微生物例如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤氏酵母属(Pichia)为例示性的酵母宿主，适宜载体按期望具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括例如来自醇脱氢酶、异细胞色素C(isocytochrome C)以及负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
除了微生物，哺乳动物组织培养也可以用来表达和生产本发明的多肽(例如编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见Winnacker，From Genesto Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。实际上优选真核细胞，因为本领域已经研发了许多能够分泌异源蛋白质(例如完整免疫球蛋白)的适宜宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞、293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞以及杂交瘤。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列为来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。
可选地，编码序列可掺入到转基因中，以引入到转基因动物的基因组中，随后在转基因动物乳汁中表达(参见例如Deboer等，U.S.5,741,957，Rosen，U.S.5,304,489和Meade等，U.S.5,849,992)。适宜的转基因包括轻链和/或重链编码序列，有效连接于来自乳腺特异性基因例如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子。
含目的多核苷酸序列和表达控制序列的载体可通过公知的方法转移到宿主细胞中，所用方法取决于细胞宿主的类型。例如，可以短暂热击化学感受态原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂转染(lipofection)、生物轰击(biolistics)或基于病毒的转染可用于其它细胞宿主(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)。其他用来转化哺乳动物细胞的方法包括应用polybrene、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等，同前)。为产生转基因动物，转基因可显微注射到受精卵中，或者可掺入到胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的细胞核转移到去核卵细胞中。
本发明基于纤连蛋白的结合分子一经表达，则可按照本领域的标准方法纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(一般参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。对于制药用途，优选基本上纯的、至少约90-95％均质的分子，最优选98-99％或更高均质性。
组合物
本发明基于纤连蛋白的结合分子(及其变体、融合物和缀合物)具有体外和体内诊断和治疗用途。从而，本发明还提供了组合物，例如药物组合物，含有与可药用载体配制在一起的一种或组合的基于纤连蛋白的结合分子(或其变体、融合物和缀合物)。本发明的药物组合物还可以在组合治疗中给药，即与其他药剂组合。例如，组合治疗可包括本发明的组合物连同至少一种或多种其他治疗剂，例如抗炎药、抗癌药和化疗剂。
本发明的药物组合物还可联合放射治疗给药。与其他基于纤连蛋白的分子共给药也涵盖在本发明中。
如本文所用，“可药用载体”包括任何及所有生理上相容的溶剂、分散介质、衣料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如，通过注射或输注)。取决于给药路径，活性化合物，即抗体、双特异性和多特异性分子，可用保护化合物免受酸及其他可能使化合物失活的天然条件作用的材料进行包衣。
“可药用盐”是指保留亲本化合物的期望生物学活性而不带来任何不期望的毒性效应的盐(参见例如Berge，S.M.，等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及无毒有机酸(例如脂肪族单羧酸和脂肪族二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族磺酸和芳族磺酸等)的那些盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)以及无毒有机胺(例如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些盐。
本发明的组合物可通过多种本领域公知的方法给药。如技术人员将会理解的那样，给药路径和/或给药方式将取决于期望的结果。活性化合物可与防止化合物快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多制备此类制剂的方法被授予专利或是本领域技术人员普遍已知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为通过某些给药路径给药本发明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料包衣化合物，或与该材料共给药化合物。例如，化合物可以在适当的载体例如脂质体或稀释剂中施用于受试者。可药用的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳化剂以及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
可药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。此类介质和试剂用作药物活性物质的用途在本领域已知。除非与活性化合物不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑在本发明药物组合物中使用。增补活性化合物也可掺入到组合物中。
治疗性组合物一般必需是无菌的，并在生产和储存条件下稳定。组合物可以配制为溶液、微乳、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)，及其适宜的混合物。恰当的流动性可例如通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可注射组合物的延时吸收可通过在组合物中纳入延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸盐和明胶。
无菌可注射溶液可通过按需要将处于适当溶剂中的所需量的活性化合物与一种或组合的上文列举的成分掺在一起、接着微滤除菌来制备。一般而言，分散体通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上文列举的那些所需其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从之前的无菌过滤溶液得到活性成分外加任何其他期望成分的粉剂。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个大剂量(bolus)，可以在一段时间给药几个分剂量，或者可以按照治疗情形的紧急情况所指示的那样成比例地降低或增加剂量。例如，本发明基于纤连蛋白的结合分子可以每周一次或两次皮下注射给药，或者每月一次或两次皮下注射。特别有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物，以易于给药和统一剂量。如本文所用的剂量单位形式是指适于作为单个剂量用于待治疗受试者的、物理上离散的单位；每个单位含有经计算可以产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药物载体。本发明剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对配制此类活性化合物用于治疗造成的本领域固有限制。
可药用抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物，本发明的制剂包括适合于口服、鼻腔、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外给药的那些。制剂可以便利地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分量将取决于待治疗的受试者和具体的给药方式。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分量一般是产生治疗效果的组合物的量。一般而言，在100％当中，该量范围将是约0.001％至约90％的活性成分，优选约0.005％至约70％，最优选约0.01％至约30％。
本发明适合于阴道给药的制剂还包括含有本领域已知适当的此类载体的栓剂、棉塞剂、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。用于局部或透皮给药本发明组合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴片和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与可药用的载体、与任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
如本文所用的短语“胃肠外给药”和“经胃肠外给药”表示除消化道和局部给药之外的给药方式，通常通过注射，并且包括，但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、包膜内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本发明的药物组合物中可采用的适宜水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。恰当的流动性例如，可通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂来维持。
这些组合物还可以含有助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物既可以通过同前的灭菌方法、又可以通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂来确保，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可能期望在组合物中纳入等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延时吸收可以通过纳入延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。
当本发明的化合物作为药物对人和动物给药时，它们可以单独地或作为含有例如0.001-90％(更优选0.005-70％，例如0.01-30％)活性成分连同可药用载体的药物组合物给予。
不管选择的给药路径如何，本发明的化合物(其可以以适宜的水合形式应用)和/或本发明的药物组合物均可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于具体的患者、组合物和给药方式而言能有效实现期望治疗反应、而对该患者无毒的活性成分量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药路径，给药时间，所采用具体化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的具体组合物组合应用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健康和既往病史，以及医学领域公知的类似因素。具有本领域普通技术水平的医师或兽医能够容易地确定和开处有效量的所需药物组合物。例如，医师或兽医可以以比为实现期望治疗效果所需低的剂量开始给予用于药物组合物中的本发明化合物，并逐渐增加剂量，直至实现期望的效果。一般而言，本发明组合物适宜的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这样的有效剂量一般将取决于上文所述的因素。优选给药是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，优选在靠近靶部位处给药。如果期望，治疗组合物的有效日剂量可以在一整天以适当的时间间隔分开为两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量来给药，任选以单位剂量的形式。虽说可以单独给药本发明的化合物，但是优选以药物制剂(组合物)形式给药所述化合物。
治疗组合物可用本领域已知的医疗装置给药。例如，在优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针头皮下注射装置给药，例如美国专利No.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所述的装置。公知的可用于本发明的植入物和器件的实例包括：美国专利No.4,487,603，其公开了以可控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利No.4,486,194，其公开了通过皮肤给药药物的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统；以及美国专利No.4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。许多其他此类植入物、递送系统和器件为本领域技术人员已知。
在某些实施方案中，可配制本发明的分子以确保体内恰当的分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果期望的话)，可例如在脂质体中配制之。有关制备脂质体的方法，参见例如U.S.专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可以含有选择性运输到特定细胞或器官中的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。例示性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如授予Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同类型以及所发明分子的组分可以含有在本发明制剂中；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还请参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选的实施方案中，脂质体包括靶向部分。在最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过在靠近肿瘤或感染的部位快速浓注来递送。组合物必须具有达到易于注射程度的流动性。其在制备和储存条件下必需稳定，并且必需防止其遭到微生物如细菌和真菌的污染。
在另一实施方案中，可配制本发明的分子以防止或减小跨胎盘运输。这可通过本领域已知的方法进行，例如通过聚乙二醇化基于纤连蛋白的结合分子。更多参考可见Cunningham-Rundles C，Zhuo Z，Griffith B，Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene-glycolimmunoglobulin conjugates.Resistance to enzymatic degradation.JImmunol Methods.152：177-190；以及Landor M.(1995)Maternal-fetaltransfer of immunoglobulins，Ann Allergy Asthma Immunol 74：279-283。这在基于纤连蛋白的结合分子用于治疗或预防复发性自然流产时尤其相关。
化合物抑制癌症的能力可在能预测人肿瘤中的功效的动物模型系统中进行评价。可选地，组合物的这种特性可通过利用技术人员已知测定法研究化合物抑制的能力、例如体外抑制作用来评价。治疗有效量的治疗化合物能够降低肿瘤大小，或以其他方式缓解受试者症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的个头、受试者症状的严重程度以及所选择的具体组合物或给药路径等因素来确定这样的量。
就组合物可通过注射器递送而言，组合物必需是无菌流动的。除了水，载体可以是等渗缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适宜的混合物。例如，可通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、和氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物纳入延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸铝或明胶。
当活性化合物如上文所述进行了适当的保护时，化合物可以口服给药，例如，用惰性稀释剂或可同化可食用的载体。
治疗和诊断应用
可以构建本文所述的基于纤连蛋白的结合分子以结合任何目的抗原，并且可以修饰之以具有增加的稳定性和半衰期以及其他功能部分。相应地，这些分子可在使用抗体的所有领域中，包括研究、治疗和诊断领域，采用以替代抗体。另外，由于这些分子拥有比抗体优越的溶解性和稳定性特性，本文所述的抗体模拟物还可以在将破坏或失活抗体分子的条件下应用。
例如，可向培养中(例如体外或离体)或受试者(例如体内)中的细胞施用这些分子，以治疗、预防或诊断多种紊乱。如本文所用的术语“受试者”旨在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。当纤连蛋白分子与其他药剂一起给药时，两者可以按任何次序或同时给药。
在一个实施方案中，本发明基于纤连蛋白的结合分子(及其变体、融合物和缀合物)可用来检测该分子所结合的靶标和/或双特异性/多特异性纤连蛋白基结合分子所结合的靶标的水平。例如，这可通过使样品(例如体外样品)和对照样品与所述分子在允许分子和靶标之间形成复合物的条件下接触来实现。检测分子和靶标之间形成的任何复合物，并在样品和对照之间进行比较。例如，可利用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法，如ELISA、FACS和流式细胞计测定法。
同样落在本发明范围内的是试剂盒，其含有本发明的组合物(例如，基于纤连蛋白的结合分子、其变体、融合物和缀合物)和使用说明。试剂盒可进一步含有至少一种其他试剂，或一种或多种本发明的其他纤连蛋白分子(例如，具有互补活性、与区别于第一分子的靶抗原上的表位结合的抗体)。试剂盒一般包括表明试剂盒内含物的目的用途的标签。术语标签包括试剂盒上或与之附随提供的、或以其他方式与试剂盒相伴的任何书面或记录材料。
如上文所述，本发明的分子可以在研究、治疗和诊断领域的所有方面采用。可利用本发明基于纤连蛋白的结合分子(及其变体、融合物和缀合物)治疗的例示性疾病/紊乱包括，但不限于，自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经变性病、精神性疾病、眼科疾病、增生、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、糖尿病、结节病、哮喘、水肿、肺高压、银屑病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、Osler-Webber氏综合症、心肌血管新生、斑块内新生血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张、血友病性关节病、血管纤维瘤、纤维化伴慢性炎症、肺纤维化、淀粉样变、阿尔茨海默氏病、器官移植排斥、深静脉血栓、或创面肉芽(wound granulation)。
一个实施方案中，本发明分子可以用于治疗自身免疫病，例如，急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、Sydenham舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu关节炎、Addison氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture氏综合症、血栓闭塞性脉管炎、Sjogren氏综合症、原发性胆汁性肝硬化、Hashimoto甲状腺炎、甲状腺毒症(即Graves病)、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨(tabes dorsalis)、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病、或致纤维性肺泡炎。
另一实施方案中，本发明分子可以用于治疗癌症。可以靶向的示例性癌症类型包括急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、胆囊癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、神经胶质和其它脑和脊髓肿瘤、和膀胱癌。
另一实施方案中，本发明分子可以用于治疗病原性生物例如细菌、病毒、真菌或单细胞寄生虫感染。可以治疗的示例性真菌包括小孢霉属(Microsporum)、发藓菌属(Trichophyton)、表皮藓菌属(Epidermophyton)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色念珠菌(Candida albican)。示例性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、Sendai病毒、猫白血病病毒、呼肠弧病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小病毒样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、EB病毒、小鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。示例性细菌包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、肺炎军团菌(Legionella pneumophilia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌属物种(Pneumococcus spp.)、流感嗜血杆菌B(Hemophilis influenzae B)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme diseasespirochetes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或支原体属(Mycoplasma)。示例性寄生虫包括兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、贾第虫属物种(Giardia spp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫属物种(Cryptospordium spp.)、棘阿米巴属物种(Acanthamoeba spp.)、耐格里原虫属物种(Naegleria spp.)、利什曼原虫属物种(Leishmania spp.)、结肠小袋虫(Balantidium coli)、伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)、锥虫属物种(Trypanosoma spp.)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、毛滴虫属物种(Trichmonas spp.)、内阿米巴属物种(Entamoeba spp.)、双核阿米巴属物种(Dientamoeba spp.)、巴贝虫属物种(Babesia spp.)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、等孢子球虫属(Isospora spp.)、弓形体属物种(Toxoplasma spp.)、肠上皮细胞微孢子虫属物种(Enterocytozoon spp.)、肺囊虫属物种(Pneumocystis spp.)和小袋虫属物种(Balantidium spp.)。
治疗和诊断应用
可以构建本文所述的基于纤连蛋白的结合分子，以结合任何目的抗原或靶标。此类靶标包括但不限于：簇结构域、细胞受体、细胞受体配体、生长因子、白介素、蛋白质变应原、细菌或病毒(参见例如图7A-C)。还可以修饰本文所述的基于纤连蛋白的结合分子，以具有增加的稳定性和半衰期，以及其他功能部分。相应地，这些分子可在使用抗体的所有领域中采用以替代抗体，包括研究、治疗和诊断领域。另外，由于这些分子拥有比抗体优越的溶解性和稳定性特性，本文所述的抗体模拟物还可以在破坏或失活抗体分子的条件下应用。
本发明进一步通过如下实施例举例说明，其不应阐释为进一步的限制。本申请通篇引述的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确并入本文作为参考。
实施例
所有实施例中使用如下材料和方法，除非另有说明。
材料和方法
一般而言，除非另有说明，本发明的实施采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(特别是例如抗体技术)的常规技术、和多肽制备的标准技术。参见例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning；Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody EngineeringProtocols(Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series，169)，McCafferty编辑，Irl Pr(1996)；Antibodise：A Laboratory Manual，Harlow等，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons(1992)。适合用来实施本发明的其他方法、技术和序列见U.S.专利No.7,153,661；7,119,171；7,078,490；6,703,199；6,673,901和6,462,189。
序列
通篇使用如下序列：
野生型Fn3序列
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)
野生型Fn3序列(RGD至RGA)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：2)
结合TNF的Fn3序列
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
SIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO：3)
结合TNF的Fn3(R18L&I56T)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
STATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO：4)
结合VEGFR的Fn3
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK
PGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO：76)
dsbA信号序列
MKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQID NO：5)
CD33信号序列+结合TNF的Fn3序列
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYR
T(SEQ ID NO：6)
CD33信号序列+结合TNF的Fn3(R18L&I56T)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPPWASTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYR
T(SEQ ID NO：7)
CD33信号序列+野生型Fn3
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
(SEQ ID NO：8)
CD33信号序列+野生型Fn3(RGD变成RGA)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT
(SEQ ID NO：9)
CD33信号序列+结合VEGFR的Fn3
MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPV
QEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ IDNO：77)
结合TNF的纳米抗体
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEIN
TNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRG
QGTQVTVSS(SEQ ID NO：1O)
结合TNF的单域抗体
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLE
TGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO：11)
抗HSA结合剂
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYNMSWVRQAPGKGLEWVSTILP
HGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFD
YWGQGTLVTVSS_(SEQ ID NO：12)
抗MSA结合剂
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQ
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO：13)
抗RSA结合剂
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQ
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYRVPPTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO：78)
人血清白蛋白(HSA)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLLAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC
VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK
DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA
WAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE
NQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYA
EAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSR
NLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESL
VNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHK
PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
(SEQ ID NO：14)
大鼠血清白蛋白(RSA)
EAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCV
ADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKD
DNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKY
NEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKA
WAVARMS QRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCE
NQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAE
AKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVL
AEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAA
RNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSL
VERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHS DICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHK
PKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALA(SEQID NO：79)
hIgG1Fc
KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：15)
引物
(1)5’gggcggaccgatgctcataaatctgaagtcgc3’(F)(SEQ ID NO：16)
(2)5’gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgcaaaccaagtgcggcctgactggccgc3’(R)(SEQID NO：17)
(3)5’cagact agatct gtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(SEQ ID NO：18)
(4)5’cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagttaatgctgatcgg3’(R)(SEQ ID NO：19)
(5)5’cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagttaatgctaatcggtttg3’(R)(SEQ ID NO：20)
(6)5’cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(S EQ ID NO：21)
(7)5’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc3’(R)(SEQ ID NO：22)
(8)5’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(SEQ ID NO：23)
(9)5’cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(SEQ ID NO：24)
(10)5’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc3’(R)(SEQ ID NO：25)
(11)5’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(SEQ ID NO：26)
(12)5’cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(SEQ ID NO：27)
(13)5’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc3’(R)(SEQ ID NO：28)
(14)5’ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(SEQ ID NO：29)
(15)5’cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3’(F)(SEQ ID NO：30)
(16)5’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctgatc3’(R)(SEQ ID NO：31)
(17)5’ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgatagttaatgctaatc3’(R)(SEQ ID NO：32)
(18)5’gggcggaccggcaaatcttgtgacaaaactcacacatgc3’(F)(SEQ ID NO：33)
(19)5’gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgtttacccggagacagggagaggc3’(R)(SEQ IDNO：34)
(20)5’cgtgcgagccagagcattagctcttacctgaactggtatcagcagaaaccg 3’(F)(SEQ ID NO：80)
(21)5’cggtttctgctgataccagttcaggtaagagctaatgctctggctcgcacg 3’(R)(SEQ ID NO：81)
(22)5’cgaaactgctgatttatcgcaacagcccgctgcagagcggtgtgcc 3’(F)(SEQ ID NO：82)
(23)5’ggcacaccgctctgcagcgggctgttgcgataaatcagcagtttcg 3’(R)(SEQ ID NO：83)
(24)5’cctattattgccagcagacttaccgtgttccgccgacctttggccagggcacc 3’(F)(SEQ ID NO：84)
(25)5’ggtgccctggccaaaggtcggcggaacacggtaagtctgctggcaataatagg 3’(R)(SEQ IDNO：85)
(26)5’gggcggaccgaagcacacaagagtgagatcgc 3’(F)(SEQ ID NO：86)
(27)5’gggtttaaacgggccctctagatcatcaatgatgatgatgatggtgggctaaggcttctttgcttctagc 3’(R)(SEQ ID NO：87)
(28)5’atggattccaaaacgccgttctggttcgatacacc 3’(F)(SEQ ID NO：88)
(29)5’ggtgtatcgaaccagaacggcgttttggaatccat 3’(R)(SEQ ID NO：89)
(30)5’accaaattggcaacagacgtcaccaaaatcaacaagg 3’(F)(SEQ ID NO：90)
(31)5’ccttgttgattttggtgacgtctgttgccaatttggt 3’(R)(SEQ ID NO：91)
实施例
实施例1
CDR移植
利用计算模建，将来自结合TNF的纳米抗体(SEQ ID NO：10)的CDR环1(SGFTFSDYWM-SEQ ID NO：35)和环3(RSPSGFNR-SEQ ID NO：36)移植到野生型人纤连蛋白III型组件第10结构域(“10Fn3”或“野生型Fn3”)的构架上。结合TNF的纳米抗体和野生型Fn3分子的氨基酸序列如下：
结合TNF的纳米抗体(SEQ ID NO：10)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEIN
TNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSG
FNRGQGTQVTVSS
野生型Fn3(SEQ ID NO：1)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
利用相同的方法，将来自结合TNF的单域抗体(SEQ ID NO：40)的CDR环1(SQAIDSY-SEQ ID NO：38)和环3(QVVWRPFT-SEQ ID NO：39)移植到野生型Fn3上。结合TNF的单域抗体的氨基酸序列如下：
结合TNF的单域抗体(SEQ ID NO：40)
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Asp SerTyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Leu Pro Glu Asp Phe Ala
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro PheThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
Glu Ile Lys Arg
然后优化下文所示形式的DNA序列以在大肠杆菌中表达，并在德国Geneart AG公司制备。所得的DNA片段用NdeI/BamHI消化，并连接至pET9a的相应位点(适当的侧翼DNA序列被添加到如下形式中)。
形式：
1)具有来自结合TNF的纳米抗体的CDR1和CDR3环的野生型Fn3-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPG
SKSTATISGLKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO：41)
2)具有来自结合TNF的纳米抗体的CDR1和CDR3环的野生型Fn3-His标签(pET9a)，其中从该序列中去除了头8个氨基酸
EVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISG
LKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO：42)
3)具有来自结合TNF的单域抗体的CDR1和CDR3环的野生型Fn3-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLlSWDASQAlDSYYRlTYGETGGNSPVQEFTVPGSKS
TATISGLKPGVDYTITVYQVVWRPFTPISINYRTHHHHHH(S EQ ID NO：43)
4)具有来自结合TNF的单域抗体的CDR1和CDR3环的野生型Fn3-His标签(pET9a)，其中从该序列中去除了头8个氨基酸
EVVAATPTSLLISWDASQAIDSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKP
GVDYTITVYQVVWRPFTPISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO：44)
利用连接混合物转化XL1-Blue或DH5α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测序来验证。构建体在包括BL21(DE3)在内的若干大肠杆菌菌株中表达。在诱导和表达之后，细胞沉淀冷冻在-20℃，然后重悬于裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、10mM咪唑、500mM NaCl、每50ml缓冲液1片无EDTA的Complete(Roche)、2mM MgCl2、10U/ml Benzonase(Merck)[pH7.4]中。细胞在冰上超声破碎并离心。上清液过滤，并上样到Ni-NTA柱上。柱用洗涤缓冲液(同裂解缓冲液，但具有20mM咪唑)洗涤，然后用洗脱缓冲液(同裂解缓冲液，但高达500mM咪唑)洗脱。样品在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra-15管中浓缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用10mM Tris或PBS洗脱。样品再次在Bis-Tris凝胶上分析。
实施例2
鉴定纤连蛋白分子内用于氨基酸修饰的位置
基于对野生型Fn3序列的检查，鉴定了作为进行氨基酸修饰的潜在位点的位置，所述修饰为例如用半胱氨酸或非天然氨基酸残基进行取代以促进聚乙二醇化。例如，如下所述分析了丝氨酸残基。总共11个丝氨酸残基，在下面的序列中以下划线标出；还参见图1，其显示了野生型Fn3分子，其中丝氨酸残基以枝杈表示。
野生型Fn3
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)
分析中排除了靠近结合表面的丝氨酸残基，例如属于N-末端区域并还与FG和BC环接触的Ser 2(在下面的序列中以下划线标出的Ser残基)。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)
Ser 53-Ser 55——这些残基属于DE环(在下面以下划线标出)。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)
Ser 81-Ser 84-Ser 85——这些残基属于FG环(在下面以下划线标出)。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)
进行修饰的候选丝氨酸包括：Ser 17-Ser 21-Ser 43-Ser 60-Ser89。这些丝氨酸残基均暴露于溶剂，并且除Ser 43之外，它们都是β链的一部分(见图2)。
Ser 17和Ser21分别位于B链的起点和末端。Ser 60位于E链的末端。
Ser 21和Ser 60位于两个相邻的链上，所述两链形成纤连蛋白的三链片层。
Ser 89位于G链的中部，G链也是形成4链片层的最后一条链。相应地，Ser 89也暴露于溶剂，并且是外部分子可及的。
Ser 43位于分子底部，属于CD环，处于朝向溶剂弯曲的环末端(见图2)。
用于潜在修饰位点的其他残基包括位于β链上并暴露于溶剂的如下残基：V11-L19-T58-T71(在下面的序列中以下划线标出)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)
参照图3，显示了三链片层(链A-B-E)。片层底部分布着候选残基Ser17和Ser 60。候选残基Ser 21位于顶部。Ser 55已经排除，因其靠近结合表面。
位于靠近A链起点的缬氨酸11似乎在纤连蛋白组件序列中并不保守。
位于B链中部的亮氨酸19也不是保守位置。
苏氨酸58位于E链末端。
参照图4(支架另一侧；4链片层)，苏氨酸71的定位靠近Ser 89。此位置也不保守。需要注意的是，纤连蛋白分子的这部分形成一种“C”结构。FG环和CD环彼此相望(见图5)。
视与分子相连的PEG分子的大小而定，分子该侧可能不易于聚乙二醇化。
实施例3
Fn3序列的聚乙二醇化
结合TNF的Fn3(SEQ ID NO：3)、结合TNF的Fn3(R18L&I56T)(SEQ ID NO：4)、野生型Fn3(SEQ ID NO：1)和野生型Fn3(RGD至RGA)(SEQ ID NO：2)的聚乙二醇化利用(1)半胱氨酸和(2)非天然氨基酸如下进行，以增加Fn的半衰期。
结合TNF的Fn3
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
SIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO：3)
结合TNF的Fn3(R18L&I56T)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
STATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO：4)
野生型Fn3
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)
野生型Fn3序列(RGD至RGA)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：2)
利用半胱氨酸聚乙二醇化
优化对应于前述结合TNF的Fn3和野生型Fn3序列的DNA序列，以在大肠杆菌中表达，并在德国Geneart AG公司制备。为插入C-末端半胱氨酸残基，结合TNF的序列利用引物6(SEQ ID NO：21)和7(SEQ IDNO：22)扩增，而野生型序列利用引物6(SEQ ID NO：21)和8(SEQ IDNO：23)扩增(参见上文材料和方法章节所述的引物)。PCR产物用NdeI/BamHI消化，并克隆至pET9a的相应位点。另外，结合TNF的序列还利用引物9(SEQ ID NO：24)和10(SEQ ID NO：25)扩增，而野生型序列利用引物9(SEQ ID NO：24)和11(SEQ ID NO：26)扩增。PCR产物用BamHI/HindIII消化，并克隆至带有dsbA信号序列的pQE-80L的相应位点。
形式：
1)结合TNF的Fn3序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
SIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH
(SEQ ID NO：48)
2)结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
STATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH
(SEQ ID NO：49)
3)野生型Fn3序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH
(SEQ ID NO：50)
4)野生型Fn3(RGD至RGA)序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH
(SEQ ID NO：51)
4)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASLATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO：52)
5)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO：53)
6)dsbA信号序列-野生型Fn3序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPI
SINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQIDNO：54)
7)dsbA信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-3xA接头-C-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPI
SINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO：55)
8)野生型Fn序列-(RGD至RGA)His标签(pET9a)
MVS DVPRDLEVVAATPTS LLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGS
KSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTHHHHHH(SEQ IDNO：37)
利用连接混合物转化XL1-Blue或DH5α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测序来验证。构建体在包括KS474、TG1(-)和BL21(DE3)在内的若干大肠杆菌菌株中表达。在诱导和表达之后，细胞沉淀冷冻在-20℃，然后重悬于裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、10mM咪唑、500mM NaCl、每50ml缓冲液1片无EDTA的Complete(Roche)、2mM MgCl2、10U/ml Benzonase(Merck)[pH7.4]中。细胞在冰上超声破碎并离心。上清液过滤，并上样到Ni-NTA柱上。柱用洗涤缓冲液(同裂解缓冲液，但具有20mM咪唑)洗涤，然后用洗脱缓冲液(同裂解缓冲液，但高达500mM咪唑)洗脱。样品在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra-15管中浓缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用PBS[pH6.5-7.2]洗脱(有时在凝胶过滤之前应用温和还原)。样品再次在Bis-Tris凝胶上分析。纯化的蛋白质补充DTT(终浓度10μM)，然后通过Amicon Ultra-4管，100k过滤以除去内毒素。使用HiTrap脱盐柱去除DTT。样品于pH 5.5的50mM MES缓冲液中，在室温与5-10摩尔过量的PEG-马来酰亚胺偶联约4小时，通过SDS-PAGE和MS分析聚乙二醇化的效率。通过HiTrap-SP-FF柱、接着用PBS或Tris透析而除去过量的PEG。与相应抗原的结合通过ELISA来验证。PEG化位点通过还原、烷基化和胰蛋白酶消化来确定。100μg样品干燥，于100μl终体积中与6.4M尿素、0.32M NH4CO3及0.01M DTT在50℃于氩气下温育30分钟，然后加入IAA(0.03M)，室温暗中温育15分钟。样品脱盐、干燥、然后于50μl终体积中与0.8M尿素、0.04M NH4CO3、0.02M Tris，pH10及1μg胰蛋白酶温育，并通过LC-MS分析。
在体内测定这些构建体的半衰期。每种化合物10mg/kg通过静脉内施用给Lewis大鼠(n＝3)，于给药前、1、2、4、8、24、48、96、192和384小时取样。使用CM5芯片和标准胺偶联进行Biacore分析。流室(flow cell)1为空白(用EDC/NHS进行表面活化，随后用乙醇胺失活)，用于参照扣除。流室2用THE抗HIS mAb(GenScript Corp)包被，用于PK读出。流室3和4用施用给动物的化合物包被(表面饱和)，用于免疫原性读出。大鼠血清样品用HBS-EP和NBS还原剂(Biacore；终浓度1mg/ml)1∶8稀释。制备标准曲线用于化合物定量，在大鼠血清(GeneTex)中制备施用给动物的相应化合物的1∶2稀释系列，从20mg/l向下至0.078mg/l。大鼠血清用HBS-EP和1mg/ml NSB还原剂1∶8稀释。使用XLfit 4.2拟合标准曲线数据，用于计算血清样品中的化合物浓度(PK)。使用WinNonlin软件计算了化合物半衰期。使用非房室模型拟合PK数据。
野生型10Fn3(RGD至RGA)和野生型10Fn3(RGD至RGA)cys在大肠杆菌中表达、纯化并用SDS PAGE分析(图8a)。除了单体外，还观察到该半胱氨酸变体的二聚体。LC-MS显示了未修饰物的质量为10.85kDa，而半胱氨酸变体的质量为11.38kDa，这些分子量相应于预期的蛋白质(数据未显示)。
野生型10Fn3(RGD至RGA)cys用30kDa PEG-马来酰亚胺修饰。图8b通过SDS-PAGE显示存在PEG化蛋白质，这进一步通过MALDI-TOF MS得到证实。该PEG化样品显示出42.8kDa的MW，由于PEG导致了宽峰。PEG化位点通过对还原、烷基化和胰蛋白酶消化的PEG化和非PEG化样品进行LC-MS分析而确定(数据未显示)。比较肽图谱显示，在PEG化样品中缺了在RT 10.89min的峰。该肽具有1527.7Da的单种同位素MW，相应于预期蛋白质的T[95-108]H(于位置99含有半胱氨酸的肽)(数据未显示)。
体内数据显示，PEG化野生型10Fn3(图10)与未修饰的10Fn3(图9)比较具有显著半衰期改善。未修饰的10Fn3的平均半衰期为0.52h，而对于PEG化10Fn3这增加至3.6h(图11)。使用动物EV3不能检测到信号。
该大鼠研究的结果说明，当制备为PEG化缀合物时，纤连蛋白(10Fn3)的体内血清半衰期可以显著地延长。
可以使用以下公式，将来自此大鼠研究的体内半衰期结果外推至人：
公式1
t 1 / 2 human ≈ ( 70 kg 0.240 kg ) 0.25 t 1 / 2 rat ≈ 4.13 × t 1 / 2 rat
其中，指数0.25是经验性的，为具有相似清除机制的物种提供外推的良好基础。参见例如，West等(1997)Science 276：122-126；Bazin-Redureau等(1998)Toxicology and applied pharmacology 150：295-300；和Dedrick(1973)J.Pharmacokinetics and Biopharmaceuticals 5：435-461。
使用公式1，外推的在人中的平均半衰期预期为大约14.9小时。
可以通过用缀合的Fn3分子的平均半衰期除于未缀合的Fn3分子的平均半衰期，计算缀合的Fn3分子的平均半衰期增加倍数。例如，用平均Fn3-PEG缀合物(3.6)除于平均未缀合的Fn3(0.52)，得到PEG-Fn3缀合物体内半衰期的大约7倍增加。
利用非天然氨基酸聚乙二醇化
优化对应于结合TNF的Fn3(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)和野生型Fn3(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)序列的DNA序列，以在大肠杆菌中表达，并在德国Geneart AG公司制备。为插入C-末端琥珀密码子，结合TNF的序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)利用引物12(SEQ ID NO：27)和13(SEQ ID NO：28)扩增，而野生型序列(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2)利用引物12(SEQ ID NO：27)和14(SEQ ID NO：29)扩增。PCR产物用NdeI/BamHI消化，并克隆至pET9a的相应位点。另外，结合TNF的序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)还利用引物15(SEQ ID NO：30)和16(SEQ ID NO：31)扩增，而野生型序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)利用引物15(SEQ ID NO：30)和17(SEQ ID NO：32)扩增。PCR产物用BamHI/HindIII消化，并克隆至带有dsbA信号序列的pQE-80L的相应位点。
形式：
1)结合TNF的Fn3序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
SIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAA*AAAHHHHHH
(SEQ ID NO：56)
2)结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWA
STATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAA*AAAHHHHHH
(SEQ ID NO：57)
3)野生型Fn3序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAA*AAAHHHHHH
(SEQ ID NO：58)
4)野生型Fn3(RGD至RGA)序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pET9a)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAA*AAAHHHHHH
(SEQ ID NO：59)
5)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASLATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTAAA*AAAHHHHHH(SEQ ID NO：60)
6)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTAAA*AAAHHHHHH(SEQ ID NO：61)
7)dsbA信号序列-野生型Fn3序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPI
SINYRTAAA*AAAHHHHHH(SEQ ID NO：62)
8)dsbA信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-3xA接头-琥珀密码子-3xA接头-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPI
SINYRTAAA*AAAHHHHHH(SEQ ID NO：63)
＊表示非天然氨基酸的位置
利用连接混合物转化XL1-Blue或DH5α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测序来验证。共转化上述构建体和pAmber-AcPheRS，并在包括KS474、TG1(-)、BL21(DE3)和DH10B在内的若干大肠杆菌菌株中表达，培养基含有1mM对乙酰-L-苯丙氨酸。在诱导和表达之后，细胞沉淀冷冻在-20℃，然后重悬于裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、10mM咪唑、500mMNaCl、每50ml缓冲液1片无EDTA的Complete(Roche)、2mM MgCl2、10U/ml Benzonase(Merck)[pH7.4]中。细胞在冰上超声破碎并离心。上清液过滤，并上样到Ni-NTA柱上。柱用洗涤缓冲液(同裂解缓冲液，但具有20mM咪唑)洗涤，然后用洗脱缓冲液(同裂解缓冲液，但高达500mM咪唑)洗脱。样品在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra-15管中浓缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用10mM Tris洗脱。样品再次在Bis-Tris凝胶上分析。纯化的蛋白质用100mM乙酸钠pH5.5透析，并在室温与5-10摩尔过量的PEG-酰肼偶联约2小时。通过SDS-PAGE和SEC分析聚乙二醇化的效率。然后用浓缩的Tris增加pH，并通过Ni-NTA层析、接着用PBS或Tris透析而除去过量的PEG。
实施例4
Fn3序列的血清白蛋白(HSA)融合物
纤连蛋白-血清白蛋白融合分子利用上文所述的结合TNF的Fn3序列(SEQ ID NO：3)、结合TNF的Fn3(R18L&I56T)(SEQ ID NO：4)、野生型Fn3序列(SEQ ID NO：1)、野生型Fn3(RGD至RGA)(SEQ ID NO：2)或结合VEGFR的Fn3(SEQ ID NO：76)组合抗HSA(SEQ ID NO：12)、抗MSA(SEQ ID NO：13)、抗RSA结合分子(SEQ ID NO：78)、RSA(SEQ IDNO：79)或HSA(SEQ ID NO：14)来制备。
(i)抗HSA、抗MSA或抗RSA融合分子
优化用于抗HSA结合剂(SEQ ID NO：12)或抗MSA结合剂(SEQ IDNO：13)的DNA序列，以在大肠杆菌中表达，并在德国Geneart AG公司制备。所得的DNA片段利用BamHI/HindIII连接至带有dsbA信号序列的pQE-80L中(添加了适当的侧翼DNA序列)。优化对应于结合TNF的Fn3序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)和野生型Fn3序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)的DNA序列，以在大肠杆菌中表达，并在德国GeneartAG公司制备。对于结合TNF的Fn3序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，所得的DNA片段利用引物3(SEQ ID NO：18)和4(SEQ ID NO：19)扩增，而对于野生型序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)利用引物3(SEQID NO：18)和5(SEQ ID NO：20)扩增，用BglII/BamHI消化，并连接至pQE-80L-dsbA-抗HSA或pQE-80L-dsbA-抗MSA的BamHI位点。从pQE-80L中的野生型Fn3(RGD至RGA)-GS接头-抗MSA His(SEQ IDNO：71)，通过定点诱变，制备了野生型Fn3(RGD至RGA)-GS接头-抗RSA His(SEQ ID NO：92)。第一个诱变，IKHLK至SSYLN，使用引物20(SEQ ID NO：80)和21(SEQ ID NO：81)进行；第二个诱变，GASR至RNSP，使用引物22(SEQ ID NO：82)和23(SEQ ID NO：83)进行；第三个诱变，GARWPQ至TYRVPP，使用引物24(SEQ ID NO：84)和25(SEQ ID NO：85)进行。
形式：
1)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3序列-GS接头-抗HSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYN
MSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(SEQ ID NO：64)
2)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-GS接头-抗HSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYN
MSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(SEQ ID NO：65)
3)dsbA信号序列-野生型Fn3序列-GS接头-抗HSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYN
MSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(SEQ ID NO：66)
4)dsbA信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-GS接头-抗HSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEYN
MSWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSHHHHHH(SEQ ID NO：67)
5)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3序列-GS接头-抗MSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLK
WYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ
QGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(SEQ ID NO：68)
6)dsbA信号序列-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-GS接头-抗MSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYR
ITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLK
WYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ
QGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(SEQ ID NO：69)
7)dsbA信号序列-野生型Fn3序列-GS接头-抗MSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLK
WYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ
QGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(SEQ ID NO：70)
8)dsbA信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-GS接头-抗MSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKHLK
WYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ
QGARWPQTFGQGTKVEIKRHHHHHH(SEQ ID NO：71)
9)dsbA信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-GS接头-抗RSA-His标签(pQE-80L)
MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPI
SINYRTGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLN
WYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ
QTYRVPPTFGQGTKVEIKRHHHHHH(SEQ ID NO：92)
利用连接混合物转化XL1-Blue或DH5α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测序来验证。构建体在包括KS474和TG1(-)在内的若干大肠杆菌菌株中表达。在诱导和表达之后，细胞沉淀冷冻在-20℃，然后重悬于裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、10mM咪唑、500mM NaCl、每50ml缓冲液1片无EDTA的Complete(Roche)、2mM MgCl2、10U/ml Benzonase(Merck)[pH7.4]中。细胞在冰上超声破碎并离心。上清液过滤，并上样到Ni-NTA柱上。柱用洗涤缓冲液(同裂解缓冲液，但具有20mM咪唑)洗涤，然后用洗脱缓冲液(同裂解缓冲液，但高达500mM咪唑)洗脱。样品在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra-15管中浓缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用10mM Tris缓冲液或PBS洗脱。使用100KAmicon离心过滤器除去内毒素。样品再次在Bis-Tris凝胶上并通过LC-MS分析。与相应抗原的结合通过ELISA来验证。在体内测定了这些构建体的半衰期。每种化合物10mg/kg通过静脉内施用给Lewis大鼠(n＝3)，于给药前、1、2、4、8、24、48、96、192和384小时取样。使用CM5芯片和标准胺偶联进行Biacore分析。流室1为空白(用EDC/NHS进行表面活化，随后用乙醇胺失活)，用于参照扣除。流室2用HSA(Fluka)包被，用于PK读出。流室3和4用施用给动物的化合物包被(表面饱和)，用于免疫原性读出。大鼠血清样品用HBS-EP和NBS还原剂(Biacore；终浓度1mg/ml)1∶8稀释。制备标准曲线用于化合物定量，在大鼠血清(GeneTex)中制备施用给动物的相应化合物的1∶2稀释系列，从20mg/l向下至0.078mg/l。大鼠血清用HBS-EP和1mg/ml NSB还原剂1∶8稀释。使用XLfit 4.2拟合标准曲线数据，用于计算血清样品中的化合物浓度(PK)。使用WinNonlin软件计算了化合物半衰期。使用非房室模型拟合PK数据。研究结果描述如下。
(ii)血清白蛋白融合分子
优化对应于CD33SS-结合TNF的Fn3序列(SEQ ID NO：6)、CD33SS-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)(SEQ ID NO：7)、CD33SS-野生型Fn3序列(SEQ ID NO：8)和CD33SS-野生型Fn3(RGD至RGA)(SEQ ID NO：9)的DNA序列，以在哺乳动物细胞中表达，并在德国GeneartAG公司制备。所得的DNA片段利用BlpI/XbaI连接至pRS5a中(载体中添加了适当的侧翼DNA序列如Kozak)。HSA利用引物1(SEQ ID NO：16)和2(SEQID NO：17)(引物2编码His标签)通过PCR扩增，并利用RsrII/XbaI插入到pRS5a(CD33-结合TNF的Fn3序列(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)或CD33-野生型Fn3序列(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9))中。RSA利用引物26(SEQ ID NO：86)和27(SEQ ID NO：87)从载体IRBPp993CO328D(RZPD)PCR扩增，并利用RsrII/XbaI插入到pRS5a-CD33信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)-HSA-His(SEQ ID NO：99)中。使用引物28(SEQID NO：88)和29(SEQ ID NO：89)通过定点诱变并入I431V，使用引物30(SEQ ID NO：90)和31(SEQ ID NO：91)通过定点诱变并入L262V。优化用于结合VEGFR的Fn3(SEQ ID NO：77)的DNA序列用于在哺乳动物细胞中表达，并在GeneartAG德国公司制备。用RsRII/CelII消化该DNA，克隆至pRS5a-CD33信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)-HSA-His(SEQID NO：99)的相应位点中。RSA从载体pRS5a-CD33信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)-RSA-His(SEQ ID NO：100)分离，并通过RsrII/XbaI克隆至pRS5a-CD33信号序列-结合VEGFR的Fn3-HSA-His(SEQ ID NO：101)中。
形式：
1)CD33信号序列-结合TNF的Fn3序列-HSA-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYR
TDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKT
CVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH
KDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK
RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK
AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC
ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNY
AEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK
VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEV
SRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTE
SLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVK
HKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLH
HHHHH(SEQ ID NO：96)
2)CD33信号序列-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-HSA-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYR
TDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKT
CVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH
KDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK
RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK
AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC
ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNY
AEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK
VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEV
SRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTE
SLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVK
HKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLH
HHHHH(SEQ ID NQ：97)
3)CD33信号序列-野生型Fn3序列-HSA-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWDAPAVTVRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPGSKSIATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLLAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC
VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK
DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA
WAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE
NQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYA
EAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSR
NLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESL
VNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHK
PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHH
HHH(SEQ ID NO：98)
4)CD33信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-HSA-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWDAPAVTVRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPGSKSIATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC
VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK
DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA
WAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICE
NQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYA
EAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSR
NLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESL
VNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHK
PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHH
HHH(SEQ ID NO：99)
5)CD33信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-RSA-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT
EAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCV
ADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKD
DNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKY
NEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKA
WAVARMSQRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCE
NQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAE
AKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVL
AEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAA
RNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSL
VERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHK
PKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALAHHHH
HH(SEQ ID NO：100)
6)CD33信号序列-结合VEGFR的Fn3-HSA-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPV
QEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTDAHKSEV
AHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AE
NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLP
RLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTE
CCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARL
SQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISS
KLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVF
LGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP
LVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKV
GSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRP
CFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK
EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH
(SEQ ID NO：101)
7)CD33信号序列-结合VEGFR的Fn3-RSA-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPV
QEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEAHKSEIA
HRFKDLGEQHFKGLVLIAFS QYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENC
DKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQ
RPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCT
ESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMSQ
RFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKL
QACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGT
FLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVLAEFQPLVEE
PKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTK
CCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSAL
TVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLK
TVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALAHHHHHH(SEQ IDNO：102)
利用连接混合物转化XL1-Blue或DH5α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测序来验证。构建体在包括HEK293T、FreeStyleTM293-F、HKB11和HEKEBNA在内的若干细胞系中表达。所有步骤使用‘无’内毒素缓冲液。培养物上清液过滤，并上样到Ni-NTA柱上。柱用洗涤缓冲液(20mMNaH2PO4、20mM咪唑、500mM NaCl、每50ml缓冲液1片无EDTA的Complete(Roche)、2mM MgCl2、10U/ml Benzonase(Merck)[pH7.4])洗涤，然后用洗脱缓冲液(同洗涤缓冲液，但高达500mM咪唑)洗脱。样品在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra-15管中浓缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用10mM Tris缓冲液或PBS洗脱。样品再次在Bis-Tris凝胶上和通过LC-MS分析。与相应抗原的结合通过ELISA来验证。在体内测定了这些构建体的半衰期。
每种化合物10mg/kg通过静脉内施用给Lewis大鼠(n＝3)，于给药前、1、2、4、8、24、48、96、192和384小时取样。使用CM5芯片和标准胺偶联进行Biacore分析。流室1为空白(用EDC/NHS进行表面活化，随后用乙醇胺失活)，用于参照扣除。流室2用THE抗HIS mAb(GenScriptCorp)包被，用于PK读出。流室3和4用施用给动物的化合物包被(表面饱和)，用于免疫原性读出。大鼠血清样品用HBS-EP和NBS还原剂(Biacore；终浓度1mg/ml)1∶8稀释。制备标准曲线用于化合物定量，在大鼠血清(GeneTex)中制备施用给动物的相应化合物的1∶2稀释系列，从20mg/l向下至0.078mg/l。该大鼠血清用HBS-EP和1mg/ml NSB还原剂1∶8稀释。使用XLfit 4.2拟合标准曲线数据，用于计算血清样品中的化合物浓度(PK)。使用WinNonlin软件计算了化合物半衰期。使用非房室模型拟合PK数据。
野生型10Fn3(RGD至RGA)-RSA和HSA融合物在哺乳动物中表达、纯化并通过SDS-PAGE分析(图12)。对于还原后野生型10Fn3(RGD至RGA)-RSA和野生型10Fn3(RGD至RGA)-HSA，LC-MS分别显示76.62kDa和77.17kDa的质量，相应于正确的蛋白质(数据未显示)。N端分析也显示相应于预期蛋白质的序列。体内数据显示，相对于未修饰的10Fn3(图9)，野生型10Fn3(RGD至RGA)-RSA和HSA融合物均有显著的半衰期改善(图13和14)。未修饰的10Fn3的平均半衰期为0.52h，对于10Fn3-RSA这增加至19.6h，而对于10Fn3-HSA增加至5.9h(图15)。在大鼠中与10Fn3-RSA相比，10Fn3-HSA的半衰期较短。这可能是因为HSA可能不能有效地结合Lewis大鼠FcRn。
使用公式1，外推的在人中的平均半衰期预期为大约80.9小时。
缀合RSA的Fn3分子的平均半衰期增加倍数为平均Fn3-RSA缀合物(19.6)除于平均未缀合Fn3(0.52)，得到Fn3-RSA缀合物的体内半衰期有大约38倍增加。预期这可以使用HSA在人中实现外推。
结合VEGFR的Fn3-RSA和HSA融合物也在哺乳动物中表达、纯化并通过SDS-PAGE分析(图16)。对于结合VEGFR的Fn3-RSA和结合VEGFR的Fn3-HSA，LC-MS分别显示76.27kDa和76.82kDa的质量，这些分子量相应于预期的蛋白质(数据未显示)。对于HSA和RSA融合物，均通过ELISA验证了与hVEGFR的特异性结合(图17)。对于RSA(图18)和HSA(图19)融合物，平均半衰期分别为41.6h和15.3h(图20)。
使用治疗性Fn3，例如结合VEGFR的Fn3-RSA，外推的在人中的平均半衰期预期为大约172小时。
该缀合的Fn3分子的平均半衰期增加倍数为平均VEGFR结合性Fn3-RSA缀合物(41.6)除于平均未缀合Fn3(0.52)，得到该Fn3-RSA缀合物的体内半衰期大约80倍的增加。预期这可以使用HSA在人中实现外推(数据未显示)。
野生型10Fn3(RGD至RGA)-抗RSA在大肠杆菌中表达、纯化并通过SDS-PAGE分析(图21)。LC-MS显示23.68kDa的质量，相应于正确的蛋白质(数据未显示)。体内数据显示，相对于未修饰的10Fn3(图9)，该抗RSA融合物有显著的半衰期改善(图22)。未修饰的10Fn3的平均半衰期为0.52h，对于10Fn3-抗RSA这增加至7.7h(图23)。
该大鼠研究的结果说明，当制备为与血清白蛋白或与血清白蛋白结合剂的融合物时，10Fn3的体内血清半衰期可以被显著地延长。
使用公式1，外推的在人中的平均半衰期预期为大约31.8小时。
缀合抗HSA的Fn3分子的平均半衰期增加倍数为平均Fn3-抗HSA缀合物(7.7)除于平均未缀合Fn3(0.52)，得到Fn3-抗HSA缀合物的体内半衰期大约15倍的增加。
实施例5
Fc-纤连蛋白融合物
优化对应于CD33SS-结合TNF的Fn3序列(SEQ ID NO：6)、CD33SS-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)(SEQ ID NO：7)、CD33SS-野生型Fn3序列(SEQ ID NO：8)和CD33SS-野生型Fn3(RGD至RGA)(SEQ ID NO：9)的DNA序列，以在哺乳动物细胞中表达，并在德国GeneartAG公司制备。所得的DNA片段利用BlpI/XbaI连接至pRS5a中(载体中添加了适当的侧翼DNA序列如Kozak)。hIgG1Fc利用引物18(SEQ ID NO：33)和19(SEQ ID NO：34)(引物19编码His标签)通过PCR扩增，并利用RsrII/XbaI插入到pRS5a(CD33-结合TNF的Fn3序列(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)或CD33-野生型Fn3序列(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9))中。
形式：
1)CD33信号序列-结合TNF的Fn3序列-Fc-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYR
TGKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(SEQ ID NO：72)
2)CD33信号序列-结合TNF的Fn3(R18L&I56T)序列-Fc-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYR
TGKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(SEQ ID NO：73)
3)CD33信号序列-野生型Fn3序列-Fc-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
GKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(SEQ ID NO：74)
4)CD33信号序列-野生型Fn3(RGD至RGA)序列-Fc-His标签(pRS5a)
MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGE
TGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT
GKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH(SEQ ID NO：75)
利用连接混合物转化XL1-Blue或DH5α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测序来验证。构建体在包括HEK293T、FreeStyleTM293-F、HKB11和HEKEBNA在内的若干细胞系中表达。所有步骤使用‘无’内毒素的缓冲液。培养物上清液过滤，并上样到蛋白质A琼脂糖柱上。柱用PBS洗涤，然后用50mM柠檬酸盐，pH2.7，140mM NaCl洗脱。中和样品，并在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra-15管中浓缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用10mM Tris缓冲液或PBS洗脱。样品再次在Bis-Tris凝胶上和通过LC-MS分析。为了还原和N-去糖基化，样品(34μg)在50μl终体积中与0.8M尿素、0.04M NH4CO3和0.01M DTT于50℃温育30分钟。然后加入1x反应缓冲液G7和1μg PNGaseF，37℃温育1h。除了蛋白A纯化外，还如前面实施例所述进行Ni-NTA纯化。与相应抗原的结合通过ELISA验证。
在体内测定了这些构建体的半衰期。每种化合物10mg/kg通过静脉内施用给Lewis大鼠(n＝3)，于给药前、1、2、4、8、24、48、96、192和384小时取样。使用CM5芯片和标准胺偶联进行Biacore分析。流室1为空白(用EDC/NHS进行表面活化，随后用乙醇胺失活)，用于参照扣除。流室2用THE抗HIS mAb(GenScript Corp)包被，用于PK读出。流室3和4用施用给动物的化合物包被(表面饱和)，用于免疫原性读出。大鼠血清样品用HBS-EP和NBS还原剂(Biacore；终浓度1mg/ml)1∶8稀释。制备标准曲线用于化合物定量，在大鼠血清(GeneTex)中制备施用给动物的相应化合物的1∶2稀释系列，从20mg/l向下至0.078mg/l。该大鼠血清用HBS-EP和1mg/ml NSB还原剂1∶8稀释。使用XLfit 4.2拟合标准曲线数据，用于计算血清样品中的化合物浓度(PK)。使用WinNonlin软件计算了化合物半衰期。使用非房室模型拟合PK数据。
野生型10Fn3(RGD至RGA)-Fc在哺乳动物中表达、纯化并通过SDS-PAGE分析(图24)。对于天然野生型10Fn3(RGD至RGA)-Fc，LC-MS显示了不同的形式，76.12kDa质量相应于二聚体、76.28kDa和76.44kDa形式相应于二聚体加己糖。在还原和N-去糖基化后，获得了36.63kDa质量，其相应于预期的单体蛋白质(数据未显示)。由于来自N-去糖基化过程中从Ans至Asp修饰的质量差异，蛋白质的MW在去糖基化后增加。N端分析也显示了相应于预期的蛋白质的序列。
体内数据显示，与未修饰的10Fn3(图9)相比，野生型10Fn3(RGD至RGA)-Fc(图25)有显著的半衰期改善。未修饰的10Fn3的平均半衰期为0.52h，对于10Fn3-Fc(图26)，这增加至9.4h。
该大鼠研究的结果说明，当制备为与hIgG1Fc的融合物时，10Fn3的体内血清半衰期可以被显著地延长。
使用公式1，外推的在人中的平均半衰期预期为大约38.8小时。
融合Fc的Fn3分子的平均半衰期增加倍数为平均Fn3-Fc融合物(9.4)除于平均未缀合的Fn3(0.52)，得到Fn3-Fc融合物体内半衰期的大约18倍增加。
总之，实施例3-5的结果证实，Fn3分子可以通过数种方式，例如HSA、Fc融合而修饰，以增加该分子的半衰期。所有修饰的Fn3分子均显示出半衰期的明显增加。此外，这些实施例也第一次证实，Fn3和修饰形式的Fn3可以成功地在哺乳动物细胞中体内表达，并对清除具有显著的体内影响。
实施例6
嵌合纤连蛋白分子
利用U.S.6,673,901B2中所述的纤连蛋白III型组件和β链序列分析，在此描述了交换纤连蛋白链以产生嵌合Fn3分子的方法。
首先鉴定了结构域7、8、9和10的β链。然后鉴定了参与疏水核心相互作用的残基。然后根据如下标准确定相似性：
(a)链间的相似性；
(b)仅定义为参与疏水核心相互作用的位置之间的相似性；和
(c)不参与疏水相互作用但暴露于溶剂的位置之间的相似性。
参照下表，与Fn3第10结构域相比较，显示了相应完整链、仅溶剂暴露残基、仅疏水核心残基之间的同一性和相似性百分比。
表1.
Figure BPA00001211647900721
Figure BPA00001211647900731
基于前述序列同一性/相似性，可行的嵌合体示于图6。
等同物
本领域技术人员将会意识到或者仅仅通过常规实验就能够确认本文所述本发明具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在涵盖在如下权利要求书的范围内。

Claims (62)

1.包含与非Fn3部分连接的基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子的缀合物，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中环区序列结合特异性靶标。
2.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分能够结合第二靶标。
3.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分增加Fn3基结合分子体内施用时的半衰期。
4.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分包含抗体Fc区。
5.权利要求4的缀合物，其中抗体Fc区与Fn3基结合分子融合于选自N末端区和C端末区的区域。
6.权利要求4的缀合物，其中抗体Fc区与Fn3基结合分子融合于选自如下的区域：环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
7.权利要求4的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、或1000倍。
8.权利要求4的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5-30倍。
9.权利要求4的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、85-90小时、90-95小时、95-100小时、100-150小时、150-200小时、200-250小时、250-300小时、350-400小时、400-450小时、450-500小时、500-550小时、550-600小时、600-650小时、650-700小时、700-750小时、750-800小时、800-850小时、850-900小时、900-950小时、950-1000小时、1000-1050小时、1050-1100小时、1100-1150小时、1150-1200小时、1200-1250小时、1250-1300小时、1300-1350小时、1350-1400小时、1400-1450小时、1450-1500小时。
10.权利要求4的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少9.4小时。
11.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分包括血清白蛋白(SA)、或转铁蛋白、或其部分。
12.权利要求11的缀合物，其中血清白蛋白(SA)或其部分是人血清白蛋白(HSA)。
13.权利要求12的缀合物，其中HSA与Fn3基结合分子缀合于选自如下的区域：环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
14.权利要求12的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、或1000倍。
15.权利要求12的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少25-50倍。
16.权利要求12的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、85-90小时、90-95小时、95-100小时、100-150小时、150-200小时、200-250小时、250-300小时、350-400小时、400-450小时、450-500小时、500-550小时、550-600小时、600-650小时、650-700小时、700-750小时、750-800小时、800-850小时、850-900小时、900-950小时、950-1000小时、1000-1050小时、1050-1100小时、1100-1150小时、1150-1200小时、1200-1250小时、1250-1300小时、1300-1350小时、1350-1400小时、1400-1450小时、1450-1500小时。
17.权利要求12的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少19.6小时。
18.权利要求12的缀合物，其中结合血清白蛋白(SA)、或转铁蛋白、或其部分的多肽是抗人血清白蛋白(HSA)多肽或抗转铁蛋白多肽。
19.权利要求18的缀合物，其中抗人血清白蛋白(HSA)多肽或抗转铁蛋白多肽与Fn3基结合分子缀合于选自如下的区域：环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
20.权利要求18的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、或1000倍。
21.权利要求18的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少10-35倍。
22.权利要求18的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、85-90小时、90-95小时、95-100小时、100-150小时、150-200小时、200-250小时、250-300小时、350-400小时、400-450小时、450-500小时、500-550小时、550-600小时、600-650小时、650-700小时、700-750小时、750-800小时、800-850小时、850-900小时、900-950小时、950-1000小时、1000-1050小时、1050-1100小时、1100-1150小时、1150-1200小时、1200-1250小时、1250-1300小时、1300-1350小时、1350-1400小时、1400-1450小时、1450-1500小时。
23.权利要求18的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少7.7小时。
24.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分包含聚乙二醇(PEG)。
25.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于巯基基团或胺基团。
26.权利要求24的缀合物，其中PEG部分通过定点聚乙二醇化与Fn3基结合分子连接。
27.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于Cys残基。
28.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于非天然氨基酸残基。
29.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于Fn3基结合分子中选自如下的区域上：环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
30.权利要求24的缀合物，其中PEG部分具有大约2kDa至大约100kDa的分子量。
31.权利要求24的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、或1000倍。
32.权利要求24的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5-25倍。
33.权利要求24的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、85-90小时、90-95小时、95-100小时、100-150小时、150-200小时、200-250小时、250-300小时、350-400小时、400-450小时、450-500小时、500-550小时、550-600小时、600-650小时、650-700小时、700-750小时、750-800小时、800-850小时、850-900小时、900-950小时、950-1000小时、1000-1050小时、1050-1100小时、1100-1150小时、1150-1200小时、1200-1250小时、1250-1300小时、1300-1350小时、1350-1400小时、1400-1450小时、1450-1500小时。
34.权利要求24的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少3.6小时。
35.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含：与结合抗体Fc区的多肽连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特异性靶标并具有至少9.4小时的血清半衰期。
36.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含：与人血清白蛋白(HSA)部分连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特异性靶标并具有至少19.6小时的血清半衰期。
37.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含：与结合人血清白蛋白(HSA)部分的多肽连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特异性靶标并具有至少7.7小时的血清半衰期。
38.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含：与PEG部分连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特异性靶标并具有至少3.6小时的血清半衰期。
39.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含：与抗FcRn部分连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物在酸性pH以高亲和性而在中性pH以低亲和性与新生儿FcR受体(FcRn)结合。
40.权利要求39的缀合物，其中酸性pH为大约1至大约7。
41.权利要求39的缀合物，其中酸性pH为大约6。
42.权利要求39的缀合物，其中中性pH为大约7至大约8。
43.权利要求39的缀合物，其中中性pH为大约7.4。
44.任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物，其中Fn3结构域来源于至少两种纤连蛋白组件。
45.任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物，其中Fn3结构域来源于至少三种或三种以上纤连蛋白组件。
46.包含编码任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物的序列的核酸。
47.包含与启动子有效连接的权利要求46的核酸的表达载体。
48.包含权利要求47的核酸的细胞。
49.权利要求48的细胞，其中细胞是哺乳动物细胞。
50.权利要求49的细胞，其中哺乳动物细胞是人哺乳动物细胞。
51.权利要求49的细胞，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
52.产生与靶标结合的任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物的方法，包括：表达包含编码任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物的序列的核酸。
53.权利要求52的方法，还包括在哺乳动物细胞中表达该核酸。
54.权利要求53的方法，其中哺乳动物细胞是人哺乳动物细胞。
55.权利要求53的细胞，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
56.包含任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物以及载体的组合物。
57.治疗受试者疾病的方法，所述疾病选自自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经变性病、精神性疾病、眼科疾病、和移植排斥，该方法包括给受试者施用任何前述权利要求的结合分子、缀合物或组合物。
58.在样品中检测蛋白质的方法，包括标记任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物，使标记的结合分子或缀合物与样品接触，和检测结合分子或缀合物与蛋白质之间的复合物形成。
59.包含缀合物的组合物用于治疗疾病的用途，所述疾病选自自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经变性病、精神性疾病、眼科疾病、和移植排斥，其中该缀合物包含与非Fn3部分连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，且其中该缀合物结合特异性靶标，并具有比未缀合的Fn基结合分子大至少3.6倍的半衰期。
60.权利要求59的用途，其中非Fn3部分选自PEG、HSA、抗HSA、和抗体Fc区。
61.组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经变性病、精神性疾病、眼科疾病、和移植排斥，其中所述组合物包含含有与非Fn3部分连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子的缀合物，其中该缀合物结合特异性靶标，并具有比未缀合的Fn基结合分子大至少3.6倍的半衰期。
62.权利要求61的用途，其中非Fn3部分选自PEG、HSA、抗HSA、和抗体Fc区。
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