CN101257926A - G-csf部分与聚合物的轭合物 - Google Patents

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Abstract

提供了G－CSF部分与一种或多种非肽的水溶性聚合物的轭合物。通常，所述非肽的水溶性聚合物是聚(乙二醇)或其衍生物。除了别的以外，还提供了包括轭合物的组合物、制备轭合物的方法以及将包括轭合物的组合物施用于患者的方法。

Description

G-CSF部分与聚合物的轭合物
发明领域
除了别的以外，本发明的一个或多个实施方案通常涉及包括G-CSF部分(即，具有至少一些粒细胞集落刺激因子活性的部分)和聚合物的轭合物。此外，本发明涉及(除了别的以外)包括轭合物的组合物、用于合成轭合物的方法以及施用组合物的方法。
发明背景
人类造血(hematopoeitic)系统的一项重要功能在于更换多种白细胞(包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞/肥大细胞)、红细胞(红血球)和凝块形成细胞(clot-forming cells)(巨核细胞/血小板)。这些特化细胞中的每一种都由位于骨髓中的造血前体细胞形成。称为“集落刺激因子”的特异性激素样糖蛋白控制造血前体细胞的分化和成熟为任何一种特化血细胞。
一种这样的集落刺激因子是粒细胞集落刺激因子或“G-CSF”。如其名称所蕴含的，这种集落刺激因子促进了粒细胞的增殖和分化，尽管G-CSF也能促进其他细胞类型的形成。G-CSF是由多种不同的细胞类型(包括活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、上皮细胞和成纤维细胞)响应细胞因子、免疫和/或炎性刺激而产生的。天然人G-CSF是具有174个氨基酸的糖蛋白，并且根据糖基化的程度可具有多种分子量。人G-CSF的分子量为约19,000。
在药理学上，G-CSF已被施用于接受化疗的癌症患者，使得在这些治疗期间所杀伤的白细胞能被快速地置换。与加速白细胞置换的目标相似，在接受骨髓置换疗法的白血病患者的治疗中施用了G-CSF。已提议诸如加速创伤愈合的G-CSF的另外用途。参见，例如，美国专利第6,689,351号。
与G-CSF疗法相关的一个缺点是频繁的给药。由于G-CSF疗法通常需要每天注射，因此患者不喜欢与这种用药方案相关的不便和不适。加上患者需要频繁地验血以便确定白细胞计数的实际情况(其需要找健康护理医师)，因此许多患者宁愿选择更方便的和/或包括注射次数减少的备选方案。
针对这些问题提出的一种解决方案提供了延长释放形式的G-CSF。例如，美国专利第5,942,253号描述了G-CSF的聚(乳酸羟乙酸共聚物)或其他可生物降解的聚合物的微球。然而，微球的形成是复杂的过程，其需要几个合成步骤。因此，这种延长释放方法具有理想中被避免的合成复杂性。
PEG化或者将聚(乙二醇)衍生物与蛋白质相连已被描述为延长蛋白质体内半衰期从而得到延长的药理活性的方法。例如，美国专利第5,880,255号描述了G-CSF与聚(乙二醇)的轭合物，通过与2，2，2-三氟乙烷磺酸酯衍生的、分子量为5,000道尔顿的直链单甲氧基聚(乙二醇)的反应而生成。
美国专利第6,646,110号描述了某些轭合物，其中G-CSF蛋白质的1至15个氨基酸残基发生改变，所述氨基酸残基包括非多肽部分的连接基团，并且具有至少一个与蛋白质的连接基团相连的非多肽部分。
美国专利第6,166,183号描述了由G-CSF与某些聚合物试剂(如，mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯和某些mPEG三嗪衍生物)反应形成的轭合物。美国专利第6,027,720号也描述了由G-CSF与某些mPEG三嗪衍生物反应形成的轭合物。
两种出版物讨论了某些聚合物试剂与G-CSF的内部半胱氨酸残基的连接。尽管这些方法中描述的共轭方法是不同的，但是每一种方法都具有至少一项显著的缺点。美国专利申请公布文本No.2005/0143563需要相对苛刻的条件，其造成聚集体沉淀。国际专利公布文本No.05/099769描述了需要诱导G-CSF可逆变性的过程。
PEG化的G-CSF的商业产品可以商品名
Figure A20068003222200081
从AmgenInc(Thousand Oaks CA)获得，其为重组甲硫氨酰基人G-CSF(非格司亭)与单甲氧基聚乙二醇的共价轭合物。
尽管有了这些轭合物，但是，仍存在对具有不同结构的其他G-CSF轭合物的需求。
因此，除了别的以外，本发明的一个或多个实施方案涉及这样的轭合物和包括所述轭合物的组合物，以及涉及如本文所描述的方法，这些都被认为是新的而且本领域完全没有提出过。
发明内容
因此，提供了一种轭合物，所述轭合物包括直接或通过间隔部分共价连接于非肽的水溶性聚合物的G-CSF部分。所述轭合物通常作为组合物的一部分提供。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分共价连接于水溶性聚合物的G-CSF前体部分的残基。聚合物的连接位点可位于G-CSF前体部分的任何点，而且可位于所述前体形式在体内裂解后产生活性所必需的部分。此外，聚合物的连接位点可位于前体形式裂解后无G-CSF活性的部分。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括经由G-CSF部分的半胱氨酸残基与G-CSF部分共价相连的水溶性聚合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括具有半胱氨酸残基侧链的G-CSF部分的残基，其中所述半胱氨酸残基侧链直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分连接于水溶性聚合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括具有半胱氨酸残基侧链的G-CSF部分的残基，所述半胱氨酸残基侧链在非轭合形式下不涉及二硫键，其中所述半胱氨酸残基侧链直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分连接于水溶性聚合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括具有半胱氨酸残基侧链的G-CSF部分的残基，所述半胱氨酸残基侧链对应于hG-CSF的第17位氨基酸，其中所述半胱氨酸残基侧链直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分连接于水溶性聚合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括通过酰胺键或仲胺键连接于支链水溶性聚合物的G-CSF部分的残基，其中(i)包括一个或多个原子的任选的间隔部分位于所述酰胺或仲胺键与所述支链水溶性聚合物之间，和(ii)所述支链水溶性聚合物不含有赖氨酸残基。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括经由可降解的键直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分共价连接于水溶性聚合物的G-CSF部分的残基。优选地，所述可降解的键是可裂解降解的键，并且为“无标签”的，其指聚合物从G-CSF部分降解和裂解后，即生成原始或天然的G-CSF部分，而没有与G-CSF部分相连的聚合物试剂的任何另外的原子或残基(即“标签”)。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包括多种轭合物，每种轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分连接于水溶性聚合物的G-CSF部分的残基，其中在所述组合物的全部轭合物中，有低于50％的轭合物为N-末端单PEG化。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种轭合物，所述轭合物包括以下结构：
POLY″-(X2)b-POLY′-(X1)a-(G-CSF)
其中：
POLY″是第二水溶性聚合物(优选支链或直链)；
POLY′是第一水溶性聚合物(优选直链)；
X1存在时，为包括一个或多个原子的第一间隔部分；
X2存在时，为包括一个或多个原子的第二间隔部分；
(b)是0或1；
(a)是0或1；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种用于制备轭合物的方法，所述方法包括在足以得到轭合物组合物的条件下，向G-CSF部分组分添加聚合物试剂组分，所述轭合物组合物包括G-CSF部分的残基直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分共价连接于水溶性聚合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种用于制备轭合物的方法，所述方法包括：在足以得到包括第一轭合物的第一轭合物组合物的条件下，向G-CSF部分组分添加第一聚合物试剂组分，所述第一轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的第一间隔部分共价连接于第一水溶性聚合物的G-CSF部分的残基；和向所述第一轭合物组合物添加第二聚合物试剂组分，从而得到第二轭合物组合物，所述第二轭合物组合物包括第二水溶性聚合物直接或通过包括一个或多个原子的第二间隔部分连接于所述轭合物的所述第一水溶性聚合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种用于制备轭合物的方法，所述方法包括在足以使轭合物形成的条件下，将聚合物试剂与G-CSF部分结合，所述轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分共价连接于水溶性聚合物的G-CSF部分的残基，其中所述G-CSF部分在半胱氨酸残基侧链处共价相连，并且其中所述方法(a)缺少引入变性条件的步骤，和(b)在低于8.5的pH进行或缺少添加洗涤剂的步骤。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种用于将轭合物递送至患者的方法，所述方法包括将组合物施用于所述患者的步骤，所述组合物包括如本文所描述的轭合物，其中所述组合物含有治疗有效量的一种或多种所述轭合物。所述施用轭合物的步骤通过注射(如，肌内注射、静脉内注射、皮下注射，等等)实现。
附图简述
图1是对应于实施例1A制备的组合物的色谱图(plot)。
图2是对实施例1A制备的组合物进行SDS-PAGE分析得到的凝胶样板(copy)。
图3是对应于实施例1A制备的组合物的色谱图。
图4是对应于实施例1B制备的组合物的色谱图。
图5是对实施例1B制备的组合物进行SDS-PAGE分析得到的凝胶样板。
图6是对应于实施例1C制备的组合物的色谱图。
图7是对应于实施例1D制备的组合物的色谱图。
图8是对实施例2A制备的组合物进行SDS-PAGE分析得到的凝胶样板。
图9是对应于实施例2A制备的组合物的色谱图。
图10是对应于实施例2B制备的组合物的色谱图。
图11和图12是对应于实施例3A制备的样品的色谱图。
图13是对应于实施例3B制备的样品的色谱图。
图14是对实施例4和实施例5制备的组合物进行SDS-PAGE分析得到的凝胶样板。
图15显示如实施例4所描述的轭合物的释放曲线图。
图16显示如实施例4所描述的轭合物的水解速率图。
图17显示如实施例5所描述的轭合物的释放曲线图。
图18显示如实施例5所描述的轭合物的水解速率图。
图19是对应于实施例6制备的组合物的色谱图。
图20和图21分别为显示如实施例9所描述的各种PEG-G-CSF轭合物在48小时和72小时的活性曲线图。
图22、图23、图24、图25、图26、图27、图28和图29分别为显示如实施例9所描述的各种PEG-G-CSF轭合物的嗜中性粒细胞反应或白细胞计数的曲线图。
发明详述
在详细地描述本发明的一个或多个实施方案之前，应理解的是本发明不受限于特定的聚合物、合成技术、G-CSF部分等，照这样可以改变。
应注意的是，如本说明书和预期的权利要求所使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数对象，除非上下文以其他方式清楚地指明。因此，例如，所提及的“聚合物”包括一种聚合物和两种或多种相同或不同的聚合物，所提及的“任选的赋形剂”是指一种任选的赋形剂和两种或多种相同或不同的任选的赋形剂，等等。
在描述和要求本发明的一个或多个实施方案的权利时，将依据以下描述的定义使用下列术语。
如本文所使用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”可互换，并且预期包括任何非肽的水溶性聚(环氧乙烷)。通常，依据本发明使用的PEG包括以下结构：“-(OCH2CH2)n-”，其中(n)是2至4000。如本文所使用的PEG还包括“-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)nO-”，其取决于末端氧是否已被置换。应注意，遍及整个说明书和权利要求的术语“PEG”包括具有不同末端基团或“封端”基团等等的结构。术语“PEG”还指含有多数(即大于50％)的-OCH2CH2-重复单元的聚合物。就具体形式而言，PEG可以采用有待在下文更详细描述的多种分子量中的任何数值和结构或几何形状，如“支链”、“直链”、“叉状”、“多官能的”等等。
术语“封端的”和“末端封端的”在本文可互换使用，其指具有封端部分的聚合物的末端或端点。尽管不是必需的，但是所述封端部分通常包括羟基或C1-20烷氧基，更优选C1-10烷氧基，还更优选C1-5烷氧基。因此，封端部分的实例包括烷氧基(如甲氧基、乙氧基和苄氧基)和芳基、杂芳基、环、杂环，等等。必须注意的是，所述封端部分可以包括聚合物中末端单体[如，CH3O(CH2CH2O)n-和CH3(OCH2CH2)n-中的封端部分“甲氧基”]的一个或多个原子。此外，预想了前述每一种形式的饱和、不饱和、取代和未取代的形式。而且，所述封端基团还可以是硅烷。所述封端基团还可以有利地包括可检测的标记物。当聚合物具有包括可检测的标记物的封端基团时，与所述聚合物偶联的聚合物和/或部分(如，活性剂)的数量或位置可以通过采用合适的检测器进行测定。这样的标记物包括，但不限于荧光增白剂、化学发光剂、酶标记中使用的部分、比色部分(如染料)、金属离子、放射性部分等。合适的检测器包括光度计、膜、分光计，等等。所述封端基团还可以有利地包括磷脂。当聚合物具有包括磷脂的封端基团时，其使得所述聚合物和得到的轭合物具有独特的性能。示例性的磷脂包括，但不限于选自称为磷脂酰胆碱的磷脂类别的那些。具体的磷脂包括，但不限于选自由二月桂酰磷脂酰胆碱、二油基磷脂酰胆碱、二棕榈基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山萮炔酰磷脂酰胆碱(behenoylphosphatidylcholine)、花生四烯酸基磷脂酰胆碱(arachidoylphosphatidylcholine)和卵磷脂组成的组的那些。
如本文就聚合物描述的“非天然存在的”，是指自然界中完全不存在的聚合物。但是，本发明非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一个或多个单体或单体的片段，只要整个聚合物结构在自然界中不存在即可。
如“水溶性聚合物”中的术语“水溶性”，是指在室温下可溶于水的任何聚合物。通常，在过滤后，水溶性聚合物透射的光是相同溶液过滤后透射的光的至少约75％，更优选至少约95％。以重量为基础，水溶性聚合物在水中优选溶解至少约35％(按重量计)，更优选在水中溶解至少约50％(按重量计)，还更优选在水中溶解约70％(按重量计)，并且还更优选在水中溶解约85％(按重量计)。但是，所述水溶性聚合物最优选在水中溶解约95％(按重量计)或在水中完全溶解。
本发明上下文中的水溶性聚合物(如PEG)的分子量，可以表示为数均分子量或重均分子量。除非另有说明，本文所有提及的分子量是指重均分子量。数均分子量和重均分子量的测定，均可采用凝胶渗透色谱法或其他的液相色谱技术进行测量。还可以使用其他用于测量分子量值的方法，比如使用端基分析或测定依数性(如，冰点降低、沸点升高或渗透压)来确定数均分子量，或使用光散射技术、超离心法或粘度测定法来确定重均分子量。本发明的聚合物通常为多分散(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，其所具有的低多分散性值优选小于约1.2，更优选小于约1.15，还更优选小于约1.10，仍更优选小于约1.05，最优选小于约1.03。
当术语“活性”或“活化的”与特定的官能团一起使用时，是指容易与另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这与那些为了发生反应而需要强催化剂或极度不切实际的反应条件的基团(即，“非反应性”基团或“惰性”基团)大不相同。
如本文所使用的术语“官能团”或其任何同义词，是指包括其受保护的形式和未受保护的形式。
如本文所使用的术语“间隔部分”、“键”或“连接体”，是指任选用来连接互连部分与G-CSF部分或G-CSF部分的亲电体或亲核体的原子或原子集合，所述互连部分如聚合物片段的末端。所述间隔部分是水解稳定的或者可包括生理上可水解的键或酶可降解的键。
“烷基”是指烃链，其长度范围一般为约1至15个原子。这样的烃链优选但不是必须为饱和的，并且虽然一般优选直链，但是其可以为支链或直链。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基，等等。如本文所使用的“烷基”包括环烷基和含有环亚烷基的烷基。
如通过甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基所示例的，“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的烷基，且可为直链或支链。
“环烷基”是指饱和或不饱和的环状烃链，其包括桥连的、稠合的或螺环化合物，优选由3至约12个碳原子构成，更优选由3至约8个碳原子构成。“环亚烷基”是指通过环状的环系统中的任何两个碳使链键合而插入烷基链的环烷基。
“烷氧基”是指-O-R基团，其中R为烷基或取代的烷基，优选C1-6烷基(如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
例如，在“取代的烷基”中的术语“取代的”，是指使用一个或多个不相互干扰的取代基取代的部分(如烷基)，所述不相互干扰的取代基例如，但不限于：烷基；C3-8环烷基，如环丙基、环丁基等；卤素，如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基；低级苯基；取代的苯基等。“取代的芳基”是指具有一个或多个不相互干扰的取代基的芳基。对于苯环上的取代而言，所述取代基可以是任何取向(即，邻、间或对)。
“不相互干扰的取代基”是指在分子中存在时，通常不与所述分子内含有的其他官能团发生反应的那些基团。
“芳基”是指分别具有5个或6个中心碳原子的一个或多个芳香环。芳基包括多个稠合的芳环(如萘基)或未稠合的芳环(如联苯)。芳环还可以与一个或多个环烃、杂芳基或杂环稠合或不稠合。如本文所使用的“芳基”包括杂芳基。
“杂芳基”是指含有1至4个杂原子的芳基，所述杂原子优选为硫、氧或氮，或其组合。杂芳环还可以与一个或多个环烃、杂环、芳基或杂芳环稠合。
“杂环”或“杂环的”是指5-12个原子，优选5-7个原子的一个或多个环，其具有或没有不饱和现象或芳香特征，且具有至少一个不是碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。
“取代的杂芳基”是指具有一个或多个不相互干扰的基团(如取代基)的杂芳基。
“取代的杂环”是指具有由不相互干扰的取代基形成的一个或多个侧链的杂环。
“亲电体”和“亲电基团”是指可以为离子的、具有亲电中心(即觅电子(electron seeking)的、能够与亲核体反应的中心)的离子或原子或原子集合。
“亲核体”和“亲核基团”是指可以为离子的、具有亲核中心(即觅亲电中心或觅亲电体的中心)的离子或原子或原子集合。
“生理上可裂解的”或“可水解的”或“可降解的”键是指在生理条件下与水反应(即被水解)的键。键在水中水解的倾向不仅取决于连接两个中央原子的键的一般类型，而且取决于连接这些中央原子的取代基。合适的水解不稳定或弱的键包括，但不限于羧酸酯、磷酸酯、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“酶可降解的键”是指经受一种或多种酶降解的键。
“水解稳定的”键(linkage)或键(bond)，是指在水中大体上稳定，即，在延长的时间周期内于生理条件下不会经受任何明显程度水解的化学键，其通常为共价键。水解稳定的键的实例包括，但不限于以下：(如，在脂肪族链中的)碳-碳键、醚、酰胺、氨基甲酸乙酯，等等。一般而言，水解稳定的键是指在生理条件下表现出的水解速率低于约1-2％/天的键。具代表性的化学键的水解速率在大多数标准的化学教科书中均可见到。
“药学上可接受的赋形剂或载体”是指可任选地包括在本发明组合物中且对患者不造成显著毒副作用的赋形剂。本文可互换使用的“药理有效量”、“生理有效量”和“治疗有效量”是指在血流或靶组织中产生期望的轭合物(或相应的非共轭G-CSF部分)水平所需的聚合物-(G-CSF)部分轭合物的量。精确的量取决于多种因素并且基于本文所提供的信息可由本领域技术人员容易地进行确定，所述因素如特定的G-CSF部分、治疗组合物的组分和物理特性、预期的患者群、个体患者的考虑，等等。
“多官能的”是指其中含有三个或多个官能团的聚合物，其中所述官能团相同或不同。本发明的多官能的聚合物试剂通常含有的官能团数目满足以下范围中的一种或多种：约3至100个官能团、3至50个官能团、3至25个官能团、3至15个官能团、3至10个官能团；聚合物试剂内的示例性官能团数目包括3、4、5、6、7、8、9和10个官能团。
如本文所使用的术语“G-CSF部分”，是指具有G-CSF活性的部分，并且除非上下文以其他方式清楚地指明，还指G-CSF前体部分(SEQ ID NO：3所提供的示例性序列)。所述G-CSF部分还具有至少一个适合与聚合物试剂反应的亲电基团或亲核基团。此外，术语“G-CSF部分”包括共轭之前的G-CSF部分和共轭之后的G-CSF部分残基。如同下文将进一步详细解释的，本领域的普通技术人员可以确定任何给定的部分是否具有G-CSF活性。包括对应于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2中任一项的氨基酸序列的蛋白质是G-CSF部分和与其大体上同源的任何蛋白质或多肽，所述与其大体上同源的任何蛋白质或多肽的生物性能造成了类似于G-CSF的生长和/或嗜中性粒细胞数目和/或活性的刺激。如本文所使用的术语“G-CSF部分”包括诸如有意地通过如位点定向诱变或者偶然通过突变进行修饰的蛋白质。这些术语还包括具有1至6个另外的糖基化位点的类似物；在蛋白质的羧基末端具有至少一个另外的氨基酸的类似物，其中所述另外的氨基酸包括至少一个糖基化位点；和具有包括至少一个糖基化位点的氨基酸序列的类似物。这些术语包括天然和重组产生的G-CSF。
术语“大体上同源的”是指特定的受试序列(如突变体序列)具有与参比序列不同的一个或多个置换、缺失或添加，但是所述置换、缺失或添加的净效应不会在所述参比序列和受试序列之间产生不利的功能不相似。出于本发明的目的，认为具有超过95％同源性、生物性能相当和表达特征相当的序列是大体上同源的。为了测定同源性，应忽略成熟序列的平截。具有较低程度同源性、相当的生物活性和表达特征相当的序列被认为是大体上等效的。用于本文的示例性G-CSF部分包括与SEQ ID NO：1大体上同源的那些序列。
术语G-CSF蛋白质的“片段”是指具有G-CSF蛋白质片段一部分的氨基酸序列的任何蛋白质或多肽，并且其具有G-CSF的生物活性。包括蛋白质或多肽的片段由G-CSF蛋白质的蛋白水解降解产生，或者由本领域常规的方法进行化学合成产生。当将蛋白质或片段施用于人而产生某种程度的G-CSF活性时，G-CSF蛋白质或其片段是具有生物活性的。测定G-CSF蛋白质的这种生物活性可通过用于此目的的、常规、公知的检验来在一种或多种哺乳动物上进行。本文描述了可用来证实此类生物活性的合适的检验。
术语“患者”是指患有或倾向于患可通过施用活性剂(如轭合物)来预防或治疗的病征的活生物体，其包括人和动物。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的可发生或可不发生的情况，因而所述描述包括所述情况发生的例子以及所述情况不发生的例子。
“大体上”是指接近全部或完全，例如，满足以下的一种或多种：大于所述条件的50％、51％或更大、75％或更大、80％或更大、90％或更大以及95％或更大。
除非上下文以其他方式清楚地指明，当术语“约”在数值之前时，该数值理解为所述数值的平均值±10％。
肽中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；以及甘氨酸为Gly或G。
转到本发明的一个或多个实施方案，提供了轭合物，所述轭合物包括直接或通过间隔部分共价连接于非肽的水溶性聚合物的G-CSF部分。本发明的轭合物应具有以下的一种或多种特征。
G-CSF部分
如前所述，轭合物一般包括直接或通过间隔部分共价连接于非肽的水溶性聚合物的G-CSF部分。如本发明所使用的术语“G-CSF部分”是指共轭之前的G-CSF部分和连接于非肽的水溶性聚合物之后的G-CSF部分。然而，应理解的是，当G-CSF部分与非肽的水溶性聚合物相连时，所述G-CSF部分因存在与聚合物键合相关的一个或多个共价键而发生轻微的改变。通常，G-CSF部分的这种与另一分子连接的、轻微改变的形式被称为G-CSF部分的“残基”。轭合物中的G-CSF部分可以是任何提供粒细胞集落刺激因子效应的部分。
G-CSF部分可由非重组方法获得或者由重组方法获得，并且本发明在这点上不受到限制。此外，G-CSF部分可源自人来源或源自动物来源。
G-CSF部分可由非重组获得。例如，如美国专利第4,810,643号所描述的，有可能从命名为5637的人癌细胞系培养基收集G-CSF，并在严格条件下保存在美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，Rockville MD)，A.T.C.C.保藏编号为HTB-9。
G-CSF部分可由重组方法获得并可在细菌(如大肠杆菌(E.coli))、哺乳动物(如中国仓鼠卵巢细胞)和酵母(如酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae))表达系统中表达。所述表达可经由外源表达或经由内源表达进行。例如，Nagata等.(1986)Nature 319：415提供了从人鳞状上皮细胞癌细胞系CHU-II分离得到的人G-CSF(″hG-CSF″)的cDNA，并且还描述了用于表达COS细胞(非洲绿猴细胞)中的蛋白质的方法。Souza等人描述了在大肠杆菌细胞中表达G-CSF的方法。美国专利第4,810,643号描述了用于制备甲硫氨酰基G-CSF(即，N末端具有氨基酸甲硫氨酸连接的G-CSF)的基于重组的方法。此外，美国专利第5,633,352号描述了用于制备G-CSF的重组方法。
人G-CSF的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。如SEQ ID NO：1所示，这种序列本文描述的所有其他序列还包括含有甲硫氨酸残基的形式(其中n″′＝1)。SEQ ID NO：2对应于具有与SEQ ID NO：1不同序列的G-CSF部分。
尽管用于制备蛋白质的基于重组的方法可以不同，但是重组方法通常包括构建编码期望的多肽或片段的核酸、将所述核酸克隆到表达载体中、转化宿主细胞(如，植物、细菌、酵母、转基因动物细胞，或哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞或仓鼠婴肾细胞)和表达所述核酸，从而产生期望的多肽或片段。用于在原核宿主细胞和真核宿主细胞中体外产生和表达重组多肽的方法对于本领域的普通技术人员是已知的。
为了促进重组多肽的鉴别和纯化，可将编码附加表位或其他亲和结合序列的核酸序列插入或添加至具有编码序列的框架中，从而产生包括期望的多肽和适于结合的多肽的融合蛋白。融合蛋白可通过以下进行鉴别和纯化：首先使含有所述融合蛋白的混合物流经包括结合部分(如抗体)的亲和柱，所述结合部分针对所述融合蛋白中的附加表位或其他的结合序列，从而将所述融合蛋白结合在柱子内。之后，通过使用合适的溶液(如酸)来洗涤柱子，使其释放出结合的融合蛋白而回收所述融合蛋白。重组的多肽还可通过以下进行鉴别和纯化：溶解宿主细胞、通过如分子排阻色谱来分离所述多肽，和收集所述多肽。用于鉴别和纯化重组多肽的这些方法和其他方法对于本领域的普通技术人员是已知的。然而，在本发明的一个或多个实施方案中，优选地，G-CSF部分并不是融合蛋白的形式。
基于用来表达具有G-CSF活性的蛋白质的系统，G-CSF部分可以是未糖基化的或糖基化的，并且均可使用。换言之，G-CSF部分可以是未糖基化的，或者G-CSF部分可以是糖基化的。在本发明的一个或多个实施方案中，优选的是G-CSF部分是未糖基化的。
为了使聚合物与氨基酸侧链内的原子容易地连接，可将G-CSF部分有利地修饰为包括一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基的例子如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸。此外，可将G-CSF部分修饰为包括非天然存在的氨基酸残基。用于添加氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的技术是本领域普通技术人员所公知的。对J.March，Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure，第4版.(New York：Wiley-Interscience，1992)进行参考。在本发明的一个或多个实施方案中，优选不将G-CSF部分修饰为包括一个或多个氨基酸残基。相对于hG-CSF具有至少一个置换的示例性G-CSF部分示于美国专利第6,646,110号，并且其适合用作本文的G-CSF部分。此外，相对于hG-CSF具有至少一个置换的示例性G-CSF部分示于美国专利第6,004,548和5,580,755号，并且其适合用作本文的G-CSF部分。
此外，可将G-CSF部分有利地修饰为包括官能团的连接(除了通过添加含有官能团的氨基酸残基之外)。例如，可将G-CSF部分修饰为包括巯基。此外，可将G-CSF部分修饰为包括N末端α碳。此外，可将G-CSF部分修饰为包括一个或多个碳水化合物部分。在本发明的一些实施方案中，优选将G-CSF部分修饰为包括巯基和/或N末端α碳。可以使用包括氨氧基(aminoxy)、醛或其他一些官能团的G-CSF部分。
优选的G-CSF部分具有选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的组的氨基酸序列。除非明确指出，如本文所提供的氨基酸残基的所有位置编号的分配基于SEQ ID NO：1(忽略任何前导甲硫氨酰基残基)。可用作G-CSF部分的序列包括存在于商业上可获得的含有G-CSF形式的制剂中的那些蛋白质序列，所述制剂如
Figure A20068003222200221
G-CSF(Amgen，Thousand Oaks，CA)和
Figure A20068003222200222
G-CSF(Dr.Reddy′s，Hyderabad，India)。
可以使用hG-CSF部分(如SEQ ID NO：1所示)和该序列的截短的形式、杂交变体和肽模拟物。任何保持至少某种程度G-CSF活性的前述序列的生物活性片段、缺失的变体、置换的变体或添加的变体也可用作G-CSF部分。
对于任何给定的肽或蛋白质部分，有可能确定该部分是否具有G-CSF活性。例如，如美国专利第5,580,755号所描述的，有可能将感兴趣的G-CSF部分与缓冲液一起施用至仓鼠的血流中，并对粒细胞进行计数。所述感兴趣的G-CSF部分可用作依据本发明的G-CSF部分，如果对仓鼠注射所提议的G-CSF部分，其粒细胞与未使用提议的G-CSF部分注射的对照仓鼠(如，仅为缓冲液)相比，显示出统计学上显著的增加。
水溶性聚合物(如POLY″、POLY′、POLY1、POLY2等)
如先前所讨论的，每种轭合物包括与水溶性聚合物相连的G-CSF部分。就水溶性聚合物而言，所述水溶性聚合物是非肽的、无毒的、非天然存在的和生物相容的。就生物相容性而言，如果通过临床医生(如内科医生)的评价，物质单独使用或与另一种物质(如，诸如G-CSF部分的活性剂)一起使用在活组织(如，施用于患者)方面相关的有益效果优于任何有害的效果，那么就认为该物质是生物相容的。就非免疫原性而言，如果物质在体内的预期使用不产生不期望的免疫反应(如，形成抗体)，或者即使产生免疫反应，这样的反应通过临床医生的评价认为不是临床显著或重要的，那么就认为该物质是非免疫原性的。特别优选的是，所述非肽的水溶性聚合物是生物相容的和非免疫原性的。
此外，所述聚合物的特征通常为具有2至约300个末端。这样的聚合物的实例包括，但不限于聚(烷撑二醇)，如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(″PPG″)、乙二醇和丙二醇的二元共聚物等；聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基异丁烯酸酯)、聚(糖类)、聚(α-羟基乙酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)及任何前述的组合。
所述聚合物不限于特定的结构，并且可为直链的(如烷氧基PEG或双官能PEG)、支链或多臂的(如叉状的PEG或与多元醇中心相连的PEG)和/或树枝状的，其中前述的每种结构可包括不可降解的键或可降解的键。此外，可将所述聚合物的内部结构可以任何数目的不同模式来组织，并且可选自由均聚物、交替的二元共聚物、随机的二元共聚物、嵌段二元共聚物、交替的三聚体、随机的三聚体和嵌段三聚体组成的组。
通常，活化的PEG及其他活化的水溶性聚合物(即，聚合物试剂)是使用适于与G-CSF部分上的期望位点偶联的合适的活化基团进行活化的。因此，聚合物试剂应具有与G-CSF部分反应的反应性基团。用于将这些聚合物与活性部分共轭的代表性聚合物试剂和方法是本领域已知的，并且在Zalipsky，S.等人的“Use of FunctionalizedPoly(Ethylene Glycols)for Modifica
tion of Polypeptides”in Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992)和Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews16：157-182中进一步描述。
通常，轭合物中水溶性聚合物的重均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。然而，示例性范围所包括的重均分子量为：大约5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围、大约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围、大约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、大约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、大约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、大约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围、大约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围、大约35,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围，和大约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围。对于任何给定的水溶性聚合物而言，优选具有这些范围中的一种或多种分子量的PEG。
水溶性聚合物的示例性重均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿和约75,000道尔顿。还可使用具有任何前述的总分子量的支链形式的水溶性聚合物(如，包括两种20,000道尔顿聚合物的、支链的、40,000道尔顿的水溶性聚合物)。在一个或多个实施方案中，轭合物不具有任何直接或间接地与PEG相连的PEG部分，其中所述PEG具有的重均分子量低于约6,000道尔顿。
当用作聚合物时，PEG通常包括多个(OCH2CH2)单体[或(CH2CH2O)单体，其取决于PEG如何定义]。如通篇说明书所使用的，重复单元的数目由“(OCH2CH2)n”中的下标“n”确定。因此，(n)值通常落入以下范围中的一种或多种：2至约3400、约100至约2300、约100至约2270、约136至约2050、约225至约1930、约450至约1930、约1200至约1930、约568至约2727、约660至约2730、约795至约2730、约795至约2730、约909至约2730和约1,200至约1,900。对于任何给定的分子量已知的聚合物而言，有可能通过将所述聚合物的总重均分子量除以重复单体的分子量来确定重复单元(即“n”)的数目。
当需要封端的聚合物时，可以使用至少一个末端被相对惰性的基团，如低级C1-6烷氧基(即使有羟基)封端的聚合物。例如，当所述聚合物为PEG时，优选使用甲氧基-PEG(一般称为mPEG)，其为直链形式的PEG，其中所述聚合物的一个末端具有甲氧基(-OCH3)，而另一个末端为可任选地进行化学修饰的羟基或其他官能团。
在本发明的一个或多个实施方案中有用的一种形式里，游离或未结合的PEG是每个末端使用羟基封端的直链聚合物：
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，
其中(n)的范围一般为0至约4,000。
上述聚合物，即α-，ω-二羟基聚(乙二醇)，可以简单的形式HO-PEG-OH表示，其中应理解的是，-PEG-符号可表示以下的结构单元：
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，
其中(n)如上定义。
在本发明的一个或多个实施方案中有用的另一种PEG类型是甲氧基-PEG-OH或简称mPEG，其中一个末端为相对惰性的甲氧基，而另一个末端为羟基。mPEG的结构在以下给出。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)如上所述。
诸如在美国专利第5,932,462号中描述的那些多臂或支链的PEG分子，也可用作PEG聚合物。例如，PEG可具有以下结构：
Figure A20068003222200251
其中：
polya和polyb是PEG骨架(相同或不同)，如甲氧基聚(乙二醇)；
R″是非反应性部分，如H、甲基或PEG骨架；和
P和Q是非反应性键。在一些例子中，支链的PEG聚合物是甲氧基聚(乙二醇)二取代的赖氨酸(如，包括以下结构的聚合物
Figure A20068003222200261
其中每个n为从3至4,000的整数)。参见，例如，美国专利第5,932,462号。根据所使用的具体G-CSF部分，所述二取代的赖氨酸的反应性酯官能团可被进一步修饰形成适合与G-CSF部分内的靶基团反应的官能团。
此外，PEG可包括叉状的PEG。叉状的PEG的实例由以下结构表示：
Figure A20068003222200262
其中：X是一个或多个原子的间隔部分，每个Z是通过确定长度的原子链与CH相连的活化的端基。美国专利第6,362,254号公开了能够在本发明的一个或多个实施方案中使用的各种叉状的PEG结构。将Z官能团与用作接支基团(tethering group)的分支碳原子相连的原子链可包括，例如烷基链、醚链、酯链、酰胺链，及其组合。
PEG聚合物可包括具有反应性基团(如羧基)的侧链PEG分子，所述反应性基团沿着PEG的长度而不是在PEG链的端部共价相连。侧链的反应性基团可直接或通过间隔部分(如亚烷基)来与PEG相连。
除了以上描述的PEG形式之外，所述聚合物(包括以上描述的聚合物中的任何一种)还可制备成在聚合物中具有一个或多个弱的或可降解的键。例如，可将PEG制备成在聚合物中具有经受水解的酯键。如下所示，这种水解导致聚合物裂解为较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→-PEG-CO2H+HO-PEG-
在聚合物骨架内用作可降解的键的其他水解可降解的键包括：碳酸酯键、由例如胺与醛反应得到的亚胺键(参见，如Ouchi等，(1997)Polymer Preprints 38(1)：582-3)、由例如醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键、通常由酰肼与醛反应形成的腙键、通常由醛与醇之间的反应形成的缩醛键、由例如甲酸盐与醇之间的反应形成的原酸酯键、由例如聚合物(如PEG)端部的胺基与另一PEG链的羧基形成的酰胺键、由例如PEG与末端异氰酸酯基团和PEG醇反应形成的氨基甲酸乙酯键、由例如聚合物(如PEG)端部的胺基与肽的羧基形成的肽键，和由例如聚合物端部的亚磷酰胺基团与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。
轭合物此类任选的特征，即，将一种或多种可降解的键引入聚合物链中，可在所述轭合物施用后提供对最终期望的药理性能的额外控制。例如，可以施用大且相对惰性的轭合物(即，具有一种或多种高分子量PEG链与其相连的轭合物，其中所述轭合物基本上不具有生物活性，所述PEG链如分子量超过约10,000的一种或多种PEG链)，其经水解产生具有一部分原始PEG链的生物活性轭合物。这样，所述轭合物的性能能够被更有效地控制(tailored)，以便平衡所述轭合物随时间的生物活性。
与所述轭合物相关的水溶性聚合物具有可降解的键，以便提供“可裂解的”效应。也就是说，该水溶性聚合物裂解(通过水解、酶过程或其他方式)，从而得到未轭合的G-CSF部分。在一些例子中，可裂解的聚合物在体内脱离G-CSF部分，而不留下任何水溶性聚合物的片段。在其他例子中，可裂解的聚合物在体内脱离G-CSF部分，但留下了相对少的水溶性聚合物片段(如，琥珀酸酯标签)。在两种例子中，结果是轭合物一经施用于患者，提供了随时间的持续释放性能。提供这样持续释放的示例性轭合物是使用经由碳酸酯键或氨基甲酸乙酯键与G-CSF部分相连的聚合物制备而得的轭合物。
在可降解的键是可裂解类型的可降解键的那些例子中，可将本发明的轭合物认为是前药(即使该轭合物在轭合形式时也保持活性)。示例性的可降解和可裂解的键包括羧酸酯、磷酸酯、硫羟酸酯(thiolester)、酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。这样的键可通过使用本领域通常采用的偶联方法来对G-CSF部分(如，蛋白质的C末端羧基，或蛋白质内所含有的氨基酸的侧链羟基，所述氨基酸如丝氨酸或苏氨酸)和/或聚合物试剂进行适当的修饰而容易地制备。然而，最优选的是由适当活化的聚合物与具有G-CSF活性的部分内所含有的未修饰官能团反应而容易形成的可水解的键。
可选地，还可将水解稳定的键用作偶联G-CSF部分的键，所述水解稳定的键如酰胺键、氨基甲酸乙酯(也称为氨基甲酸酯)键、胺键、硫醚(也称为硫化物)键或脲(也称为尿素)键。此外，优选的水解稳定的键是酰胺。在一种方法中，含有活化的酯的水溶性聚合物可与G-CSF部分上的胺基反应，从而得到了酰胺键。在一些实施方案中，优选的键(由此相应的轭合物)缺少
Figure A20068003222200281
部分。在一些实施方案中，优选的键(由此相应的轭合物)缺少由苯基乙二醛封端的聚合物试剂与G-CSF部分反应产生的键。在一些实施方案中，优选的键缺少由卤代乙酰胺封端的聚合物试剂与G-CSF部分反应产生的键。
轭合物(与未轭合的G-CSF部分相对)具有或不具有可测量的G-CSF活性度。也就是说，依据本发明的聚合物-G-CSF部分的轭合物所具有的生物活性为未修饰的母体G-CSF部分活性的约0.1％至约100％。在一些例子中，聚合物-G-CSF部分的轭合物所具有的活性超过未修饰的母体G-CSF部分的100％生物活性。优选地，几乎不具有或不具有G-CSF活性的轭合物包括将聚合物与所述部分相连的可水解的键，以便不论轭合物活性的缺失(或相对缺失)，一经用水诱导可水解的键降解后，即释放出活性的母体分子(或其衍生物)。根据所采用的具有G-CSF活性的特定部分的已知活性，可使用合适的体内或体外模型来测定这样的活性。
对于具有水解稳定的键(其将具有G-CSF活性的部分偶联于聚合物)的轭合物而言，所述轭合物一般具有可测量的生物活性度。例如，这样的轭合物的特征相对于未轭合的G-CSF部分而言，一般为具有满足以下一种或多种百分比的生物活性：至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约100％和大于105％(当在合适的模型中测量时，诸如本领域公知的那些模型)。优选地，具有水解稳定的键(如酰胺键)的轭合物应具有至少某种程度的呈G-CSF活性的未修饰母体部分的生物活性。
本领域的普通技术人员应认识到，前述关于非肽的水溶性聚合物的讨论并非穷尽性的而且只为示例性的，并且其包括具有上述性质的所有聚合物材料。如本文所使用的术语“聚合物试剂”通常是指完整的分子，其可包括水溶性的聚合物片段和官能团。
如上所述，本发明的轭合物包括与G-CSF部分共价连接的水溶性聚合物。一般而言，对于任何给定的轭合物，有1至3个水溶性聚合物与一个或多个具有G-CSF活性的部分共价连接。但是，在一些例子中，所述轭合物具有与G-CSF部分单独连接的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个水溶性聚合物。
现在对依据本发明的示例性轭合物进行描述。在所述轭合物的描述中，对某些氨基酸进行了定位。这样的定位涉及SEQ ID NO：1所示的人G-CSF，并且仅仅是为了方便。本领域的普通技术人员能够容易地确定在具有G-CSF活性的其他部分中的原子或其相应的位置。特别地，本文所提供的天然人G-CSF的描述一般适用于任何前述的片段、缺失的变体、置换的变体或添加的变体。
如上所示，具有G-CSF活性和聚合物的部分内特定的键取决于多种因素。这样的因素包括，例如所采用的特定键的化学性质、特定的G-CSF部分、G-CSF部分内可利用的官能团(用于连接聚合物或转化为合适的连接位点)、G-CSF部分内存在的其他反应性官能团，等等。
G-CSF部分上的氨基提供了G-CSF部分与水溶性聚合物之间的连接点。在一个实施方案中，所述轭合物在G-CSF部分的N末端具有一个水溶性的轭合物，但是，在一些例子中，组合物包括低于50％的N末端单PEG化的轭合物。在示例性的轭合物中，N末端共轭的G-CSF部分不包括作为末端氨基酸的甲硫氨酸残基。人G-CSF包括4个含有胺的赖氨酸残基和1个氨基末端(参见SEQ ID NO：1)。因此，这种G-CSF的示例性连接点包括在第16位、23位、34位和40位中任何一个位置的赖氨酸相关的胺侧链的连接。
存在多种适用于与G-CSF部分可利用的胺形成共价键的聚合物试剂的例子。具体的例子和相应的轭合物示于下表1中。在表中，变量(n)表示重复的单体单元的数目，“-NH-(G-CSF)”表示G-CSF部分与聚合物试剂共轭后的残基。尽管表1中示出的每种聚合物部分[如(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n]均以“CH3”基团封端，但是也可将其取代为其他基团(如H和苯甲基)。
表1
胺-具体的聚合物试剂与由其生成的G-CSF部分轭合物
Figure A20068003222200301
Figure A20068003222200311
Figure A20068003222200321
Figure A20068003222200331
Figure A20068003222200351
Figure A20068003222200361
聚合物试剂与G-CSF部分的氨基的共轭可通过多种技术来完成。在一种方法中，G-CSF部分可与使用琥珀酰亚胺基衍生物(或其他活化的酯基)官能化的聚合物试剂共轭。在这种方法中，含有琥珀酰亚胺基团(或其他活化的酯基)的聚合物可在pH为7至9.0的水性介质中与G-CSF部分相连，尽管使用不同的反应条件(如，诸如6至7的较低的pH，或不同的温度和/或低于15℃)可能导致所述聚合物连接于G-CSF部分的不同位置。此外，可通过使胺封端的非肽水溶性聚合物与含有活化的羧酸基团的G-CSF部分反应来形成酰胺键。
本发明的示例性轭合物包括通过酰胺键或仲胺键与支链的水溶性聚合物相连的G-CSF部分的残基，其中(i)包括一个或多个原子的任选的间隔部分位于所述酰胺键或仲胺键与所述支链的水溶性聚合物之间，和(ii)所述支链的水溶性聚合物不含有赖氨酸残基。
此外，就N末端修饰的轭合物而言，示例性的组合物包括多种轭合物，每种轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分连接于水溶性聚合物的G-CSF部分的残基，其中在所述组合物的全部轭合物中，有低于50％的轭合物不是N-末端单PEG化的。
依据本发明的示例性轭合物具有以下结构
Figure A20068003222200371
其中：
(n)是具有3至4000的值的整数；
X是包括一个或多个原子的间隔部分；
R1是含有1至3个碳原子的有机基，其选自由甲基、乙基、丙基和异丙基组成的组；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
本发明的示例性轭合物具有以下结构：
Figure A20068003222200372
其中(n)是具有3至4000的值的整数，G-CSF是G-CSF部分的残基。
另一种用于将G-CSF部分与聚合物试剂共轭的通常方法是，使用还原性氨基化来使G-CSF部分的伯胺与用酮、醛或其水合形式(如酮水合物或醛水合物)官能化的聚合物试剂共轭。在这种方法中，G-CSF部分的伯胺与醛或酮(或相应的含有羟基的水合醛或水合酮)的羰基反应，从而形成了席夫碱。然后，通过使用诸如硼氢化钠的还原剂可使席夫碱反过来被还原转化成稳定的轭合物。选择性反应(如，在N末端)是可能的，特别是使用酮或α-甲基支链醛官能化的聚合物和/或在特定的反应条件下(如，降低的pH)。
本发明的示例性轭合物(其中水溶性聚合物为支链形式)应具有支链形式的水溶性聚合物，所述支链形式的水溶性聚合物具有以下结构
Figure A20068003222200381
其中每一个(n)独立地为具有3至4000的值的整数。
本发明的示例性轭合物具有以下结构：
Figure A20068003222200382
其中：
每一个(n)独立地为具有3至4000的值的整数；
X是包括一个或多个原子的间隔部分；
(b)是2至6；
(c)是2至6；
R2在各种情况下独立地为H或低级烷基；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
本发明的示例性轭合物具有以下结构：
其中：
每一个(n)独立地为具有3至4000的值的整数；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
本发明的示例性轭合物具有以下结构：
Figure A20068003222200391
其中：
每一个(n)独立地为具有3至4000的值的整数；
(a)是0或1；
X存在时，为包括一个或多个原子的间隔部分；
(b′)是0或具有1至10的值的整数；
(c)是具有1至10的值的整数；
R2在各种情况下，独立地为H或有机基；
R3在各种情况下，独立地为H或有机基；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
本发明的示例性轭合物具有以下结构：
其中：
每一个(n)独立地为具有3至4000的值的整数；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
本发明的示例性轭合物具有以下结构：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离的氢原子；
R1是H或有机基；
R2是H或有机基；
(a)是0或1；
(b)是0或1；
Re1存在时，为第一电子变更基团；
Re2存在时，为第二电子变更基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
这些轭合物(其为“基于富烯的”)包括可裂解的键，其中所述轭合物一经施用后即在体内释放出G-CSF部分。有利地，这样的“基于富烯的”轭合物包括其中仅有一种水溶性聚合物存在(如，POLY2和X2不存在)的例子，并且是在相应的聚合物试剂(随即在以下的段落中描述)缺少POLY2和X2时形成的。
这样的基于富烯的轭合物可通过在共轭作用条件下，使G-CSF部分与基于富烯的聚合物试剂结合而制备，所述基于富烯的聚合物试剂具有以下结构：
Figure A20068003222200411
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离的氢原子；
R1是H或有机基；
R2是H或有机基；
(a)是0或1；
(b)是0或1；
Re1存在时，为第一电子变更基团；和
Re2存在时，为第二电子变更基团。
共有和共同待决的、序号为11/454,971的美国专利申请描述了此类基于富烯的聚合物试剂的合成。如该申请所描述的，基于富烯的聚合物试剂可以多种方式制备。例如，一种用于制备基于富烯的试剂的方法包括：(a)提供包括第一连接位点、第二连接位点和任选的第三连接位点的、含有芳香族化合物的部分；(b)使官能团试剂与所述第一连接位点反应，以使所述第一连接位点含有能够与活性剂的氨基反应的官能团，并生成可降解的键，如氨基甲酸酯；和(c)使含有反应性基团的水溶性聚合物与所述第二连接位点和所述任选的第三连接位点(当存在时)反应，从而使(i)所述第二连接位点通过间隔部分含有水溶性聚合物，和使(ii)所述任选的第三连接位点(当存在时)通过间隔部分含有第二水溶性聚合物。在一些例子中，于步骤(c)之前实施(b)，而在其他例子中，于步骤(b)之前实施(c)。
因此，在这种用于制备基于富烯的聚合物试剂的方法中，必需的步骤是(a)提供包括第一连接位点、第二连接位点和任选的第三连接位点的、含有芳香族化合物的部分。在合成制备的范畴中，应理解的是，“提供”物质是指获得物质(例如，其通过合成获得或由商业上获得)。出于举例的目的，示例性的含有芳香族化合物的部分是如下所示的9-羟甲基-2，7-二氨基芴。
Figure A20068003222200421
这种含有芳香族化合物的部分——9-羟甲基-2，7-二氨基芴是具有如下三个连接位点的、含有芳香族化合物的部分的实例：第9位的羟基和分别在第2位和第7位的氨基。所述含有芳香族化合物的部分可以碱或盐的形式提供。就9-羟甲基-2，7-二氨基芴而言，有可能使用二氢氯化物的形式。
提供含有芳香族化合物的部分后，用于提供基于富烯的聚合物试剂的方法中的另一步骤广泛地包括使含有反应性基团的水溶性聚合物与所述含有芳香族化合物的部分上的连接部位反应的步骤。此处可使用任何本领域已知的、用于将水溶性聚合物与所述含有芳香族化合物的部分上的一个或多个连接位点相连的步骤，并且该方法不受限于此具体步骤。例如，胺反应性PEG(如N-琥珀酰亚胺基酯封端的mPEG，其由例如N-羟基琥珀酰亚胺与CH3O-CH2CH2-(OCH2CH2)-OCH2CH2-OCH2COOH在双环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺(DIC)作为缩合剂和任选地存在碱下反应形成)可与包括含有芳香族化合物的部分的胺反应，所述含有芳香族化合物的部分如9-羟甲基-2，7-二氨基芴。
在一些例子中，含有反应性基团的水溶性聚合物与含有芳香族化合物的部分的反应得到了水溶性聚合物与其相连的所有可能的连接位点。在这样的情况下，必须除去至少一种水溶性聚合物，从而使得连接位点可用来与官能团试剂反应。因此，例如，在先前段落中讨论的N-琥珀酰亚胺基酯封端的mPEG与9-羟甲基-2，7-二氨基芴的反应得到了包括以下的混合物：(a)含有两个水溶性聚合物的物质，所述两个水溶性聚合物分别位于两个胺位点，和(b)含有三个水溶性聚合物的物质，其中两个水溶性聚合物位于两个胺位点，另一个位于羟基位点。此处有可能通过使用分子排阻色谱来除去和收集分子量较高的物质。此外，有可能在进行离子交换色谱(IEC)之前，将该混合物处理到高pH[例如，使用氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)来处理该混合物]。在每种情况中，结果所得的组合物主要包括含有两个水溶性聚合物的9-羟甲基-2，7-二氨基芴，所述两个水溶性聚合物分别位于两个胺位点。由此可利用第三羟基位点来与官能团试剂反应。
最终的步骤是含有芳香族化合物的部分的反应性位点与官能团试剂反应。优选的步骤是在使用N-羟基琥珀酰亚胺处理之前，使含有两个水溶性聚合物(每一个水溶性聚合物位于两个胺位点之一)的包括羟基的9-羟甲基-2，7-二氨基芴与三光气反应。这样，官能团能够与活性剂的氨基反应形成可降解的键，比如在包括羟基的反应性位点上形成的氨基甲酸酯键(在该情况下，为“活化的碳酸酯”)。
用于提供基于富烯的聚合物试剂的方法中的步骤在适当的溶剂中进行。本领域的普通技术人员可以确定任何具体的溶剂是否适用于任何给定的反应。但是，一般而言，所述溶剂优选为非极性溶剂或极性的非质子溶剂。非极性溶剂的非限制性实例包括苯、二甲苯、二氧六环、四氢呋喃(THF)、叔丁醇和甲苯。特别优选的非极性溶剂包括甲苯、二甲苯、二氧六环、四氢呋喃和叔丁醇。示例性的极性的非质子溶剂包括，但不限于DMSO(二甲基亚砜)、HMPA(六甲基磷酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMA(二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)。
可用作连接聚合物位点的G-CSF中的优选胺基包括存在于赖氨酸残基内的那些胺基，所述赖氨酸残基如Lys 16、Lys 34和Lys 40。此外，可将为蛋白质的任何G-CSF部分的N末端用作聚合物连接位点。
羧基代表可在G-CSF部分上用作连接点的另一官能团。从结构上，此轭合物应包括以下：
Figure A20068003222200441
其中(G-CSF)和相邻的羰基对应于包括羧基的G-CSF部分；X为间隔部分，在此情况中优选为选自O、N(H)和S的杂原子；POLY是任选地以封端部分封端的水溶性聚合物，如PEG。
由含有末端官能团的聚合物衍生物与包括羧基的G-CSF部分之间的反应得到了C(O)-X键。如上所讨论的，具体的键将取决于所采用的官能团的类型。如果聚合物是使用羟基端部官能化的或者“活化的”，所得的键为羧酸酯，并且X为O。如果聚合物骨架用巯基官能化，所得的键为硫羟酸酯，并且X为S。当采用某些多臂、支链或叉状的聚合物时，C(O)X部分，尤其是X部分，可相对更复杂并且可包括较长的键合结构。
包括酰肼部分的水溶性衍生物也可用来在羰基处共轭。对于G-CSF部分不包括羰基部分的情况，可通过还原任何的羧酸(如，C末端的羧酸)和/或通过提供糖基化或糖化(其中所添加的糖具有羰基部分)形式的G-CSF部分而引入羰基部分。包括酰肼部分的水溶性衍生物的具体实例和相应的轭合物示于下表2中。此外，可通过使包括活化的酯的水溶性聚合物衍生物与肼(NH2-NH2)或叔丁基卡巴酯(carbazate)[NH2NHCO2C(CH3)3]反应而将任何包括活化的酯(如，琥珀酰亚胺基)的水溶性衍生物转化为包括酰肼部分。在表中，变量(n)表示重复的单体单元的数目，“＝C-(G-CSF)”表示与聚合物试剂共轭后的G-CSF部分残基。任选地，可使用适宜的还原剂对腙键进行还原。尽管表1中示出的每种聚合物部分[如(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n]均以“CH3”基团封端，但是也可将其取代为其他基团(如H和苯甲基)。
表2
羧基特异性的聚合物试剂与从其生成的G-CSF部分轭合物
Figure A20068003222200451
包括在G-CSF部分内的巯基可用作连接水溶性聚合物的有效位点。特别的是，当G-CSF部分为蛋白质时，所述G-CSF部分中的半胱氨酸残基提供了巯基。然后，此类半胱氨酸残基中的巯基可与对巯基反应具有特异性的活化的PEG反应，所述巯基的例子如美国专利第5,739,208号和国际专利公布文本No.WO 01/62827中所描述的N-马来酰亚胺基聚合物或其他的衍生物。
就SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3而言，具有5个包括巯基的半胱氨酸残基。因此，优选的巯基连接位点与这五个半胱氨酸残基之一相关。尽管优选不破坏任何的二硫键，但是有可能在这些半胱氨酸残基中的一个或多个的侧链内连接聚合物，并且保留一定程度的活性。然而，对于任何特定的G-CSF部分缺失巯基或者要避免破坏二硫键的情况，可能使用常规的合成技术来将半胱氨酸残基添加到G-CSF部分。参见，例如，WO 90/12874中所描述的用于添加半胱氨酸残基的方法，其中这种方法适用于G-CSF部分。此外，还可使用常规的基因工程方法来将半胱氨酸残基引入G-CSF部分中。但是，在一些实施方案中，优选不引入另外的半胱氨酸残基和/或巯基。
具体的例子和相应的轭合物示于下表3中。在表中，变量(n)表示重复的单体单元的数目，“-S-(G-CSF)”表示与水溶性聚合物共轭后的G-CSF部分残基。尽管表3中示出的每种聚合物部分[如(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n]均以“CH3”基团封端，但是也可将其取代为其他基团(如H和苯甲基)。
表3
巯基特异性的聚合物试剂与从其生成G-CSF部分轭合物
Figure A20068003222200471
Figure A20068003222200491
就包括一个或多个马来酰亚胺官能团(不论马来酰亚胺是与G-CSF部分的胺基反应还是巯基反应)的水溶性聚合物形成的轭合物而言，所述水溶性聚合物相应的马来酰胺酸形式也可与G-CSF部分反应。在某些条件下(如，约7-9的pH和在水存在下)，马来酰亚胺环将“打开”形成相应的马来酰胺酸。马来酰胺酸反过来可与G-CSF部分的胺基或巯基反应。示例性的基于马来酰胺酸的反应用图解显示如下。POLY表示水溶性聚合物，(G-CSF)表示G-CSF部分。
Figure A20068003222200492
适合用来形成本发明的G-CSF轭合物的聚合物试剂包括以下结构
POLY-[Y-S-W]x
其中：
POLY是水溶性聚合物片段；
x是1至25；
Y是包括至少四个碳原子的二价连接基团，并且由饱和或不饱和的烃骨架组成，所述烃骨架的长度为3至8个碳原子并具有取代基，所述取代基独立地选自氢、低级烷基、低级烯基和如本文所定义的不相互干扰的取代基，其中所述骨架的不同碳原子上的两个这样的烷基和/或烯基取代基可相连，以便形成环烷基、环烯基或芳基；
S是与Y的sp3杂交的碳相连的硫原子；且
S-W是巯基(即W为H)、受保护的巯基或巯基反应性的衍生物，如邻吡啶基二硫化物(OPSS)。受保护的巯基包括，例如，硫醚(如S-苯甲基或S-三苯甲基醚)和硫羟酸酯。美国专利申请公布文本No.2006/0135586描述了这样的聚合物试剂。
依据本发明的代表性的轭合物可具有以下结构：
POLY-L0，1-C(O)Z-Y-S-S-(G-CSF)
其中POLY是水溶性聚合物，L是任选的连接体，Z是选自由O、NH和S组成的组的杂原子，Y选自由C2-10烷基、C2-10取代的烷基、芳基和取代的芳基组成的组，以及(G-CSF)是G-CSF部分的残基。美国专利申请公布文本No.2005/0014903描述了可与G-CSF部分反应并得到这种类型轭合物的聚合物试剂。
可使用巯基特异性的聚合物试剂通过多种途径来形成轭合物，并且本发明在这点上不受到限制。例如，将任选地在适宜的缓冲液(如果需要，包括含有胺的缓冲液)中的G-CSF部分置入pH为约7-8的水性介质中，并加入摩尔过量的巯基特异性聚合物试剂。尽管在PEG化收率经测定相对低时，超过2小时(如，5小时、10小时、12小时和24小时)的反应时间是有用的，但是也允许该反应进行约0.5小时至2小时。在这种方法中可使用的示例性聚合物试剂是包括反应性基团的聚合物试剂，所述反应性基团选自由马来酰亚胺、砜(如乙烯砜)和巯基(例如，如邻吡啶基保护的巯基或“OPSS”)组成的组。
可用作连接聚合物试剂位点的G-CSF部分中的优选巯基包括存在于半胱氨酸残基内的那些巯基。特别优选的巯基是与位于氨基酸第17位的半胱氨酸残基侧链相关的巯基。
因此，本发明示例性的轭合物包括G-CSF部分的残基，所述G-CSF部分具有对应于hG-CSF的第17位氨基酸的半胱氨酸残基侧链，其中所述半胱氨酸残基侧链直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分连接于水溶性聚合物。
如前所述，基于巯基的轭合的某些G-CSF部分的PEG化收率相对低。即使允许延长反应时间，这样的PEG化收率仍然不能令人满意。在这些情况中，仍有可能通过采用制备轭合物的方法来提供收率相对高的基于巯基的修饰，所述方法包括：(a)在足以得到包括第一轭合物的第一轭合物组合物(即，包括第一轭合物的组合物)的条件下，向G-CSF部分组分添加第一聚合物试剂组分(即，包括第一聚合物试剂的组分)，所述第一轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的第一间隔部分共价连接于第一水溶性聚合物的G-CSF部分；和(b)向所述第一轭合物组合物添加第二聚合物试剂组分(即，包括第二聚合物试剂的组分)，从而得到第二轭合物组合物(即，包括第二轭合物的组合物)，所述第二轭合物组合物包括第二水溶性聚合物直接或通过包括一个或多个原子的第二间隔部分连接于所述轭合物的所述第一水溶性聚合物。
依据该方法，可使用具有相对小的重均分子量的聚合物试剂来与G-CSF部分进行最初的连接。之后，可使用具有相对高的重均分子量的聚合物试剂。尽管不希望受到理论的束缚，但是相信通过使用这样的方法，具有相对小的重均分子量的聚合物试剂和具有相对高的重均分子量的聚合物试剂相比，与G-CSF部分内具有空间位阻的位置的反应更为完全。这样，就有可能更为有效地制备所需的轭合物。
根据这种方法的基于巯基的修饰采用了包括一个或多个官能团的聚合物试剂，所述官能团能够与半胱氨酸残基侧链所包括的巯基反应。这样的PEG试剂包括，但不限于PEG邻吡啶基二硫化物试剂、PEG乙烯砜试剂、PEG马来酰亚胺试剂和PEG碘代乙酰亚胺试剂。这些和其他的聚合物试剂示于表3。
依据此方法使用的聚合物试剂在性质上可为异型双官能的或同型双官能的。
重均分子量相对低的聚合物试剂应具有的重均分子量范围为约100道尔顿至约5,000道尔顿。在此范围中的示例性重均分子量包括：约100道尔顿、约150道尔顿、约200道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约300道尔顿、约350道尔顿、约400道尔顿、约450道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约3,500道尔顿、约4,000道尔顿、约4,500道尔顿和约5,000道尔顿。重均分子量相对低的示例性聚合物试剂具有以下结构：
Y′-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-Y″    式I
其中Y′是亲电基团或亲核基团，Y″是适合与G-CSF部分相关的官能团反应的反应性基团(如，Y″可以是与G-CSF部分相关的巯基反应的马来酰亚胺、砜或巯基；与G-CSF部分相关的胺基反应的醛、酮或琥珀酰亚胺基，等等)，和(n)是具有2至约114的值的整数，优选具有约3至约6的值(如，3、4、5和6中任一个)。
重均分子量相对低的聚合物试剂可任选地为单分散的(尽管单分散性是不必需的)。通过使用单分散的聚合物试剂，有可能制备包括轭合物的组合物，所述轭合物包括与G-CSF部分共价相连的一种或多种水溶性聚合物，其中每种水溶性聚合物具有(n)个重复的单体，和(ii)在所述组合物中，一个或多个水溶性聚合物与G-CSF部分共价相连的各种轭合物的每个(n)是相同的。
重均分子量相对高的聚合物试剂应具有的重均分子量范围为约100道尔顿至约150,000道尔顿。但是，示例性的重均分子量范围包括：大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围、约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围、约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围、约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围、约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围、约35,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围和约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围。重均分子量相对高的示例性聚合物试剂具有以下结构：
Z′-CH2CH2O(CH2CH2O)n′CH2CH2-Z″    (式II)
其中Z″与重均分子量相对低的聚合物试剂(式I)的Y′反应，Z′是官能团的封端基团，和(n′)是具有2至约3,400的值的整数。就重均分子量相对高的聚合物试剂而言，示例性的形式包括直链和支链的聚合物试剂。
这种方法的图解如下(其中G-CSF表示G-CSF部分的残基)：
在G-CSF部分的巯基部分制备轭合物的图解
应理解的是，上述图解只用于说明的目的，并且依据此方法可使用(例如)其他的聚合物试剂。因此，例如，可依据上述图解使用聚合物试剂得到以下的结构：
Figure A20068003222200532
其中(n)是2至约114的整数，n′是2至约3,400的整数，G-CSF是G-CSF部分的残基。
在用于连接诸如半胱氨酸残基(如第17位半胱氨酸)的内部氨基酸残基的备选方法中，有可能经由单步骤来实施PEG化，其中反应性基团(如，诸如马来酰亚胺的巯基反应性基团)任选地设置在相对长的接支基团上[如，环氧乙烷聚合物；生物相容的聚合物，包括例如聚氨基酸(polymaminoacids)(即，相同或不同氨基酸的聚合物)；聚碳水化合物(即，相同或不同碳水化合物的聚合物)，如聚单糖、聚乳酸等；及任何前述的组合]。任选地，与聚合物相连的G-CSF部分可依次与第二聚合物(如，支链的聚合物)相连。文献和美国专利第6,774,180号和序列号为No.10/734,858的美国专利申请对这样的试剂进行了描述。
无论使用的是哪种方法，优选在低于10的pH实施将水溶性聚合物连接于G-CSF部分的方法，更优选低于8.5的pH，还更优选低于8.25，仍更优选低于8.0，最优选低于7.5。
在那些使用两种聚合物试剂产物的方法的例子中，形成了具有以下结构的轭合物：
POLY″-(X2)b-POLY′-(X1)a-(G-CSF)
其中：
POLY″是第二水溶性聚合物(优选支链或直链)；
POLY′是第一水溶性聚合物或生物相容的聚合物；
X1存在时，为包括一个或多个原子的第一间隔部分；
X2存在时，为包括一个或多个原子的第二间隔部分；
(b)是0或1；
(a)是0或1；和
G-CSF是G-CSF部分的残基。
就聚合物试剂而言，此处和别处描述的那些聚合物试剂可从商业来源购买(如Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)。此外，文献中描述了用于制备所述聚合物试剂的方法。
G-CSF部分与非肽的水溶性聚合物之间的连接(以及本文描述的轭合物的不同部分之间的其他连接，如两个水溶性聚合物之间的连接)可以是直接的(如，其中无插入原子位于G-CSF部分与聚合物之间)或间接的(如，其中一个或多个原子位于G-CSF部分与聚合物之间)。就间接连接而言，使用一个或多个原子[按惯例指的是“间隔部分”(此处标为X1、X2等)，其包括一个或多个碳原子、氮原子、硫原子、氧原子，及其组合]来连接相邻的原子，从而提供间接连接。所述间隔部分可包括酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚或二硫化物基团。具体的间隔部分的非限制性实例包括选自由以下组成的组的那些：-O-、-S-、-S-S-、-CH2-S-S-CH2-、-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C(O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-
CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-、二价的环烷基、-O-、-S-、氨基酸、-N(R6)-，和任何前述的两种或多种组合，其中R6是H或选自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基组成的组的有机基，(h)是0至6，(j)是0至20。其他具体的间隔部分具有以下结构：-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C
(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，其中每个亚甲基之后的下标值是指所述结构中所包括的亚甲基的数目，如，(CH2)1-6是指该结构可包括1、2、3、4、5或6个亚甲基。此外，任何上述的间隔部分可进一步包括环氧乙烷低聚物链，所述环氧乙烷低聚物链包括1至20个环氧乙烷单体单元[即-(CH2CH2O)1-20]。也就是说，所述环氧乙烷低聚物链可出现在间隔部分之前或之后，并且任选地在包括两个或多个原子的间隔部分的任何两个原子之间。此外，如果低聚物与聚合物片段相邻并且仅表示聚合物片段的延伸，那么就不应将所述低聚物链认为是间隔部分的一部分。在一些例子中，优选不包括两个或多个氨基酸残基的间隔部分(如，不包括-Gly-Gly-的间隔部分)。
组合物
轭合物通常为组合物的一部分。一般而言，所述组合物包括多种轭合物，优选但不是必需地，每种轭合物包括相同的G-CSF部分(即，在整个组合物内，仅存在一种类型的G-CSF部分)。此外，所述组合物可包括多种轭合物，其中任何给定的轭合物包括选自由两种或多种不同的G-CSF部分组成的组的部分(即，在整个组合物内，存在两种或多种不同的G-CSF部分)。但是，最佳的是，所述组合物中大体上所有的轭合物(如，所述组合物中多种轭合物的85％或更多)均各自包括相同的G-CSF部分。
所述组合物可包括单种轭合物物质(如，单PEG化的轭合物，其中对于组合物中大体上所有的轭合物而言，单种聚合物在相同的位置相连)或轭合物物质的混合物(如，单PEG化的轭合物的混合物，其中聚合物的连接出现在不同的位点，和/或单PEG化、二PEG化和三PEG化的轭合物的混合物)。所述组合物还可以包括其他的轭合物，所述其他的轭合物具有4、5、6、7、8或更多个聚合物与任何给定的具有G-CSF活性的部分相连。此外，本发明包括这样的例子——其中所述组合物包括多种轭合物，每种轭合物包括与一个G-CSF部分共价相连的一个水溶性聚合物；以及所述组合物包括与一个G-CSF部分共价相连的2、3、4、5、6、7、8或更多个水溶性聚合物。
就组合物中的轭合物而言，所述组合物应满足以下的一个或多个特征：组合物中至少约85％的轭合物具有1至4个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约85％的轭合物具有1至3个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约85％的轭合物具有1至2个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约85％的轭合物具有1个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约95％的轭合物具有1至4个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约95％的轭合物具有1至3个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约95％的轭合物具有1至2个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约95％的轭合物具有1个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约99％的轭合物具有1至4个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约99％的轭合物具有1至3个聚合物与G-CSF部分相连；组合物中至少约99％的轭合物具有1至2个聚合物与G-CSF部分相连；和组合物中至少约99％的轭合物具有1个聚合物与G-CSF部分相连。
在一个或多个实施方案中，优选的包括轭合物的组合物不含或大体上不含白蛋白。还优选的是，所述组合物不含或大体上不含不具有G-CSF活性的蛋白质。因此，所述组合物优选有85％，更优选有95％，最优选有99％不含白蛋白。此外，所述组合物优选有85％，更优选有95％，最优选有99％不含任何不具有G-CSF活性的蛋白质。就组合物中存在白蛋白的情况，本发明示例性的组合物大体上不含包括将G-CSF部分的残基与白蛋白相连的聚(乙二醇)聚合物的轭合物。
可通过选择适当的聚合物试剂、聚合物试剂与G-CSF部分的比例、温度、pH条件和共轭反应的其他方面来实现任何给定部分所需的聚合物数目的控制。此外，可通过纯化手段来实现不需要的轭合物(如，具有四个或更多个相连聚合物的那些轭合物)的还原或消除。
例如，可以纯化聚合物-G-CSF部分的轭合物，以便获得/分离不同的共轭物质。具体而言，可纯化混合物产物，以实现每个G-CSF部分平均有1个PEG/到2、3、4、5和更多个PEG，一般为每个G-CSF部分有1、2或3个PEG。用于纯化最终的共轭反应混合物的策略将取决于多种因素，其包括，例如所采用的聚合物试剂的分子量、特定的G-CSF部分、所需的给药方案，以及轭合物的残留活性与体内性能。
如果需要，可使用凝胶过滤色谱和/或离子交换色谱来分离具有不同分子量的轭合物。也就是说，基于它们不同的分子量(差异基本上对应于水溶性聚合物部分的平均分子量)使用凝胶过滤色谱来分馏出聚合物/G-CSF部分为不同比值(如，1-mer、2-mer、3-mer等，其中“1-mer”表示1个聚合物与G-CSF部分相连，“2-mer”表示两个聚合物与G-CSF部分相连，等等)的轭合物。例如，在示例性的反应中，35,000道尔顿的蛋白质随机地与分子量为约20,000道尔顿的聚合物试剂共轭，得到的反应混合物可包括未修饰的蛋白质(分子量为约35,000道尔顿)、单PEG化的蛋白质(分子量为约55,000道尔顿)、二PEG化的蛋白质(分子量为约75,000道尔顿)，等等。
尽管这种方法可用来分离PEG和其他具有不同分子量的聚合物-G-CSF部分的轭合物，但是这种方法对于分离在G-CSF部分内具有不同的聚合物连接位点的位置异构体(isoform)通常是无效的。例如，可用凝胶过滤色谱来相互分离1-mer、2-mer、3-mer等的混合物，尽管每种回收的轭合物组合物可能含有与G-CSF部分内的不同反应性基团(如赖氨酸残基)相连的PEG。
适合用于实施这种类型分离的凝胶过滤柱包括从AmershamBiosciences
(Piscataway，NJ)获得的SuperdexTM和SephadexTM柱。特定柱的选择将取决于所需的分馏范围。一般使用合适的缓冲液来实施洗脱，所述缓冲液如磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等。所收集的馏分可通过多种不同的方法进行分析，例如，(i)用于蛋白质含量测定的280nm处的吸光度，(ii)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品的基于染料的蛋白质分析，(iii)用于PEG含量测定的碘试验(Sims等.(1980)Anal.Biochem，107：60-63)，(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，随后使用碘化钡染色和(v)高效液相色谱(HPLC)。
位置异构体的分离通过采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)的反相色谱法进行或通过采用离子交换柱的离子交换色谱法进行，所述反相高效液相色谱使用了适宜的柱子(如，从诸如Amersham Biosciences或Vydac公司商业获得的C18柱或C3柱)，所述离子交换柱如从Amersham Biosciences获得的SepharoseTM离子交换柱。每种方法都可用来分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(即位置异构体)。
所述组合物优选大体上不含不具有G-CSF活性的蛋白质。此外，所述组合物优选大体上不含所有其他非共价连接的水溶性聚合物。但是，在一些情况下，所述组合物可包括聚合物-G-CSF部分的轭合物与未轭合的G-CSF部分的混合物。
与美国专利申请公布文本No.2005/0143563中描述的方法所形成的组合物相比，当前描述的轭合物组合物不含或大体上不含聚集体。因此，本发明的组合物不含或大体上不含(如，小于约20％，更优选小于约15％，还更优选小于约10％，仍更优选小于约9％，仍然更优选小于约8％，仍然更优选小于约7％，仍然更优选小于约6％，更优选小于约5％，更优选小于约4％，更优选小于约3％，更优选小于约2％，更优选小于约1％，其中最优选的是小于约0.5％)聚集体。
美国专利申请公布文本No.2005/0143563描述了解决无活性聚集体形成的方法。该参考文献描述使用少量SDS、吐温20、吐温80洗涤剂的处理是预防聚集体形成所必需的。有利地，可制备本发明的组合物和轭合物，而无需施行添加SDS、吐温20和吐温80的步骤。此外，可制备本发明的组合物和轭合物，而无需施行添加洗涤剂的步骤。而且，本发明的组合物不含或大体上不含(如，小于约20％，更优选小于约15％，还更优选小于约10％，仍更优选小于约9％，仍然更优选小于约8％，仍然更优选小于约7％，仍然更优选小于约6％，仍然更优选小于约5％，仍然更优选小于约4％，仍然更优选小于约3％，仍然更优选小于约2％，仍然更优选小于约1％，仍然更优选小于约0.5％，其中最优选小于0.001％)诸如SDS、吐温20和吐温80的洗涤剂。此外，可制备本发明的组合物和轭合物，而无需施行除去(通过例如超滤)诸如SDS、吐温20和吐温80的洗涤剂的步骤。此外，可制备本发明的组合物和轭合物，而无需施行除去(通过例如超滤)洗涤剂的步骤。
与国际专利申请公布文本No.WO 05/099769中用于形成轭合物的方法相比，本发明用于制备轭合物和组合物的方法不包括使G-CSF变性以暴露Cys-17的巯基的步骤。优选地，当前用于形成轭合物和组合物的方法不包括添加变性剂(以及不在变性剂存在下进行)的步骤，所述变性剂的例子如选自由脲、氯化胍或异硫氰酸盐、二甲基脲、高度中性的盐浓缩物和溶剂(例子如乙腈、醇、有机酯、二甲基亚砜)组成的组的变性剂。如实验所示，获得在Cys-17残基处的G-CSF轭合物不需要这样的变性步骤。
此外，本发明的组合物不含或大体上不含(如，小于约20％，更优选小于约15％，仍更优选小于约10％，仍然更优选小于约9％，仍然更优选小于约8％，仍然更优选小于约7％，仍然更优选小于约6％，仍然更优选小于约5％，仍然更优选小于约4％，仍然更优选小于约3％，仍然更优选小于约2％，仍然更优选小于约1％，其中最优选的是小于约0.5％)变性剂。此外，可制备本发明的组合物和轭合物，而无需施行使轭合物暴露于复性条件的步骤(例子如超滤或色谱法)。
任选地，本发明的组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。如果需要，可将所述药学上可接受的赋形剂加到轭合物中以形成组合物。
示例性的赋形剂包括，但不限于选自由碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合组成的组的那些。
碳水化合物(如糖)、衍生化的糖(如糖醇、糖醛酸、酯化的糖)和/或糖聚合物可作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉等；以及糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等。
所述赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，及其组合。
所述组合物还可包括用于预防或抑制微生物生长的抗微生物剂。适用于本发明一个或多个实施方案的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、西吡氯铵、三氯叔丁醇、酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)，及其组合。
抗氧化剂也可存在于组合物中。抗氧化剂用来预防氧化，从而防止制剂中的轭合物或其他组分降解。适合用于本发明一个或多个实施方案的抗氧化剂包括，例如抗坏血酸棕榈酸盐、丁羟茴香醚、丁羟甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸钠、偏重亚硫酸钠，及其组合。
在一些情况中，表面活性剂可作为赋形剂存在。示例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，如“吐温20”和“吐温80”，和普卢兰类，如F68和F88(两者均可从BASF，Mount Olive，New Jersey获得)；山梨坦酯；脂质，如磷脂(比如卵磷脂)和其他的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(虽然优选为非脂质形式)、脂肪酸和脂肪酯；甾族化合物，如胆固醇；螯合剂，如EDTA、锌和其他此类合适的阳离子。
酸或碱可作为赋形剂存在于所述组合物中。可使用的酸的非限制性实例包括那些选自由以下组成的组的酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸，及其组合。合适的碱的实例包括，但不限于选自由以下组成的组的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾(potassium fumerate)及其组合。
组合物中轭合物(即，活性剂与聚合物试剂形成的轭合物)的量将根据多种因素而改变，但是当该组合物贮存在单位剂量容器(如，管形瓶)中时，最佳的是治疗有效剂量。此外，药物制剂可封装在注射器中。为了确定哪种量产生临床需要的终点，可通过重复施用增加量的轭合物来由实验确定治疗有效剂量。
组合物中任何一种赋形剂的量将根据所述赋形剂的活性和该组合物的特定需求而改变。通常，任何一种赋形剂的最佳量通过常规的实验确定，即，通过制备含有不同量赋形剂(范围从低到高)的组合物，考察该组合物的稳定性和其他参数，然后确定获得最佳性能而无显著副作用的范围。
然而，一般而言，所述赋形剂在组合物中存在的量为约1％至约99％重量，优选约5％-98％重量，更优选约15％至约95％重量，其中最优选小于30％重量的浓度。
这些前述的药物赋形剂连同其他赋形剂一起在″Remington：TheScience&Practice of Pharmacy″，19th ed.，Williams&Williams，(1995)，the″Physician′s Desk Reference″，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，Handbook of PharmaceuticalExcipients，3rd Edition，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000.中描述。
所述组合物包括所有类型的制剂，并且特别是适用于注射的那些，如可用液体重新溶解的粉末或冻干粉(lyophilates)。适合在注射前用来重新溶解固体组合物的适宜的稀释剂实例包括用于注射的抑菌水、5％的葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液、盐水、无菌水、去离子水，及其组合。就液体药物组合物而言，包括溶液和悬浮液。
虽然不是必须的，但是本发明一个或多个实施方案的组合物通常经由注射施用，因而一般在施用之前即刻配制为液体溶液或悬浮液。此药物制剂还可采用其他的形式，如糖浆、乳膏、软膏剂、片剂、散剂，等等。其他的施用方式还可包括，如肺部、直肠、经皮、经粘膜、口服、膜内、皮下、动脉内等。
本发明还提供了用于将本文所提供的轭合物施用于患者的方法，所述患者患有对本文所提供的轭合物的治疗有反应的病征(condition)。所述方法包括向患者施用(一般经由注射)治疗有效量的轭合物(优选作为药物组合物的一部分提供)。如前所述，所述轭合物可通过静脉内注射，或者次优地通过肌内注射或通过皮下注射来进行胃肠外施用。除了别的以外，适合用于胃肠外施用的剂型包括容易用于注射的溶液、在使用前与溶剂结合的干燥粉末、容易用于注射的悬浮液、在使用前与载体结合的不溶性干燥组合物、在施用前进行稀释的乳剂和液体浓缩物。
该施用方法可用来治疗通过施用轭合物可减轻或预防的任何病征。本领域的普通技术人员应了解本发明的轭合物可有效治疗哪一种病征。例如，可使用所述轭合物来治疗经受骨髓抑制化学疗法、骨髓移植、严重的慢性嗜中性粒细胞减少症、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、再生障碍性贫血、毛细胞性白血病、脊髓发育不良、粒细胞缺乏(如，药物诱导的粒细胞缺乏、先天性粒细胞缺乏和同种异体免疫新生儿粒细胞缺乏(alloimmune neonatalneutropenia)的患者。此外，可将轭合物用于需要进行外周血液祖细胞采集的患者。有利地，可在另一活性剂施用之前、同时或之后将轭合物施用于患者。
有待施用的实际剂量将根据受治疗者的年龄、体重、大体状况，以及所治疗的病征的严重性、健康护理专业人员的判断和所施用的轭合物而改变。治疗有效量为本领域技术人员已知和/或在相关的参考教科书和参考文献中描述。通常，治疗有效量的范围为约0.001mg至100mg，优选剂量为0.01mg/天至75mg/天，更优选的剂量为0.10mg/天至50mg/天。可定期地施用给定的剂量，直到例如达到所要求的(如健康的)白细胞数目。
任何给定轭合物的单位剂量(再次声明，优选作为药物制剂的一部分提供)可根据临床医生的判断、患者的需求等，以多种给药时间表进行施用。具体的给药时间表应为本领域普通技术人员已知，或可使用常规的方法通过实验确定。示例性的给药时间表包括，但不限于每天施用1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月2次、每月1次，及其任何组合。一旦到达临床终点，停止组合物的给药。
施用本文所描述的某些轭合物的一项优势在于单个水溶性聚合物部分可发生裂解。当从身体的清除因聚合物尺寸而成为潜在的问题时，这样的结果是有利的。最佳地，通过使用生理上可裂解的和/或酶可降解的键来促进每种水溶性聚合物部分的裂解，所述键如酰胺、碳酸酯或包括酯的键。这样，轭合物的清除(经由单个水溶性聚合物部分的裂解)可通过选择聚合物的分子大小和选择提供所需清除性能的官能团类型来进行调整。本领域的普通技术人员可确定分子大小合适的聚合物和可裂解的官能团。例如，本领域的普通技术人员可使用以下的常规实验来确定合适的分子大小和可裂解的官能团：首先，制备具有不同聚合物重量和可裂解的官能团的多种聚合物衍生物；然后，通过将所述聚合物衍生物施用于患者并定期进行血液和/或尿液样品采集来获得清除性能(如，通过定期的血液或尿液采样)。一旦从每种受试轭合物获得多种清除性能，即可鉴别出适宜的轭合物。
应理解的是，尽管本发明已连同其优选的具体实施方案一起进行描述，但是前述的描述和随后的实施例只预期进行说明而不限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优势和改进对于本发明所属领域的技术人员是显而易见的。
实验
除非另有说明，本发明的实施将采用有机合成、生物化学、蛋白质纯化等常规技术，其均为所属领域的技术。这样的技术在文献中均有充分的解释。参见，例如先前的J.March，Advanced OrganicChemistry：Reactions Mechanisms and Structure，第4版.(New York：Wiley-Interscience，1992)。
在以下的实施例中，努力确保所使用数字(如，量、温度等)的准确度，但应考虑某些实验误差和偏差。除非另有说明，温度为摄氏度，压力为海平面的大气压或接近海平面的大气压。认为以下每一实施例对本领域普通技术人员实施本文所描述的一个或多个实施方案具有启示。
重组甲硫氨酰基人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是由大肠杆菌(E.coli)产生的非糖基化蛋白质，并在实施例1-5中使用。该重组的蛋白质包括175个氨基酸，其中在第17位有一个游离的半胱氨酸(忽略前导的甲硫氨酸残基)。该完整的氨基酸序列如下：
MTPLGPASSL PQSFLLKCLE QVRKIQGDGA ALQEKLCATYKLCH
PEELVL LGHSLGIPWA PLSSCPSQAL QLAGCLSQLHSGLFLYQGL
L QALEGISPEL GPTLDTLQLD VADFATTIWQ QMEELGMAPALQP
TQGAMPA FASAFQRRAG GVLVASHLQS FLEVSYRVLRHLAQP，
且对应于SEQ ID NO：1，其中n″′为1。
SDS-PAGE分析
当进行SDS-PAGE分析时，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析样品，所述电泳使用了Bio-Rad系统(Mini-PROTEAN III预制的凝胶电泳系统)和Invitrogen系统(XCellSureLock Mini-Cell)。将样品与样品缓冲液一起混合。然后，将所制备的样品装载到凝胶上，并运行大约30分钟。
RP-HPLC分析
当实施例1A、2B、3A和6进行RP-HPLC分析时，在Agilent 1100HPLC系统(Agilent)上施行反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。使用PRP-3柱(3μm粒径，75×4.6mm，Hamilton)和由0.1％三氟乙酸水(缓冲液A)与0.1％三氟乙酸乙腈(缓冲液B)组成的流动相对样品进行分析。柱子的流速为0.5ml/min。使用线性梯度在40分钟内对蛋白质和PEG-蛋白质轭合物进行洗脱，并采用UV检测器在280nm处显像。
当实施例1B、1C和1D进行RP-HPLC分析时，在Agilent 1100HPLC系统(Agilent)上施行反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。使用Zorbax 300SB-C3柱(3.5μm粒径，150mm×3.0mm，Agilent)和由0.1％三氟乙酸的水溶液(缓冲液A)与0.1％三氟乙酸的乙腈溶液(缓冲液B)组成的流动相对样品进行分析。柱子的流速为0.3ml/min。使用线性梯度在35分钟内对蛋白质和PEG-蛋白质轭合物进行洗脱，并采用UV在280nm处检测。
通过RP-HPLC鉴别的二聚体(当存在时)表明蛋白质二聚体发生了聚集(并缺失任何的聚合物组分)。
阳离子交换色谱法
当进行阳离子交换色谱法时，将HiTrap SP Sepharose HP阳离子交换柱(Amersham Biosciences)与AKTAprime系统(AmershamBiosciences)一起使用，以纯化PEG-G-CSF轭合物。对于所制备的每种轭合物溶液而言，将轭合物溶液装载在经20mM NaOAc缓冲液，pH 4.0(缓冲液A)预平衡的柱子上，然后用10根柱子体积的缓冲液A进行洗脱以便除去任何未反应的PEG试剂。随后，升高缓冲液A和0-100％缓冲液B(20mM NaOAc和1.0M NaCl缓冲液，pH 4.0)的梯度。洗脱液由UV检测器在280nm处监测。收集馏分并通过RP-HPLC或SDS-PAGE来测定个体轭合物的纯度。
收率百分数和轭合物溶液
PEG化的收率百分数是指单PEG化物质的收率。术语“轭合物溶液”和“反应混合物”是同义的，并且两者均表示由所描述的反应或过程得到的组合物。
实施例1A
用直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(mPEG-OPSS)，10kDa使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200671
直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(“mPEG-OPSS”)，10kDa
将在氩气下于-20℃贮存的mPEG-OPSS，10kDa加热至室温。将50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的mPEG-OPSS溶于二甲基亚砜(“DMSO”)形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.4mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。为了促使mPEG-OPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基偶联，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，以便于在37℃共轭。30分钟后，将另外50倍过量的mPEG-OPSS，10kDa加入到反应溶液中，随后在37℃首先混合30分钟，然后在室温混合2小时，由此形成mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液。通过SDS-PAGE和RP-HPLC对mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。
图1显示mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液在RP-HPLC分析后的色谱图。PEG化反应产生36％的mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液(位于G-CSF半胱氨酸残基的单PEG化轭合物)。图2显示mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液的SDS-PAGE分析。使用阳离子交换色谱纯化轭合物。图3显示阳离子交换纯化后的色谱图。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的mPEG-OPSS来制备其他的轭合物。
实施例1B
用直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(mPEG-OPSS)，10kDa使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200681
直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(“mPEG-OPSS”)，10kDa
将在氩气下于-20℃贮存的mPEG-OPSS，10kDa加热至室温。将50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的mPEG-OPSS溶于50％DMSO形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(3.0mg/ml 10mM磷酸钠缓冲液，1％(w/v)蔗糖，pH 6.7)并充分混合。为了促使mPEG-OPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基偶联，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，以便于在37℃共轭1小时，然后室温过夜，由此形成mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液。通过SDS-PAGE和RP-HPLC对mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。
图4显示轭合物溶液在RP-HPLC分析后的色谱图。PEG化反应产生34％的mPEG10K-G-CSF轭合物。
图5显示轭合物溶液的SDS-PAGE分析。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的mPEG-OPSS来制备其他的轭合物。
实施例1C
用直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(mPEG-OPSS)，10kDa使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200682
直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(“mPEG-OPSS”)，10kDa将在氩气下于-20℃贮存的mPEG-OPSS，10kDa加热至室温。将已加热的mPEG-OPSS(37mg)溶于乙腈形成试剂溶液。将试剂溶液快速加入1ml的G-CSF溶液中(0.5mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 6.9)并充分混合。为了促使mPEG-OPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基偶联，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，以便于在37℃共轭30分钟，然后室温2小时，由此形成mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液。通过RP-HPLC对mPEG
10kDa-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。
图6显示mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液在RP-HPLC分析后的色谱图。PEG化反应产生56％的mPEG10K-G-CSF轭合物。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的mPEG-OPSS来制备其他的轭合物。
实施例1D
用直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(mPEG-OPSS)，10kDa使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200691
直链mPEG-邻吡啶基-二硫化物试剂(“mPEG-OPSS”)，10kDa
将在氩气下于-20℃贮存的mPEG-OPSS，10kDa加热至室温。将已加热的mPEG-OPSS(17mg)溶于乙腈形成试剂溶液。将试剂溶液快速加入0.2ml的G-CSF溶液中(0.3mg/ml 10mM磷酸钠缓冲液，1％(w/v)蔗糖，pH 7.0)并充分混合。为了促使mPEG-OPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基偶联，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，以便于在37℃共轭1小时，然后室温2小时，由此形成mPEG10kDa-G-CSF。通过RP-HPLC对mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。
图7显示mPEG10kDa-G-CSF轭合物溶液在RP-HPLC分析后的色谱图。PEG化反应产生73％的mPEG10K-G-CSF轭合物。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的mPEG-OPSS来制备其他的轭合物。
实施例2A
用直链PEG-二邻吡啶基-二硫化物试剂，2kDa和直链mPEG-巯基试剂，20kDa使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200701
直链PEG-二邻吡啶基-二硫化物试剂，2kDa(“PEG-DiOPSS”)
Figure A20068003222200702
直链mPEG-巯基试剂，20kDa(“mPEG-SH”)
本实施例(以及实施例2B)依赖于一种方法，该方法包括最初将重均分子量相对小的聚合物试剂连接于G-CSF部分，随后将重均分子量相对高的聚合物试剂连接于由重均分子量相对小的聚合物试剂连接于G-CSF部分所形成的轭合物的聚合物部分。通过采用这种方法，能够修饰G-CSF的包括部分内埋(buried)游离巯基的半胱氨酸残基。双官能的PEG-DiOPSS，2kDa通过二硫键大体上插入具空间阻碍的游离巯基中，随后通过另一个二硫键将巯基封端的PEG偶联于PEG-OPSS，2kDa试剂暴露的残基。
以下用图解显示该方法[其中最初将具有相对低重均分子量的聚合物试剂“PEGB”连接于待轭合的部分(A)，随后将重均分子量较高的聚合物试剂(图解中的PEGA)连接于由低重均分子量的试剂连接于轭合部分所形成的轭合物的聚合物部分]。需要注意的是，以下提供的结构仅仅为解释性的，并且可以使用多种结构的聚合物试剂。
Figure A20068003222200711
将在氩气下于-20℃贮存的PEG-DiOPSS，2kDa加热至室温。将50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的PEG-DiOPSS溶于DMSO形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.4mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。为了促使PEG-DiOPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基轭合，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，并允许在37℃混合1小时，然后室温2小时，由此得到mPEG2kDa-G-CSF反应混合物。在反应完成后，将反应溶液对磷酸钠缓冲液(pH 7.0)进行透析，以除去过量的游离PEG-DiOPSS。然后向透析的轭合物溶液中加入50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的mPEG-SH，20kDa，随后在室温混合1小时，然后在4℃过夜，由此形成mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物溶液。通过SDS-PAGE和RP-HPLC对mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。
图8显示mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物溶液的SDS-PAGE分析。使用PEG-diOPSS进行PEG化的第一步骤产生58％的PEG2kDa-G-CSF轭合物，而与mPEG-SH反应的第二步骤产生42％的mPEG20kDa-PEG2kDa
-G-CSF轭合物。
使用阳离子交换色谱纯化最终的轭合物。图9显示了阳离子交换纯化后的色谱图。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的PEG-OPSS和mPEG-SH来制备其他的轭合物。
实施例2B
用直链PEG-二邻吡啶基-二硫化物试剂，2kDa和直链mPEG-巯基试剂，20kDa使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200721
直链PEG-二邻吡啶基-二硫化物试剂，2kDa(“PEG-DiOPSS”)
Figure A20068003222200722
直链mPEG-巯基试剂，20kDa(“mPEG-SH”)
将在氩气下于-20℃贮存的PEG-DiOPSS，2kDa加热至室温。将100倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的PEG-DiOPSS溶于DMSO形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.5mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。为了促使PEG-DiOPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基轭合，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，DubuqueIA)上，并允许在37℃混合1小时，然后室温混合3.5小时。在反应完成后，将反应溶液对磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)进行透析，以除去过量的游离PEG-DiOPSS。此后，向透析的轭合物溶液中加入100倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的mPEG-SH，20kDa，随后在室温混合过夜，由此形成mPEG20kDa-PEG
2kDa-G-CSF轭合物溶液。通过SDS-PAGE和RP-HPLC对mPEG20kDa-
PEG2kDa-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。
图10显示轭合物溶液在RP-HPLC分析后的色谱图。PEG化反应产生25％的mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物。
使用阳离子交换色谱法来纯化mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物，所述阳离子交换色谱法采用了SP琼脂糖凝胶高效交换介质(Amersham Biosciences，Uppsala Sweden)和NaOAc缓冲液。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的PEG-DiOPSS和mPEG-SH来制备其他的轭合物。
实施例3A
用直链PEG-二邻吡啶基-二硫化物试剂，2kDa和直链mPEG-巯基试剂，30kDa使G-CSF PEG化
直链PEG-二邻吡啶基-二硫化物试剂，2kDa(“PEG-DiOPSS”)
Figure A20068003222200732
直链mPEG-巯基试剂，30kDa(“mPEG-SH”)
本实施例(以及实施例3B)依赖于一种方法，该方法包括最初将重均分子量相对小的聚合物试剂连接于G-CSF部分，随后将重均分子量相对高的聚合物试剂连接于由重均分子量相对小的聚合物试剂连接于G-CSF部分所形成的轭合物的聚合物部分。通过采用这种方法，能够修饰G-CSF的包括部分内埋游离巯基的半胱氨酸残基。双官能的PEG-DiOPSS，2kDa通过二硫键大体上插入具空间阻碍的游离巯基中，随后通过另一个二硫键将巯基封端的PEG偶联于PEG-OPSS，2kDa试剂的残基。
将在氩气下于-20℃贮存的PEG-DiOPSS，2kDa加热至室温。将50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的PEG-DiOPSS溶于DMSO形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.4mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。为了促使PEG-DiOPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基轭合，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，并允许在37℃混合1小时，然后室温2小时，由此得到mPEG2kDa-G-CSF反应混合物。在反应完成后，将反应溶液对磷酸钠缓冲液(pH 7.0)进行透析，以除去过量的游离PEG-DiOPSS。然后向透析的轭合物溶液中加入50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的mPEG-SH，30kDa，随后在室温混合1小时，然后在4℃过夜，由此形成mPEG30kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物溶液。通过SDS-PAGE和RP-HPLC对mPEG30kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。
图11显示mPEG30kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物溶液在RP-HPLC分析后的色谱图。PEG化反应产生20％的mPEG30kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物。
使用阳离子交换色谱纯化mPEG30kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物。图12显示了阳离子交换纯化后的色谱图。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的PEG-OPSS和mPEG-SH来制备其他的轭合物。
实施例3B
用直链PEG-二邻吡啶基-二硫化物试剂，2kDa和直链mPEG-巯基试剂，30kDa使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200751
直链PEG-邻吡啶基-二硫化物衍生物，2kDa(“PEG-DiOPSS”)
直链mPEG-巯基衍生物，30kDa(“mPEG-SH”)
将在氩气下于-20℃贮存的PEG-DiOPSS，2kDa加热至室温。将100倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的PEG-DiOPSS，2kDa溶于DMSO形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.5mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。为了促使PEG-DiOPSS通过二硫键与G-CSF的第17位游离(即蛋白内部没有二硫键参与)半胱氨酸残基轭合，将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，并允许在37℃混合1小时，然后室温3.5小时。在反应完成后，将反应溶液对磷酸钠缓冲液(pH 7.0)进行透析，以除去过量的游离PEG-DiOPSS。然后向透析的轭合物溶液中加入100倍过量和50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的mPEG-SH，30kDa，随后在室温混合过夜，由此形成mPEG30kDa-PEG-2kDa-G-CSF轭合物溶液。通过SDS-PAGE和RP-HPLC对轭合物溶液进行鉴定。
PEG化反应产生21％的mPEG30kDa-PEG2kDa-G-CSF轭合物。
使用阳离子交换色谱法来纯化mPEG30K-PEG2K-G-CSF轭合物，所述阳离子交换色谱法采用了SP琼脂糖凝胶高效交换介质(Amersham Biosciences，Uppsala Sweden)和NaOAc缓冲液(参见图13)。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的PEG-DiOPSS和mPEG-SH来制备其他的轭合物。
实施例4
用9-羟甲基-2，7-二[mPEG(20,000)-酰氨基戊二酰胺]芴-N-羟基琥珀酰亚胺试剂(“支链的”试剂)，40kDa使G-CSF进行可降解的PEG化
9-羟甲基-2，7-二[mPEG(20,000)-酰氨基戊二酰胺]芴-N-羟基琥珀酰亚胺试剂，40kDa或“支链的mPEG-FMOC-N-羟基琥珀酰亚胺试剂”，40kDa或“G2-PEG2-FMOC-NHS”，40kDa
将在氩气下于-20℃贮存的G2-PEG2-FMOC-NHS，40kDa加热至室温。将5倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的G2-PEG2-FMOC-NHS溶于2mM HCl中形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.4mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。加入PEG试剂后，测定反应混合物的pH并使用常规技术将其调节至7.0。为了促使G2-PEG2-FMOC-NHS通过酰胺键偶联于G-CSF，将反应溶液置于低速实验室旋转器上3小时，以便于在室温轭合，由此形成G2-PEG2-FMOC-G-CSF轭合物溶液。通过加入1M乙酸将pH降低至4.0来使反应猝灭。通过SDS-PAGE对G2-PEG2-FMOC-
G-CSF轭合物溶液进行鉴定。参见图14所示SDS-PAGE第4泳道的结果。
PEG化反应产生52％的1-mer(单轭合物或一个PEG与G-CSF相连)和15％的2-mer(两个轭合物或两个PEG与G-CSF相连)物质。使用阳离子交换色谱法来纯化轭合物，所述阳离子交换色谱法采用了SP琼脂糖凝胶高效交换介质和NaOAc(乙酸钠)缓冲剂。
由于PEG结构中具有可降解的键，因此预期G-CSF在生理条件下会从轭合物中慢速释放。其证据可见——在pH 7.4，37℃孵育时的G2-PEG2-
FMOC-40K-G-CSF单轭合物的释放曲线(参见图15)，其将剩余轭合物的HPLC峰面积表示为时间的函数。由水解速率的直线图(参见图16)计算G2-PEG2-FMOC-40K-G-CSF单轭合物的半衰期为98小时。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的G2-PEG2-FMO
C-NHS试剂来制备其他的轭合物。
实施例5
用9-羟甲基-[4-甲酰氨基mPEG(10,000)-7-酰氨基戊二酰胺mPEG(10,000)]芴-N-羟基琥珀酰亚胺试剂，20kDa使G-CSF进行可降解的PEG化
9-羟甲基-[4-甲酰氨基mPEG(10,000)-7-酰氨基戊二酰胺mPEG(10,000)]芴-N-羟基琥珀酰亚胺试剂，20kDa或“支链的mPEG-FMOC-N-羟基琥珀酰亚胺试剂”，20kDa，或“CG-PEG2-FMOC-NHS”，20kDa
将在氩气下于-20℃贮存的CG-PEG2-FMOC-NHS，20kDa加热至室温。将7倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的CG-PEG2-FMOC-NHS溶于2mM HCl中形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.4mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。加入PEG试剂后，测定反应混合物的pH并使用常规技术将其调节至7.0。为了促使CG-PEG2-FMOC-NHS通过酰胺键偶联于G-CSF，将反应溶液置于低速实验室旋转器上3小时，以便于在室温轭合，由此形成CG-PEG2-FMOC-G-CSF轭合物溶液。通过加入1M乙酸将pH降低至4.0来使反应猝灭。通过SDS-PAGE对CG-PEG2-FMOC-G-CSF轭合物溶液进行鉴定。参见图14所示SDS-PAGE第2泳道的结果。
PEG化反应产生45％的1-mer(单轭合物或一个PEG与G-CSF相连)和26％的2-mer(两个轭合物或两个PEG与G-CSF相连)物质。使用阳离子交换色谱法来纯化轭合物，所述阳离子交换色谱法采用了SP琼脂糖凝胶高效交换介质和NaOAc缓冲剂。
由于PEG结构中具有可降解的键，因此预期G-CSF在生理条件下会从PEG-G-CSF轭合物中缓慢释放。其证据可见——在pH 7.4，37℃孵育时的CG-PEG2-FMOC-20K-G-CSF单轭合物的释放曲线(参见图17)，其将剩余轭合物的HPLC峰面积表示为时间的函数。由水解速率的直线图(参见图18)计算CG-PEG2-FMOC-20K-G-CSF单轭合物的半衰期为60小时。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的CG-PEG2-FMO
C-NHS试剂来制备其他的轭合物。
实施例6
使用PEG2000-二-((CH2)4-邻吡啶基二硫化物)和支链的PEG240,000-巯基使G-CSF PEG化
Figure A20068003222200791
PEG2000-二-((CH2)4-邻吡啶基二硫化物)
Figure A20068003222200792
PEG240,000-巯基
将在氩气下于-20℃贮存的PEG2,000-二-(4C-OPSS)(按美国专利申请公布文本No.2006/0135586的实施例2进行制备)加热至室温。将50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的已加热的PEG2,000-二-(4C-OPSS)溶于DMSO中形成10％的试剂溶液。将10％的试剂溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.4mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。将溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，并允许在37℃混合2小时，然后室温混合2小时。在反应完成后，将反应溶液对磷酸钠缓冲液(pH 7.0)进行透析，以除去过量的PEG2,000-二-(4C-OPSS)。
然后向透析的轭合物溶液中加入75倍过量(相对于G-CSF)的PEG240,000-巯基(Nektar Therapeutics，Huntsville AL)，随后在室温混合3小时，然后4℃过夜，形成PEG240,000-PEG2,000-G-CSF轭合物。通过SDS-PAGE和RP-HPLC对轭合物进行鉴定。如图19所示，所获得的轭合物的最终产率为35％。
实施例7(比较)
用PEG2000-二-((CH2)-邻吡啶基二硫化物)和PEG240,000-巯基进行G-CSF PEG化反应
Figure A20068003222200801
PEG2000-二-((CH2)2-邻吡啶基二硫化物)
Figure A20068003222200802
PEG240,000-巯基
大致重复实施例6的反应过程，但其使用的是低分子量的具有两个碳而不是四个碳的连接体的PEG巯基试剂。
因此，将在氩气下于-20℃贮存的PEG2,000-二-(2C-OPSS)(来自Nektar Therapeutics，Huntsville AL)加热至室温。将50倍过量(相对于测量的G-CSF储备液等分试样中的G-CSF量)的试剂溶于DMSO中形成10％的溶液。将该溶液快速加入G-CSF储备液等分试样中(0.4mg/ml磷酸钠缓冲液，pH 7.0)并充分混合。将反应溶液置于RotoMix(型号48200，Thermolyne，Dubuque IA)上，并允许在37℃混合2小时，然后室温混合2小时。在反应完成后，将反应溶液对磷酸钠缓冲液(pH 7.0)进行透析，以除去过量的PEG2,000-二-(2C-OPSS)。
然后向透析的轭合物溶液中加入75倍过量(相对于G-CSF)的支链PEG240,000-巯基(Nektar Therapeutics，Huntsville AL)，随后在室温混合3小时，然后在4℃过夜。然而，SDS-PAGE和RP-HPLC分析显示没有可可检测量的所需PEG240,000-PEG2,000-G-CSF轭合物。
该证据表明乙烯(C2)-连接的PEG-OPSS试剂经历的还原性裂解在其与目标蛋白反应前和反应后有效地破坏了该试剂。丁烯(C4)-连接的试剂对于这样的裂解更稳定，由此使其能幸存从而提供了更高产率的轭合物。
实施例8
系列rhG-CSF的PEG化
将G-CSF溶于pH 6.8的乙酸钠缓冲液形成储备液。向储备液中加入大约40摩尔过量(相对于G-CSF)的OPSS-PEG2,000道尔顿-酰肼的水溶液，以便形成反应溶液。
Figure A20068003222200811
OPSS-PEG2,000道尔顿-酰肼试剂
为使半胱氨酸与巯基反应性的邻吡啶基二硫化物基团(“OPSS”)反应，在室温将反应溶液混合3小时。然后使反应溶液通过分子排阻色谱柱，并收集与单PEG化(“1-mer”)轭合物[结构为(G-CSF)-S-S-PEG2,000道尔顿C(O)-NH-NH2]有关的峰，以便形成单PEG化组合物。
然后使用20摩尔过量的mPEG30,000道尔顿丙醛衍生物来处理单PEG化组合物，使其形成第二反应溶液。
Figure A20068003222200812
mPEG丙醛试剂
为使酰肼与醛官能团反应，在pH调节至3.8时于室温将第二反应溶液混合3小时。反应混合物的分析揭示G-CSF成功轭合，所述G-CSF具有以下结构：(rG-CSF)-S-S-PEG2,000道尔顿C(O)-NH-N＝CHCH2CH2O(CH2CH2
O)CH3。
使用与此相同的方法，可利用具有其他重均分子量的PEG-OPSS和mPEG丙醛试剂来制备其他的轭合物。
实施例9
轭合物的活性
实施例9的目的是评价表4所鉴别的人重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)轭合物的效力。
表4
所制备的PEG-G-CSF轭合物体外和体内评价总结
ID# 样品名称   蛋白质浓度(μg/ml)   体积(ml)
  01   G-CSF对照   67.8   1.8
  02   培非司亭＊   132.1   1.5
  03   实施例2A   31.6   1.8
  04   实施例2B   27.3   1.7
  05   实施例3A   47.6   1.8
  06   实施例3B   24.2   1.7
  07   实施例1A   53.0   1.2
08   mPEG-OPSS，10kDa，对照(如实施例1A所示) 27.6 1.5
  09   实施例4   51.0   1.8
  10   实施例5   31.2   1.8
＊培非司亭是重组甲硫氨酰基人G-CSF(非格司亭)与单甲氧基聚乙二醇的共价轭合物，其在商业上可由Amgen Inc.，Thousand Oaks CA获得。当以3.45mcg/kg-11.5mcg/kg给人皮下施用时，据报道非格司亭半衰期为3.5小时，清除率为0.5mL/min/kg-0.7mL/min/kg，和分布体积为150mL/kg。但是，已报道培非司亭的半衰期为15-80小时。
获得M-NFS-60鼠骨髓瘤细胞(ATCC#CRL-1838)并在添加有10％FBS(HyClone)、50μM2-巯基乙醇(Gibco)和62ng/ml人重组巨噬细胞集落刺激因子(rhM-CSF，Sigma#M6518)的RPMI-1640(ATCC#30-2001)中培养。每2-3天或每周3次将细胞传代培养。接种密度为2.5E4细胞/mL。这些细胞不是贴壁依赖性细胞。恰好在测试PEG-GCSF化合物之前，用PBS缓冲液洗涤细胞三次以除去rhM-CSF。过程如下表5。
表5
过程
  天数   活性
第0天   在不含rhM-CSF的培养基中以2.5E4细胞/mL至5E4细胞/mL制备细胞悬浮液。将细胞悬浮液加到96孔板上，每孔100μL。使用完全生长培养基(不含rhM-CSF)稀释测试化合物。通过每孔加入100μL使用测试化合物处理细胞[2×稀释并重复]。最终化合物浓度是25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL、0.195ng/mL、0.097ng/mL、0.049ng/mL、0.024ng/mL和0.012ng/mL。加入药物后接种密度减少至1.25E4细胞/mL或2.5E4细胞/mL。阴性培养基对照是不含rhM-CSF的化合物溶剂。
  第1天   在24小时，通过MTT细胞存活率试验在一组板上测定NFS-60细胞的增殖。
  第2天   在48小时，通过MTT细胞存活率试验在第二组板上测定NFS-60细胞的增殖。
  第3天   在72小时，通过MTT细胞存活率试验在第三组板上测定NFS-60细胞的增殖。
在正常雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis IN)中测定各轭合物的药效学活性。所订购的动物体重范围为150g-200g，大约6周龄。在交付后、研究开始之前，让它们适应动物房至少3天。
共有10个治疗组，每组4只大鼠。赋予每个治疗组字母(A-J)并且将大鼠随机分配至各治疗组，如表6所示。
表6
治疗组
  组   ID#   剂量   浓度   剂量体积
  A   08   100μg/kg   71.2μg/mL   1.40mL/kg
  B   07   40μg/kg   71.2μg/mL   0.56mL/kg
  C   07   100μg/kg   71.2μg/mL   1.40mL/kg
  D   04   40μg/kg   71.7μg/mL   0.56mL/kg
  E   04   100μg/kg   71.7μg/mL   1.39mL/kg
  F   06   40μg/kg   60.0μg/mL   0.67mL/kg
  G   06   100μg/kg   60.0μg/mL   1.67mL/kg
  H   09   40μg/kg   101.0μg/mL   0.40mL/kg
  I   09   100μg/kg   101.0μg/mL   0.99mL/kg
  J   02   100μg/kg   112.7μg/mL   0.89mL/kg
通过各给药溶液的浓度来确定载体和测试物质的剂量体积。每只大鼠通过皮下注射接受单剂量的测试物质、阳性对照或载体。
10组动物(每组n＝8(对于5次治疗采样n＝4))通过注射接受皮下剂量的测试物质、载体或阳性对照，采集血样进行分析。表7提供了采样安排。
表7
采样安排
  动物编号   治疗   采样时间
  1-4   A   0，24，48，96和144h
  5-8   A   12，36，72，120和168h
  9-12   B   0，24，48，96和144h
  13-16   B   12，36，72，120和168h
  17-20   C   0，24，48，96和144h
  动物编号   治疗   采样时间
  21-24   C   12，36，72，120和168h
  25-28   D   0，24，48，96和144h
  29-32   D   12，36，72，120和168h
  33-36   E   0，24，48，96和144h
  37-40   E   12，36，72，120和168h
  41-44   F   0，24，48，96和144h
  45-48   F   12，36，72，120和168h
  49-52   G   0，24，48，96和144h
  53-56   G   12，36，72，120和168h
  57-60   H   0，24，48，96和144h
  61-64   H   12，36，72，120和168h
  65-68   I   0，24，48，96和144h
  69-72   I   12，36，72，120和168h
  73-76   J   0，24，48，96和144h
  77-80   J   12，36，72，120和168h
对于初期采样，由尾静脉采集大约0.5mL全血。对于第5次/最后采样，使用二氧化碳麻醉动物并通过心脏穿刺采集最大体积的血样。心脏取样的时间点为给药后第144小时和168小时。将血样放入涂有EDTA的收集瓶中，立即混合然后在冰上贮存。在最后的采血时间点后通过颈椎脱位处死动物。记录实际的采血时间。立即将血样放于冰上，并在分析之前在大约4℃冷藏。在取样48小时内对血样进行分析。使用EDTA作为血液样品的抗凝剂。
表8中提供了血液学的测量参数和方法学。
表8
血液学的测量参数和方法学
  参数  代码   单位   方法
  白细胞计数  WBC   ×103/μL   Advia 120
  嗜中性粒细胞  Neut   ×103/μL   Advia 120
  淋巴细胞  Lymph   ×103/μL   Advia 120
  嗜酸性粒细胞  Eosin   ×103/μL   Advia 120
  单核细胞  Mono   ×103/μL   Advia 120
  嗜碱性粒细胞  Baso   ×103/μL   Advia 120
在图20和图21中对各测试化合物的活性进行了说明。每幅图描述了作为浓度函数的NFS细胞的生长％。两幅图的差别在于孵育的时长，即图20为48小时，图21为72小时。
结果表明当与各测试的PEG-GCSF轭合物相比时，GCSF在更低浓度具有活性。为了更好地比较图中的结果，将数据标准化并直接与天然的GCSF比较。计算EC50(ng/mL)活性。下表进行了比较。
表9
G-CSF(ID#1)与测试化合物的活性比较
  ID#   EC50活性(ng/mL)   变化
  1   0.012   0
  2   0.097   8×
  7   0.195   16×
  3   0.39   32×
  4   0.39   32×
  5   0.39   32×
  6   0.39   32×
  8   0.00   N/A
  9   0.78   64×
  10   1.56   128×
结果表明培非司亭(ID#2)的效力比天然GCSF(ID#1)低8倍，实施例1A制备的轭合物(ID#7)的效力低16倍，实施例2A、2B、3A和3B制备的各轭合物的效力低32倍，即1.5个对数减小。可释放的轭合物并不是非常有效，因为PEG化被认为是非选择性的。但是，预期可释放的轭合物会释放具有活性GCSF分子，该活性GCSF分子将具有天然化合物的完全活性。如所预期的，聚合物试剂对照(ID#8)不具有任何活性。
还观察到在0.097ng/mL以下的浓度时，天然GCSF(ID#1)和培非司亭的活性比半胱氨酸轭合的化合物更佳。但是在0.097ng/mL以上的浓度时，观察到相反的现象(即天然GCSF和培非司亭的细胞增殖活性变平，而PEG-GCSF样品显示出持续的增长)。
就体内活性而言，对嗜中性粒细胞和白细胞进行计数和比较。在以下各图中，将计数作图(两种剂量)并与培非司亭(N末端PEG化的GCSF)进行比较。在所有图中，在40μg/kg至100μg/kg剂量之间观察到微小但是可见的剂量反应。
总之，基于半胱氨酸的GCSF轭合物在体外和体内显示阳性活性。实施例1A的轭合物似乎具有最接近培非司亭的活性。所测定的实施例2A、2B、3A和3B轭合物的活性没有显著差异。可释放的轭合物也显示阳性活性。
序列表
SEQ ID NO：1
(Met)n″′
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1               5                   10                  15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
            20                  25                  30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
    50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
                85                  90                  95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
    130                 135                 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145                 150                 155                 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170
(n″′＝0或1)
SEQ ID NO：2
(Met)n″′
Ala Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1               5                   10                  15
Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
            20                  25                  30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
        35                  40                  45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
    50                  55                  60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
                85                  90                  95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
    130                 135                 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145                 150                 155                 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
                165                 170
(n″′＝0或1)
SEQ ID NO：3
(Met)n″′
Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln
1                5                  10                  15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
            20                  25                  30
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
        35                  40                  45
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
    50                  55                  60
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
65                  70                  75                  80
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
                85                  90                  95
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
            100                 105                 110
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
        115                 120                 125
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
    130                 135                 140
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
                165                 170                 175
Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
            180                 185                 190
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
(n″′＝0或1)

Claims (20)

1. 一种轭合物，其包括G-CSF部分的残基，所述G-CSF部分直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分经由可降解的键共价地连接于水溶性聚合物。
2. 根据权利要求1所述的轭合物，其中所述可降解的键是可裂解的键。
3. 根据权利要求1所述的轭合物，其中所述G-CSF部分的氨基用作共价连接的位点。
4. 根据权利要求1所述的轭合物，其具有以下结构：
Figure A2006800322220002C1
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离的氢原子；
R1是H或有机基；
R2是H或有机基；
(a)是0或1；
(b)是0或1；
Re1存在时，为第一电子变更基团；
Re2存在时，为第二电子变更基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；且
G-CSF是G-CSF部分的残基。
5. 根据权利要求4所述的轭合物，其选自由以下组成的组：
Figure A2006800322220003C1
Figure A2006800322220003C2
和
Figure A2006800322220003C3
其中(n)为3至4,000，且G-CSF为G-CSF部分的残基。
6. 根据权利要求1、2、3、4和5任一项所述的轭合物，其中所述G-CSF部分是重组人G-CSF或具有N末端甲硫氨酰基残基的重组人G-CSF。
7. 一种轭合物，其具有以下结构：
POLY″-(X2)b-POLY′-(X1)a-(G-CSF)
其中：
POLY″是第二水溶性聚合物；
POLY′是第一水溶性聚合物；
X1存在时，为包括一个或多个原子的任选的间隔部分；
X2为包括一个或多个原子的间隔部分；
(b)是1；
(a)是0或1；且
G-CSF是G-CSF部分的残基。
8. 根据权利要求7所述的轭合物，其中POLY″是支链的聚合物。
9. 根据权利要求8所述的轭合物，其中所述支链的聚合物包括选自由以下组成的组的结构：
Figure A2006800322220004C1
其中每一(n)独立地为具有3至4000的值的整数；和
Figure A2006800322220004C2
其中每一(n)独立地为具有3至4000的值的整数。
10. 根据权利要求7所述的轭合物，其中POLY″是直链聚合物。
11. 根据权利要求7所述的轭合物，其中所述G-CSF部分的巯基用作共价连接所述第一水溶性聚合物的位点，或者当所述任选的间隔部分存在时，用作共价连接所述任选的间隔部分的位点。
12. 根据权利要求11所述的轭合物，其具有以下结构：
CH3-O(CH2CH2O)n′-[CH2]2-8-S-S-[CH2]2-8-O(CH2CH2O)n-[CH2]2-8-S-S-(G-CSF)其中(n)是2至约114的整数，n′是2至约3,400的整数，G-CSF是G-CSF部分的残基。
13. 根据权利要求11所述的轭合物，其具有以下结构：
Figure A2006800322220005C1
其中(n)是2至约114的整数，n′是2至约3,400的整数，且G-CSF是G-CSF部分的残基。
14. 根据权利要求7、8、9、10、11、12和13任一项所述的轭合物，其中所述G-CSF部分是重组人G-CSF或具有N末端甲硫氨酰基残基的重组人G-CSF。
15. 一种用于制备轭合物的方法，所述方法包括在足以使轭合物形成的条件下，将聚合物试剂与G-CSF部分结合，所述轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的间隔部分共价连接于水溶性聚合物的G-CSF部分的残基，其中所述G-CSF部分在半胱氨酸残基侧链处共价连接，并且其中所述方法(a)缺少引入变性条件的步骤，和(b)在低于8.5的pH进行或缺少添加洗涤剂的步骤。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述半胱氨酸残基对应于hG-CSF的第17位半胱氨酸。
17. 根据权利要求15和16任一项所述的方法，其中所述G-CSF部分是重组人G-CSF或具有N末端甲硫氨酰基残基的重组人G-CSF。
18. 一种用于制备轭合物的方法，所述方法包括：在足以得到包括第一轭合物的第一轭合物组合物的条件下，向G-CSF部分组分添加第一聚合物试剂组分，所述第一轭合物包括直接或通过包括一个或多个原子的第一间隔部分共价连接于第一水溶性聚合物的G-CSF部分的残基；和向所述第一轭合物组合物添加第二聚合物试剂组分，从而得到第二轭合物组合物，所述第二轭合物组合物包括第二水溶性聚合物直接或通过包括一个或多个原子的第二间隔部分连接于所述轭合物的所述第一水溶性聚合物。
19. 一种组合物，其根据权利要求15所述的方法制备。
20. 一种组合物，其根据权利要求18所述的方法制备。
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