ES2523030T3 - Un conjugado del G-CSF modificado por un polímero hidrosoluble - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de fórmula general (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo: en la que,**Fórmula** R se elige de entre alquilo C1-4 lineal o ramificado, preferiblemente metilo o etilo, más preferiblemente metilo; R1 y R2 se eligen cada uno independientemente de entre hidrógeno o alquilo C1-4 lineal o ramificado; preferiblemente hidrógeno, metilo o etilo; X se elige de entre O, S, NH,**Fórmula** I es un número entero elegido de entre 1 - 20, preferiblemente de entre 1 - 10, más preferiblemente de entre 1 - 5; m es un número entero elegido de entre 50 - 2.500, preferiblemente de entre 100 - 1.000; n es un número entero elegido de entre 1 - 20, preferiblemente de entre 1 - 10, más preferiblemente de entre 1 - 5; el G-CSF se elige de entre el G-CSF natural, el G-CSF recombinante o el producto de una mutación génica que tenga la función del G-CSF.

Description

Un conjugado del G-CSF modificado por un polímero hidrosoluble
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un conjugado del G-CSF modificado por un polímero hidrosoluble con la fórmula (I): un polímero hidrosoluble-grupo conector-N-terminal del G-CSF, o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, al procedimiento de preparación del mismo y a la composición farmacéutica que comprende el mismo. En particular, se refiere a un conjugado del G-CSF de fórmula general (II).
Antecedentes de la invención
El factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) es producido por las células mononucleares y los fibroblastos. Puede estimular a los granulocitos para que formen colonias, y tiene un efecto estimulante sobre los neutrófilos. Mediante su combinación con los receptores de la membrana de la célula objetivo, el G-CSF estimula principalmente la hematopoyesis de los granulocitos y también promueve que las células madre hematopoyéticas multipotenciales entren en el ciclo celular; promueve la proliferación, la diferenciación y la maduración de los precursores hematopoyéticos mieloides, e impulsa la liberación de los neutrófilos en la sangre, mientras que aumenta el número de neutrófilos periféricos y mejora su función, tal como la fagocitosis, la actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpo frente a células tumorales, etc. [Metcalf, Blood 67: 257 (1986); Yan y col., Blood 84 (3): 795 -799 (1994); Bensinger, y col., Blood 81(11): 3158 -3163 (1993); Neben, y col., Blood 81 (7): 1960 1967 (1993)]. Por lo tanto, el factor estimulante de las colonias de granulocitos recombinante se usa habitualmente en pacientes oncológicos sometidos a radioterapia o a quimioterapia, y en pacientes de leucemia tras un trasplante de médula ósea, como un tratamiento coadyuvante.
Los G-CSFs humanos usados habitualmente en el mercado son Neupogen y Neutrogin, y el derivado del G-CSF humano, es decir Neu-wp. Los derivados del G-CSF o las proteínas variantes también son mencionados en numerosa literatura [tales como el documento US5581476, el documento US5214132, el documento US5362853, el documento US4904584]. Estas proteínas variantes tienen múltiples sustituciones de aminoácidos que se han diseñado para explorar un G-CSF que es más estable, más activo y más adecuado para su uso clínico.
El G-CSF recombinante humano disponible comercialmente debe ser inyectado con frecuencia, y es difícil conseguir buenos efectos clínicos debido a su baja biodisponibilidad, a su corta semivida en el cuerpo humano y a su vulnerabilidad a las proteasas in vivo. La investigación muestra que la posibilidad de que las proteínas con aplicaciones terapéuticas se transformen en fármacos está muy aumentada tras ser modificadas con polietilenglicol para pasar a ser un conjugado de PEG -proteína. Este tipo de proteínas PEGiladas se han aplicado completamente en la práctica clínica [tal como Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10: 91(1993); Inada; y col.; J. Bioact y Compatible Polymers; 5: 343(1990)]. Los conjugados de proteína modificada con polietilenglicol no sólo tienen una mejor estabilidad física y química, sino también una mejor resistencia a las proteasas; además, al aumentar el peso molecular de los conjugados, se amplía la semivida de los conjugados in vivo. La toxicidad se reducirá debido a la baja posibilidad de producir anticuerpos in vivo y al reducido volumen de distribución de los conjugados en comparación con las proteínas originales. Las proteínas variantes del G-CSF o del G-CSF modificadas con PEG se han desvelado en numerosaliteratura, tales como en el documento EP0335423, en el documento EP0401384, en el documento US5824778, en el documento US5985265, en el documento WO0044785, en el documento WO2001051510, en el documento US5824784, etc. Específicamente, de entre los conjugados modificados con polietilenglicol del G-CSFs desvelados por la patente US5985265, los conjugados modificados en el N terminal del G-CSF tiene las mejores actividades biológicas tanto in vitro como in vivo. Pero la selectividad del grupo amino es baja cuando la modificación con polietilenglicol se realiza a través de una reacción de acilación, por lo que generalmente se obtiene una forma mixta de la modificación en varias posiciones (grupo amino) del G-CSF por el polietilenglicol. Se requiere una separación y una purificación para obtener cada monómero con un bajo rendimiento, y son difíciles de aplicar en la elaboración industrial. En la patente US5824784, se usó aldehído de polietilenglicol con un elevado peso molecular para modificar directamente el G-CSF. Controlando estrictamente el pH de la reacción, pueden obtenerse conjugados modificados con PEG N-terminales relativamente específicos. Indiscutiblemente, sin embargo, la reacción con elevada selectividad se consigue mediante los diferentes Pka entre el grupo amino de la cadena lateral y el grupo amino N-terminal, lo que es muy difícil de controlar en la escala de producción. Además, debido al contenido variable en cada lote de aldehídos del aldehído de polietilenglicol con un elevado peso molecular, es difícil controlar la proporción de suministro entre los aldehídos macromoleculares y las proteínas, lo que afectará definitivamente al rendimiento de la reacción y a los costes de producción. Mientras tanto, la diferente actividad biológica de los conjugados producidos mediante aldehídos macromoleculares acoplados con diferentes grupos amino afectará también a la homogeneidad y a la actividad del producto final.
El documento WO 2005/0055946 (D1) describe un GCSF glucopegilado.
El documento WO 2007/019331 (D2) describe conjugados de una fracción del GCSF y un polímero.
Descripción de la invención
En vista de las deficiencias de la técnica anterior, el propósito de la presente invención es proporcionar un conjugado del G-CSF con una nueva estructura, de fórmula general (II), o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Otro propósito de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la preparación del conjugado de fórmula general (II) o de sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que contiene dichos conjugados o sales farmacéuticamente aceptables y usos de los mismos.
La presente invención se refiere a un conjugado de fórmula general (I) o a sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
El G-CSF se elige de entre el G-CSF natural, el G-CSF recombinante o el producto de una mutación génica que tenga la función del G-CSF, preferiblemente el G-CSF es un derivado del G-CSF establecido en las ID. SEC. Nº: 1 10, más preferiblemente el G-CSF es la secuencia del G-CSF humano natural o Met-G-CSF establecida en la ID. SEC. Nº: 1.
en la que,
R se elige de entre alquilo C1-4 lineal o ramificado, preferiblemente R es metilo o etilo, más preferiblemente R es metilo; R1 y R2 se eligen cada uno independientemente de entre hidrógeno o alquilo C1-4 lineal o ramificado;
preferiblemente R1, R2 son hidrógeno, metilo o etilo; X se elige de entre O, S, NH,
1 es un número entero elegido de entre 1 -20, preferiblemente 1 es un número entero elegido de entre 1 -10, más preferiblemente 1 es un número entero elegido de entre 1 -5;
m es un número entero elegido de entre 50 -2.500, preferiblemente m es un número entero elegido de entre 100 -1.000;
n es un número entero elegido de entre 1 -20, preferiblemente n es un número entero elegido de entre 1 -10, más preferiblemente n es un número entero elegido de entre 1 -5;
el G-CSF se elige de entre el G-CSF natural, el G-CSF recombinante o los productos de una mutación génica con la función del G-CSF.
Además, la presente invención se refiere al anterior conjugado de fórmula general (II) o a sales farmacéuticas del mismo, en los que el G-CSF tiene una secuencia del G-CSF humano natural.
Además, la presente invención se refiere al anterior conjugado de fórmula general (II) o a sales farmacéuticas del mismo, en los que el G-CSF es Met-G-CSF (ID. SEC. Nº: 1).
Los anteriores conjugados de fórmula general (II) incluyen:
m es un número entero elegido de entre 400 -500;
m es un número entero elegido de entre 400 -500;
5 Adicionalmente, los conjugados de fórmula general (II) pueden reaccionar con ácidos para formar sales. Los ácidos usados se eligen de entre ácidos orgánicos o ácidos inorgánicos, en los que los ácidos orgánicos se eligen de entre ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido maleico o ácido p-toluensulfónico o mezclas de los mismos. Preferiblemente, los ácidos orgánicos son ácido acético, ácido trifluoroacético. Los ácidos inorgánicos se eligen de entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido o sulfónico o mezclas de los
10 mismos. Preferiblemente el ácido inorgánico es el ácido clorhídrico.
Por otro lado, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de los conjugados de fórmula general (II) que incluye las siguientes etapas de:
1) hacer reaccionar el compuesto de fórmula general (III) con el grupo amino N-terminal del G-CSF mediante una aminación reductora para obtener el compuesto de fórmula general (IV):
2) eliminar el grupo protector del grupo tiol del compuesto de fórmula general (IV) para obtener el compuesto de fórmula general (V):
3) hacer reaccionar el compuesto de fórmula general (V) con mPEG-MAL mediante una adición de Michael para obtener el conjugado de fórmula general (II):
en la que,
R, R1, R2, G-CSF, X, 1, m, n se definen como anteriormente;
Z es un grupo protector de mercapto elegido de entre un grupo formilo, acetilo, propionilo, tritilo o terc-butilo, 5 preferiblemente Z es un grupo acetilo.
Además, la presente invención también se refiere al uso del conjugado o de sales farmacéuticas del mismo proporcionados por la presente invención en la preparación de los medicamentos para el tratamiento de una leucopenia causada por radioterapia o por quimioterapia, del SIDA y de otras enfermedades inmunodeficitarias, de infecciones bacterianas.
10 Por otro lado, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene una cantidad farmacéuticamente eficaz del conjugado o de sales farmacéuticamente aceptables del mismo proporcionados por la presente invención y vehículos farmacéuticamente aceptables.
Además, la presente invención también se refiere al uso de dichas composiciones farmacéuticas en la preparación de los medicamentos para el tratamiento de la leucopenia causada por radioterapia o por quimioterapia, del SIDA y
15 de otras enfermedades inmunodeficitarias, de infecciones bacterianas.
La presente invención desvela un nuevo conjugado del G-CSF modificado por PEG y un nuevo procedimiento de preparación del mismo. En comparación con los conjugados y los procedimientos de preparación tradicionales del mismo, existen las siguientes diferencias:
En primer lugar, la introducción de un grupo conector entre el PEG y el G-CSF puede asegurar la especificidad
20 de la reacción en el N-terminal de la proteína, ya que la proteína modificada con moléculas pequeñas en su Nterminal puede ser fácilmente separada y purificada, asegurando la especificidad del sitio modificado;
En segundo lugar, dada la presencia del grupo tiol en el grupo conector, el control del pH del sistema de reacción asegurará que se lleve a cabo una reacción de adición de Michael con una elevada especificidad;
Además, debido a la existencia del grupo conector, también pueden unirse otros grupos funcionales, tal como la
25 introducción de un grupo imido, de un grupo éster, que proporcione unas precondiciones para la liberación in vivo del G-CSF desde los conjugados.
Los conjugados de la presente invención o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos tienen la actividad fisiológica del G-CSF humano natural, y una semivida in vivo circulante más larga y una mejor actividad del factor estimulante de las colonias de granulocitos que el G-CSF.
30 Específicamente, la estructura del conjugado desvelado por la presente invención se muestra como (II):
en la que,
R se elige de entre alquilo C1-4 lineal o ramificado, preferiblemente R es metilo o etilo, más preferiblemente R es metilo; R1 y R2 se eligen independientemente de entre hidrógeno o alquilo C1-4 lineal o ramificado; preferiblemente R1, R2 son hidrógeno, metilo o etilo; X se elige de entre O, S, NH,
1 es un número entero elegido de entre 1 -20, preferiblemente 1 es un número entero elegido de entre 1 -10, más preferiblemente 1 es un número entero elegido de entre 1 -5; m es un número entero elegido de entre 50 -2.500, preferiblemente m es un número entero elegido de entre 100 -1.000; n es un número entero elegido de entre 1 -20, preferiblemente n es un número entero elegido de entre 1 -5; el G-CSF se elige de entre el G-CSF natural, el G-CSF recombinante o los productos de una mutación génica con la función del G-CSF.
Cuando X es O, S, hay un enlace éster susceptible de una hidrólisis in vivo por la esterasa en el grupo conector entre el PEG y el G-CSF. En ese momento, el G-CSF en su forma libre puede interactuar con su receptor para mostrar actividad biológica; cuando X es NH,
la actividad biológica se consigue principalmente por el conjugado per se. Por supuesto, debido a que el enlace imido también tiene la capacidad de liberar el G-CSF a través de una hidrólisis in vivo, no puede descartarse la posibilidad de que actúe el G-CSF libre.
En los procedimientos de preparación desvelados por la presente invención, se obtiene en primer lugar el intermedio
(IV) mediante la reacción del grupo conector que contiene el grupo tiol con el grupo amino N-terminal del G-CSF mediante una aminación reductora. De hecho, el grupo conector y el grupo amino del G-CSF pueden estar conectados mediante varios procedimientos de reacción (tales como la reacción de varios ésteres activados con el grupo amino). Pero teniendo en cuenta la elevada selectividad de la reacción entre el grupo aldehído y el grupo amino N terminal, en la presente invención el conector es introducido mediante la reacción del grupo aldehído con el grupo amino N terminal mediante la aminación reductora. El agente reductor usado en la presente invención se elige de entre varios agentes reductores bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, los agentes reductores son cianoborhidruro de sodio, triacetoxi borhidruro.
En la preparación del intermedio (V), las diferentes condiciones de reacción se eligen de acuerdo con los diferentes grupos protectores del tiol. Cuando el grupo protector es tritilo o terc-butilo, se usan unas condiciones ácidas (tales como ácido trifluoroacético, ácido clorhídrico, ácido metansulfónico, etc.) para eliminar el grupo protector. Cuando el grupo protector es acetilo, propionilo, etc., se usan varios procedimientos, reactivos que son bien conocidos por la persona experta en la técnica para eliminar el grupo protector, preferiblemente se usa clorhidrato de hidroxilamina para eliminar el grupo protector a pH 5 -7.
En la preparación del compuesto de fórmula general (II), la reacción se realiza controlando el pH y mediante el uso de la adición de Michael clásica. Dicha reacción tiene una buena selectividad de hasta más del 99 %. Después de la reacción, el producto de reacción puede separarse y purificarse mediante una cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC), una columna de intercambio iónico o una columna de gel.
En la presente invención, "alquilo C1-4" significa un alquilo lineal o ramificado, tal como el grupo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, y así sucesivamente.
En la presente invención, el G-CSF se elige preferiblemente de entre el G-CSF humano. La ausencia de variaciones en la secuencia interna de esta proteína puede reducir la antigenicidad de la proteína in vivo y reducir al máximo la formación de anticuerpos neutralizantes in vivo para mejorar la eficacia farmacológica. El G-CSF y sus proteínas variantes, incluyen, pero no se limitan a, Met-G-CSF, Trp-G-CSF, Asp-G-CSF, Glu-G-CSF, preferiblemente Met-G-CSF (para su secuencia, véase la ID. SEC. Nº: 1) que es expresada por E. coli, puede obtenerse mediante el uso de los procedimientos tradicionales de expresión génica referidos en la literatura.
El compuesto obtenido mediante la presente invención es administrado en unidades de dosificación. Dichas
unidades de dosificación pueden expresarse mejor como la composición farmacéutica mezclada con los compuestos activos y los excipientes farmacéuticos en forma de una formulación.
En la composición farmacéutica proporcionada por la presente invención, los conjugados de fórmula general (II) o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos son compuestos activos. La composición farmacéutica 5 proporcionada por la presente invención puede usarse en la terapia coadyuvante para pacientes oncológicos sometidos a quimioterapia o a radioterapia, y para pacientes sometidos a un trasplante de médula ósea, con objeto de prevenir infecciones debidas a una reducción en la inmunidad. También puede usarse para el tratamiento de pacientes con leucopenia crónica o relativa, para el tratamiento de pacientes con leucemia mieloide aguda, con SIDA o con otras enfermedades inmunodeficitarias, y también para el tratamiento de hongos, especialmente para las
10 infecciones por candidiasis sistémicas o invasivas.
La dosis de administración de los conjugados de fórmula general (II) o de las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos es de 5 -500 g/kg, en la que "g" se refiere a la unidad de los conjugados de fórmula general (II) o de las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, "kg" se refiere a la unidad de peso corporal del mamífero. Se sabe que la dosis y la frecuencia de administración dependen de muchos factores, tales como sexo, la edad del
15 paciente, el tipo de enfermedades que necesitan prevención o tratamiento en el paciente.
Pueden prepararse varias formas de formulación mediante la mezcla de los conjugados o de las sales farmacéuticamente aceptadas de los mismos proporcionados por la presente invención con vehículos farmacéuticos convencionales, que pueden ser administrados mediante diferentes vías tales como la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa.
20 Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un diagrama de MALDI-TOF-TOF del compuesto 1 proporcionado por la presente invención;
La Figura 2 muestra un diagrama de MALDI-TOF-TOF del compuesto 2 proporcionado por la presente invención;
La Figura 3 muestra el efecto del PEG-G-CSF, del G-CSF sobre el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos de los ratones tratados con ciclofosfamida;
25 La Figura 4 muestra el efecto del PEG-G-CSF, del G-CSF sobre el recuento de glóbulos rojos sanguíneos periféricos de los ratones tratados con ciclofosfamida;
La Figura 5 muestra el efecto del PEG-G-CSF, del G-CSF sobre el recuento de plaquetas periféricas de los ratones tratados con ciclofosfamida.
Formas de realización preferidas
30 Para una descripción más detallada de la presente invención, se proporcionan los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Aminación reductora del Met-G-CSF
Met-G-CSF (pH = 5,0): 40 mg/140 ml
7,0 mg
35 Cianoborhidruro de sodio: 176 mg
La disolución original de Met-G-CSF se dializó frente a una disolución de ácido acético 0,1 M / acetato de sodio, a partir de la cual se extrajeron 140 ml de una disolución que contenía 40 mg de proteínas. La pequeña molécula de aldehído (7,0 mg) se extrajo y se disolvió en acetonitrilo (300 ml), que se añadió a una disolución de proteínas, después se añadió cianoborhidruro de sodio (176 mg) y la reacción se llevó a cabo durante 3 horas a la temperatura
40 ambiente con agitación.
La disolución de reacción se dializó frente a una disolución de PBS 0,1 M (pH = 6,2) que contenía EDTA 2 mM a 4 °C.
Ejemplo 2
Desprotección del grupo protector del grupo tiol -grupo acetilo
45 Se añadieron 10 ml de clorhidrato de hidroxilamina 0,1 M preparado (pH = 6,3) a la disolución proteica preparada en el Ejemplo 1 para llevar la concentración de clorhidrato de hidroxilamina a 50 mM. La reacción se llevó a cabo
agitando durante 30 minutos a la temperatura ambiente para liberar el grupo tiol mediante la eliminación del grupo acetilo.
Ejemplo 3
Preparación de mPEG-Met-G-CSF (39 KD)
Se añadió mPEG-MAL (400 mg, 20 KD) a la disolución proteica preparada en el Ejemplo 2, y la reacción se llevó a cabo mediante agitación durante 60 minutos a la temperatura ambiente. La purificación se llevó a cabo después de un control por HPLC que mostraba que la reacción había terminado. El compuesto obtenido era el compuesto 1 de la presente invención. La estructura se confirmó mediante MALDI -TOF-TOF según se muestra en la Figura 1.
Condiciones de control:
Columna: Jupiter C4, 5 u, 300 Å, 150 * 4,6
Fase móvil: A: 0,05 % de TFA / H2O B: 0,05 % de TFA / CH3CN
Condiciones del gradiente:
A B
0’ 60 % 40 % 30’ 20 % 80 % 35’ 20 % 80 % 36’ 60 % 40 %
Condiciones de la purificación:
La columna (1,6 cm x 12 cm, el volumen era de aproximadamente 24 ml, caudal: 4 ml/min) se llenó con SP Sepharose HP,
Pretratamiento de la columna: la columna se lavó con un volumen de 5 veces el volumen de la columna de la disolución de NaOH 0,5 M; y después se lavó hasta pH neutro con agua purificada; finalmente la columna se equilibró HAc / NaAc 20 mM, pH 4,0, el volumen usado para equilibrar era 5 veces el volumen de la columna.
Carga de la muestra: la muestra desalinizada fue succionada directamente en la columna mediante el uso de una bomba;
Elución: en primer lugar la columna se eluyó con HAc / NaAc 20 mM, pH 4,0 cuyo volumen era 10 veces el volumen de la columna, para eliminar el exceso de PEG;
Entonces se estableció un gradiente salino del 0 al 50 % con un tiempo de análisis de 50 min a 4 ml/min. Las impurezas, los productos y las proteínas sin reaccionar diluyeron y fueron recogidos por turnos.
Ejemplo 4
Preparación de mPEG-Met-G-CSF (59 KD)
El procedimiento de preparación y purificación es el mismo que el del Ejemplo 3, excepto porque el mPEG-MAL (400 mg, 20 KD) se sustituyó por mPEG-MAL (800 mg, 40 KD). El compuesto obtenido es el compuesto 2 de la presente invención, cuyo MALDI-TOF-TOF se muestra en la Figura 2.
Ejemplo 5
Preparación de la disolución inyectable de mPEG-Met-G-CSF (39 KD) es decir, del compuesto 1
Acetato de sodio: 0,12 g
Polisorbato 20 35 mg
Sorbitol: 50 g Compuesto 1:10 g En la sala aséptica de preparación se pesaron acetato de sodio (0,12 g), polisorbato 20 (35 mg), sorbitol (50 g) y se disolvieron en agua inyectable (1.000 ml) con agitación. Se añadió el compuesto 1 (10 g) y se agitó hasta uniformidad, y se añadió el agua inyectable hasta un volumen final de 3.000 ml. Después de filtrar con una membrana microporosa de 0,22 m, la disolución se envasó y se tapó con un tapón esterilizado y se selló.
Ensayo 1
Comparación del efecto entre el PEG-G-CSF y el G-CSF sobre el aumento en el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos
Nota: el PEG-G-CSF se refiere a los compuestos 1 de la presente invención.
1.
Propósito del ensayo
Evaluar y comparar el efecto del PEG-G-CSF y del G-CSF sobre el aumento en el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos de los ratones tratados con ciclofosfamida.
2.
Materiales y procedimientos:
El PEG-G-CSF, el G-CSF y la ciclofosfamida (CTX) fueron proporcionados por Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co., Ltd. y diluidos con disolución salina antes de su uso.
Los ratones Kunming hembra fueron adquiridos en el Shanghai Experimental Animal Center de la Chinese Academy of Sciences, con un peso de 18 -22 g con un número de 10 animales en cada grupo.
Después de la adaptación de los animales al entorno, se administró ciclofosfamida mediante una inyección intraperitoneal, y se administró el PEG-G-CSF, el G-CSF mediante una inyección subcutánea al día siguiente. El PEG -G-CSF se inyectó subcutáneamente a 0,5, 1,0 mg / kg una vez; el G-CSF se inyectó subcutáneamente una vez al día durante 4 días consecutivos con las dosis de 0,1, 0,2 mg / kg. Después de la administración, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical y se contaron las células sanguíneas con un contador automático de células sanguíneas ABC.
3. Resultados
La inyección intraperitoneal de CTX disminuye significativamente el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos, de glóbulos rojos sanguíneos, de plaquetas (P promedio < 0,01 en comparación con el control, Figuras 3 -5), lo que indica que el CTX es un fuerte inhibidor de la médula ósea.
Una única inyección subcutánea de PEG-G-CSF en ratones tratados con ciclofosfamida aumenta el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos. Cuando se administran 0,5 mg/kg, el recuento de glóbulos blancos vuelve a los niveles normales. Cuando se administran 1,0 mg/kg, el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos es incluso mayor que el nivel normal (P < 0,01 en comparación con el control, Figura 3). Sin embargo, el PEG-G-CSF no tiene un efecto obvio de aumento sobre el recuento de glóbulos rojos sanguíneos periféricos o sobre el recuento de plaquetas (Figura 4, 3), lo que indica que el efecto del PEG-G-CSF es específico.
La inyección subcutánea continua de G-CSF en ratones tratados con ciclofosfamida también aumenta el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos. Cuando se administran 0,1 mg/kg, el recuento de glóbulos blancos sanguíneos aumenta hasta el nivel normal; cuando se administran 0,2 mg/kg, el recuento de glóbulos blancos sanguíneos es mayor que el nivel normal (P < 0,01 en comparación con el control, Figura 3), lo que muestra una obvia dependencia de la dosis. Pero el G-CSF no tiene un efecto significativo sobre los glóbulos rojos sanguíneos periféricos, el recuento de plaquetas (Figuras 4, 5).
De acuerdo con los resultados, en el caso de que la cantidad total administrada sea equivalente en el PEG-G-CSF y en el G-CSF, una única inyección subcutánea de PEG-G-CSF y múltiples inyecciones subcutáneas de G-CSF tienen una eficacia equivalente sobre el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos en los ratones.
4. Conclusiones
El PEG-G-CSF y el G-CSF aumentan, ambos, significativamente el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos de los ratones tratados con ciclofosfamida. En el caso de que la cantidad total administrada sea equivalente, una única inyección subcutánea del compuesto 1 de la presente invención y múltiples inyecciones subcutáneas del G-CSF tienen una eficacia equivalente sobre el recuento de glóbulos blancos sanguíneos periféricos en los ratones.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.
<120> Conjugado del G-CSF modificado por un polímero hidrosoluble
<130> GECCX/P46708EP
<140> EP 08706693.2
<141> 18-02-08
<150> PCT/CN2008/070320
<151> 18-02-08
<160> 10 5
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 175 10 <212> PRT
<213>
<400> 1
<210> 2
<211> 174
<212> PRT 20 <213>
<400> 2
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213>
<400> 3
<210> 4
<211> 174
<212> PRT 15 <213>
<400> 4
<210> 5
<211> 175
<212> PRT
<213>
<400> 5
<210> 6
<211> 175
<212> PRT 15 <213>
<400> 6
<210> 7
<211> 175
<212> PRT
<213>
<400> 7
<210> 8
<211> 175
<212> PRT 15 <213>
<400> 8
<210> 9
<211> 175
<212> PRT
<213>
<400> 9
<210> 10
<211> 175
<212> PRT 15 <213>
<400> 10

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado de fórmula general (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    en la que,
    R se elige de entre alquilo C1-4 lineal o ramificado, preferiblemente metilo o etilo, más preferiblemente metilo; R1 y R2 se eligen cada uno independientemente de entre hidrógeno o alquilo C1-4 lineal o ramificado; preferiblemente hidrógeno, metilo o etilo; X se elige de entre O, S, NH,
    10 I es un número entero elegido de entre 1 -20, preferiblemente de entre 1 -10, más preferiblemente de entre 1 -5; m es un número entero elegido de entre 50 -2.500, preferiblemente de entre 100 -1.000; n es un número entero elegido de entre 1 -20, preferiblemente de entre 1 -10, más preferiblemente de entre 1 -5; el G-CSF se elige de entre el G-CSF natural, el G-CSF recombinante o el producto de una mutación génica que tenga la función del G-CSF.
    15 2. Un conjugado o una sal farmacéutica aceptable del mismo de la reivindicación 1, en el que el G-CSF se elige de entre derivados del G-CSF de una proteína establecida en la ID. SEC. Nº: 1 -10.
  2. 3. Un conjugado o una sal farmacéutica aceptable del mismo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de dicho G-CSF es la secuencia del G-CSF humano natural.
  3. 4. Un conjugado o una sal farmacéutica aceptable del mismo de la reivindicación 1, en el que dicho G-CSF es el 20 Met-G-CSF mostrado en la ID. SEC. Nº: 1.
  4. 5. Un conjugado o una sal farmacéutica aceptable del mismo de la reivindicación 1, en el que dicho conjugado incluye:
    m es un número entero elegido de entre 400 -500; o
    m es un número entero elegido de entre 400 -500.
  5. 6. Un conjugado o una sal farmacéutica aceptable del mismo de la reivindicación 1, en el que dicho conjugado reacciona con un ácido para formar una sal, en los que el ácido se elige de entre ácidos orgánicos o inorgánicos.
  6. 7.
    Un conjugado o una sal farmacéutica aceptable del mismo de la reivindicación 6, en el que dicho ácido orgánico se elige de entre ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido maleico o ácido ptoluensulfónico o mezclas de los mismos, preferiblemente acético ácido o ácido trifluoroacético; el ácido inorgánico se elige de entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido metansulfónico, o mezclas de los mismos, preferiblemente ácido clorhídrico.
  7. 8.
    Un procedimiento de preparación de un conjugado de la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas de:
    1) hacer reaccionar compuestos de fórmula general (III) con el grupo amino N-terminal del G-CSF mediante una aminación reductora para obtener los compuestos de fórmula general (IV):
    2) eliminar el grupo protector del mercapto de los compuestos de fórmula general (IV) para obtener los compuestos de fórmula general (V):
    3) hacer reaccionar los compuestos de fórmula general (V) con mPEG-MAL mediante una reacción de adición de Michael para obtener los compuestos (II):
    en las que, R, R1, R2, G-CSF, X, I, m y n son según se define en la reivindicación 3; Z es un grupo protector de mercapto elegido de entre un grupo formilo, acetilo, propionilo, tritilo o terc-butilo, preferiblemente un grupo acetilo.
    20 9. El uso de un conjugado o de una sal farmacéutica del mismo de la reivindicación 1 en la preparación de medicamentos para el tratamiento de la leucopenia causada por radioterapia o por quimioterapia, SIDA y de otras enfermedades inmunodeficitarias, de infecciones bacterianas.
  8. 10. Un conjugado o una sal farmacéutica del mismo de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de la
    leucopenia causada por radioterapia o por quimioterapia, SIDA y otras enfermedades inmunodeficitarias, de 25 infecciones bacterianas.
  9. 11. Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del conjugado o de una sal farmacéutica del mismo de la reivindicación 1, y vehículos farmacéuticos aceptables.
  10. 12.
    El uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 10 en la preparación de los medicamentos para el tratamiento de la leucopenia causada por radioterapia o por quimioterapia, SIDA y otras enfermedades inmunodeficitarias, de infecciones bacterianas.
  11. 13.
    Una composición farmacéutica de la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de la leucopenia causada por radioterapia o por quimioterapia, del SIDA y de otras enfermedades de inmunodeficencia, de infecciones bacterianas.
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