ES2433253T3 - Conjugado de polietilenglicol-G-CSF - Google Patents

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Soo-Hyung Kang
Moo-Hi Yoo
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Abstract

Conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF de la siguiente fórmula general (1):**Fórmula** en la que la relación de unión de polietilenglicol de tres ramas (PEG) y G-CSF es 1:1 (moles/moles), y PEG tiene un pesomolecular promedio de 200 a 45.000 dalton, en donde, n es un número entero de 1 a 1.000; m es un número entero de 10 a 1.000; Z es (CH2)S o (CH2)SNHCO(CH2)S como adaptador de G-CSF y PEG en las que S es un número entero de 1 a 6;Y es un enlace de amida formado combinando el grupo funcional NH2 en G-CSF y un grupo funcional de derivadode PEG.

Description

Conjugado de polietilenglicol-G-CSF
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF.
TÉCNICA ANTERIOR
El factor estimulante de colonias (CSF), como una glucoproteína que actúa sobre la producción, división y actividad de células hematopoyéticas, se clasifica en factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de múltiples colonias (multi-CSF), etc.
Se sabe que G-CSF aumenta la liberación de neutrófilos maduros en sangre periférica facilitando la producción y división del precursor neutrófilo en la médula ósea; induce una actividad fagocítica activando neutrófilos maduros; representa una citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo; genera superóxidos; y aumenta la reactividad contra factor quimiotáctico.
El factor estimulante de colonias de granulocitos humano (hG-CSF) lo separon por primera vez de la línea celular de carcinoma de vejiga 5637 Welt y col. en 1985, y hG-CSF recombinante (rhG-CSF) lo produjeron clonando el gen de la biblioteca de ADNc de una célula cancerosa Nagata y col. Souza y col. en 1986. El rhG-CSF actualmente usado en ensayos clínicos es filgrastim que une metionina en el extremo N de proteína sin glucosilación, producido en Escherichia coli, y lenograstim con glucosilación, producido en la célula de animal.
En caso de usar rhG-CSF clínicamente, rhG-CSF tiene que administrarse una vez o más al día para disminuir los leucocitos debido a que rhG-CSF tiene una corta duración del efecto farmacológico. Así, se han realizado muchos estudios para aumentar una semivida de circulación de rhG-CSF usando polímero soluble en agua, desarrollando así el fármaco para que tenga una larga duración de actividad y alta estabilidad, y disminuyendo la frecuencia de administración.
Y, el polietilenglicol en el polímero soluble en agua es fuertemente hidrófilo, y puede aumentar la solubilidad en el momento de unirse a proteína para el tratamiento. Por tanto, el polietilenglicol es eficaz en aumentar la cantidad de proteína molecular unida al mismo, manteniendo las principales funciones biológicas tales como actividad enzimática y unión a receptor. Así, el polietilenglicol puede disminuir la filtración del riñón y proteger eficazmente la proteína de la enzima proteolítica que descompone la proteína. Por tanto, se han realizado muchos estudios para encontrar procedimientos modificadores de proteína usando polietilenglicol debido a que tengan las ventajas de prevenir la descomposición de proteínas, aumentar la estabilidad y tiempo de circulación de la proteína, y disminuir la inmunogenicidad.
La patente coreana nº 0508358 desveló conjugados y un procedimiento de preparación de los mismos, en el que los conjugados tienen actividades biológicas y están en forma de unir un polímero de biocompatibilidad con el tiol del residuo de cisteína de G-CSF, en la relación molar de polímero: G-CSF a estequiométricamente 0,7~1,3:1, preferentemente 1:1. Pero, como el residuo de cisteína de G-CSF que no forma enlaces disulfuro en G-CSF es la parte de unión principal con el receptor de G-CSF, el conjugado que usa el residuo de cisteína tiene el inconveniente de que su efecto de proliferación real para neutrófilo es pequeño. Y, debido a que los conjugados se agregan inmediatamente para unir un PEG a residuos de cisteína de G-CSF, tiene la desventaja de que debe añadirse una pequeña cantidad de SDS al conjugado para prevenir la agregación para salvaguardo, y el SDS se eliminó por ultrafiltración para administrarlo in vivo.
La patente coreana nº 0507796 desveló conjugados de PEG-homodímero que se unen a un polipéptido activo biológico y un PEG, para aumentar la semivida in vivo del polipéptido. Particularmente, describió que el homodímero une un grupo amino de residuos de licina de polipéptido bioactivo de dos moléculas a un PEG para aumentar el tiempo residual y mantener actividades biológicas durante un largo tiempo. Pero los conjugados tienen menos actividad que los conjugados de mono-PEG debido a la conjugación de excesivos PEG y las características fisicoquímicas y biológicas de los conjugados no son uniformes debido a conjugación no específica.
Y se conoce el procedimiento de unión de rhG-CSF a SCM-MPEG lineal (éster succinimidil carboximetílico de metoxi PEG). Los conjugados de mono-PEG-G-CSF preparados mediante el procedimiento tienen 3 tipos de isómeros de posición modificados en los residuos del extremo N, de licina 35 y de licina 45. Particularmente, el conjugado modificado en licina 35 tiene la desventaja de PEG salientes del conjugado (patente coreana nº 0248111, patente de Estados Unidos nº 5.824.784).
La patente de Estados Unidos nº 5.951.974 desveló conjugados de unión de un SC-PEG lineal (polietilenglicol-carbonato de N-succinimida) a interferón alfa de recombinación génica. Los conjugados consisten en conjugados covalentes de
enlace de uretano en el grupo !-amino de residuos de licina de interferón, el grupo ∀-amino de los residuos de cisteína del extremo N y un grupo amino de residuos de histidina. Pero los conjugados tienen la desventaja de PEG salientes del conjugado debido a que el enlace de uretano de los conjugados es inestable.
El polietilenglicol lineal comúnmente usado tiene un peso molecular de aproximadamente 1.000-25.000 dalton, pero tiene una limitación en la unión de muchas moléculas grandes lineales a proteína o péptido, con mantener sus actividades, debido a regiones activas biológicas limitadas de proteína y péptido.
La patente coreana nº 0254097 desveló conjugados que unen un PEG de dos ramas de una estructura esquelética de licina a interferón alfa de recombinación génica. Los conjugados tienen la ventaja de prevenir que el PEG se una a múltiples partes del interferón, y tienen 2 veces el peso molecular de PEG por el del PEG lineal debido a que dos PEG lineales se unen a una única parte del interferón. Pero los PEG de dos ramas pueden hidrolizarse a una única cadena para salvaguardar o para hacer reaccionar bajo una condición de álcali debido a que el PEG de dos ramas que tiene una estructura esquelética de licina tiene dos enlaces de uretano en el PEG.
Generalmente, se sabe que la actividad biológica, durabilidad, etc., de conjugados de unión de un PEG a proteína de recombinación génica depende del tamaño y la parte modificada en el PEG. Pero todavía no se ha mostrado si un tamaño de PEG en conjugados que unen PEG y rhG-CSF afecta o no actividades biológicas de una proteína. Por tanto, ha habido una necesidad en la materia de vencer las desventajas del procedimiento conocido mediante el control de un tamaño de PEG y unión a diversas estructuras esqueléticas de PEG para no reducir las bioactividades de G-CSF y para aumentar la estabilidad de partes de unión.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
PROBLEMA TÉCNICO
El objetivo de la presente invención es proporcionar conjugados de polietilenglicol (PEG) de tres ramas-G-CSF preparados conjugando PEG de tres ramas y G-CSF que tienen alta estabilidad y las mismas o más bioactividades de G-CSF que conjugados de G-CSF y PEG-G-CSF conocidos en la técnica; un procedimiento de preparación de los mismos; y una composición farmacéutica que contiene los mismos.
SOLUCIÓN TÉCNICA
Para lograr el objetivo anterior, la presente invención proporciona conjugados de polietilenglicol de tres ramas (PEG)-G-CSF conjugados entre derivados de PEG de tres ramas y G-CSF.
La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF que comprende conjugar derivados de PEG de tres ramas y G-CSF.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende los conjugados.
La presente invención también proporciona un procedimiento de tratamiento de neutropenia, prevención de neutropenia, o facilitación del aumento del número de neutrófilos en el momento de la movilización de citoblastos hematopoyéticos a sangre periférica y trasplante de citoblastos hematopoyéticos, que comprende administrar el conjugado de la presente invención como componente eficaz.
La presente invención se explica en detalle más adelante.
Los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF de la presente invención pueden prepararse conjugando polietilenglicol de tres ramas (PEG), representado por la siguiente fórmula general (1):
en la que
n es un número entero de 1 a 1.000;
m es un número entero de 10 a 1.000;
Z es (CH2)S o (CH2)SNHCO(CH2)S como adaptador de G-CSF y PEG en las que S es un número entero de 1 a 6;
Y es un enlace de amida formado combinando el grupo funcional NH2 en G-CSF y un grupo funcional de derivado de PEG.
El PEG tiene un peso molecular promedio de 200 a 45.000 dalton, preferentemente de 20.000 a 45.000 dalton, más preferentemente de 23.000 a 43.000 dalton. Debido a que un tiempo medicinalmente eficaz puede cambiarse según un peso molecular promedio de PEG, el peso molecular promedio de PEG usado en la presente invención puede cambiarse, dependiendo del tiempo requerido para el tratamiento.
El procedimiento de preparación del conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF que comprende conjugar derivados de PEG de tres ramas y G-CSF de la presente invención se explica en detalle más adelante.
Los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF de fórmula general (1) se preparan formando un enlace covalente entre el PEG de tres ramas derivado de la siguiente fórmula general (2) y G-CSF, teniendo el PEG un peso molecular promedio de 200 a 45.000 dalton, preferentemente de 20.000 a 45.000 dalton, más preferentemente de 23.000 a 43.000 dalton:
en la que
n es un número entero de 1 a 1.000;
m es un número entero de 10 a 1.000;
Z es (CH2)S o (CH2)SNHCO(CH2)S como adaptador de G-CSF y PEG en las que S es un número entero de 1 a 6; y
el grupo funcional que puede reaccionar químicamente con proteínas y péptidos que contienen G-CSF es Nhidrosuccinimida.
Los derivados de PEG de tres ramas de la presente invención activan grandes moléculas que tienen estructura ramificada en la que se combinan tres grandes moléculas receptoras biológicas lineales. Las tres regiones de OH (hidroxi) en la estructura esquelética del glicerol se polimerizan con moléculas de unidades de etilenglicol, y el extremo de una región se activa como grupo funcional. Las otras dos regiones, excepto la región activada, están sustituidas con monometoxi, para prevenir reacciones adicionales. Cuando los derivados de PEG anteriormente ramificados se preparan, el tamaño de cada PEG lineal puede controlarse libremente mediante un procedimiento conocido en la técnica.
Los derivados de PEG de tres ramas en la presente invención pueden usarse como derivados de PEG, reaccionando el grupo funcional químicamente con proteína y péptido, conocidos en la técnica. Los derivados de PEG de fórmula general
(2) (con N-hidroxisuccinimida) se prefieren en términos de rendimiento del conjugado de la presente invención.
El G-CSF en la presente invención puede separarse de organismo mamífero o sintetizarse mediante un procedimiento conocido en la técnica, tal como clonación de ADNg, clonación de ADNc, etc. Y el G-CSF puede comercializarse en el mercado.
Y el enlace covalente entre G-CSF y los derivados de PEG de tres ramas pueden formarse a una baja temperatura. La reacción se completa añadiendo ácidos, y los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF preparados pueden purificarse mediante un procedimiento conocido en la técnica tal como el procedimiento de purificación usando una resina de intercambio catiónico.
En la presente invención, la relación molar de la reacción de G-CSF con respecto al derivado de PEG de tres ramas es de
1: 0,5 a 1: 50. Una relación molar preferible del G-CSF con respecto al derivado de PEG de tres ramas es de 1: 0,5 a 1: 5 debido a que el rendimiento del conjugado de mono PEG-G-CSF es disminuido, ya que la relación molar de polietilenglicol con respecto a G-CSF es elevada.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para tratar o prevenir síntomas producidos por la disminución de la función hematopoyética o la disminución de la función inmunológica. Particularmente, los ensayos clínicos usando el conjugado de la presente invención como eficaz mostraron que el número de neutrófilos era disminuido, y los síntomas se aliviaron o controlaron, para enfermedades causadas en un tratamiento tal como quimioterapia o radioterapia para el cáncer; enfermedades infecciosas producidas por bacterias, virus y hongos; otras enfermedades infecciosas; enfermedades producidas por motivo genético o medioambiental tales como neutropenia crónica grave y leucemia; o enfermedades geriátricas producidas por otra parte. Por ejemplo, los síntomas producidos por la disminución de la función hematopoyética o disminución de la función inmunológica son neutropenia producida por
5 quimioterapia para el cáncer para tumores de la sangre o cáncer sólido, neutropenia producida por síndrome mielodisplásico, neutropenia producida por anemia aplásica, neutropenia idiopática congénita y neutropenia causada por el tratamiento del virus de la inmunodeficiencia humana.
La composición puede estar compuesta de conjugados de PEG-G-CSF de la presente invención o diluyente, antisépticos, solubilizante, emulsionante, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.
10 Las composiciones de la presente invención pueden formularse para agente de inyección, cápsula, comprimido, fármaco líquido, píldora, pomada, ungüento ocular, colirio, agente de absorción transdérmica, pasta, cataplasma, aerosoles, etc.
Y la dosificación eficaz de G-CSF es muy pequeña, tal como 0,1 ~500 μg (preferentemente 5~50 μg). Y el fármaco que comprende 0,1 ~500 μg de G-CSF puede administrarse a un adulto, generalmente de 1 a 7 veces a semana. Así, la dosificación eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención puede calcularse por una cantidad de
15 administración conocida de G-CSF y un peso molecular de PEG usado en la presente invención. La dosificación eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención puede variarse, pero generalmente una vez a semana, y la composición puede administrarse una vez o muchas veces al día dentro de un intervalo de dosificación diariamente eficaz.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar adicionalmente la presente invención, y el alcance de la presente invención no 20 pretende limitarse así de ningún modo.
EFECTOS VENTAJOSOS
Los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF de la presente invención son más farmacéuticamente estables que los conjugados de PEG lineal o de dos ramas-G-CSF en el aspecto de PEG salientes de conjugados de PEG-G-CSF y formar los agregados de conjugados. Y los conjugados de la presente invención pueden usarse sin separaciones
25 adicionales de isómeros de posición debido a que los conjugados consisten en isómeros de posición con actividades similares. Y la composición de la presente invención tiene los efectos de producción continua de neutrófilos y elevada semivida in vivo.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de una mezcla formada para preparar
30 conjugados de PEG de tres ramas que tiene MW 23.000 Da y G-CSF según el Ejemplo 1, por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño.
La Fig. 2 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de una mezcla formada para preparar conjugados de PEG de tres ramas que tiene MW 43.000 Da y G-CSF según el Ejemplo 2, por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño.
35 La Fig. 3 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de una mezcla formada para preparar conjugados de PEG lineal que tiene MW 10.000 Da y G-CSF según el Ejemplo comparativo 1, por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño.
La Fig. 4 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de las purezas de conjugados de mono-PEG de tres ramas-G-CSF separados de la mezcla del Ejemplo 1, por cromatografía líquida de alta resolución de
40 exclusión por tamaño.
La Fig. 5 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de las purezas de conjugados de mono-PEG de tres ramas-G-CSF separados de la mezcla del Ejemplo 2, por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño.
La Fig. 6 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de las purezas de conjugados de mono
45 PEG lineal-G-CSF separados de la mezcla del Ejemplo comparativo 1, por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño.
La Fig. 7 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de conjugados de mono-PEG de tres ramas-G-CSF separados de la mezcla del Ejemplo 1, por espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF).
50 La Fig. 8 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de conjugados de mono-PEG de tres
ramas-G-CSF separados de la mezcla del Ejemplo 2, por espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF).
La Fig. 9 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de conjugados de mono-PEG lineal-G-CSF separados de la mezcla de Ejemplo comparativo 1, por espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF).
La Fig. 10 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de los isómeros de posición que comprenden conjugados de mono-PEG de tres ramas-G-CSF separados de la mezcla del Ejemplo 1, por cromatografía de intercambio iónico.
La Fig. 11 es un dibujo esquemático que ilustra los resultados analíticos de la actividad biológica de los isómeros de posición de conjugados de mono-PEG de tres ramas-G-CSF separados de la mezcla del Ejemplo 1, según el Ejemplo experimental 1, mediante el procedimiento del Ejemplo experimental 2.
MODO PARA LA INVENCIÓN
<Ejemplo 1> Preparación de conjugados de polietilenglicol de tres ramas (PEG MW 23.000 Da)-G-CSF
Se filtraron 10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) a pH 8,5 y 50 mM de disolución de tampón borato de sodio. Luego se añadieron 9,2 mg de PEG de tres ramas que tiene N-hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japón) y el peso molecular de 23.000 dalton a la disolución en la relación molar de rhG-CSF : PEG de tres ramas de 1: 0,75. Y la disolución se agitó a 4 ºC durante 90 min. La reacción se detuvo añadiendo HCl 100 mM para hacer el pH de la disolución 4 y diluyendo el volumen de la disolución 5 veces con agua destilada estéril. Entonces, la mezcla se entró en cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 20 mM de disolución de tampón acetato sódico (pH 4,0), y se separó el conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF. La mezcla se fraccionó usando 0 ~ 1 M de gradiente de concentración de cloruro sódico (NaCl). La relación molar de PEG de tres ramas con respecto a G-CSF en los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF se confirmó por HPLC y SDS-PAGE. Y se excluyeron los conjugados de di-o más (tri-, tetra-...)-PEG de tres ramas-G-CSF, G-CSF sin reaccionar que queda después de la reacción, etc. Y los eluatos se concentraron y se esterilizaron por filtración para obtener el conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF en el que un G-CSF y un PEG de tres ramas (MW 23.000Da) están conjugados (o llamado conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF).
Se confirmó que la mezcla de reacción consistió en 35,4 % de conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF (mono-PEG-G-CSF), aproximadamente 59,4 % de G-CSF sin modificar por PEG, y los otros [conjugado de di-PEG de tres ramas-G-CSF (conjugado de di-PEG-G-CSF) y N-hidroxisuccinimida (NHS)], por una cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño (véase la Fig. 1, en la que 1 y 2 representan conjugado de di-PEG-G-CSF, 3 representa conjugado de mono-PEG-G-CSF, 4 representa G-CSF sin modificar por PEG y 5 representa NHS que sale del PEG de tres ramas). Y la pureza del mono-PEG de tres ramas-G-CSF separado de la mezcla se midió por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (véase la Fig. 4, en la que 2 representa conjugado de di-PEG-G-CSF y 3 representa conjugado de mono-PEG-G-CSF) y el peso molecular se midió por espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) (véase la Fig. 7: el resultado analítico de mono-PEG de tres ramas-G-CSF por EM/MALDI-TOF). Y los isómeros de posición se separaron por columna analítica de resina de intercambio catiónico (SP-5WP, TOSOH) para confirmar que la relación para cada isómero de posición es aproximadamente 54 %: 33 %:10 % (véase la Fig. 10). Y se confirmó que cada isómero de posición tiene actividad muy similar en el experimento para actividad biológica de cada isómero de posición (véase la Fig. 11)
<Ejemplo 2> Preparación de conjugados de polietilenglicol de tres ramas (PEG MW 43.000 Da)-G-CSF
Se filtraron 10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) a pH 8,5 y 50 mM de disolución de tampón borato de sodio. Luego se añadieron 17,2 mg de PEG de tres ramas con N-hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japón) y el peso molecular de 43.000 dalton a la disolución para preparar la relación molar de rhG-CSF : PEG de tres ramas de 1: 0,75. Y la disolución se agitó a 4 ºC durante 90 min. Y la reacción se detuvo añadiendo HCl 100 mM para hacer el pH de la disolución 4 y diluyendo el volumen de la disolución 5 veces con agua destilada estéril. Y la mezcla se entró en cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 20 mM de disolución de tampón acetato sódico (pH 4,0), y se separó de la misma el conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF. La mezcla se fraccionó usando 0 ~ 1 M de gradiente de concentración de cloruro sódico (NaCl). La relación molar de PEG de tres ramas con respecto a G-CSF en los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF se confirmó por HPLC y SDS-PAGE. Y se excluyeron conjugados de di-o más (tri, tetra...)-PEG de tres ramas-G-CSF, G-CSF sin reaccionar que queda después de la reacción, etc. Y los eluatos se concentraron y se esterilizaron por filtración para obtener el conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF en el que un G-CSF y un PEG de tres ramas (MW 43.000Da) están conjugados (o se llama conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF).
Se confirmó que la mezcla de la reacción consistió en 18,7 % de conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF
(conjugado de mono-PEG-G-CSF), aproximadamente 40,1 % de G-CSF sin modificar por PEG y los otros [conjugado de di-PEG de tres ramas-G-CSF (conjugado de di-PEG-G-CSF) y N-hidroxisuccinimida (NHS)] por cromatografía de alto rendimiento de exclusión por tamaño (véase la Fig. 2. en la que 2 representa conjugado de di-PEG-G-CSF, 3 representa conjugado de mono-PEG-G-CSF y 4 representa G-CSF sin modificar por PEG). Y la pureza de mono-PEG de tres ramas-G-CSF separado de la mezcla se midió por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (véase la Fig. 5, en la que 1 representa conjugado de oligo-PEG-G-CSF, 2 representa conjugado de di-PEG-G-CSF y 3 representa conjugado de mono-PEG-G-CSF), y el peso molecular se midió por espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) (véase la Fig. 8; el resultado analítico de mono-PEG de tres ramas-G-CSF por EM/MALDI-TOF).
<Ejemplo comparativo 1> Preparación de conjugados de polietilenglicol lineal (PEG MW 10.000 Da)-G-CSF
Se filtraron 10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) a pH 8,5 y 50 mM de disolución de tampón borato de sodio. Y se añadieron 5,2 mg de PEG lineal con N-hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japón) y el peso molecular de 13.000 dalton a la disolución para preparar la relación molar de rhG-CSF : PEG lineal de 1: 0,75. Y la disolución se agitó a 4 ºC durante 90 min. Y la reacción se detuvo añadiendo HCl 100 mM para hacer el pH de la disolución 4 y diluyendo el volumen de la disolución 5 veces con agua destilada estéril. Y la mezcla se entró en cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 20 mM de disolución de tampón acetato sódico (pH 4,0) y se separó de la misma el conjugado de PEG lineal-ramificado-G-CSF. La mezcla se fraccionó usando 0 ~ 1 M de gradiente de concentración de cloruro sódico (NaCl). La relación molar de PEG lineal con respecto a G-CSF en el conjugado de PEG lineal-G-CSF se confirmó por HPLC y SDS-PAGE. Y se excluyeron conjugados de di-o más (tri, tetra...)-PEG lineal-G-CSF, G-CSF sin reaccionar que queda después de la reacción, etc. Y los eluatos se concentraron y se esterilizaron por filtración para obtener el conjugado de mono-PEG lineal-G-CSF en el que un G-CSF y un PEG lineal (MW 13.000Da) están conjugados (o se llaman conjugado de mono-PEG lineal -G-CSF).
Se confirmó que la mezcla de la reacción consistió en 45,6 % de conjugado de mono-PEG lineal-G-CSF (conjugado de mono-PEG-G-CSF), aproximadamente 45,9 % de G-CSF sin modificar por PEG y los otros [conjugado de di-PEG lineal-G-CSF (conjugado de di-PEG-G-CSF) y N-hidroxisuccinimida (NHS)], por una cromatografía de alta resolución de exclusión por tamaño (véase la Fig. 3, en la que 1 representa conjugado de oligo-PEG-G-CSF, 2 representa conjugado de di-PEG-G-CSF, 3 representa conjugado de mono-PEG-G-CSF y 4 representa G-CSF sin modificar por PEG). Y la pureza de mono-PEG lineal-ramificado-G-CSF separado de la mezcla se midió por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (véase la Fig. 6, en la que 1 representa conjugado de oligo-PEG-G-CSF, 2 representa conjugado de di-PEG-G-CSF, 3 representa conjugado de mono-PEG-G-CSF y 4 representa G-CSF sin modificar por PEG), y el peso molecular se midió por espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) (véase la Fig. 9).
<Ejemplo comparativo 2> Preparación de conjugados de polietilenglicol lineal (PEG MW 20.000 Da)-G-CSF
Se filtraron 10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) a pH 8,5 y 50 mM de disolución de tampón borato de sodio, y entonces se añadieron 8,0 mg de PEG lineal que tiene N-hidroxisuccinimida (NOF Corporation, Japón) y el peso molecular de 20.000 dalton a la disolución para preparar la relación molar de rhG-CSF : PEG lineal de 1: 0,75. Y la disolución se agitó a 4 ºC durante 90 min. La reacción se detuvo añadiendo HCl 100 mM para hacer el pH de la disolución 4 y diluyendo el volumen de la disolución 5 veces con agua destilada estéril. Entonces la mezcla se entró en cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 20 mM de disolución de tampón acetato sódico (pH 4,0), y se separó de la misma el conjugado de PEG lineal-ramificado-G-CSF. La mezcla se fraccionó usando 0 ~ 1 M de gradiente de concentración de cloruro sódico (NaCl). La relación molar de PEG lineal con respecto a G-CSF en el conjugado de PEG lineal-G-CSF se confirmó por HPLC y SDS-PAGE. Y se excluyeron conjugados de di-o más (tri, tetra...)-PEG lineal-G-CSF, G-CSF sin reaccionar que queda después de la reacción, etc. Y los eluatos se concentraron y se esterilizaron por filtración para obtener el conjugado de mono-PEG lineal-G-CSF en el que un G-CSF y un PEG lineal (MW 20.000Da) están conjugados (o se llama conjugado de mono-PEG lineal-G-CSF).
<Ejemplo comparativo 3> Preparación de conjugados de polietilenglicol de dos ramas (PEG MW 20.000 Da, estructura esquelética de licina)-G-CSF
Se filtraron 10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) a pH 8,5 y 50 mM de disolución de tampón borato de sodio y luego se añadieron 9,1 mg de PEG de dos ramas que tiene N-hidroxisuccinimida (Nektar, EE.UU.) y el peso molecular de
20.000 dalton a la disolución para preparar la relación molar de rhG-CSF : PEG lineal de 1: 0,75. Y la disolución se agitó a 4 ºC durante 90 min. La reacción se detuvo añadiendo HCl 100 mM para hacer el pH de la disolución 4 y diluyendo el volumen de la disolución 5 veces con agua destilada estéril. Entonces, la mezcla se entró en cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 20 mM de disolución de tampón acetato sódico (pH 4,0), y se separó de la misma el conjugado de PEG lineal-ramificado-G-CSF. La mezcla se fraccionó usando 0 ~ 1 M de gradiente de concentración de cloruro sódico (NaCl). La relación molar de PEG de dos ramas con respecto a G-CSF en el conjugado de PEG de dos ramas-G-CSF se confirmó por HPLC y SDS-PAGE. Y se
excluyeron conjugados de di-o más (tri, tetra...)-PEG de dos ramas-G-CSF, G-CSF sin reaccionar que queda después de la reacción, etc. Y los eluatos se concentraron y se esterilizaron por filtración para obtener el conjugado de mono-PEG de dos ramas-G-CSF en el que un G-CSF y un PEG de dos ramas (MW 20.000Da) están conjugados (o se llama conjugado de mono-PEG lineal-G-CSF).
<Ejemplo comparativo 4> Preparación de conjugados de polietilenglicol dos ramas (PEG MW 20.000 Da, estructura esquelética de glicina)-G-CSF
Se filtraron 10 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) a pH 8,5 y 50 mM de disolución de tampón borato de sodio. Y se añadieron 8,0 mg de PEG de dos ramas que tiene N-hidroxisuccinimida (NOF, Japón) y el peso molecular de 20.000 dalton a la disolución para preparar la relación molar de rhG-CSF : PEG lineal de 1: 0,75. La disolución se agitó a 4 ºC durante 90 min. Y la reacción se detuvo añadiendo HCl 100 mM para hacer el pH de la disolución 4 y diluyendo el volumen de la disolución 5 veces con agua destilada estéril. Entonces la mezcla se entró en cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 20 mM de disolución de tampón acetato sódico (pH 4,0), y se separó de la misma el conjugado de PEG lineal-ramificado-G-CSF. La mezcla se fraccionó usando 0 ~ 1 M de gradiente de concentración de cloruro sódico (NaCl). La relación molar de PEG de dos ramas con respecto a G-CSF en el conjugado de PEG de dos ramas-G-CSF se confirmó por HPLC y SDS-PAGE. Y se excluyeron conjugados de di-o más (tri, tetra...)-PEG de dos ramas-G-CSF, G-CSF sin reaccionar que queda después de la reacción. etc. Y los eluatos se concentraron y se esterilizaron por filtración para obtener el conjugado de mono-PEG de dos ramas-G-CSF en el que un G-CSF y un PEG de dos ramas (MW 20.000 Da) están conjugados (o se llama conjugado de mono-PEG lineal-G-CSF).
<Ejemplo comparativo 5> Preparación de conjugados de mono-metoxipolietilenglicol-G-CSF que se unen en el residuo de ∀-amino del extremo N
El conjugado del título se preparó mediante un procedimiento descrito en la patente coreana nº 0248111 y la patente de Estados Unidos nº 5.824.784. El procedimiento como se describe brevemente es del siguiente modo.
Se agitaron 100 mM de fosfato de sodio que contiene 20 mM de NaCNBH3 y 5 mg/ml de rhG-CSF a 4 ºC. Y se añadieron 5 veces de moles de aldehído de metoxipolietilenglicol lineal (mPEG) (Nektar, EE.UU.) a la disolución, que se agitó durante 10 h. La reacción se detuvo añadiendo HCl 100 mM para hacer el pH de la disolución 4 y diluyendo el volumen de la disolución 5 veces con agua destilada estéril. Entonces, la mezcla se entró en cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con 20 mM de disolución de tampón acetato sódico (pH 4,0) y se separó de la misma el conjugado de PEG lineal-ramificado-G-CSF. La mezcla se fraccionó usando 0 ~ 1 M de gradiente de concentración de cloruro sódico (NaCl). Y los eluatos se concentraron y se esterilizaron por filtración para obtener el conjugado de mono-mPEG-G-CSF en el que un G-CSF y un PEG de dos ramas (MW 20.000 Da) están conjugados (o se llama conjugado de mono-PEG lineal-G-CSF).
<Ejemplo comparativo 6> Preparación de conjugados de mono-metoxipolietilenglicol-G-CSF que se unen en el grupo tiol del residuo de cisteína de G-CSF
El conjugado del título se preparó mediante un procedimiento descrito en la patente coreana nº 0508358. El procedimiento como se describe brevemente es del siguiente modo.
Se añadió 1 mg de rhG-CSF (Dong-A Pharm. Co., Ltd.) a 1 ml de disolución de tampón fosfato de sodio (0,1 M) que tiene pH 8,5, y se añadieron 52,6 mg de polietilenglicol-maleimida (NOF, Japón) a la disolución. Y la disolución se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces se eliminaron los derivados de PEG que quedaron después de la reacción de la disolución por Centricon 30 (Amicon, EE.UU.). Y la disolución se concentró y se esterilizó por filtración para obtener el conjugado de mono-mPEG-G-CSF.
Las pruebas de propiedades y actividad farmacológica se realizaron usando los conjugados preparados anteriormente, y los resultados son del siguiente modo.
<Ejemplo experimental 1> Separación analítica de isómeros de posición de conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF
Se introdujeron 100 μg de conjugados de mono-PEG de tres ramas-G-CSF del Ejemplo 1 a una columna analítica de resina de intercambio catiónico (SP-SWP, TOSOH) equilibrada con 25 mM de tampón acetato sódico (pH 4,0, controlada con ácido acético glacial), y cada isómero de posición de los conjugados se separó por 100 mM de tampón acetato sódico, pH 7,8). Se confirmó que la relación de cada isómero de posición era aproximadamente 54 %: 33 %:10 % (véase la Fig. 10).
<Ejemplo experimental 2> Análisis de actividades biológicas de isómeros de posición de conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF
Se midieron actividades biológicas relativas de isómeros de posición de conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF del
Ejemplo 1 usando las de G-CSF.
Cepa de células NFS-60 cultivada en RPMI 1640 de crecimiento que contenía un10 % de SBF y 1 ng/ml de rmIL-3 se lavó 3 veces con RPMI 1640 de ensayo que contenía un 5 % de SBF. Y la cepa de células se dividió en 100 ml (2x105 células/ml) en una placa de 96 pocillos. Entonces la muestra se diluyó con medio de ensayo para preparar una muestra de 200 ng/ml, y 9 muestras más de 200 ng/ml por gradiente de 5 veces, y las muestras se dividieron en 3 pocillos, cada uno de 100 ml, por concentración en placas de 96 pocillos que contenían las disoluciones de células.
Cada pocillo se cultivó a 37 ºC y 5 % de CO2 en estufa de incubación durante 48 h, se añadieron 40 μl de MTS a cada pocillo. Después de 2 h se midió una absorbancia de la muestra a 490 nm por un lector de ELISA. La CE50 se calculó por una curva de dosis-respuesta y un análisis de regresión lineal del punto que comprendió la recta lineal de una curva patrón, y se determinaron las actividades de isómeros de posición (véase la Fig. 11). Los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF de la presente invención tienen isómeros de posición que tienen actividades similares. Es decir, es necesario eliminar algunos isómeros de posición que tienen actividad relativamente menor debido a que los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF de la presente invención están compuestos por conjugados con actividades uniformes.
<Ejemplo experimental 3> Prueba farmacocinética de los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF
La prueba farmacodinámica se realizó para inyectar hipodérmicamente cada uno de G-CSF, los conjugados de PEG-G-CSF del Ejemplo 1 y los conjugados de PEG-G-CSF del Ejemplo 2 en ratas de ensayo (Sprague Dawley) que tenían de 240 ~ 260 g de pesos corporales. Después de inyectarles la cantidad de 400 μg por rata, las muestras de sangre se recogieron de las ratas a 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h, 12 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días y 7días después de la inyección. Y las concentraciones de los conjugados de G-CSF en la muestra se analizaron cuantitativamente por un kit de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) (Biosource, EE.UU.).
La semivida en sangre de los conjugados de PEG-G-CSF del Ejemplo 1 y Ejemplo 2 aumentó 3 veces y 10,8, respectivamente, en comparación con la de G-CSF, y las áreas bajo la curva de concentración-tiempo en sangre de los conjugados del Ejemplo 1 y Ejemplo 2 también aumentaron 7,6 veces y 23,4 veces, respectivamente, en comparación con las de G-CSF [Tabla 1: Prueba farmacocinética de los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF y G-CSF en rata (rata Sprague Dawley)]. Se confirmó por esta prueba que la farmacocinética del conjugado de PEG-G-CSF depende de un tamaño de PEG.
[Tabla 1]
rhG-CSF
Ejemplo 1 Ejemplo 2
Cmáx (h)
1383,2 1676,8 1710,6
Tmáx (h)
1,5 12 36
t1/2 (h)
2,9 8,7 31,2
ABC (ng*h/ml)
6246,9 47420,3 146196,1
*Las abreviaturas en la tabla anterior tienen significados: Tmáx: tiempo para alcanzar la concentración máxima Cmáx: concentración máxima t1/2: semivida de eliminación ABC: área bajo la curva de concentración-tiempo.
los siguientes
<Ejemplo experimental 4> Prueba de estabilidad de los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF sobre PEG salientes de los conjugados
Los conjugados de PEG-G-CSF de los Ejemplos 1 y 2 y los Ejemplos comparativos 2, 3 y 4 se depositaron bajo pH 7 y 37 ºC durante 7 días, y se analizaron los aspectos de PEG salientes en la longitud de tiempo por cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa, para estimar los grados de PEG salientes sobre una estructura esquelética, pesos moleculares y tipos ramificados de PEG.
En la estructura esquelética de PEG, los PEG salientes se produjeron más frecuentemente en el Ejemplo comparativo 2
usando PEG lineal. Sin embargo, los PEG salientes de los conjugados de los Ejemplos 1 y 2, y el Ejemplo comparativo 4, se produjeron menos frecuentemente que aquellos de los Ejemplos comparativos 2 y 3 (Tabla 2: Comparación de tasas de generación de G-CSF en conjugados de PEG-G-CSF que tienen diversas estructuras esqueléticas de PEG). Esta prueba confirmó que el conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF es más estable que los conjugados de PEG lineal, de dos ramas-G-CSF, y el conjugado con una estructura esquelética de glicerol es más estable que los conjugados con una estructura esquelética de licina.
[Tabla 2]
Ejemplo 1
Ejemplo 2 Ejemplo comparativo 2 Ejemplo comparativo 3 Ejemplo comparativo 4
Δ (tasa de generación, %/día)
0,44 0,34 5,59 1,36 0,54
<Ejemplo experimental 5> Prueba de estabilidad de los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF contra la formación de agregaciones según una estructura esquelética de PEG y un tipo de unión de PEG a G-CSF
Se probaron el conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF del Ejemplo 1; el conjugado de mono-PEG-G-CSF de los Ejemplos comparativos 2 y 4 que tiene un peso molecular similar al conjugado del Ejemplo 1 y diferente estructura esquelética del conjugado del Ejemplo 1; y el conjugado de mono-PEG-G-CSF del Ejemplo comparativo 5 que tiene diferente tipo de unión del conjugado del Ejemplo 1 para medir estabilidades contra la formación de agregaciones. Cada muestra se recogió en 500 μl, y el disolvente de las muestras se intercambió 3 veces con 100 mM de disolución de tampón fosfato que tenía pH 7. Y las muestras se depositaron a 37 ºC durante 14 días, y la formación de agregación de los conjugados se analizó por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño.
Los resultados del análisis de formación de la agregación representan que el conjugado de mono-PEG-G-CSF del Ejemplo 1 tuvo la mayor estabilidad en el aspecto de PEG salientes, y formó la mínima agregación (Tabla 3: Tasas de generación de conjugados de agregación según una estructura esquelética de PEG y un tipo de unión de PEG a G-CSF). Los conjugados de mono-PEG-G-CSF de los Ejemplos comparativos 2 y 4 usando PEG que tienen la misma estructura esquelética de glicerol que los PEG en el Ejemplo 1, y usando el mismo tipo de unión al Ejemplo 1, además del conjugado del Ejemplo 1, formaron alguna agregación. Sin embargo, los conjugados de mono-PEG-G-CSF del Ejemplo comparativo 3 que usaron PEG que tiene diferente estructura esquelética a la los PEG en el Ejemplo 1 (aunque usando el mismo tipo de unión que el Ejemplo 1) formaron mucha agregación. Y los conjugados de mono-PEG-G-CSF del Ejemplo comparativo 5 que usaron PEG que tiene diferente estructura esquelética a la de los PEG en el Ejemplo 1 y que usaron diferente tipo de unión a la del Ejemplo 1 formaron 2 veces o más de agregación en comparación con los conjugados del Ejemplo 1.
[Tabla 3]
muestra
Ejemplo 1 Ejemplo comparativo 2 Ejemplo comparativo 3 Ejemplo comparativo 4 Ejemplo comparativo 5
Tasa de generación (%)
6,81 7,89 50,5 7,91 15,3
En conclusión, el conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF del Ejemplo 1 es el más estable en tanto PEG salientes de los conjugados como en formar agregación. Es decir, este ventajoso efecto es de diferentes estructuras esqueléticas entre PEG ramificado y PEG ramificado usado en la presente invención.
<Ejemplo experimental 6> Ensayo de actividades de proliferación de neutrófilos de conjugados de PEG-G-CSF en el modelo animal al que se administra una medicina contra el cáncer
Las actividades de proliferación de neutrófilos de conjugados de mono-PEG de tres ramas-G-CSF del Ejemplo 1, conjugados de mono-mPEG (metoxipolietilenglicol)-G-CSF de los Ejemplos comparativos 5 y 6 que tienen diferente tipo de unión y diferente peso molecular de los conjugados del Ejemplo 2 se ensayaron por modelo de ratón al que se administró un agente contra el cáncer.
Ratones (BDF1) de 20 ~ 25 g se administraron con 200 mg/kg de un agente contra el cáncer (ciclofosfamida) para reducir el número de neutrófilos durante 2 días.
Y cada uno del conjugado del Ejemplo 1 y los conjugados de los Ejemplos comparativos 5 y 6 se administraron subcutáneamente una vez, 1 mg/kg por ratón, y G-CSF se administró 8 veces por 0,125 mg/kg por ratón para preparar la
cantidad de administración total, 1 mg/kg. Las sangres de los ratones se recogieron a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 12
días, y los números totales de leucocitos y neutrófilos se midieron por el instrumento de medición de hemocitos
automático (HEMAVET 850, Drew Scientific Ltd., RU). Los periodos que empezaron la recuperación de neutrófilos
5 disminuidos por un agente contra el cáncer y los tiempos requeridos para la recuperación de neutrófilos, en el conjugado
del Ejemplo 1 y los conjugados de los Ejemplos comparativos 5 y 6, fueron similares. Sin embargo, el tiempo en alcanzar
el máximo número de neutrófilos en el conjugado del Ejemplo 1 fue aproximadamente 12 h más rápido que en aquellos
de los conjugados de los Ejemplos comparativos 5 y 6. El área bajo la elevada curva de recuento de neutrófilos-tiempo
(AB-RN) del conjugado del Ejemplo 1 fue mayor (Tabla 4: Ensayo de actividades de proliferación de neutrófilos de 10 conjugados de PEG-G-CSF en el modelo animal al que se administra una medicina contra el cáncer). Por tanto, se
confirmó que el conjugado de mono-PEG de tres ramas-G-CSF tiene un rápido efecto de proliferación de neutrófilos.
[Tabla 4]
G-CSF
Ejemplo 1 Ejemplo comparativo 5 Ejemplo comparativo 6
Aumento de neutrófilos †
2 días 2 días 2 días 2 días
Tiempo de recuperación de neutrófilos*
4,5 días 4,5 días 4,5 días 4,5 días
Pico de neutrófilos
6 días 5,5 días 6 días 6 días
AB-RN (×109 células·día/l)
24,4 54,0 52,1 34,6
†: Tiempo para que los neutrófilos aumenten después de la administración de una medicina *: Tiempo para alcanzar 1.000/mm3 o más neutrófilos después de la administración de una medicina contra el cáncer.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
15 Los conjugados de PEG de tres ramas-G-CSF de la presente invención son farmacéuticamente más estables que los conjugados de PEG lineal o de dos ramas-G-CSF en términos de PEG salientes de conjugados de PEG-G-CSF y formación de agregados de los conjugados. Y los conjugados de la presente invención pueden usarse sin separaciones adicionales de isómeros de posición debido a que los conjugados consisten en isómeros de posición con actividades similares. Y la composición de la presente invención tiene los efectos de producción continua de neutrófilos y elevada
20 semivida in vivo.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF de la siguiente fórmula general (1):
    en la que la relación de unión de polietilenglicol de tres ramas (PEG) y G-CSF es 1:1 (moles/moles), y PEG tiene un peso
    5 molecular promedio de 200 a 45.000 dalton,
    en donde,
    n es un número entero de 1 a 1.000;
    m es un número entero de 10 a 1.000;
    Z es (CH2)S o (CH2)SNHCO(CH2)S como adaptador de G-CSF y PEG en las que S es un número entero de 1 a 6; 10 Y es un enlace de amida formado combinando el grupo funcional NH2 en G-CSF y un grupo funcional de derivado
    de PEG.
  2. 2.
    El conjugado de la reivindicación 1, en el que el PEG tiene un peso molecular promedio de 20.000 a 45.000 dalton.
  3. 3.
    El conjugado de la reivindicación 1, en el que el PEG tiene un peso molecular promedio de 23.000 a 43.000 dalton.
  4. 4.
    Un procedimiento de preparación del conjugado de PEG de tres ramas-G-CSF de la fórmula general (1) de la
    15 reivindicación 1 que comprende formar un enlace covalente de derivado de PEG de tres ramas de la siguiente fórmula general (2) y G-CSF en el que PEG (polietilenglicol) tiene un peso molecular promedio de 200 a 45.000 dalton;
    en donde, n es un número entero de 1 a 1.000;
    20 m es un número entero de 10 a 1.000; Z es (CH2)S o (CH2)SNHCO(CH2)S como adaptador de G-CSF y PEG en las que S es un número entero de 1 a 6; y el grupo funcional que puede reaccionar químicamente con proteínas y péptidos que contienen G-CSF es N
    hidrosuccinimida.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el PEG tiene un peso molecular promedio de 20.000 a 45.000 dalton.
    25 6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el PEG tiene un peso molecular promedio de 23.000 a 45.000 dalton.
  6. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la relación molar de G-CSF con respecto a derivado de PEG de tres ramas es de 1: 0,5 a 1: 50.
  7. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la relación molar de G-CSF con respecto a derivado de PEG de tres ramas en la reacción es de 1: 0,5 a 1: 5.
    30 9. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y un diluyente, antiséptico, solubilizante, emulsionante, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.
  8. 10.
    Una composición farmacéutica para su uso para tratar o prevenir síntomas producidos por la disminución de la función hematopoyética y la disminución de la función inmunológica, que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 como componente eficaz.
  9. 11.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que los síntomas producidos por la disminución de la
    5 función hematopoyética y la disminución de la función inmunológica son cáncer sólido, neutropenia producida por quimioterapia para el cáncer para tumor de la sangre, neutropenia producida por síndrome mielodisplásico, neutropenia producida por anemia aplásica, neutropenia idiopática congénita y neutropenia producida por el tratamiento del virus de la inmunodeficiencia humana.
  10. 12. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para su uso para tratar neutropenia, prevenir
    10 neutropenia o facilitar el aumento del número de neutrófilos en el momento de la movilización de citoblastos hematopoyéticos a sangre periférica y trasplante de citoblastos hematopoyéticos.
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