KR102020995B1 - 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법 - Google Patents
콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
인터페론 알파와 같은 폴리펩티드류는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩티드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 좀 더 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩티드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 단백질 및 펩티드와 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)와의 공유 접합을 사용하여 왔다. 이는 치료적 단백질의 생체내 순환성 반감기를 상당히 연장시키기 위한 접근 방식으로서 널리 인식되어 왔다. PEG화는 주로 신장 청소를 지연시킴으로써 상기 효과를 달성시키는데, 이는 PEG 부분이 해당 단백질에 상당한 유체역학 반경을 부가해주기 때문이다(Zalipsky, S., et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides., in poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications., J.M. Harris, Ed., Plenum Press: New York., 347-370 (1992)). 단백질 및 펩티드를 PEG화함으로써 종종 부여되는 부가의 이득에는 용해도 증가, 단백질 분해적 분해에 대한 저항성, 및 치료적 폴리펩티드의 면역원성 저하가 포함된다.
한편, 이러한 약제를 제조하는 과정에서 단백질 치료제의 활성을 유지하면서 결합체 제조 수율을 높이기 위해서는 정교한 제조 기술을 요구한다. 이에 따라 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 단백질 치료제를 제조하는 방법과 이러한 제조에 사용되는 폴리에틸렌 글리콜에 대한 지속적인 연구가 진행되어 왔다.
본 발명자들은 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 생리활성 폴리펩티드 결합체를 제조함에 있어, 본원을 통하여 보다 효과적으로 시간 단축이 가능한 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 "호중구 감소증(neutropenia)"은 혈중 백혈구 수치가 정상 수치(혈액 1㎕ 당 1,000~ 10,000개) 이하로 감소되어 있는 상태를 말한다. 다시 말해, 백혈구 내에는 호중구, 호산구, 호염기구와 같은 과립구가 있는데 그 중 백혈구 내 차지하는 비율이 50~70%인 호중구의 수가 비정상적으로 감소된 것을 말하며, 호중구의 수가 약 1000개 이하로 감소된 경우를 호중구 감소증이라고 한다. 즉, 백혈구는 호중구, 호산구, 호염기와 같은 과립구와 림프구 등으로 구성되어 있는데, 백혈구에서 호중구의 수가 차지하는 비율이 크기 때문에 백혈구 감소증은 대개 호중구 감소증(neutropenia)으로 나타난다. 또한, 암제나 방사선 등의 항암 치료는 골수기능을 저하시키고 그 결과로 호중구의 생성을 낮추어 환자들은 호중구 감소증을 야기한다.
본 발명의 일 구체예에서 "호중구 감소증 치료제"는 항암제 투여 후 호중구 수치가 낮은 환자는 항생제 또는 항진균제로 감염에 대처하며, 과립구 생산을 자극하여 호중구 수를 증진시키는 약물인 granulocyte macrophage-colony stimulating factor(GM-CSF) 또는 granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF)을 병행 치료한다. 특히, G-CSF 제제(filgrastim, lenograstim, pegfilgrastim)를 사용하여 발열성 호중구감소증을 예방 또는 치료하는 방법이 보편적이다.
본 발명의 일 구체예에서 "GCSF(과립구 콜로니 자극 인자(Granulocyte colony stimulating factor))"란, 과립구 촉진제로서, 호중구의 생성 및 활성화를 자극하는 물질을 지칭한다. 특히, 항암치료 후 과립구의 회복을 증가시키고 감염으로 인한 위험을 감소하기 위해 투여되며 보통 정맥내 주사 또는 경피 주사로 투여된다.
본 발명의 일 구체예에서, “G-CSF API(Granulocyte-Colony Stimulating Factor Active Pharmaceutical Ingredient)”란, 과립구 콜로니 자극 인자 중 하나로서, 174개의 아미노산으로 이루어진 단일 사슬의 폴리펩티드 단백질을 의미하고, 이는 호중구 감소증에 사용된다. Active Pharmaceutical Ingredient는 약제학적 활성 원료를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, “Neulasta”은 암젠사(Amgen)에서 시판하고 있는 것으로, 이의 제조 방법이한국등록특허 제 0248111호에 기재되어 있다. 상기 문헌에 기재된 바와 같이, 이의 페길레이션 반응은 100mM 비신(Bicine) pH 8.0 버퍼에, 분자비가 G-CSF:mPEG(1:1.5) 비율로 교반하여 pH 4.0으로 맞춘다. 그후, 정제는 완충용액 A(20mM 아세트산 나트륨, pH 4.0)로 평형화시킨 이온 교환 크로마토그래피(파마시아 S 세파로스 FF XK 50/30 컬럼, 440ml 부피)에 15컬럼 부피의 완충용액 B(20mM 아세트산 나트륨, pH 4.0, 1 M NaCl) 를 0 - 23% 선형 기울기를 사용하여 단백질을 용리한다. 그 다음, 20mM 아세트산 나트륨 pH 4.0으로 평형화시킨 크기 배제 크로마토그래피(파마시아 수퍼덱스 75 HR 16/60 컬럼, 120ml 부피)에 100분 동안 1.5ml/분씩 컬럼을 유출시켜 용리한다.
본 발명의 일 구체예에서 "반감기 연장"이란, 임의의 화합물이 생체내 신장 여과에 의한 청소를 방지시키기에 충분한 유체역학적 크기를 달성하도록 도와주는 기능이다. 예를 들어, 실질적으로 직쇄, 측쇄 또는 수지상 형태의 중합체성 거대분자로 이루어진 군으로부터 "반감기 연장"이 가능하도록 선택할 수 있다. 또 다른 한편, "반감기 연장"이 가능한 것으로서는 임의의 화합물이 생체 내에서 혈청 단백질과 결합하여 복합체를 형성하도록 하고, 이로써 형성된 복합체가 실재적 신장 청소를 피하도록 선택될 수 있다. "반감기 연장"이 가능한 것은 예를 들어, 지질, 콜레스테롤기(예를 들어, 스테로이드), 탄수화물 또는 올리고당류, 또는 재이용 수용체와 결합하는 모든 천연 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 목적에 따라서 사용될 수 있는 "반감기 연장"이 가능한 것의 예로서는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 일부, 또는 생물학적으로 적합한 중합체 또는 공중합체, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이 포함된다. 기타 적당한 폴리알킬렌 글리콜 화합물에는 덱스트란, 폴리리신, 콜로민산(colominic acid) 또는 기타 탄수화물계 중합체, 아미노산의 중합체 및 바이오틴 유도체와 같은 유형의 전하를 띤 중합체 또는 중성 중합체가 포함되지만, 그에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 "페길레이션(pegylation)"은 단백질에 PEG 유도체(생체고분자)를 결합시키는 기술을 지칭한다. 페길레이션은 수용성 폴리머의 폴리머 골격인 PEG를 단백질에 결합시켜 바이오 의약품의 안정성을 증가시키는 기술로서, 반감기를 증가시켜 해당 의약품에 의한 약효를 증대시킨다. 용어 PEG는 알콕시 PEG, 2기능성(difunctional) PEG, 멀티암(multiarmed) PEG, 포크(forked) PEG, 가지(branched) PEG, 펜던트(pendent) PEG(즉, 폴리머 골격에 매달린 일 이상의 기능기를 갖는 PEG 또는 관련 폴리머), 또는 내부에 분해가능한 결합(linkages)을 갖는 PEG를 포함하는 임의의 형태의 폴리(에틸렌글리콜)을 포함한다. 폴리머 골격은 선형 또는 가지형일 수 있다. 가지달린 폴리머 골격은 일반적으로 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 가지달린 폴리머는 중앙 가지 코어 부분(central branch core moiety) 및 상기 중앙 가지 코어에 결합된 복수의 선형 폴리머 사슬을 갖는다. PEG는 글리세롤, 펜타에리스리톨 및 소르비톨과 같은, 다양한 폴리올에 대한 에틸렌 옥사이드의 첨가에 의하여 제조될 수 있는 가지 달린 형태로 일반적으로 이용된다. 중앙 가지 부분(central branch moiety)은 라이신과 같은 몇몇 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 가지 달린 폴리(에틸렌글리콜)은 R(-PEG-OH)m로서의 일반형으로 나타내어질 수 있으며, 상기에서 R은 글리세롤 또는 펜타에리스리톨과 같은 코어 부분을 나타내며, 및 m은 팔(arm)의 수를 나타낸다.
간략하게 언급하면, PEG 기를 일반적으로, PEG 부분 상의 반응성 기(예를 들어, 알데히드, 아미드, 티올 또는 에스테르기)를 통하여 본 발명의 화합물 상의 반응성 기(예를 들어, 알데히드, 아미드 또는 에스테르기)로 환원적 알킬화 또는 아실화함으로써 본 발명의 화합물의 펩티드 일부에 부착시킨다. 합성 펩티드를 PEG화 하는데 유용한 전략은 용액 중에서의 접합체 연쇄 형성을 통하여, 각각 서로에 대해 상호 반응성인 특수 관능기를 보유하고 있는 펩티드와 PEG 부분을 조합하는 것으로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따라서 유용한 PEG에는 실질적으로 선형, 직쇄 PEG, 측쇄 PEG, 또는 수지상 PEG가 포함된다 [참고: 예를 들어, Merrill, 미국 특허 제5,171,264호; Harris et al., Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces, 미국 특허 제5,932,462호; Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, 미국 특허 제6,602,498호].
본 발명은 폴리올과 콜로니자극인자를 혼합하여 혼합물을 생성하는 단계, 상기 혼합물을 pH 3.0 내지 7.0에서 세정시키서 세정물을 수득하는 단계, 및 상기 세정물을 pH 4.1 내지 6.5에서 용출시켜서 용출물을 획득하는 단계를 포함하는, 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 폴리올은 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 콜로니자극인자는 과립구 콜로니자극인자(Granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 콜로니자극인자는 폴리올의 전구체 중 하나인 mPEG(모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜)와의 비율을 1:3으로 하여 조제하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 세정시 완충액으로는 20mM 아세트산암모늄-아세트산을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 세정시 완충액은 pH 4.8 내지 6.8이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 세정시 완충액은 pH 5.8이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 용출시 완충액으로는 20mM 아세트산암모늄-아세트산을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 용출시 완충액은 pH 4.5 내지 5.5이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 용출시 완충액은 pH 5.0이다.
본 발명은 콜로니자극인자와 폴리올이 접합된 접합물을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 새롭게 밝혀낸 pH의 범위를 적용함으로써, 단일 단계의 정제 과정만을 통해서 정제할 수 있었고, 또한 그 결과가 정제의 멀티 단계를 통한 Neulasta와 동등 또는 그 이상의 효과를 나타냄을 밝혀내었다.
도 1은 본 발명에 따른 PEG-GCSF에 대한 고수율 제조 방법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 티트리졸(titrisol) 염색법에 의해서, 각각의 로딩 볼륨을 달리하여 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 3은 실버(silver) 염색법에 의해서, 환원 상태 및 비환원 상태로 하여, 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 4는 Neulasta(도 4(a))를 본 발명에 따른 제조 방법에 의한 경우(도 4(b))와 비교하여, RP-HPLC로 분석, 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 Neulasta(도 5(a))를 본 발명에 따른 제조 방법에 의한 경우(도 5(b))와 비교하여, SEC-HPLC로 분석, 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Neulasta(도 6(a))를 본 발명에 따른 제조 방법에 의한 경우(도 6(b))와 비교하여, 펩티드 맵핑(peptide-mapping)을 분석, 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 웨스턴블랏법에 의해서, Neulasta와 본 발명에 따른 제조 방법에 따라 생성된 경우를 비교한 것을 나타낸다.
도 2는 티트리졸(titrisol) 염색법에 의해서, 각각의 로딩 볼륨을 달리하여 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 3은 실버(silver) 염색법에 의해서, 환원 상태 및 비환원 상태로 하여, 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 4는 Neulasta(도 4(a))를 본 발명에 따른 제조 방법에 의한 경우(도 4(b))와 비교하여, RP-HPLC로 분석, 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 Neulasta(도 5(a))를 본 발명에 따른 제조 방법에 의한 경우(도 5(b))와 비교하여, SEC-HPLC로 분석, 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Neulasta(도 6(a))를 본 발명에 따른 제조 방법에 의한 경우(도 6(b))와 비교하여, 펩티드 맵핑(peptide-mapping)을 분석, 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 웨스턴블랏법에 의해서, Neulasta와 본 발명에 따른 제조 방법에 따라 생성된 경우를 비교한 것을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 : PEG-GCSF의 수율을 증가시키는 방법
1) 준비
각각 다른 조건의 HKP(Hankook Korus Pharm) batch(#1, 2, 3, 및 #4)를 준비하였다. 결과 재현성이 충분히 가능한 실험결과를 얻기 위해, batch #1~4번까지는 동일한 방법으로 반복실험을 통해 유효한 결과를 얻을 수 있는지 확인하였다. 또한, 추가로 양성 대조군으로서 Neulasta(공급처: Amgen사)를 사용하고, 음성 대조군으로서 G-CSF API를 사용하였다.
2) 조제
G-CSF의 분자비는 mPEG(모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜)와의 비율을 1:3으로 하여 조제하였다. 이어서, mPEG의 몰량의 10배수로 NaCNBH3을 첨가하였다. 바람직하게는, NaCNBH3은 mPEG의 몰량에 대하여, 10배, 100배, 1000배, 10000배로 가하였다. 20mM 아세트산나트륨-아세트산(pH 5.0) 완충액을 사용하여, 최종 농도를 결정하였다. 물질의 농도는 4.0 mg/ml가 되도록 조제하였다. 조제된 시약은 4℃에서 18시간 동안 교반시켰다.
3) 정제
20mM 아세트산나트륨-아세트산 (pH 5.0) 완충액으로 4 CV 만큼 평형화시키고 조제된 시약을 양이온 교환을 위해 SP 세파로오즈 수지를 사용하여 유량(flow rate)이 1 cm/min인 것으로 로딩하여 정제하였다. 세정 완충액으로는 20mM 아세트산암모늄-아세트산 (pH 5.8)을 사용하였다. pH 5.8에 도달하게 되면, 용출(elution) 완충액 20mM 아세트산암모늄-아세트산 (pH 5.0)을 사용하였다.
4) 농축
10 mg/ml로 최대 농축하여 10mM 아세트산나트륨-아세트산 (pH 4.0) 완충액으로 완충액을 변경하였다.
5) 제제
5% 소르비톨(최종 농도가 5%이다) 및 0.004% Tween 20 (최종 농도가 0.004%이다)를 첨가하였다.
6) 여과
필터 포어 사이즈는 0.2 ㎛로 하고, 친수성 셀룰로스 아세테이트 필터를 사용하여 여과하였다.
7) 최종원액
최종원액을 4℃에서 보관하였다.
결과
상기한 바와 같이, 제조방법에서 정제 과정에 있어 종래에는 2단계 이상의 정제 과정을 통해 표적하는 물질을 정제하였으나, 본 발명에서는 1단계 과정만을 통해 표적하는 물질을 정제할 수 있는 특정 pH 범위를 밝혀냄으로써, 소요 시간 절감 및 효율성을 높인 제조 방법을 제공하는 것을 특징으로 하여 종래의 기술 과정을 개선하였다.
구체적으로, 상기한 바와 같이, Neulasta는 pH 8.0 및 4.0 버퍼를 이용하여 이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피 2단계의 과정을 이용하여 정제를 진행하였다. 그러나, 본원의 기재된 방법에 의해 생산된 HKP에서는 20mM 아세트산 나트륨 pH 5.0에 molar ratio of G-CSF : mPEG(1 : 3) 비율로 교반하여 페길레이션 반응시켰다 그 후, 정제는 완충용액 A(20mM 아세트산 나트륨, pH 5.0)로 평형화시켰다. 이어서, 이온 교환 크로마토그래피(파마시아 S 세파로스 FF XK 26/20 컬럼, 53ml 부피)에 완충용액 B(20mM 아세트산 암모늄, pH 5.8)로 세척 후 pH 5.8에서 완충용액 C(20mM 아세트산 암모늄, pH 5.0)를 사용하여 단백질을 용리하였다.
일반적으로 단백질 정제 단계에서 최소한의 정제 단계로 높은 순도의 단백질을 얻을 수 있다면 가장 좋은 방법이라고 사료된다. 본 발명은 정제 단계를 단일 단계만 거침으로써 적게는 10~50% 정도의 손실률이 발생하게 되었다. 상기한 바와 같이 Neulasta의 정제 방법이 2단계 이상의 크로마토그래피의 과정을 거쳐서 단백질을 수득하게 되는데 비교하여, 본 발명에 기재된 방법에 의해서는 완충용액의 pH를 조절함과 동시에 단일 단계의 크로마토그래피 단계만을 진행시킬 수 있는, 조건을 고안하였다. 또한, 효과 측면에서는 종래의 Neulasta와 동등 또는 그 이상의 순도를 보임으로써 단일 단계의 크로마토그래피로 정제하는 본원의 방법이 좀 더 수율이 좋을 것이라 사료된다.
보다 상세하게는, 도 2는 대조군으로 사용한 Neulasta와 G-CSF API 및 시험군으로 사용한 HKP 샘플의 PEGylated proteins 유무를 확인할 수 있는 티트리졸 염색(titrisol staining) 사진을 나타낸다. 페길레이션이 되어 있는 Neulasta 및 HKP 샘플에서는 동일한 위치에서 밴드 발현이 되었고 페길레이션이 되지 않은 G-CSF API는 아무것도 검출되지 않았음을 보여준다.
도 3은 대조군으로 사용한 Neulasta와 G-CSF API 및 시험군으로 사용한 HKP 샘플의 전체 분자를 확인할 수 있는 실버 염색(silver staining) 사진을 나타낸다. Neulasta 및 HKP 샘플에서는 동일한 위치에서 밴드 발현이 되었고 페길레이션이 되지 않은 G-CSF API는 하단에서 밴드 발현 확인이 됨을 보여준다.
따라서, 도 2 및 도 3에 나타내어지는 바와 같이, 본원에 따른 제조 방법으로 수득된 시험군들(HKP-batch #1, 2, 3, 및 #4)은 Neulasta과 동일한 크기 및 양으로 나타나 있음을 알 수 있었다. 이는, 정제 과정을 줄였음에도 불구하고, 종래의 물질과 동일하거나 보다 우수한 수율로 수득될 수 있음을 나타내는 결과이다.
또한, 도 4는 물질의 극성 차이에 따라 상호작용의 차이를 보여주는 역상 크로마토그래피(RP-HPLC)의 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군인 Neulasta 및 시험군인 HKP 샘플이 동일한 시간에 검출되는 것을 확인하였다. 또한, 순도가 98.07% 및 99.32%로, 시험군인 HKP 샘플이 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 분자 크기에 따라 차이를 보여주는 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)의 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군인 Neulasta 및 시험군인 HKP 샘플이 동일한 시간에 검출되는 것을 확인하였다. 또한, 순도가 93.61% 및 98.39%로, 시험군인 HKP 샘플이 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 4 및 도 5에 나타내어지는 바와 같이, 본원에 따른 제조 방법으로 수득된 시험군들(HKP-batch #1, 2, 3, 및 #4)은 크로마토그래피를 통해 보여지는 바와 같이, Neulasta과 동일하게 나타났고, 또한 순도에 있어서는 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6은 단백질을 효소로 절단하여 생성된 펩티드들에 대한 질량분석 결과를 기존의 단백질 서열 결과와 비교하여 특정 단백질을 규명하는 방법인 펩티드 맵핑 결과를 나타내는 그래프이다. 따라서, 도 6에서 나타내는 바와 같이, 본원에 따른 제조 방법으로 수득된 시험군인 HKP 샘플 및 대조군인 Neulasta가 동일한 패턴을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 특정 단백질의 유무 또는 양을 알기 위해 항체를 이용해 검출하는 웨스턴블랏 결과를 나타내는 사진이다. 및 도 7에서 나타내는 바와 같이, 웨스턴블랏의 결과, 본원에 따른 제조 방법으로 수득된 시험군인 HKP 샘플이 대조군인 Neulasta와 동일한 위치에서 단백질 발현이 확인되었고 G-CSF API는 하단에서 단밸질 발현이 확인되었다.
이로부터, 본 발명은 새롭게 밝혀낸 pH의 범위를 적용함으로써, 단일 단계의 정제 과정만을 통해서 정제할 수 있었고, 또한 그 결과가 정제의 멀티 단계를 통한 Neulasta과 동등 또는 그 이상의 효과를 나타냄을 밝혀내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 다음의 단계를 포함하는 과립구 콜로니자극인자(G-CSF)와 PEG가 접합된 G-CSF-PEG 접합물을 제조하는 방법:
(a) pH 5.0의 20 mM 아세트산암모늄-아세트산 완충액에, 과립구 콜로니자극인자(G-CSF)와 mPEG(모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜)을 1:3의 몰비율로 혼합하여 이들의 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 상기 제조한 혼합물을 pH 5.0의 20 mM 아세트산암모늄-아세트산 완충액으로 평형화시키고, 양이온 교환 수지를 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 로딩하는 단계; 및
(c) 상기 크로마토그래피 컬럼을 pH 5.8의 20 mM 아세트산암모늄-아세트산 세정 완충액으로 세정하고, pH가 5.8에 도달하면, pH 5.0의 20 mM 아세트산암모늄-아세트산 용출 완충액으로 용출하는 단계.
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