ITMI20122097A1 - Procedimento per la preparazione di proteine terapeutiche peghilate ad elevato grado di purezza - Google Patents

Procedimento per la preparazione di proteine terapeutiche peghilate ad elevato grado di purezza Download PDF

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Rodolfo Schrepfer
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Description

PROCEDIMENTO PER LA PREPARAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE PEGHILATE AD ELEVATO GRADO DI PUREZZA
OGGETTO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda il settore dei polipeptidi coniugati utilizzabili come farmaci a lunga emivita. In particolare, la presente invenzione riguarda una proteina peghilata ottenuta mediante peghilazione enzimatica con transglutamminasi microbica (MTGasi) e la messa a punto di un processo per la preparazione di proteine peghilate ad elevato grado di purezza in quanto prive di contaminanti derivati dalla degradazione del prodotto.
STATO DELL’ARTE
La coniugazione con polimeri biocompatibili ad alto peso molecolare è una delle principali tecnologie utilizzate per aumentare l’emivita di peptidi o proteine terapeutiche e per migliorare il loro effetto nel tempo. In particolare, nella cosidetta reazione di peghilazione, che ha avuto un largo impiego, la proteina di interesse viene covalentemente legata ad una o più catene lineari o ramificate di glicole polietilenico (PEG) di peso molecolare variabile da 1.000-2.000 dalton (Da) a 20.000-40.000 Da o anche di peso molecolare più elevato.
In generale, le proteine peghilate mostrano una minore velocità di eliminazione renale oltre ad una maggiore stabilità ed una ridotta immunogenicità. Il legame di un polipeptide al PEG ne aumenta il volume idrodinamico e ne modifica le proprietà chimico-fisiche mentre le principali funzioni biologiche, quali l’attività biologica in vitro o il legame col recettore possono essere invariate, ridotte o in qualche caso del tutto abolite.
La coniugazione con PEG maschera la superficie della proteina ed aumenta la sua grandezza apparente diminuendone sia la filtrazione renale e l’interazione con anticorpi o con cellule in grado di processare la proteina stessa sia la sua degradazione ad opera di enzimi proteolitici. Infine, la coniugazione con PEG conferisce alle molecole peghilate le proprietà chimico-fisiche del PEG così da modificare la biodistribuzione e la solubilità di farmaci sia peptidici che non peptidici. Un’altra opzione per la coniugazione delle proteine è l’impiego, in alternativa al PEG, di altri polimeri biocompatibili lineari o ramificati quali, per esempio, destrano, polivinilpirrolidone, poliacriloilmorfolina, polisaccaridi, eccetera.
La peghilazione viene effettuata comunemente mediante una reazione chimica tra le catene reattive degli amminoacidi ed un metossi-PEG (m-PEG) opportunamente funzionalizzato.
Le tecniche di peghilazione chimica generalmente utilizzate sono descritte nelle seguenti pubblicazioni:
S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev., 16, 157-182, 1995;
F.M. Veronese, Peptide and Protein PEGylation: a Review of Problems and Solutions, Biomaterials, 22, 405-417, 2001.
S. Jevsévar, M. Kunstelj, V.G. Porekar, PEGylation of therapeutic proteins, Biotechnol. J. 5, 113-128, 2010.
Per legare catene di m-PEG alle proteine sono state descritte, oltre alla peghilazione chimica, anche reazioni di peghilazione enzimatica basate sull’impiego di enzimi, di origine sia procariotica che eucariotica, ad azione transglutamminasica che catalizzano il trasferimento di catene di m-PEG funzionalizzate con un gruppo amminico primario sul gruppo acilico di residui di glutammina naturalmente presenti nel polipeptide di interesse o inseriti mediante reazioni di mutagenesi sito-specifica (H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of Proteins, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 487-504, 2002).
Per esempio, in EP7852276 e US6010871 viene descritto l’impiego di una transglutamminasi batterica (MTGasi) per coniugare catene polimeriche a proteine la cui sequenza amminoacidica contenga almeno un residuo di glutammina. Tuttavia, sebbene gli esempi riportati in questi brevetti si riferiscono a derivati monosostituiti di alcune proteine modello, non viene chiaramente definito se si tratti di sostituzioni sito-specifiche per dare una singola forma molecolare oppure si tratti di una miscela di isomeri posizionali nei quali la catena polimerica è monoconiugata a residui diversi di glutammina.
Diversamente, sia in EP2049566 che nel corrispondente US7893019B2, viene descritto un nuovo analogo di G-CSF selettivamente monopeghilato sulla glutammina 135 mediante una reazione enzimatica catalizzata da MTGasi.
Tuttavia negli articoli e nei brevetti precedentemente citati non viene posta nessuna particolare attenzione al procedimento di purificazione del prodotto peghilato nè viene considerato il fatto inaspettato che la contaminazione residuale di MTGasi potrebbe ancora idrolizzare la proteina coniugata a PEG dando luogo ad eterogeneità derivata dalla degradazione del prodotto.
E’ perciò importante e necessario sviluppare un processo di produzione che permetta di mantenere la stabilità delle proteine terapeutiche covalentemente coniugate attraverso un legame ammidico al gruppo γ-carbossilico ed è, conseguentemente, oggetto della presente invenzione la descrizione di un processo che riduce la contaminazione residua di MTGasi dopo reazioni di peghilazione enzimatica in modo da evitare la degradazione della proteina coniugata nel successivo periodo di stoccaggio.
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un processo di purificazione mediante cromatografia a scambio cationico di una proteina peghilata, ottenuta per reazione di peghilazione enzimatica catalizzata daH’enzima MTGasi, caratterizzato dal fatto che il contenuto residuale di MTGasi nel prodotto purificato non supera il livello di 5 ppm. Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un processo di purificazione per cromatografia a scambio cationico di una proteina enzimaticamente peghilata mediante transglutamminasi. Come verrà successivamente descritto in maniera più dettagliata, il processo oggetto della presente invenzione ha il vantaggio di preparare proteine terapeutiche peghilate altamente purificate.
Secondo la presente invenzione, il processo di purificazione di una proteina peghilata comprende i seguenti passaggi:
a. equilibrare una colonna a scambio cationico ad un pH uguale o inferiore a 4;
b. caricare la colonna cromatografica di cui al passaggio precedente, con la 12235PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
miscela di reazione contenente la proteina peghilata avente un pH uguale o inferiore a 4
c. eluire la colonna cromatografica di cui al precedente passaggio, con un tampone eluente avente un pH uguale o inferiore a 4 e raccogliere la frazione contenente la proteina peghilata avente un contenuto residuo di MTGasi uguale o inferiore a 5 ppm rispetto alla quantità di proteina peghilata.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione è rappresentato da una proteina peghilata preparata secondo il processo descritto nell’invenzione stessa.
RIASSUNTO DELLE FIGURE
Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione sono evidenziati nella descrizione dettagliata di seguito riportata, negli Esempi successivi, che hanno solo lo scopo di illustrare senza in alcun modo limitare l’invenzione stessa e nelle figure 1-7 allegate, dove:
La Figura 1 mostra il dosaggio quantitativo di MTGasi mediante RP-HPLC con rivelatore fluorimetrico.
a) Curva di calibrazione e b) separazione RP-HPLC del substrato fluorescente CBZ-GIn-Gly-CAD-DNS, eluito a 7,3 minuti, dal prodotto di reazione fluorescente CBZ-Gln(Gly-CAD-DNS)-Q-NH-CH2-CH2-0-Me eluito a 8,0 minuti.
La Figura 2 mostra la separazione mediante SE-HPLC della miscela di reazione tra Met-G-CSF e mPEG-NH2 20 kDa in presenza di MTGasi dopo circa 30 minuti ed al termine della reazione.
Separazione SE-HPLC della miscela di reazione di Met-G-CSF e mPEG-NH2 20 kDa in presenza di MTGasi dopo circa 30 minuti di reazione (a) e dopo 16 ore (b) che dimostra come Met-G-CSF (eluito con un tempo di ritenzione di 11,5 minuti) viene peghilato per dare Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa (tempo di ritenzione di 7,9 min). Il picco eluito con tempo di ritenzione di 13 minuti corrisponde al fronte del solvente
La figura 3 riporta il profilo di eluizione a pH 5 di MTGasi da una colonna Macrocap SP La Figura 4 mostrai! profilo di eluizione di Met-G-CSF monopeghilato e di MTGasi eluiti da una colonna Macrocap SP a pH5.
La Figura 5 mostra il dosaggio di MTGasi mediante RP-HPLC con rivelazione fluorimetrica nelle frazioni eluite da una colonna di resina Macrocap S caricata con Met-G-CSF monopeghilato MTGasi: frazioni 26-40 (a) corrispondenti al volume di eluizione atteso di MTGasi; frazioni 21-58 (b) corrispondenti al volume di eluizione atteso di Met-G-CSF peghilato e frazioni 66-75 (c).
La Figura 6 mostra la separazione mediante IE-HPLC di r-Met-G-CSF-Q135-PEG 20 kDa prima (a) e dopo (b) lo stoccaggio per 1 mese a 5°C in presenza di 50 ppm of MTGase. Il doppio picco corrispondente a Met-G-CSF ed eluito al tempo di ritenzione 7,5-8, 1 minuti è un artefatto causato dall’eluizione del picco con il fronte del solvente.
La Figura 7 mostra la separazione mediante IE-HPLC di una preparazione purificata di r-Met-G-CSF prima (a) e dopo (b) il trattamento per 1,5 ore con 50 ppm di MTGasi a temperatura ambiente.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive una proteina peghilata, ottenuta tramite peghilazione enzimatica catalizzata da una tranglutamminasi microbica (MTGgasi), caratterizata dal fatto che il contenuto residuo di MTGasi nel prodotto peghilato purificato non supera il livello di 5 ppm. L’invenzione descrive inoltre un processo di purificazione di un peptide terapeutico o di una proteina ricombinante coniugati ad un polimero non immunogenico attraverso un legame ammidico con una glutammina mediante una reazione catalizzata da una transglutamminasi microbica (MTGasi) che permette di ottenere il peptide o la proteina coniugata contenente un bassissimo residuo di enzima contaminante (non superiore a 5 ppm).
Il peptide o la proteina coniugata (per esempio peghilata) possono così essere vantaggiosamente utilizzati come farmaci in quanto a causa della inattesa elevata purezza che non permette l’idrolisi enzimatica del legame ammidico tra il peptide o la proteina ed il polimero, hanno una conseguente stabilità del prodotto conservato a 5°C non inferiore a 36 mesi.
La presente invenzione riguarda un processo di purificazione per cromatografia a scambio cationico di una proteina peghilata mediante una reazione enzimatica catalizzata da una transglutamminasi, che comprende i seguenti passaggi: a. equilibrare una colonna a scambio cationico ad un pH uguale o inferiore a 4;
b. caricare sulla colonna cromatografica, equilibrata come al punto a precedente, la miscela di reazione contenente una proteina peghilata ed avente un pH uguale o inferiore a 4
c. eluire la colonna cromatografica di cui al punto b precedente, con un tampone eluente avente un pH uguale o inferiore a 4 e raccogliere la frazione contenente la proteina peghilata avente un contenuto residuo di MTGasi uguale o inferiore a 5 ppm rispetto alla quantità della proteina peghilata.
Il metodo rivendicato nella presente invenzione ha il vantaggio di preparare una proteina peghilata con un elevato grado di purezza ed un contenuto di tranglutamminasi microbica residua uguale o inferiore a 5 ppm con un conseguente significativo miglioramento della stabilità della preparazione. La presente invenzione descrive un metodo sorprendentemente efficiente per separare la transglutamminasi batterica dal prodotto peghilato. Questo risultato inaspettato si ottiene conducendo la purificazione del peptide o della proteina coniugata dai reagenti e dall’enzima contaminante su una resina a scambio cationico eluita a pH ≤ 4.0. A questo valore di pH non si manifestano interazioni non-covalenti tra la proteina peghilata e l’enzima prevenendo perciò la parziale ritenzione deH’enzima da parte della proteina peghilata.
Secondo una modalità preferita per l’attuazione della presente invenzione, i punti a, b, e c del processo di purificazione descritto nell’invenzione stessa sono condotti ad un pH compreso nell'intervallo da 3 a 4, e preferibilmente a pH 4. Per lo scopo della presente invenzione:
Il termine “proteina peghilata o peptide peghilato” si riferisce ad una proteina o ad un peptide covalentemente legato a catene polimeriche di glicole polietilenico (PEG).
Il termine “ derivato di un peptide od una proteina terapeutica” si riferisce ad una catena amminoacidica che mantiene in tutto o in parte l’attività biologica della sequenza nativa.
Il termine “ proteina o peptide o loro omologhi” si riferisce a varianti di una proteina o di un peptide aventi la sequenza amminoacidica identica per almeno il 90% alla sequenza amminoacidica nativa del corrispondente peptide o proteina. In questo contesto le variazioni della sequenza amminoacidica della proteina o del peptide possono derivare da addizioni, sottrazioni, sostituzioni o modificazioni chimiche di uno o più amminoacidi della sequenza nativa.
Il termine “adatto polimero biocompatibile” si riferisce a qualsiasi polimero utilizzato nelle reazioni di coniugazione enzimatica ed implica che lo stesso polimero coniugato quando venga somministrato per via sistemica non induce attivazione del sistema immunitario né una significativa formazione di specifici anticorpi antipolimero. Esempi di polimeri biocompatibili compresi nella presente invenzione sono i glicole polietilenici (PEG), i poliossipropileni, i polivinilpirrolidoni, le poliacriloilmorfoline, i polisaccaridi ed i destrani.
Il termine “ peptide o proteina terapeutica ricombinante coniugata ad un polimero biocompatibile mediante una reazione catalizzata da una transglutamminasi batterica (MTGasi)” si riferisce a qualsiasi peptide o proteina di impiego clinico o a loro omologhi o varianti covalentemente coniugate ad un polimero biocompatibile mediante l’impiego di MTGasi allo scopo di aumentare l’emivita del peptide o della proteina
Il termine “peptide terapeutico” si riferisce a sequenze amminoacidiche di lunghezza inferiore a 50 residui preparate per sintesi chimica o mediante la tecnologia del DNA ricombinante.
Secondo una modalità preferita di attuazione della presente invenzione, il pH di cui ai punti a e b del processo sono realizzati impiegando un tampone acetato, preferibilmente in concentrazione 30 mM.
Secondo una ulteriore modalità di attuazione preferita della presente invenzione, il pH di cui al punto c del processo è realizzato impiegando un tampone acetato, preferibilmente in concentrazione 200 mM.
Secondo una ulteriore modalità di attuazione della presente invenzione, dopo il caricamento di cui al punto b del processo, la colonna cromatografica viene lavata con un volume di tampone acetato, preferibilmente in concentrazione 30 mM, corrispondente a 4 volte il volume della colonna cromatografica.
Secondo un’ulteriore modalità di attuazione della presente invenzione, la miscela di reazione di cui al punto b del processo è ottenuta in una reazione enzimatica, catalizzata da una transglutamminasi batterica, tra una proteina terapeutica ed un polimero idrofilico, preferibilmente un polimero idrofilico non immunogenico. Secondo un’ulteriore modalità di attuazione della presente invenzione, la proteina terapeutica è selezionata tra un gruppo di proteine comprendente il fattore di stimolazione granulocitario (G-CSF) e le sue varianti di impiego clinico quali Met-G-CSF (Filgrastim); il fattore di stimolazione delle colonie di granulociti macrofagi (GM-CSF); gli interferoni (IFNs); l’ormone della crescita umano (h-GH); le interleuchine; i frammenti di anticorpi monoclonali quali i frammenti Fab e scFv; le insuline; il glucagone e i peptidi incretino-mimetici quali il peptide glucagono-simile di tipo 1 (GLP-1), l’exenatide ed i loro derivati ed analoghi.
Secondo un’ulteriore modalità di attuazione della presente invenzione, il polimero idrofilico non immunogenico è selezionato tra un gruppo di polimeri comprendente glicole polietilenico (PEG); poliacriloilmorfolina (PAM); polivinilpirrolidone (PVP) ed idrossi-etil-amido. Secondo una modalità di attuazione preferita, la proteina peghilata purificata secondo la presente invenzione viene preparata mediante una reazione enzimatica, catalizzata da una transglutamminasi batterica, tra Met-G-CSF e un ammino-polietilenglicole. Un’ulteriore rivendicazione della presente invenzione riguarda una proteina peghilata preparata secondo il processo descritto nella invenzione stessa.
La presente invenzione descrive un processo per eliminare la transglutamminasi residua da peptidi o proteine ricombinanti enzimaticamente coniugate, mediante l’impiego di una transglutamminasi batterica (MTGAsi), a polimeri idrofilie] non immunogenici, con formazione di un legame ammidico con la catena laterale di una glutammina. Il risultante peptide o proteina coniugata sono stabili rispetto all’idrolisi enzimatica del legame ammidico tra la catena peptidica o proteica ed il polimero idrofilico ed essendo conseguentemente liberi da contaminanti derivati dalla degradazione del prodotto mantengono un profilo di stabilità necessario per un farmaco.
Le applicazioni preferite della presente invenzione sono illustrate, ma in nessun modo limitate, dagli esempi seguenti riguardanti un metodo per purificare Met-G-CSF (Filgrastim) monopeghilato attraverso un legame ammidico sulla glutammina 135 per azione deH’enzima MTGasi, utilizzando una cromatografia a scambio cationico condotta a bassi valori di pH che elimina ogni significativa deammidazione, causata dalla MTGasi residua, nel periodo di conservazione del biofarmaco coniugato.
ESEMPI
Esempio 1.
Negli esempi seguenti è stata utilizzata una preparazione di MTGasi commerciale Activa WM ( Ajinomoto) parzialmente purificata come descritto da Scaramuzza et al. (J. Control Rei. 164, 355-363, 2012 ) ed avente un’attività enzimatica non inferiore a 30 unità/mg proteina determinata secondo il metodo colorimetrico di Folk and Cole (J. Biol.Chem. 241 ,5518-5525, 1966) utilizzando come substrati idrossilammina e Ν-α-carbobenzossi-L-glutaminiI-glicina (N-CBZ-Gln-Gly).
Determinazione quantitative di MTGasi residua in Met-G-CSF-Gln135-PEG20 kDa
La determinazione della MTGasi residua presente come contaminante a livello di parti per milione (ppm) nelle preparazioni di Met-G-CSF peghilato viene eseguita secondo una modificazione del metodo di Pasternack R. et al. (Anal. Biochem.
249, 54-60, 1997) nel quale il composto 1-N-(benzilossi carbonil-L-glutaminilglicinil)-5-N-(5<'>-N<'>,N<'>-dimetilammino-1’-naftalensulfonil)-diammino pentano (Z-Gln-Gly-CAD-DNS) usato come substrato di MTGase forma un prodotto fluorescente coniugato tra la glutammina di CBZ-GIn-Gly-CAD-DNS ed il gruppo amminico di 2-metossi etilammìna (MED). I campioni per la curva di calibrazione sono preparati a partire da cinque soluzioni contenenti 30 pi di CBZ-GIn-Gly-CAD-DNS (2,6 mg/ml di DMSO/acqua 9:1), 20 pi di MED (1,7 mg/ml in acqua), 10 pi di DMSO e 20 pi di tampone T ris-HCI- pH 8.0. A ciascuna soluzione vengono addizionati 100 pi MTGase standard in acqua per dare concentrazioni finali di 40, 100, 200, 400 e 800 ng di MTGasi/ml.
I campioni da dosare sono preparati allo stesso modo aggiungendo invece che la soluzione standard di MTGasi, 100 μΐ di Met-G-CSF peghilato (200 ng/ml). I campioni sono quindi incubati a 37°C per 22 ore e la reazione è bloccata addizionando 100 pi di acetonitrile. Dopo centrifugazione i surnatanti dei campioni sono analizzati per RP-HPLC utilizzando una colonna Hypersyl C18, 5pm, 250 x 4.6 mm ed un rivelatore fluorimetrico (con eccitazione a 335 nm ed emissione a 550 nm) eluendo ad un flusso di 0,5 ml/min con un gradiente di 15 minuti (acetonitrile da 40 a 90%; H2O da 60 a 10%). Il prodotto coniugato fluorescente è eluito con un tempo di ritenzione di circa 8,0 minuti, mentre il substrato fluorescente CBZ-GIn -Gly-CAD-DNS è eluito a circa 7,3 minuti. La quantità di MTGAsi è calcolata interpolando l’area del picco corrispondente al campione in esame sulla curva di calibrazione ottenuta incubando CBZ-GIn -Gly-CAD-DNS e 2-metossietilammina con diverse quantità di MTGasi standard. La tabella 1 riporta l’area dei picchi di una curva di calibrazione, misurata in duplicato, corrispondenti agli standard mentre la Figura 1 riporta una curva di calibrazione ed un esempio di separazione HPLC del substrato e del prodotto della reazione enzimatica.
Tabella 1. Dosaggio fluorimetrico mediante RP-HPLC-di una soluzione standard di MTGasi
MTGasi standard Attività RP-HPLC (area del picco*) ng/ml MTGasi Campione 1 Campione 2 Media U/ml
0 0 0 0 0
40 0.0010 12.2 9.3 10.8
100 0.0025 26.8 24.4 25.6
200 0.0050 47.6 48.9 48.3
400 0.0100 103.7 91.6 97.7
800 0.0200 215.7 204.7 209.9
* Unità arbitrarie
Esempio 2.
Depeghilazione di Mat-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa catalizzata da MTGasi: effetto della quantità di MTGasi
Aliquote di 1,5 mi di filgrastim peghilato sulla glutammina 135 mediante MTGasi altamente purificata (Met-G-CSF lotto 8105, 10,0 mg/ml, formulato con sorbitolo e Tween 20 a pH 4,5 e contenente 5 ppm di MTGasi contaminante residua) sono state distribuite in 6 vials a ciascuno dei quali veniva aggiunta MTGasi per dare una concentrazione finale di 150, 50, 21 , 10, 5 e 2 ppm. I vials erano mantenuti a 5 ± 3°C in frigorifero o incubati a 25 ± 2°C. Dopo 1 , 2, 3 e 6 mesi i campioni sono stati diluiti 1 :40 v/v con tampone acetato 10 mM-pH 4,5 ed analizzati per SE-HPLC per valutare il contenuto di desammido filgrastim calcolato come percentuale dell’ area totale dei picchi. Le analisi sono state condotte caricando 5 pi di campione su una colonna Zorbax GF-250, 4pm, 4.6x250mm con rivelatore UV a 210 nm e mantenuta a 25°C, mediante eluizione isocratica con tampone K2HPO4 63 mM- pH 7 ad un flusso di 0,250 ml/min.
I risultati delle analisi sono riportati nelle tabelle 2 e 3, dove il contenuto effettivo di MTGasi è riportato tenendo conto della quantità di MTGasi presente nel lotto di Met-G-CSF peghilato n°08105.
Tabella 2. Percentuale di prodotto depeghilato (filgrastim deammidato) formatosi nel corso dello studio di stabilità di filgrastim peghilato su Gin 135, addizionato di quantità diverse di MTGAsi e mantenuto a 5°C e a pH 4,5.
Quantità di MTGasi*
Tempo
7 ppm 10 ppm 15 ppm 25 ppm 55 ppm 155 ppm (mesi)
0 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
1 0.1 0.5 0.0 2.2 6.4 23.1
2 0.3 0.9 1.6 5.6 14.9 44.7
3 0.4 0.8 2.6 7.7 19.8 53.3
6 0.4 2.2 13.2
*Somma di MTGasi inizialmente presente e di MTGasi addizionata
Tabella 3. Percentuale di prodotto depeghilato (filgrastim deammidato) formatosi nel corso dello studio di stabilità di filgrastim peghilato su Gln135, addizionato di quantità diverse di MTGAsi e mantenuto a 25°C e a pH 4,5.
Quantità di MTGasi*
Tempo
7 ppm 10 ppm 15 ppm 55 ppm 155 ppm (mesi)
0 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
1 0.7 2.7 4.7 33.5 76.4
2 1.3 5.3 8.9 -
Somma di MTGasi inizialmente presente e di MTGasi addizionata
Esempio 3.
Depeghilazione di Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa catalizzata da MTGasi: effetto del pH
Aliquote di 2 mi di filgrastim peghilato sulla glutammina 135 mediante MTGasi (lotto di Met-G-CSF 08-BK-01 , 15,5 mg/ml) sono state distribuite in 6 vials ed il pH delle soluzioni è stato portato a 3,5; 4,0; 4,5; 5,5; 6,5 e 7,5 con acido acetico diluito o con idrossido di sodio diluito.
100 pi di ciascuna soluzione sono stati diluiti 1 :40 con tampone acetate 10 mM-pH 4,5 ed analizzati per SE-HPLC come descritto nell’esempio 2 per determinare il contenuto di desammido filgrastim depeghilato (valore al Tempo 0 nella Tabella 4) Alle soluzioni rimanenti di 1,9 mi sono stati addizionati 14,7 pi di MTGasi (3 unità/ml; 0,1 mg/ml) corrispondenti a 1,47 pg e a 50 ppm.
Il contenuto di ciascun vial è stato suddiviso in 10 aliquote di 150 μΙ che sono state quindi mantenute in frigorifero a 5 ± 3°C. Dopo 1 e 2 settimane e dopo 1 , 2, 3 e 6 mesi ogni campione è stato analizzato per SE-HPLC per valutare, come percentuale dell’area totale dei picchi, il contenuto di desammido filgrastim depeghilato ed i risultati ottenuti sono riportati nella tabella 4.
Tabella 4. Percentuale di prodotto depeghilato (filgrastim deammidato) formatosi nel corso dello studio di stabilità di filgrastim peghilato su Gln135, addizionato di 50 ppm di MTGasi e mantenuto a 5°C e a diversi valori di pH .
pH delle soluzioni
Tempo
pH 3,5 pH 4,0 pH 4,5 pH 5,5 pH 6,5 pH 7,5
(mesi)
0 1.3 1.2 1.3 1.3 1.3 1.2
0.25 1.2 1.3 1.9 3.2 2.6 2,0
0,5 1.2 1.4 2.9 6.0 4.4 2.7
1 1.2 1.8 4.4 10.7 7.4 3.5
2 1.3 2.3 7.7 19.4 12.8 5.1
3 1.3 2.9 11.4 29.8 18.3 6.1
6 1.5 4.4 19.2 49.3 27.5 8.9
Come controllo, soluzioni a pH 4 di filgrastim peghilato sulla glutammina 135, non adddizionate di MTGasi sono state tenute a 5 °C fino 6 mesi ed analizzate ad intervalli, come descritto in precedenza. I risultati sono riportati nella Tabella 5.
Tabella 5. Percentuale di prodotto depeghilato (filgrastim deammidato) formatosi nel corso dello studio di stabilità di filgrastim peghilato su Gln135, mantenuto a 5°C e a pH 4, senza addizione di MTGasi.
Filgrastim peghilato senza addizione di MTGasi
Tempo (mesi) pH 4
0 1.3
0.25 1.1
0.50 1.2
1 1.3
2 1.4
3 1.2
6 1.2
Esempio 4.
Preparazione di Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa per reazione di rec-Met-G-CSF e m-PEG-NH2 in presenza di MTGasi
Ad una soluzione di Met-G-CSF ricombinante (Filgrastim) espresso in E. coli , sciolto in tampone potassio monofosfato 20 mM-pH 8,1 alla concentrazione di circa 2 mg/ml, è stato addizionato metossi-polietilenglicole-ammino, n°catalogo CIAM-20 (Sunbio, Anyang City, South Korea) in rapporto molare mPEG-NH2:Met-G-CSF di 10:1. Dopo addizione di MTGasi per dare una concentrazione finale di 0,25 U/ml, la soluzione è stata mantenuta 16 ore a 5±2°C in debole agitazione.
La resa di peghilazione (media di 3 reazioni) è stata di 84,6 ± 6.5 %, come riportato nella Tabelle 6, 7 e 8.
Tabella 6. Risultati della peghilazione enzimatica di Met-G-CSF (reazione n° 1)
Reazione di peghilazione N° 1 Risultati
0,31 grammi
0,37 grammi di Met-G-CSF
Met-G-CSF-Q<135>-PEG 20 kDa
46 unità di MTGase Resa di peghilazione 83.7 %
3,7 grammi di mPEG-NH220 kDa Aggregati 1 ,6% dell’area totale dei picchi
Tabella 1. Risultati della peghilazione enzimatica di Met-G-CSF (reazione n° 2)
Reazione di peghilazione N° 2 Risultati
0,31 grammi
0,39 grammi di Met-G-CSF
Met-G-CSF-Q<135>-PEG 20 kDa
49 unità di MTGase Resa di peghilazione 78.5%
3,9 grammi di mPEG-NH220 kDa Aggregati 4,4 % dell’area totale dei picchi
Tabella 8. Risultati della peghilazione enzimatica di Met-G-CSF (reazione n° 3)
Reazione di peghilazione N° 2 Risultati
1 ,40 grammi di Met-G-CSF 1 ,28 grammi di Met-G-CSF-Q<iai)>-PEG 20 kDa
Resa di peghilazione 91 ,5 %
175 unità di MTGasi
Aggregati 1 ,3 % dell’area totale dei picchi
14 grammi di mPEG-NFI2 20 kDa
La separazione SE-HPLC della miscela di reazione dopo 30 minuti e 16 ore
confermava la elevata resa di formazione di Met-CSF-Gln135-PEG 20 kDa come
riportato, per esempio nella Figura 2.
Esempio 5.
Purificazione di Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa a diversi pH
Le miscele delle reazioni di peghilazione N° 1 , 2 e 3 (vedi l’esempio 4) erano portate con acido acetico 1 M rispettivamente a pH 5,0, a pH 4,5 e a pH 4,0 e purificate separatamente su una colonna cromatografica di resina a scambio cationico (Macrocap SP) pre-equilibrata con tampone 30 mM sodio acetato titolato allo stesso pH della soluzione di caricamento. Dopo lavaggio della colonna con 4 volumi di tampone di equilibrazione, si raccoglieva il prodotto di reazione Met-G-CSF-Gln35-PEG 20 kDa per eluizione con tampone sodio acetato 200 mM titolato allo stesso pH della soluzione di caricamento. Le frazioni contenenti Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa erano riunite ed il tampone era scambiato su una colonna di Sephadex G 25 equilibrata ed eluita con tampone sodio acetato 10 mM titolato allo stesso pH del tampone di eluizione.
A ciascun passaggio della procedura di purificazione, campioni delle diverse soluzioni sono stati analizzati per SE-HPLC per determinare la resa di reazione, il grado di purificazione e la concentrazione proteica.
Una aliquota delle soluzioni finale ottenute dopo la scambio del tampone è stata concentrata su una ultramembrana Amicon (cut-off 10 kDa) fino ad ottenere una concentrazione finale di circa 13 mg/ml. La contaminazione residua di MTGasi è stata determinata nelle soluzioni concentrate con il metodo RP-HPLC fluorimetrico descritto nell’esempio 1. I risultati delle purificazioni di Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa condotte a pH 5, pH 4.5 e pH 4.0 sono riassunti nella Tabelle 9, 10 e 11.
Dopo ogni separazione la colonna cromatografica era rigenerata con sodio idrossido 0.5 M seguita dall’equilibrazione della resina con tampone sodio acetato 30 mM.
Tabella 9. Riassunto della purificazione di Met-G-CSF-Gln1 35-PEG 20 kDa a pH 5
Purificazione della reazione N° 1 a pH 5.0 Risultati
0,24 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG 20 Colonna Macrocap SP 1 ,6 x 28 cm
kDa
Caricamento
Resa di purificazione 76.5% 0,31 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG 20 kDa
Pool eluito dalla colonna Macrocap SP Aggregati 1 ,4 % dell’area totale dei picchi 0,24 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG20 kDa
MTGasi residua 68 ppm
Tabella 10. Riassunto della purificazione di Met-G-CSF-Gln1 35-PEG 20 kDa a pH 4,5
Purificazione della reazione N° 2 a pH 4,5 Risultati
Colonna Macrocap SP 1 ,6 x 28 cm 0.29 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG20 kDa
Caricamento
Resa di purificazione 93.5 % 0,31 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG 20 kDa
Pool eluito dalla colonna Macrocap SP
0,29 grammi di Met-G-CSF-Gln135-PEG20 kDa Aggregati 2,1 % dell’area totale dei picchi
MTGasi residua 36 ppm
Tabella 11. Riassunto della purificazione di Met-G-CSF-Gln135-PEG20 kDa a pH 4,0.
Purificazione della reazione N°3 a pH 4,0 Risultati
Colonna Macrocap SP 5 x 28 cm 0,90 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG20 kDa
Caricamento
Resa di purificazione 70.3 %
1 ,28 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG20 kDa
Pool eluito dalla colonna Macrocap SP
0,90 grammi di Met-G-CSF-Gln<135>-PEG20 kDa Aggregati 0,4 % dell’area totale dei picchi
MTGasi residua 3 ppm Esempio 6:
Riproducibiità della purificazione di Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa mediante eluzione a pH 4,0
Quattro preparazioni di Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa sono state purificate su resina Macrocap SP a pH 4, come descritto nell’esempio 5, per verificare la riproducibilità dell'eliminazione di MTGasi nel processo di purificazione cromatografica di r-Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa a pH 4. La quantità residua di MTGasi nelle soluzioni concentrate di r-Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa sono state determinate come descritto nell’esempio 1 ed i risultati ottenuti sono riportati nella tabella 12.
Tabella 12. Riproducibilità del processo di purificazione di r-Met-G-CSF-Q135-PEG 20 kDa a pH 4.0.
Preparazionel Preparazione2 Preparazione 3 Preparazione 4
Colonna Macrocap SP XK50/30 h=28cm
Caricato su Macrocap SP* 1 ,28 grammi 1 ,10 grammi 1 , 29 grammi 1 ,41 grammi
Pool da Macrocap SP* 0,90 grammi 0,73 grammi 0,95 grammi 1 ,04 grammi
Resa di purificazione (%) 70,3 72,4 74,2 73,7
Aggregati (% area dei picchi 0,8 0,4 1 ,2 0,7
MTGasi residua (ppm) 3,2 3,3 < 3** < 3** *grammi dif Met-G-CSF-Gln135-PEG 20 kDa;
**Limit of Detection = 3 ppm
Esempio 7: Cromatografìa preparativa di MTGasi su resina a scambio ionico a pH 5
6.8 mg of MTGasi, sciolti in 60 mi di tampone acetato pH5,0, sono stati caricati su una colonna di resina a scambio ionico Macrocap SP che è stata successivamente eluita con tampone acetato pH 5 ottenendo il profilo di eluizione riportato nella figura 3. 15 mi della frazione di 150 mi corrispondente al volume di eluizione di Met-G-CSF peghilato sono stati concentrati fino a 0,6 mi (25 volte) per ultrafiltrazione (Centriprep Ultracell™10-10,000 MWCO) e sul concentrato è stata determinata la quantità di MTGasi presente con il metodo analitico descritto nell’esempio 1 (figura 5). Come riportato nella tabella 13, in questa frazione non è stata misurata alcuna quantità di MTGasi, quando il limite di determinazione di MTGasi era uguale a 20 ng/ml, corrispondente a 2,5 ppm in caso di coeluizione in questa frazione di Met-G-CSF peghilato.
La medesima quantità di MTGasi (6.8mg ), addizionata di 107.1 mg di Met-G-CSF peghilato e sciolta in 60 mi di tampone acetato-pH 5.0, è stata caricata su una colonna a scambio ionico Macrocap SP ed eluita con tampone acetato-pH 5, ottenendo il profilo di eluizione riportato nella figura 4. Dalla colonna sono state raccolte frazioni di circa 200 mi, corrispondenti al volume di eluizione di Met-G-CSF peghilato e di 50 mi, corrispondenti alla quantità residuale di Met-G-CSF non peghilata e 15 mi di queste soluzioni sono state concentrate 25 volte (fino a 0,6 mi) per ultrafiltrazione (su Centriprep Ultracell™1 0-10,000 MWCO) e sui concentrati è stata determinata la quantità di MTGasi presente con il metodo analitico descritto nell’esempio 1 (figura 5). Come riportato nella tabella 13, la frazione contenente Met-G-CSF peghilato era contaminata con 256 ng/ml di MTGasi (corrispondenti a 32 ppm) mentre la frazione contenente Met-G-CSF non peghilato oltre che un residuo di Met-G-CSF peghilato era contaminata da 1628,4 ng/ml di MTGasi (Figura 5). Questi risultati dimostrano che, a pH 5, MTGasi sui lega parzialmente a Met-G-CSF peghilato rendendo inefficiente la purificazione cromatografica su resina a scambio ionico dei prodotti peghilati.
Tabella 13. Riassunto delle determinazioni mediante analisi fluorimetrica RP-HPLC di MTGasi nelle frazioni eluite dalla resina Macrocap SP caricata con solo MTGasi e con MTGasi in presenza di Met-G-CSF peghilato.
Esperimento Met-G-CSF Campione RP-HPLC MTGasi MTGasi area del picco* ng/ml peghilato ppm mg/ml
MTGasi Frazioni 0 < 20 0 < 2.5<*>
26-40
Frazioni 65.1 256
MTGasi 8 32 Met-G-CSF 21-58
peghilato
Frazioni 69.2 1628 7.5 -66-75
*Unità arbitrarie
Esempio 8:
Identificazione del prodotto depeqhilato mediante IE-HPLC
Una soluzione a pH 4,5 contenente filgrastim peghilato purificato e 50 ppm di MTGasi, preparata come descritto nell’esempio 5, è stata mantenuta per 1 mese a 5°C e quindi analizzata per HPLC su colonna a scambio ionico (IE-HPLC), in paragone ad una soluzione di Met-G-CSF peghilato altamente purificato.
Una soluzione di Met-G-CSF non peghilato purificato addizionata di 50 ppm di MTGasi è stata mantenuta a temperatura ambiente per 1 ,5 ore e quindi analizzata per HPLC su colonna a scambio ionico, in paragone ad una soluzione di Met-G-CSF purificato.
L’analisi IE-HPLC è stata condotta utilizzando una colonna TSK gel DEAE-5PW 10 pm, di 7.5 cm x 7.5mm i.d., termostatata a 25°C e con un rivelatore UV a 215 nm, eluita ad un flusso di 0,7 ml/min con le fasi mobili A (tampone 30 mM Tris-HCI, pH 7,5) e B (30 mM Tris-HCI, pH 7,5-0, 1 M NaCI) secondo il seguente gradiente:
Tempo (min): 0 2 5 15 40
% fase B: 0 0 6 13 75
I risultati, riportati nelle Figure 6 e 7, dimostrano che Met-G-CSF peghilato viene eluito col fronte del solvente, con un tempo di ritenzione di circa 8,2 minuti e che il prodotto depeghilato (desammido Met-G-CSF-Gln<135>Glu) viene eluito a circa 34 minuti. Met-G-CSF non peghilato viene eluito con un tempo di ritenzione di circa 24 minuti mentre il cromatogramma di Met-G-CSF incubato con MTGasi presenta un picco addizionale con comportamento simile al picco con tempo di ritenzione di 34 minuti osservato nella soluzione di Met-G-CSF peghilato trattato con MTGasi. Questi risultati confermano che la depeghilazione di r-Met-G-CSF-Q<135>-PEG 20 kDa si accompagna alla concomitante deammidazione della glutammina 135.
Dalla descrizione precedente così come dagli esempi sopra riportati risultano evidenti i vantaggi che si ottengono dal processo descritto nella presente invenzione.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Una proteina peghilata, ottenibile mediante reazione enzimatica catalizzata da una transglutamminasi microbica (MTGasi), caratterizzata dal fatto che il contenuto residuo di MTGasi nel prodotto purificato non è superiore a 5 ppm. 2. Un processo per la purificazione di una proteina peghilata, ottenibile per peghilazione enzimatica con una transglutamminasi, mediante cromatografia a scambio cationico comprendente i seguenti passaggi: a. equilibrazione di una colonna cromatografica a scambio cationico ad un pH inferiore od uguale a 4; b. caricamento della colonna cromatografica di cui al passaggio a, con la miscela contenente la proteina peghilata portata ad un pH uguale o inferiore a 4. c. eluizione della colonna cromatografica di cui al passaggio b, con una fase eluente avente un pH inferiore o uguale a 4 e raccolta delle frazioni contenenti la proteina peghilata con un contenuto residuo di MTGasi uguale o inferiore a 5 ppm rispetto alla quantità totale di proteina peghilata. 3. Il processo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il pH dei passaggi a e b è mantenuto nell'intervallo da 3 a 4, con il pH preferibilmente mantenuto a 4 e dal fatto che il pH dei passaggi a e b è condotto con un tampone acetato, preferibilmente con una tampone acetato 30 mM 4. Il processo secondo qualsiasi delle rivendicazioni 2 e 3, caratterizzato dal fatto che il pH del passaggio c è condotto con un tampone acetato, preferibilmente con un tampone acetato 200 mM. 5. Il processo secondo qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 4, caratterizzato dal fatto che dopo il caricamento del passaggio b, la colonna cromatografica è lavata con 4 volte il volume della colonna cromatografica con tampone acetato e preferibilmente tampone acetato 30 mM. 6. Il processo secondo qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 5, caratterizzato dal fatto che la miscela di reazione del passaggio b si ottiene mediante una reazione enzimatica, catalizzata da una transglutamminasi microbica, tra una proteina terapeutica ed un polimero idrofilico, preferibilmente un polimero idriofilico non immunogenico. 7. Il processo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che la proteina terapeutica è selezionata da un gruppo comprendente Met-G-CSF, G-CSF, GM-CSF, h-GH, intereferoni, interleuchine, frammenti anticorpali Fab e scFv, glucagone, GLP-1, insuline oltre ad analoghi e derivati di queste proteine. 8. Il processo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che il polimero idrofilico non immunogenico è selezionato da un gruppo comprendente glicole polietilenico, poliacriloilmorfolina, polivinilpirrolidone ed idrossietil- amido. 9. Il processo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che la proteina peghilata è ottenuta nella reazione enzimatica, catalizzata da una transglutamminasi microbica, tra Met-G-CSF e amminopolietilenglicole. 10. Una proteina peghilata ottenibile in un processo secondo qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 9. (ZAC/lm) CLAIMS / RIVENDICAZIONI 1. A PEGylated protein, obtained by enzymatic pegylation via microbial transglutaminase (MTGase), characterized by the fact that the content of residual MTGase in the purified product is not higher than 5 p.p.m.
  2. 2. Process for the purification of a PEGylated protein, obtained by enzymatic pegylation via transglutaminase, by cation exchange chromatography including the steps of, a. bringing a cation exchange chromatography column to a pH of less than or equal to 4; b. loading the chromatography column with a reaction mixture containing the PEGylated protein, having a pH of less than or equal to 4 on the column of step a.; c. eluting the chromatography column of step b. with an eluent having a pH of less than or equal to 4, thereby collecting a fraction containing the PEGylated protein having a residual microbial transglutaminase content lower or equal to 5ppm of the total amount of the PEGylated protein.
  3. 3. The process according to claim 2, wherein the pH of steps a., b. and c. is in the range of from 3 to 4, preferably pH 4, and wherein the pH of steps a. and b. is obtained with an acetate buffer, preferably a 30mM acetate buffer.
  4. 4. The process according to anyone of claims 2 to 3, wherein the pH of step c. is obtained with an acetate buffer, preferably a 200mM acetate buffer.
  5. 5. The process according to anyone of claims 2 to 4, wherein after the loading step b., the chromatography column is washed with an acetate buffer, preferably a 30m M acetate buffer, in a volume which is of 4 times the volume of the chromatography column.
  6. 6. The process according to anyone of claims 2 to 5, wherein said reaction mixture of step b. is obtained through an enzymatic reaction catalyzed by microbial transglutaminase, between a therapeutic protein and a hydrophilic polymer, preferably a hydrophilic non immunogenic polymer.
  7. 7. The process according to claim 6, wherein said therapeutic protein is selected from the group consisting of Met-G-CSF, G-CSF, GM-CSF, h-GH, Interferons, interleukins, Fab and scFv antibody fragments, Glucagon, GLP-1 , Insulins and derivatives and analogues thereof.
  8. 8. The process according to claim 6, wherein said hydrophilic non immunogenic polymer is selected from the group consisting of polyethyleneglycol, polyacryloyl morpholine, polyvinyl pyrrolidone, and hydroxyl ethyl starch.
  9. 9. The process according to claim 2, wherein said PEGylated protein is obtained through an enzymatic reaction catalyzed by microbial transglutaminase, between Met-G-CSF and amino-polyethyleneglycol
  10. 10. A PEGylated protein obtainable by the process according to anyone of claims 2 to 9.
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