JP2016501886A - 高純度の治療用複合タンパク質の調製方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、血漿半減期が改良された薬物の製造に適した複合ペプチドの分野に関するものである。特に、本発明は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）を介した酵素反応によって得られる複合タンパク質と、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）によりアミド結合を介してグルタミン側鎖にて親水性非免疫原性ポリマーと酵素的に結合したペプチド又は組換えタンパク質から残留トランスグルタミナーゼを除去するための改良された方法とに関するものであり、該方法によれば、ペプチド又はタンパク質部分と親水性ポリマーの間にあるアミド結合の酵素加水分解に対して安定である精製された複合ペプチド又はタンパク質を得ることが可能であり、そして、生成物由来の分解がなく、薬物に必要な安定性を示す。

Description

本発明は、血漿半減期が改良された薬物の製造に適した複合ペプチドの分野に関するものである。特に、本発明は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）を介した酵素反応によって得られる複合タンパク質と、生成物由来の分解がなく改良された保存寿命を示す高純度の複合タンパク質を調製するための改良された方法とに関するものである。
生体適合性のある高分子量ポリマーへの複合化は、治療用ペプチド又はタンパク質の半減期を増加させる目的やそれらの長続きする効果を改善する目的から最も適用されている技術の一つである。特に、広く使用されている所謂ＰＥＧ化反応においては、選ばれたタンパク質が、分子量が１，０００〜２，０００ダルトン（Ｄａ）から２０，０００〜４０，０００Ｄａの範囲にあるか又はそれ以上である一種以上の線状又は枝分かれポリ−（エチレングリコール）（ＰＥＧ）鎖に共有結合している。一般に、ＰＥＧ化したタンパク質は、高い安定性や低下した免疫原性の他、低い腎クリアランス速度を示す。ポリペプチドがＰＥＧと適切に結合している場合には、その流体力学的体積が増加し、その物理化学的特性が修飾される一方で、インビトロでの活性や受容体認識等の根本的な生物学的機能については、変化がなかったり、低下を受けたり、時には完全に取り除かれたりする場合がある。ＰＥＧ複合化は、タンパク質の表面をマスクし、その見掛け上の分子サイズを増加させ、それ故に、腎臓の限外ろ過を低下させ、抗体又は抗原処理細胞との相互作用を妨げて、タンパク質分解を低下させる。最後に、ＰＥＧ複合化は、ＰＥＧ化した分子に、その物理化学的特性を与えるため、ペプチド及び非ペプチドの薬物体内分布及び溶解度も修飾される。ＰＥＧに代わる手段であるタンパク質の複合化のもう一つの選択肢として、例えば、デキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）、多糖等、その他の生体適合性のある線状又は枝分かれポリマーの使用がある。
ＰＥＧ化は、アミノ酸反応性側鎖と適切に官能基化されたメトキシ−ＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ）間の化学反応によって一般的に行われる。
一般的に用いられる化学的なＰＥＧ化技術は、以下に示す刊行物において説明されている：
・ S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev., 16, 157-182, 1995
・ F.M. Veronese, Peptide and Protein PEGylation: a Review of Problems and Solutions, Biomaterials, 22, 405-417, 2001
・ S. Jevsevar, M. Kunstelj,V.G. Porekar, PEGylation of therapeutic proteins, Biotechnol. J. 5, 113-128, 2010
化学的ＰＥＧ化の他には、ｍ−ＰＥＧ鎖とタンパク質を結合する酵素的手順が説明されている。これらは、例えば、原核生物起源と真核生物起源両方のトランスグルタミナーゼ酵素を用いて、第一級アミノ基で官能基化されたｍ−ＰＥＧの、興味のあるポリペプチド鎖に自然に存在しているか又は部位特異的な突然変異反応によって挿入されたグルタミン残基のアシル基への移動を触媒することに基づいている（H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of Proteins, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 487-504, 2002）。
例えば、ＥＰ７８５２７６及びＵＳ６０１０８７１は、両方とも、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）を用いて、ポリマー鎖を、アミノ酸配列において少なくとも一つのグルタミン残基を持つペプチドやタンパク質に結合させることを記載している。これらの特許では、一部のモデルタンパク質に関する一置換の例が与えられているものの、その置換が部位特異的かどうかまでは不明確である。そのことは、単一の分子の形態が得られるのか又は位置異性体混合物（一置換であるがそのポリマー鎖は異なるグルタミンに結合している）が得られるのか、重要性を持つ。
一方、ＥＰ２０４９５６６及びＵＳ７８９３０１９は、両方とも、ＭＴＧａｓｅを用いた酵素反応によってグルタミン１３５にて選択的にモノＰＥＧ化された新しいＧ−ＣＳＦ類似体を開示している。
しかしながら、先に報告された特許及び論文では、酵素反応に由来するＰＥＧ化した生成物の精製方法については全く注意を払っていない。特には、予想外にも、複合化したＰＥＧ分子を依然として加水分解する可能性があり、生成物由来の不均一性にとって代わることもあり得る生成物中に残留した汚染ＭＴＧａｓｅの量を考慮して、注目していない。
安定な治療用タンパク質を維持することを可能にする方法を開発する必要性及び重要性をますます感じている。
ＥＰ７８５２７６ ＵＳ６０１０８７１ ＥＰ２０４９５６６ ＵＳ７８９３０１９
S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev., 16, 157-182, 1995 F.M. Veronese, Peptide and Protein PEGylation: a Review of Problems and Solutions, Biomaterials, 22, 405-417, 2001 S. Jevsevar, M. Kunstelj,V.G. Porekar, PEGylation of therapeutic proteins, Biotechnol. J. 5, 113-128, 2010 H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of Proteins, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 487-504, 2002
そこで、本発明の目的は、複合反応後に存在し、複合化した薬物の保管中にそれを分解させる残留ＭＴＧａｓｅ汚染物の低下を可能にする方法を開発することにある。
本発明は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）を介した酵素反応によって得られる複合タンパク質に関するものであり、その精製物中における残留ＭＴＧａｓｅの含有量が３ｐ．ｐ．ｍ以下であることを特徴としており、前述の複合タンパク質は、２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す。
更なる態様において、本発明は、トランスグルタミナーゼを介した酵素反応によって得られる複合タンパク質の陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製方法に関するものである。
本発明の詳細な説明において更に記載されるように、本発明の方法は、高純度の治療用複合タンパク質を得ることが可能になる利点を有する。
本発明に従う複合タンパク質の精製方法は、
ａ．陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを４未満のｐＨにする工程と；
ｂ．上記クロマトグラフィーカラムに、工程ａ．のカラム上でｐＨが４未満である、ＰＥＧ化したタンパク質を含有する反応混合物を充填する工程と；
ｃ．ｐＨが４未満の溶離液を用いて工程ｂ．のクロマトグラフィーカラムを溶離する工程とを含むものであり、
それによって、残留微生物トランスグルタミナーゼの含有量が複合タンパク質の総量の３ｐｐｍ以下である複合タンパク質を含有する画分を集め、前述の複合タンパク質が、２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す。
本発明の更なる態様は、ここに記載される方法によって得られる複合タンパク質と、前述のタンパク質及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物である。
本発明の特徴及び利点は、以下に報告される詳細な説明と、限定されるものではないが実例となるために与えられた例と、添付の図１〜８から明らかになる。
ＭＴＧａｓｅのＲＰ−ＨＰＬＣ蛍光分析を示す。ＭＴＧａｓｅのＲＰ−ＨＰＬＣ蛍光分析。較正曲線（ａ）と、８．０分の蛍光生成物ＣＢＺ−Ｇｌｎ（Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳ）−Ｑ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｍｅからの、７．３分の蛍光基質ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳのＲＰ−ＨＰＬＣ分離（ｂ）。 約３０分後（ａ）及び１６時間後（ｂ）のＭＴＧａｓｅの存在下におけるＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦとｍＰＥＧ−ＮＨ２ ２０ｋＤａの反応混合物のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（１１．５分の保持時間で溶出される）がＰＥＧ化されてＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａ（保持時間７．９分）を与えることを示す。１３分で溶出されたピークは溶媒前端に起因する。 ｐＨ５のＭａｃｒｏｃａｐ ＳＰカラムからのＭＴＧａｓｅの溶出プロファイルを示す。 ｐＨ５のＭａｃｒｏｃａｐ ＳＰカラムからのＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦとＭＴＧａｓｅの溶出プロファイルを示す。 ＭＴＧａｓｅ分離画分２６〜４０（ａ）と、ＰＥＧ化Ｍｅｔ−ＧＣＳＦ＋ＭＴＧａｓｅ画分２１〜５８（ｂ）と、画分６６〜７５（ｃ）における残留ＭＴＧａｓｅのＲＰ−ＨＰＬＣ蛍光分析を示す。 ５０ｐｐｍのＭＴＧａｓｅの存在下における５℃で１箇月の保管の前（ａ）及び後（ｂ）における精製したｒ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｑ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａのＩＥ−ＨＰＬＣを示す。７．５〜８．１分で溶出されたＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのゆがんだピークは、溶媒の前端と一緒の溶出による人為的な結果である。 室温にて５０ｐｐｍのＭＴＧａｓｅによる１．５時間の処置の前（ａ）及び後（ｂ）における精製したｒ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのＩＥ−ＨＰＬＣを示す。 ＴＧａｓｅの媒介によるＰＥＧ化によって生成され、異なるｐＨの陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製された、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧの安定性データを示す。
本発明は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）を介した酵素反応によって得られる複合タンパク質に関するものであり、その精製物中における残留ＭＴＧａｓｅの含有量が５ｐ．ｐ．ｍ以下、好ましくは３ｐ．ｐ．ｍ以下であることを特徴としており、前述の複合タンパク質は、２〜８℃の範囲における温度にて、少なくとも２４箇月、好ましくは少なくとも３６箇月の保存寿命を示す。
微生物トランスグルタミナーゼ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）により触媒される反応を用いてグルタミンへのアミド結合を介して親水性非免疫原性ポリマーと複合化した治療用ペプチド又は組換えタンパク質を高純度で得るための精製方法であって、残留汚染酵素を非常に低い量で（実に３ｐｐｍ程度に低い）含有する複合ペプチド又はタンパク質を得ることが可能になる。
有利には、複合化した（好ましくはＰＥＧ化した）ペプチド又はタンパク質は、非常に高い安定性を示すことが証明されており、５±３℃で保管される場合には３６箇月以上の安定性を示し、それ故に、薬物として使用できる。予期せぬ高純度によって、ペプチド又はタンパク質とポリマー間にある酵素により触媒されたアミド結合の開裂が起こり得ず、その結果、有利には薬物として使用し得る安定な生成物が提供される。
４．０未満のｐＨにて行われる精製の利点を実証する例として、図８では、ＴＧａｓｅＰＥＧ化によって作製されたＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦであって、異なるｐＨでの陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製され、冷蔵庫内で２４箇月及び３６箇月保管された４つのバッチについての安定性データを報告する。バッチ０８ＢＫ０１及び０８ＢＫ０２は、４．０より高いｐＨで精製され、残留ＴＧａｓｅを３ｐｐｍより多く含有するものであり、２４箇月の保管後に、高い量の脱アミド化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（＞１％）を示している。バッチ０８１０５は、ｐＨ４．０で精製され、５ｐｐｍの残留トランスグルタミナーゼを含有するものであり、バッチ０８ＢＫ０１及び０８ＢＫ０２よりも安定であるが、３６箇月の保管後にかなりの量の脱アミド化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（０．２％）を示している。バッチＬＰ０７０４２４は、４．０未満のｐＨで精製され、検出可能な量の残留ＴＧａｓｅ（＜３ｐｐｍ）を含有しないものであり、最も安定であり、冷蔵庫内での３６箇月の保管後にも脱アミド化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの検出可能な含有量を示していない。
好ましい態様において、本発明に従う複合タンパク質は、治療用タンパク質と、親水性ポリマー、好ましくは親水性非免疫原性ポリマーとの間における、微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られる。
上記治療用タンパク質は、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈ−ＧＨ、インターフェロン、インターロイキン、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ抗体フラグメント、グルカゴン、ＧＬＰ−１、インスリン並びにその誘導体及び類似体よりなる群から好適に選択できる。
上記親水性非免疫原性ポリマーは、好ましい形態として、ポリエチレングリコール、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルピロリドン、及びヒドロキシルエチルデンプンよりなる群から選択できる。
より好適な態様においては、上記複合タンパク質が、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦとアミノ−ポリエチレングリコールとの間における、微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られるものであり、それによって、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧを得ることが可能になる。
本発明に従う複合タンパク質は、２〜８℃の範囲における温度、好ましくは５℃の温度にて、少なくとも３６箇月の保存寿命を示すという利点を有する。
このような保存寿命は、予測されなかったものであり、従来技術のタンパク質によってこれまで得られていない。該タンパク質は、複合反応後に存在する残留ＭＴＧａｓｅ汚染物を有しており、その保管中に複合化した薬物を分解してしまう（図８）。
本発明は、
ａ．陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを４未満のｐＨにする工程と；
ｂ．上記クロマトグラフィーカラムに、工程ａ．のカラム上でｐＨが４未満である、複合タンパク質を含有する反応混合物を充填する工程と；
ｃ．ｐＨが４未満の溶離液を用いて工程ｂ．のクロマトグラフィーカラムを溶離する工程とを含む陽イオン交換クロマトグラフィーによって、トランスグルタミナーゼを介した酵素反応によって得られる、複合タンパク質を精製する方法に関するものであり、
それによって、残留微生物トランスグルタミナーゼの含有量が複合タンパク質の総量の３ｐｐｍ以下である複合タンパク質を含有する画分を集め、前述の複合タンパク質は、２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す。
本発明の方法は、高純度で且つ残留微生物トランスグルタミナーゼの含有量が３ｐｐｍ以下であるＰＥＧ化タンパク質を得ることが可能になる利点を有しており、それにより、薬物安定性の著しい向上を可能にする。本発明によって提供される方法においては、トランスグルタミナーゼが、ＰＥＧ化した生成物から驚くほど効率よく分離される。この予期しない結果は、ｐＨ＜４．０の酸性溶離液を用いて、試薬と汚染酵素からの複合ペプチド又はタンパク質の陽イオン交換精製を行うことによって得られる。このｐＨの値では、ＰＥＧ化タンパク質と酵素の間で非共有結合性の相互作用がなく、それ故に、ＰＥＧ化タンパク質による酵素部分の保持を回避する。
好ましい態様においては、本発明に従う方法の工程ａ．、ｂ．及びｃ．のｐＨが、３〜３．９の範囲内にあり、好ましくはｐＨ３．８であり、更に好ましくはｐＨ３．５である。
本発明のために：
・「複合タンパク質」の用語は、親水性ポリマー、好ましくは親水性非免疫原性ポリマーと共有結合しているタンパク質又はペプチドを指す。例えば、親水性非免疫原性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルピロリドン、及びヒドロキシルエチルデンプンとすることができる。
・「Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ」の用語は、メチオニル化した顆粒球コロニー刺激因子をグルタミン１３５にてポリエチレングリコールと複合化したものを指す。
・「ＰＥＧ化タンパク質又はＰＥＧ化ペプチド」の用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖と共有結合しているタンパク質又はペプチドを指す。
・「治療用ペプチド又はタンパク質誘導体」の用語は、天然配列の生物学的活性を完全に又は部分的に維持するアミノ酸鎖を指す。
・「タンパク質若しくはペプチド又はそれらの同族体」の用語は、対応する天然ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも９０％が一致しているアミノ酸配列を持つタンパク質又はペプチド変異体を指す。この文脈において、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列の変化は、天然配列の１つ以上のアミノ酸を加えること、減らすこと、置換すること又は化学的に修飾することに起因し得る。
・「適切な生体適合性ポリマー」の用語は、酵素複合反応に使用されるあらゆるポリマーを指しており、同一の複合ポリマーが、全身経路を経由して投与される場合に、免疫活性化を引き起こさず、特異的な抗ポリマー抗体を大きくもたらすことがないことを示唆する。本発明に含まれる生体適合性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシプロピレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルホリン、多糖及びデキストランがある。
・「微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）により触媒される反応によって生体適合性ポリマーと複合化した治療用ペプチド又は組換えタンパク質」の用語は、ペプチド又はタンパク質の半減期を増加させるためにＭＴＧａｓｅを用いることによって適切な生体適合性ポリマーと共有結合している、臨床的に有用なあらゆるタンパク質又はペプチド及びそれらの同族体又は変異体を指す。治療用ペプチドの用語は、化学合成又は組換えＤＮＡ技術によって調製される５０残基未満のアミノ酸配列を指す。
更に好ましい態様においては、本発明に従う方法の工程ａ．及びｂ．のｐＨが、酢酸緩衝液、好ましくは３０ｍＭの酢酸緩衝液によって得られる。
より一層好ましい態様においては、本発明に従う方法の工程ｃ．のｐＨが、酢酸緩衝液、好ましくは２００ｍＭの酢酸緩衝液によって得られる。
更なる態様においては、本発明に従う方法の充填工程ｂ．の後で、クロマトグラフィーカラムの体積の４倍の体積の酢酸緩衝液、好ましくは３０ｍＭの酢酸緩衝液によって、クロマトグラフィーカラムを洗浄する。
更なる態様においては、本発明に従う方法の工程ｂ．の反応混合物が、治療用タンパク質と、親水性ポリマー、好ましくは親水性非免疫原性ポリマーとの間における、微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られる。
本発明の更なる態様においては、治療用タンパク質が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のその臨床上用いられる変異体；インターフェロン（ＩＦＮ）；ヒト成長ホルモン（ｈ−ＧＨ）；インターロイキン、Ｆａｂ及びｓｃＦＶフラグメント等のモノクローナル抗体フラグメント；インスリン；グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）等のインクレチン模倣ペプチド、エキセナチド、並びにそれらの誘導体及び類似体よりなる群から選択される。
本発明の更なる態様においては、親水性非免疫原性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリロイルモルホリン（ＰＡＭ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及びヒドロキシルエチルデンプンよりなる群から選択される。
更に好ましい態様においては、本発明に従う方法によって得られる複合タンパク質が、ＰＥＧ化タンパク質であり、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦとアミノ−ポリエチレングリコールの間での微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られるものであるが、それによって、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧを得ることが可能になる。
本発明に従う方法は、有利に、温度５℃にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す複合タンパク質を得ることが可能になる。
更なる態様において、本発明は、ここに記載される方法によって得られる複合タンパク質、好ましくはＰＥＧ化タンパク質に関係する。
ｐＨ４未満での陽イオン交換クロマトグラフィー方法によって得られる複合タンパク質は、２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも３６箇月の保存寿命を有利に示す。
更なる態様において、本発明は、上記複合タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に関するものである。
ペプチド又は組換えタンパク質を微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）によってアミド結合を介してグルタミン側鎖にて親水性非免疫原性ポリマーと酵素的に複合化したものから残留トランスグルタミナーゼを除去する方法がここに記載される。結果として生じる精製された複合ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質部分と親水性ポリマー間にあるアミド結合の酵素加水分解に対して安定であり、生成物由来の分解がなく、薬物に必要な安定性を示す。
複合バイオ薬物の保存期間中におけるかなりの脱アミド化を排除するため、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）をグルタミン１３５のアミド結合により酵素的にモノＰＥＧ化したものを、低いｐＨでの陽イオン交換クロマトグラフィーによって、汚染酵素ＭＴＧａｓｅから精製する方法に関する以下の例によって、本発明の好適な実施態様を説明するが、これらは決して制限されるものではない。
例１．
Ｆｏｌｋ及びＣｏｌｅ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１，５５１８−５５２５，１９６６）の方法に従って基質としてＮ−α−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミニル−グリシン（Ｎ−ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）とヒドロキシルアミンを用いたヒドロキサメート比色分析手順によって分析したときの酵素活性がタンパク質ｍｇ当たり３０ユニット以上となるよう、Ｓｃａｒａｍｕｚｚａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．１６４，３５５−３６３，２０１２）に記載されるように部分的に精製された市販の酵素（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ，Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）のバッチから、以下の例において用いられるＭＴＧａｓｅを調製した。
Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａにおける残留ＭＴＧａｓｅの定量化
Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９，５４−６０，１９９７）に記載される方法の修飾により残留ＭＴＧａｓｅ汚染物を評価することによって、ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを汚染するＭＴＧａｓｅの百万分率（ｐｐｍ）レベルでの決定を行う。簡潔には、１−Ｎ−(ベンジルオキソカルボニル−Ｌ−グルタミニル−グリシニル)−５−Ｎ−(５’−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ−１’−ナフタレンスルホニル)−ジアミノ，ペンタン（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳ）をＭＴＧａｓｅ基質として用いて、ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳのグルタミンと２−メトキシエチルアミン（ＭＥＤ）のアミノ基の間において蛍光性の複合生成物を形成させる。ＤＭＳＯ／水（９：１）中における２．６ｍｇ／ｍｌのＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳ ３０μｌ、１．７ｍｇ／ｍｌのＭＥＤ水溶液 ２０μｌ、ＤＭＳＯ １０μｌ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ−ｐＨ８．０緩衝液 ２０μｌを混合することによって、較正曲線のための５つの溶液を調製した。各溶液に、１００μｌのＭＴＧａｓｅ標準水溶液（それぞれ４０、１００、２００、４００及び８００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。
標準ＭＴＧａｓｅ溶液の代わりに１００μｌ（２００ｎｇ／ｍｌ）のＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ溶液を加えたことを除いて、サンプル溶液を較正溶液として調製する。
サンプル溶液及び参照溶液を３７℃にて２２時間インキュベートし、アセトニトリル１００μｌを加えることで反応を停止する。
遠心分離の後、サンプル溶液及び標準溶液の上澄みをＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。Ｈｙｐｅｒｓｙｌ Ｃ１８、５μｍ、２５０×４．６ｍｍのｉ．ｄ．カラム上で分析され、蛍光検出器（励起３３５ｎｍ、発光５５０ｎｍ）が装備され、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で溶出され、１５分の勾配がアセトニトリル ４０％→９０％；Ｈ２Ｏ ６０％→１０％である。複合生成物の保持時間が約８．０分であり、一方、試薬（ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳ）の保持時間が約７．３分である。
ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳ及び２−メトキシエチルアミンを異なる量の標準ＭＴＧａｓｅと共にインキュベートすることによって得られた較正曲線に関して、サンプル溶液におけるＣＢＺ−Ｇｌｎ（Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ＤＮＳ）−Ｑ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｍｅの領域を内挿することによって定量化を行う。表１は、二重反復試験の標準溶液のピーク面積を示しており、図１は、得られた較正曲線と一緒に、標準溶液の酵素反応の基質と生成物の典型的なＨＰＬＣ分離を報告する。
Figure 2016501886
例２．
ＭＴＧａｓｅにより触媒されたＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの脱ＰＥＧ化：ＭＴＧａｓｅの量の影響
ＭＴＧａｓｅを介してＧｌｎ１３５にてＰＥＧ化された高精製フィルグラスチム（バッチ＃０８１０５、１０．０ｍｇ／ｍｌ、ソルビトール及びＴｗｅｅｎ２０ ｐＨ４．５と共に配合されたもの）であって、汚染ＭＴＧａｓｅを５ｐｐｍ含有する高精製フィルグラスチム１．５ｍｌを６つのバイアルに移す。
１５０、５０、２０、１０、５、２ｐｐｍのＭＴＧａｓｅ濃度を得るため、各バイアルに、適切な量のＭＴＧａｓｅを加えた。
各バイアルを冷蔵庫（５±３℃）又は２５±２℃のインキュベータ内で保管した。１、２、３及び６箇月後にサンプルを取り出し、デスアミドフィルグラスチムの含有量を評価するためにＳＥ−ＨＰＬＣにより分析した。その含有量は、酢酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ４．５により１：４０ｖ／ｖに希釈した後、総ピーク面積の百分率として表された。２１０ｎｍのＵＶ検出器が装備され、２５℃にて維持されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０、４μｍ、４．６×２５０ｍｍのカラム上に５μｌのサンプルを注入することによって分析を行った。ｐＨ７のＫ２ＨＰＯ４ ６３ｍＭ緩衝液を用いた定組成溶離を流量０．２５０ｍｌ／ｍｉｎで行った。
分析結果を表２及び３に報告するが、ここでは、バッチ＃０８１０５において検出された残留ＭＴＧａｓｅを加えることによって、ＭＴＧａｓｅの実際の量を調節した。
Figure 2016501886
Figure 2016501886
例３：
ＭＴＧａｓｅにより触媒されたＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの脱ＰＥＧ化：ｐＨの影響
ＭＴＧａｓｅを介してＧｌｎ１３５にてＰＥＧ化したフィルグラスチム（バッチ＃０８−ＢＫ−０１、１５．５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを６つのバイアルに移す。希釈した酢酸又は希釈した水酸化ナトリウムを用いて、これら溶液のｐＨを対象のｐＨ（３．５、４．０、４．５、５．５、６．５、７．５）に調整する。
これらの溶液１００μｌを酢酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ４．５により約１：４０ｖ／ｖに希釈し、脱ＰＥＧ化したデスアミドフィルグラスチムの含有量を決定するため、例２に記載されるように、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析する（表４の時間０の値）。残りの１．９ｍｌに、１．４７μｇ及び５０ｐｐｍに相当する１４．７μｌのＭＴＧａｓｅ（３Ｕ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。
各バイアルの内容物を１０×１５０μｌのアリコートに分けて、冷蔵庫内で５±３℃にて保管した。１週間、２週間、１箇月、２箇月、３箇月及び６箇月後にサンプルを取り出し、脱ＰＥＧ化したデスアミドフィルグラスチムの含有量を総ピーク面積の百分率として評価するためにＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。結果を表４に示す。
Figure 2016501886
対照として、ｐＨ４にて滴定されたＧｌｎ１３５にてＰＥＧ化したフィルグラスチムの溶液を、ＭＴＧａｓｅの添加なしで、同じ保存条件にて、６箇月に至るまで保持し、記載したような時間間隔で分析した。結果を表５に報告する。
Figure 2016501886
例４．
ＭＴＧａｓｅの存在下におけるｒｅｃ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦとｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２の反応によるＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの調製
大腸菌で発現した組換えＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）を、ｐＨ８．１の２０ｍＭのリン酸二水素カリウム緩衝液中に、約２ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解させた。次いで、カタログ番号ＣＩＡＭ−２０（Ｓｕｎｂｉｏ，Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，韓国）である２０ｋＤａのメトキシ−ポリエチレングリコール−アミンを、ｍＰＥＧ−ＮＨ２：Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１で、上記タンパク質溶液に加えた。最終濃度０．２５Ｕ／ｍｌでＭＴＧａｓｅを添加した後、その溶液を、穏やかに撹拌しながら、５±２℃にて１６時間維持した。４つのＰＥＧ化反応を行ったが、表６、７、８及び９に示されるように平均ＰＥＧ化収率は８４．１±５．４％であった。
Figure 2016501886
Figure 2016501886
Figure 2016501886
Figure 2016501886
３０分後及び１６時間後の反応混合物のＳＥ−ＨＰＬＣは、例えば図２に報告されるように、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの高い形成収率を示した。
例５．
異なるｐＨでのＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの精製
ＰＥＧ化反応番号１、２、３及び４の最終溶液（例４参照）を１Ｍの酢酸によりそれぞれｐＨ５．０、ｐＨ４．５、ｐＨ４．０及びｐＨ３．５にて滴定し、充填溶液の同一ｐＨにて滴定された３０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液により予備平衡化された陽イオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏｃａｐ ＳＰ）上に充填することによって別々に精製した。カラム４容量の平衡緩衝液でカラムを洗浄した後、充填ｐＨで緩衝化した２００ｍＭの酢酸ナトリウムを用いた段階溶離によってＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａを集めた。精製したＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの統合された画分に、溶離緩衝液の同一ｐＨで緩衝化された１０ｍＭの酢酸ナトリウムを用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上で緩衝液交換を行った。
各精製工程にて、ＳＥ−ＨＰＬＣカラムによってサンプルを分析し、反応収率、精製の度合い及びタンパク質濃度を決定した。
次いで、約１３ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得るために、緩衝液交換した溶液のアリコートをＡｍｉｃｏｎウルトラメンブラン（カットオフ１０ｋＤａ）によって濃縮した。例１に記載されるＲＰ−ＨＰＬＣ−蛍光分析によって、濃縮した溶液の残留ＭＴＧａｓｅを決定した。各分離の後、そのカラムを０．５Ｍの水酸化ナトリウムで衛生化し、その後、３０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて樹脂を平衡化した。
ｐＨ５、ｐＨ４．５、ｐＨ４．０及びｐＨ３．５にて行われたＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの精製結果は、以下に示す表１０、１１、１２及び１３に要約される。
Figure 2016501886
Figure 2016501886
Figure 2016501886
Figure 2016501886
例６：
ｐＨ５．０でのＭＴＧａｓｅの予備イオン交換分離
酢酸緩衝液ｐＨ５．０中において６．８ｍｇのＭＴＧａｓｅを６０ｍｌに希釈し、イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏｃａｐ ＳＰ上に充填した。そのカラムにｐＨ５．０の２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて段階的溶離を受けさせ、その溶出プロファイルを図３に報告する。
ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの溶出体積に相当する１５０ｍｌの画分を集めて、この溶液の１５ｍｌを限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＵｌｔｒａｃｅｌｌＴＭ１０；１０．０００ＭＷＣＯ）により０．６ｍｌ（２５倍）まで濃縮した。例１に記載される分析方法を用いてＭＴＧａｓｅの定量化を行った（図５）。
表１３に示されるように、この画分において検出されるＭＴＧａｓｅはなかった（検出限界＝２０ｎｇ／ｍｌであり、ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ共溶出の場合の２．５ｐｐｍに相当する）。
同じ量のＭＴＧａｓｅ（６．８ｍｇ）を、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液６０ｍｌ中における精製されたＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ１０７．１ｍｇに加えた。その混合物をイオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍａｃｒｏｃａｐ ＳＰ）上に充填した。そのカラムにｐＨ５．０の２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて段階溶離を受けさせ、その溶出プロファイルを図４に報告する。
ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの溶出体積に相当する約２００ｍｌの画分と、残留するＰＥＧ化していないＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦに相当する５０ｍｌの画分を集め、これらの溶液の１５ｍｌを限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＵｌｔｒａｃｅｌｌＴＭ１０；１０．０００ＭＷＣＯ）により２５倍濃縮した。例１に記載される分析方法を用いてＭＴＧａｓｅの定量化を行った（図５）。
表１５に示されるように、ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを含有する画分は、２５６ｎｇ／ｍｌのＭＴＧａｓｅ（３２ｐｐｍ相当）によって汚染されたものであり、一方、ＰＥＧ化していないＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを含有する画分は、１６２８．４ｎｇ／ｍｌのＭＴＧａｓｅによって汚染されたものであり、ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦをも含有していた（図５）。
これらの結果は、ＭＴＧａｓｅがｐＨ５．０にてＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦと部分的に結合していることを実証しており、イオン交換クロマトグラフィーによるＰＥＧ化生成物のクロマトグラフィー精製を効果のないものにしている。
Figure 2016501886
脱ＰＥＧ化した生成物のＩＥ−ＨＰＬＣ確認試験
例５に記載されるように調製されたｐＨが４．５である精製したＰＥＧ化フィルグラスチムと５０ｐｐｍのＭＴＧａｓｅの溶液を５℃にて１箇月維持し、イオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥ−ＨＰＬＣ）により分析して、非常に精製されたＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの溶液と比較した。
精製されたＰＥＧ化していないＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの溶液を５０ｐｐｍのＭＴＧａｓｅで処理し、室温にて１．５時間保ち、ＩＥ−ＨＰＬＣによって分析して、精製されたＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの溶液と比較した。
２１５ｎｍのＵＶ検出器が装備され２５℃に維持されたＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ １０μｍ、長さ７．５ｃｍ×７．５ｍｍのｉ．ｄ．カラム上でＩＥ−ＨＰＬＣを行った。移動相Ａ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）と移動相Ｂ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用い、流量０．７ｍｌ／ｍｉｎにて、以下に示す勾配に従って、溶離を行った。
時間（分）： ０ ２ ５ １５ ４０
溶離液Ｂの％： ０ ０ ６ １３ ７５
図６及び７に示される結果によれば、ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦが約８．２分の保持時間で溶出されており、溶媒の前端では保持されておらず、また、脱ＰＥＧ化した生成物（デスアミドＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５Ｇｌｕ）は約３４分で溶出されていることが分かる。ＰＥＧ化されていないＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦは、約２４分の保持時間で溶出されるが、一方で、ＰＥＧ化Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのＭＴＧａｓｅ処理溶液において検出されるピーク（保持時間約３４分）に類似している追加のピークが、Ｍ−ＴＧａｓｅで処理したＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのカラムクロマトグラムにおいて溶出されており、ｒ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｑ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａの脱ＰＥＧ化が、同時に起こるグルタミン１３５の脱アミド化を伴っていることを示している。
上記の説明及び例から、記載された方法によって達成され、本発明に従って得られる利点が明らかになる。

Claims (18)

  1. 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧａｓｅ）により触媒される酵素反応によって得られる複合タンパク質であって、その精製物中における残留ＭＴＧａｓｅの含有量が５ｐ．ｐ．ｍ以下であることを特徴とし、２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも２４箇月の保存寿命を示す複合タンパク質。
  2. 請求項１に記載の複合タンパク質であって、その精製物中における残留ＭＴＧａｓｅの含有量が３ｐ．ｐ．ｍ．以下であることを特徴とし、２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す複合タンパク質。
  3. 治療用タンパク質と、親水性ポリマー、好ましくは親水性非免疫原性ポリマーとの間における、微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られる、請求項１又は２のいずれか１項に記載の複合タンパク質。
  4. 前記治療用タンパク質が、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈ−ＧＨ、インターフェロン、インターロイキン、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ抗体フラグメント、グルカゴン、ＧＬＰ−１、インスリン並びにその誘導体及び類似体よりなる群から選択される、請求項３に記載の複合タンパク質。
  5. 前記親水性非免疫原性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルピロリドン、及びヒドロキシルエチルデンプンよりなる群から選択される、請求項３に記載の複合タンパク質。
  6. Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦとアミノ−ポリエチレングリコールとの間における、微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られる、請求項３に記載の複合タンパク質。
  7. ａ．陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを４未満のｐＨにする工程と；
    ｂ．前記クロマトグラフィーカラムに、工程ａ．のカラム上でｐＨが４未満である、複合タンパク質を含有する反応混合物を充填する工程と；
    ｃ．ｐＨが４未満の溶離液を用いて工程ｂ．のクロマトグラフィーカラムを溶離する工程と
    を含む陽イオン交換クロマトグラフィーによって、トランスグルタミナーゼを介した酵素反応によって得られる、複合タンパク質を精製する方法であって、
    それにより、残留微生物トランスグルタミナーゼの含有量が複合タンパク質の総量の３ｐｐｍ以下である複合タンパク質を含有する画分を集め、前記複合タンパク質が２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す、方法。
  8. 工程ａ．、ｂ．及びｃ．のｐＨが３〜３．９の範囲内にあり、好ましくはｐＨが３．８であり、そして、工程ａ．及びｂ．のｐＨが酢酸緩衝液、好ましくは３０ｍＭの酢酸緩衝液によって得られる、請求項７に記載の方法。
  9. 工程ｃ．のｐＨが酢酸緩衝液、好ましくは２００ｍＭの酢酸緩衝液によって得られる、請求項７又は８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 充填工程ｂ．の後、前記クロマトグラフィーカラムの体積の４倍の体積の酢酸緩衝液、好ましくは３０ｍＭの酢酸緩衝液によって、前記クロマトグラフィーカラムを洗浄する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 工程ｂ．の前記反応混合物が、治療用タンパク質と、親水性ポリマー、好ましくは親水性非免疫原性ポリマーとの間における、微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られる、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記治療用タンパク質が、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈ−ＧＨ、インターフェロン、インターロイキン、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ抗体フラグメント、グルカゴン、ＧＬＰ−１、インスリン並びにその誘導体及び類似体よりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記親水性非免疫原性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルピロリドン、及びヒドロキシルエチルデンプンよりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記複合タンパク質が、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦとアミノ−ポリエチレングリコールとの間における、微生物トランスグルタミナーゼにより触媒される酵素反応によって得られる、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記複合タンパク質が、温度５℃にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記複合タンパク質が、温度５℃にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  17. 請求項７〜１６のいずれか１項に従うｐＨ４未満での陽イオン交換クロマトグラフィー方法によって得られる複合タンパク質であって、２〜８℃の範囲における温度にて少なくとも３６箇月の保存寿命を示す複合タンパク質。
  18. 請求項１７に記載の複合タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
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