JP2008069073A - ラクトフェリン複合体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の製造方法であって、ラクトフェリンと、分岐型非ペプチド性親水性高分子とを含む反応液を、pH8〜10の条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。
【選択図】なし
Description
特に、短時間で効率的に上記の特性を有するラクトフェリン複合体を大量調製するのに適した方法を提供することも目的とする。
(1) 式〔I〕:
又は式〔II〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の製造方法であって、
ラクトフェリンと、式〔III〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とを含む反応液を、pH8〜10の条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法;
(2) POLYが、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン性アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカリド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N−アクリロイルモルホリン)及びそれらの修飾物、ならびにそれらのコポリマー類及び混合物からなる群から選択される、前記(1)記載の製造方法;
(3) POLYが、ポリエチレングリコール又はその修飾物である、前記(2)記載の製造方法;
(4) 式〔I〕:
又は式〔II〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体をヘパリンセファロース担体に吸着させる工程、及びこの担体から0.25〜0.35Mの塩濃度の溶液を用いて前記複合体を溶出させる工程を含むことを特徴とする方法;
(5) 式〔I〕:
又は式〔II〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体を陽イオン交換体に吸着させる工程及びこの担体から溶出させる工程を含み、かつ、この溶出液の分子篩クロマトグラフィによる精製工程を含まないことを特徴とする方法;
(6) 前記(1)〜(3)のいずれか1項記載の方法によって製造された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体;
(7) 前記(4)又は(5)記載の方法によって精製された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体;
(8) 前記(6)又は(7)記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体及び治療上不活性な基剤及び/又は添加物を含む医薬品組成物;
(9) 疾患又は症状の治療又は予防用の医薬品の製造のための、前記(6)又は(7)記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の使用方法、
を提供する。
また、本発明の精製方法は、単純な工程で短時間に高純度の複合体が得られるので、工業的な大量生産に非常に適している。
式〔I〕:
式〔II〕:
で示される。
Yは、−O−、−S−、−NH−のようなヘテロ原子結合である。
Lは、リンカーとして作用する基であって特に制限はないが、Yと同様、存在してもしなくてもよい。
式〔IV〕:
で示されるものを使用することができる。
種々のPEG誘導体を用いてラクトフェリンとの複合体を調製した。
ラクトフェリンとしては、ウシラクトフェリン(マレーゴルバン社製)を用いた。PEG化のターゲットは、ラクトフェリンのリジンのε−アミノ基(ウシラクトフェリン1分子当たり54個存在する)及びN末端のα−アミノ基とした。
PEG誘導体としては、以下に示す4種類の分岐型PEG誘導体(実施例)及び3種類の直鎖型PEG誘導体(比較例)を用いた:
上記と同様の実験において、ウシラクトフェリンとPEG誘導体2〜4を用い、PEG化カップリング反応液のpHを4〜9の範囲で変化させてカップリング反応を行った。使用緩衝液は、pH4〜5については酢酸緩衝液、pH6〜8についてはリン酸緩衝液、pH9はホウ酸緩衝液とした。他の条件は、ウシラクトフェリンの最終濃度0.5mg/ml、反応温度25℃、反応時間1時間とし、ウシラクトフェリン:PEG誘導体のモル比は1:54(PEG誘導体濃度337.5μM)、及び1:10(PEG誘導体濃度62.5μM)とした。反応後、7.5% SDS−PAGE及びCBB染色によって反応生成物を解析した。
上記と同様の実験において、ウシラクトフェリンとPEG誘導体2、3、4を用いて、反応温度を25℃、16℃、又は4℃とし、また、反応時間を変化させてPEG化カップリング反応を行った。他の条件は、ウシラクトフェリンの最終濃度は0.5mg/ml、反応緩衝液はPBS(pH7.4)、ウシラクトフェリン:PEG誘導体のモル比は1:54(PEG誘導体濃度337.5μM)、及び1:10(PEG誘導体濃度62.5μM)とした。反応後、7.5% SDS−PAGE及びCBB染色によって反応生成物を解析した。
PEG化に使用したヒトラクトフェリン(hLf)は、SIGMA社より購入した(SIGMA, L0520)。PEG化のターゲットは、ラクトフェリンのリジンε−アミノ基(タンパク質1分子当たり44個存在)及びN末端のα−アミノ基とした。使用したPEG誘導体は、3種類の分岐型PEG誘導体(表1のPEG誘導体2〜4)であった。カップリング反応は、ラクトフェリンの最終濃度0.5mg/ml、25℃、1時間、PBS(pH7.4)中、最終容量1mlで行った。ヒトラクトフェリン(hLf)0.5mg(6.25μM)に対し、PEG誘導体の混合比はPEG誘導体/リシル基のモル比で0.02〜5、hLf:PEG誘導体のモル比で1:1〜1:220(PEG誘導体濃度として6.25μM〜1.38mMに相当)の範囲で変化させた。反応生成物の評価は、7.5% SDS−PAGE及びCBB染色により行った。
ヘパリンカラム及びゲルろ過カラムの組み合わせにより、PEG化ウシラクトフェリン反応液中の未カップリングPEG誘導体、未カップリングラクトフェリンを分離し、PEG化ラクトフェリンを精製した。
PEG化されたタンパク質は、ヨウ化バリウムによって特異的に染色される(Kurfurst MM, Anal Biochem, 200,244-248 (1992), Balion P. et al., Bioconjug Chem, 12, 195-202 (2001))。上記5.の実験において製造・精製されたPEG化bLfが確かにPEGで修飾されているかどうかを確認するため、ヨウ化バリウム染色を行った。
上記5.の実験で得られた精製PEG化bLf、20k−PEG−bLf及び40k−PEG−bLfを、以下の条件でペプシン又はトリプシンで消化して、未修飾bLfの消化と比較検討した。
ラクトフェリンは分子量8万の非ヘム性の鉄結合性糖タンパク質で、Nローブ、Cローブと呼ばれる二つの領域からなり、炭酸イオン(CO3 2−)の存在下でタンパク質1分子当たり2個の鉄イオン(Fe3+)を可逆的にキレート結合する能力を有する(Anderson, et al., Nature, 344, 784-78 (1990))。ラクトフェリンの鉄結合能の測定を、以下のように行った。
ラクトフェリン:分岐型PEG誘導体のモル比1:0.1〜1:5の範囲について、表1の分岐型PEG誘導体3(日本油脂社製PEG化試薬 SUNBRIGHT GL2−200GS2(20kDa))を用いて、PBS(pH7.4)及び50mMホウ酸緩衝液(pH9.0)中でのPEG化ラクトフェリン(20k−PEG−bLf)の生成反応を検討した。
ウシラクトフェリン(bLf)0.5〜20mg/mlに対し、bLf:PEG誘導体のモル比が1:0.1〜1:5の混合比となる条件において25℃で1時間カップリング反応を行い、反応液を7.5% SDS−PAGEの後、CBB染色により解析した。
表1の分岐型PEG誘導体3(日本油脂社製PEG化試薬 SUNBRIGHT GL2−200GS2(20kDa))を用いて、bLf(0.5mg/ml):PEG誘導体のモル比1:10で25℃、PBS(pH7.4)で1時間のカップリング反応を行い、20k−PEG−bLFを作製した。
この反応液を試料として用いたこと以外は、上記と同様にしてヘパリンセファロース(Heparin Sepharose)6 FFに吸着させた後、塩濃度のステップワイズ溶出を行って吸着画分を溶出し、画分中のタンパク質をSDS−PAGE及びCBB染色によって確認した。
表1の分岐型PEG誘導体4(日本油脂社製PEG化試薬 SUNBRIGHT GL2−200GS2(40kDa))を用いて、50mMホウ酸緩衝液(pH9.0)中での生成PEG化ラクトフェリン(40k−PEG−bLF)の経時変化を検討した。ウシラクトフェリン(bLf)0.5mgに対し、bLf:PEG誘導体のモル比が1:10の混合比となる条件において25℃でカップリング反応を行い、反応液を経時的にサンプリングして、7.5% SDS−PAGEの後、CBB染色により解析した。比較のため、PBS(pH7.4)中で同様の反応を行なった。
上記11.の実験によって、ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)中でのPEG化反応においては、10分間という極めて短時間で、均一な分子種(PEG化ラクトフェリン)を作製できることが示された。この結果がpH9.0であることに起因するのか、あるいはホウ酸ナトリウム緩衝液を使用したことに起因するのかを検討するため、グッドバッファー(pH9.0)を用いて検討を行なった。
Bicine、CHES、TAPS(同仁社製)の3種類のグッドバッファーを50mM(pH9.0)で調製した。それぞれのバッファーを用いて上記9.と同様の実験を行なった。即ち、ウシラクトフェリン(bLf)0.5mgに対し、bLf:PEG誘導体のモル比が1:10になるように混合して、25℃でカップリング反応を行い、生成PEG‐bLfを含む反応液を10分間、20分間、40分間、1時間反応後にサンプリングして7.5%SDS‐PAGEの後、CBB染色により解析した。
シリカを担体とした陽イオン交換カラムを用いてPEG化ラクトフェリン反応液中の未カップリングPEG誘導体及び未カップリングラクトフェリンを分離し、PEG化ラクトフェリンを一段階で精製した。
分岐型PEG誘導体3(日本油脂社製PEG化試薬 SUNBRIGHT GL2−200GS2(20kDa))及び同4(SUNBRIGHT GL2−400GS2(40kDa))を用いてbLf(0.5mg/ml):PEG誘導体のモル比1:10で25℃、pH7.4で1時間のカップリング反応を行い、それぞれ20k−PEG−bLF及び40k−PEG−bLFを作製した。
この反応液を試料として、カルボキシメチル基(CM)を官能基に持つシリカを担体とした弱陽イオン交換カラム(CM−EP−DF−10−500A、カラムサイズ 2.5ml、旭硝子エスアイテック(株))を用いて反応生成物を吸着させた。PEG化ラクトフェリンの溶出は「Akta explorer 10S」(商品名)(GE Healthcare社)を用いて行なった。緩衝液として、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、及び溶出緩衝液として1.5M NaClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を用い、流速1.0ml/minで、直線的勾配(linear gradient)で20カラム容量かけて塩濃度を上昇させることでPEG化ラクトフェリンの分離を行った。得られた各溶出画分を7.5% SDS−PAGE後、銀染色により溶出パターンを解析した。
分岐型PEG誘導体3及び4のいずれを用いた場合も、PEG化したラクトフェリン反応液から、弱陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて未修飾ラクトフェリンとPEG化ラクトフェリンを良好に分離・精製できることが明らかとなった。
ラクトフェリン(bLf)の生理活性の一つに抗炎症作用がある。bLfは、ヒト単球細胞(THP−1)培養系においてリポポリサッカライド(LPS)のエンドトキシンショックにより産生されるIL−6量を抑制することが報告されている(Mattsby-Baltzer I et al., Pediatr Res, 40, 257-262 (1996), Haversen L et al., Cell Immunol, 220, 83-95 (2002))。そこで、上記13.において作製、精製したPEG−bLf(20k−PEG−bLF及び40k−PEG−bLF)も、bLfと同様のエンドトキシンショックの抑制活性を保持しているかどうかを検討した。
培養上清中のIL−6量は、ヒトIL−6 ELISA測定キット(鎌倉テクノサイエンス(株))を用いて測定した。IL−6の産生抑制活性は、LPSのみを添加した場合に産生抑制されるIL−6量とLPSとbLfの共存下で産生されたIL−6量を比較し、産生が抑制されたIL−6量から算出した。bLfの抑制活性を100%としてそれぞれのPEG−bLfの比活性を算出した。
図23及び表4において、20k−及び40k−PEG−bLfは細胞のみで培養した場合と同等の吸光度(細胞生存度)を示していた。したがって、PEG化ラクトフェリンは細胞毒性を示さないことが明らかとなった。
Claims (9)
- 式〔I〕:
又は式〔II〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の製造方法であって、
ラクトフェリンと、式〔III〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とを含む反応液を、pH8〜10の条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。 - POLYが、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィン性アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシアルキルメタクリレート)、ポリ(サッカリド)、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ(N−アクリロイルモルホリン)及びそれらの修飾物、ならびにそれらのコポリマー類及び混合物からなる群から選択される、請求項1記載の製造方法。
- POLYが、ポリエチレングリコール又はその修飾物である、請求項2記載の製造方法。
- 式〔I〕:
又は式〔II〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体をヘパリンセファロース担体に吸着させる工程、及びこの担体から0.25〜0.35Mの塩濃度の溶液を用いて前記複合体を溶出させる工程を含むことを特徴とする方法。 - 式〔I〕:
又は式〔II〕:
で示される分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の精製方法であって、
試料中に含有される前記複合体を陽イオン交換体に吸着させる工程及びこの担体から溶出させる工程を含み、かつ、この溶出液の分子篩クロマトグラフィによる精製工程を含まないことを特徴とする方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項記載の方法によって製造された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体。
- 請求項4又は5記載の方法によって精製された分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体。
- 請求項6又は7記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体及び治療上不活性な基剤及び/又は添加物を含む医薬品組成物。
- 疾患又は症状の治療又は予防用の医薬品の製造のための、請求項6又は7記載の分岐型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体の使用方法。
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