JP2001526238A - 実質的に純粋なヒスチジン結合タンパク質−ポリマー結合体 - Google Patents
実質的に純粋なヒスチジン結合タンパク質−ポリマー結合体Info
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Abstract
Description
ing life)、水溶性またはin vivo抗原性の特性のうちの1つ以上が改善されると
いうことが示唆されている。例えば、ペプチドまたはポリペプチドのポリエチレ
ングリコール(PEG)および同様の水溶性ポリマーへの結合についての最初の概念 のいくつかが米国特許第4,179,337号に開示されている。この開示は、参照によ り本明細書に組み込まれる。
のような比較的大きなポリペプチドには、いくつかの遊離リシンε-アミノ結合 部位が含まれる。いくつかのポリマーは生物活性を有意に損失させることなく結
合され得る。
ある。結合プロセスは結合部位に関して特異的ではない。結合反応によって引き
起こされる生物活性の損失を抑えることに注意を払う必要がある。例えば、過剰
の活性化ポリマーが標的タンパク質またはポリペプチドに結合すると、生物活性
は激しく低下するか消失する可能性がある。さらに、タンパク質にポリマーを結
合するのに不適切なリンカーを用いた場合、または不十分な量のポリマーを標的
に結合させた場合、得られる結合体の治療上の価値はかなり抑制される。多くの
場合、そのような結合体は生物活性の損失を補うのほどの循環寿命の増大を示さ
ない。治療成分の活性部位(すなわち生物活性に関連する基が見出される)がポ
リマー結合の結果としてブロックされる場合も問題が発生し得る。ポリマーとタ
ンパク質は典型的には溶液ベースの反応において結合し、ポリマー結合プロセス
は結合部位に関して特異的ではないので、この問題を回避するのは困難であり得
る。ピリドキサールリン酸などの物質で活性部位を予めブロックすることが提案
されているが、その結果には一貫性がない。タンパク質のリシン欠失変異体もポ
リマー結合を制御する一つの方法として提案されている。しかしながら、この技
術は最終生成物のコストを有意に増大させるので実際的でない場合が多い。この
問題は、低分子量のタンパク質およびペプチドに関して特に深刻である。これら
の生物活性物質は、生物活性に関係しない結合部位はほとんど持たない場合が多
い。
球コロニー刺激因子(「G-CSF」)をmPEGカルボキシメチル-N-ヒドロキシ-スクシ ンイミジルエステルに結合させ、次いで2モルのヒドロキシルアミン(pH7.3)で 処理して「不安定な」リンカーを除去し、その後pHを3.5まで低下させている。K
instlerら, 1996, Pharmaceutical Res. 13(7):996-1002。改良型G-CSFを得るた
めの記載や示唆も任意のその他のタンパク質結合体の処理に関するガイダンスも
示されていない。
6号および4,917,888号を参照されたい。これらには、とりわけ、mPEG-2,4,6-ト リクロロ-S-トリアジン、mPEG-N-スクシンイミジルグルタル酸またはmPEG-N-ス クシンイミジルコハク酸などの活性化ポリマーと結合したβインターフェロンが
記載されている。この特許権者らは、タンパク質の共有結合的修飾をpH5〜9で行
い、タンパク質がそのリシン残基により反応する場合にはタンパク質の共有結合
的修飾をpH8〜9で行うということを開示している。活性化ポリマーはかなりモル
過剰(10、20および50倍)でも用いられている。
エチレングリコールとの反応が記載されている。欧州特許出願公開第0 510 356 号には、7〜9のpHにおけるαインターフェロンとピリジニルカルボニルおよびチ
オカルボニル活性化PEGとの結合が記載されている。これらの開示ではリシン以 外のアミノ酸が結合に関与していること、またはリシン以外のアミノ酸が結合に
有利であることは言及されていない。
る一方、N-末端αアミノ基との結合には好都合であるということが述べられてい
る。またWO96/11953には、G-CSFをPEGとpH8.0で反応させた後、単に分離カラム 上に生成物を付加するための準備としてpHをpH4.0まで低下させる2段階pH処理プ
ロセスも記載されている。WO96/11953には、N-末端またはリシン以外のIFN残基 にポリマーを選択的に結合させるためのアシル化反応の利点は教示されておらず
、示唆すらされていない。
野に対するさらなる改良を提供するものであり、よってこれらの短所に取り組む
ものである。
ク質を含む。αインターフェロンの場合、ヒスチジンは好ましくはヒスチジン34
である。好ましくはαインターフェロンはインターフェロンα2bであり、結合体
はαインターフェロン1分子当たり約1個のポリマー鎖を含む。IL-10などのその 他のタンパク質についてのヒスチジン結合モノポリマー結合体も本発明の一部と
して含まれる。好ましいモノポリマーHis結合結合体を含む組成物は、所望によ り、少量のその他のモノ-PEG-タンパク質種も含み得る。
性化ポリマー鎖への共有結合を促進するのに十分な条件下で反応させることによ
り複数のタンパク質-ポリマー結合体種または位置異性体を形成すること、その 後タンパク質とポリマーとの間にHis結合が形成された結合種または位置異性体 を、残りの結合体種から実質的に単離することを含む。本実施形態の1つの好ま
しい態様においては、活性化ポリマーはベンゾトリアゾールカーボネート-活性 化ポリマーである。別の態様においては、活性化ポリマーはオキシカルボニル- オキシ-N-ジカルボキシミド-活性化ポリマー、例えばスクシンイミジルカーボネ
ート(SC-PEG)である。これらの活性化ポリマーによって、当業者は、結合体のか
なりの部分がαインターフェロン上のリシン残基またはN-末端ではなくヒスチジ
ン残基に共有結合したポリマー鎖を含むものであるような反応プールを形成でき
る。
対して相対的に多量に形成させる条件のいくつかには、アシル化ポリマー結合反
応を特定のpH範囲内、すなわち好ましくは約7以下、より好ましくは約4.5〜約6.
8で行うことが含まれる。これは、少なくとも一部のポリマー鎖の、タンパク質 のヒスチジン残基のアミノ基への優先的共有結合を促進する。次いで、クロマト
グラフィーカラム、例えばゲル濾過とその後の陽イオン交換、または陰イオン交
換とその後の陽イオン交換などを用いて、所望の実質的に純粋なタンパク質結合
体を反応プール中の残りのタンパク質結合体から単離するのが好ましい。
ド(PAO)である。別の実施形態においては、その他の実質的に非抗原性のポリマ ーも用いることができる。ポリマーの分子量は、好ましくは約200〜約35,000で ある。
な治療が必要な哺乳動物に本明細書に記載したタンパク質結合体を含む組成物を
有効量投与することが含まれる。
ノ酸残基の中の1つにポリマー鎖が結合した結合体を説明するものであると理解
されるであろう。具体的な位置異性体は、本明細書ではアミノ酸残基結合点に関
して記載されている。例えば、タンパク質Lys31-ポリマー位置異性体は、タンパ
ク質のLys31にポリマーが結合したモノポリマー結合体を示すものである。その 他の位置異性体、すなわちタンパク質の他の部位にポリマーが結合した結合体も
同様に示される。
と理解されるであろう。結合されるタンパク質および用いられる結合体分離技術
に依存するが、本発明による組成物は、所望の位置異性体を大部分含む場合には
実質的に純粋であるとみなされる。好ましくは組成物には少なくとも約60%、よ
り好ましくは少なくとも約80%の所望の位置異性体が含まれる。
体クロマトグラフィーを用いた結果、広範な位置異性体から所望の位置異性体を
回収する本発明の方法の一部を記載するものと理解されるであろう。得られた単
離物には、所望の位置異性体とできる限り少量、例えば15%未満のその他の位置
異性体からなる実質的に純粋な単離物が含まれる。
較的高収量で含む、実質的に純粋な位置異性体を得ることが可能である。αIFN の場合、好ましい位置異性体、すなわちモノポリマー-His34結合IFNα-2b結合体
は、天然のαインターフェロンのみならずその他の位置異性体よりも予想外に高
レベルの生物活性を示す。その他の位置異性体、すなわちN-末端またはリシンア
ミノ基のようなインターフェロンのその他の位置にポリマーが結合した結合体は
、より低いがそれでもなお有効な量の生物活性を示す場合が多く、いくつかの本
発明の組成物に少量含まれ得る。
合位置異性体が形成されるということも分かった。
リマー結合に関して利用可能な少なくとも1個のヒスチジンを有するポリペプチ ド、酵素、ペプチドなども包含するものと理解されるであろう。さらに、本発明
で使用することが考えられるタンパク質は、限定するものではないが、生理学的
活性または薬理活性を有するものである。例えば、有機溶媒中で反応を触媒する
ことができる酵素結合体も含まれる。同様に、いくつかの本発明のポリマー結合
体は検査室診断にも有用である。すべての結合体についての2つの主要な特徴は
、それらが好ましくはHis残基を介して結合されており、非修飾タンパク質と関 連した活性の少なくともいくらかの部分を維持するものであるということである
。
ではないが、ヘモグロビン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子などの血液因子 のような血清タンパク質;免疫グロブリン、サイトカイン、例えばインターロイ
キン、すなわちIL-1〜IL-13、α-、β-およびγ-インターフェロン、好ましくは
以下により詳しく記載したα-インターフェロン、コロニー刺激因子、例えば顆 粒球コロニー刺激因子、血小板由来増殖因子およびホスホリパーゼ-活性化タン パク質(PLAP)が挙げられる。一般的な生物学的または治療目的のその他のタンパ
ク質としては、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチンおよびリシン、腫
瘍壊死因子および関連タンパク質、形質転換増殖因子などの増殖因子、例えばTG
FαまたはTGFβおよび上皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチ
ン、色素ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性
ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン
活性化因子などが挙げられる。対象となる免疫グロブリンとしては、IgG、IgE、
IgM、IgA、IgDおよびそれらのフラグメントが挙げられる。
のタンパク質は、通常組換え技術を用いた結果、非グリコシル化形態でも存在す
る。非グリコシル化体も本発明のタンパク質に含まれる。
ドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ
およびリガーゼが挙げられる。具体的な酵素に限定するものではないが、対象と
なる酵素としては、例えば、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデア
ミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドト
キシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシン
ジホスファターゼ、チロシナーゼおよびビリルビンオキシダーゼが挙げられる。
対象となる炭水化物特異的酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコダー
ゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼなどが挙げ
られる。
合タンパク質(例えば米国特許第4,946,778号(この開示は参照により本明細書 に組み込まれる)を参照されたい)、結合分子、例えば抗体またはフラグメント
の融合物、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および触媒抗体が含まれる
。
に知られた技術を用いて、または組換えDNA法により、調製または単離すること ができる。トランスジェニック起源のタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列
なども含まれる。そのような材料はトランスジェニック動物、すなわち、マウス
、ブタ、ウシなどから得られるものであり、タンパク質は乳、血液または組織中
に発現される。トランスジェニック昆虫およびバキュロウイルス発現系も起源と
して含まれる。さらに、突然変異インターフェロンなどのタンパク質の突然変異
体も本発明の範囲に含まれる。
ある。本発明に適したタンパク質は上記に例示したとおりである。本明細書で規
定したように、具体的に言及していないが利用可能なヒスチジン基を有するタン
パク質も対象とするものであり、本発明の範囲に含まれることは理解されるであ
ろう。
めに特に遺伝子工学的に操作してヒスチジンを含有させたタンパク質が本発明に
含まれることも理解されるであろう。
基もしくは他の適当な結合基を天然に含むか、または標準合成技術を用いて修飾
することによりヒスチジン、チロシン、イミダゾールまたは本明細書に記載した
ようにポリマーを結合するための同様の窒素もしくはアミン含有基を含有させた
、有機合成分子などの非タンパク質ベースの化合物である。
術を用いて種々の起源から調製または取得できることは理解されるであろう。Pe
stka, ヒトサイトカインにおける「インターフェロンα」, Blackwell Scientif
ic Publications 1-16 (1992)も参照されたい。この開示は参照により本明細書 に組み込まれる。さらに、IFNは好ましくはαIFNであり、ヒト、反芻動物または
ウシαIFNのような哺乳動物起源の抽出物でもよい。特に好ましいIFNの一つは、
Schering社(Kenilworth, NJ)により組換え産生された産物IFNα-2bである。
相同なタンパク質のファミリーを意味する。ヒトインターフェロンは細胞起源お
よび抗原性に基づいて3つのクラス:α-インターフェロン(白血球)、β-イン
ターフェロン(繊維芽細胞)およびγ-インターフェロン(B細胞)に分類される
。各グループの組換え体が開発されており、市販されている。各グループのサブ
タイプは抗原/構造特性に基づくものである。異なるアミノ酸配列を有する少な
くとも24種のインターフェロンα(サブタイプA〜Hに分類される)が、これらの
ペプチドをコードするDNAを単離し、配列決定することにより同定されている。 また、Viscomi, 1996 Biotherapy 10:59-86も参照されたい。この内容は参照に より本明細書に組み込まれる。「α-インターフェロン」、「αインターフェロ ン」、「インターフェロンα」および「ヒト白血球インターフェロン」という用
語は、本出願では、このグループのメンバーを記載するために同義で用いられて
いる。米国特許第4,897,471号(この内容は参照により本明細書に組み込まれる )に記載されたような共通インターフェロンを含む天然および組換えα-インタ ーフェロンの両方を本発明の実施に用いることができる。
αの精製は、米国特許第4,503,035号に記載されている。この方法で調製された ヒト白血球インターフェロンには、異なるアミノ酸配列をもつヒト白血球インタ
ーフェロンの混合物が含まれる。本発明の実施に用いられ得る精製天然ヒトα- インターフェロンおよびその混合物としては、限定するものではないが、Sumito
mo(日本)から市販されているSumiferon(登録商標)インターフェロンα-n1、Glax
o-Wellcome社(ロンドン, 英国)から市販されているWellferon(登録商標)インタ ーフェロンα-n1(Ins)、およびPurdue Frederick社(ノーウォーク, CT)から市販
されているAlferon(登録商標)インターフェロンα-n3が挙げられる。
、産生、単離および種々のインターフェロンの均質な精製が可能になった。組換
え産生インターフェロンは、そのin vitroおよびin vivoの抗ウイルス活性およ び免疫調節活性を維持している。また組換え技術には組換え誘導ポリペプチド上
に炭水化物部分を付加するためのグリコシル化部位も含まれ得ることは理解され
るであろう。
DNAプラスミドの構築、およびヒト白血球インターフェロンの免疫学的または生 物学的活性を有するポリペプチドの大腸菌における発現は、米国特許第4,530,90
1号および欧州特許第EP 0 032 134号に開示されている。異なるサブタイプ配列 の組合せ(例えばAとD、AとB、AとF)を含むハイブリッドα-インターフェロン遺 伝子の構築は、米国特許第4,414,150号、4,456,748号および4,678,751号に開示 されている。本発明の実施に用いられ得る典型的で適切な組換えα-インターフ ェロンとしては、限定するものではないが、Schering Corporation(Kenilworth,
N.J.)から市販されているIntron(登録商標)Aなどのインターフェロンα-2b、Ho
ffmann-La Roche(Nutley, N.J.)から市販されているRoferon(登録商標)Aなどの インターフェロンα-2aおよびAmgen(Thousand Oaks, CA)から市販されているInf
ergen(登録商標)が挙げられる。
結合体に含まれ得る。本明細書で用いられる場合、「哺乳動物におけるα-IFN作
用」とは、αIFN類で観察された作用に対応するin vivo活性を意味する。これら
の物質は、組織培養、動物起源からの抽出のような当業者に知られた技術を用い
ることにより、または組換えDNA法により調製される。トランスジェニック起源 のαIFNおよび関連部分も含まれる。そのような物質は、αIFNタンパク質が乳、
血液またはその他の組織中に発現されるトランスジェニック動物、例えばマウス
、ブタ、ウシなどから取得される。αIFNを本発明の結合体用に調製する方法は 限定するものではないが本明細書に記載された方法である。本発明の目的に関し
、αIFN類がその生化学的特性および血清学的特性により好ましい。特に、αIFN
は抗ウイルス特性を示し、その他のインターフェロンよりも効率的に血流中に拡
散する。
ポリマーのヒドロキシル末端基の一つを、結合を可能にする反応性官能基に変換
する。このプロセスはしばしば「活性化」と呼ばれ、その生成物は「活性化」ポ
リマーまたは活性化ポリ(アルキレンオキシド)と呼ばれる。その他の実質的に非
抗原性のポリマーも同様に「活性化」または官能基化される。
シンのε-アミノ基およびN-末端アミノ基でより低い程度で生じるように、活性 化ポリマーをαIFNなどのタンパク質と反応させる。遊離のカルボン酸基、適切 に活性化されたカルボニル基、酸化した炭水化物部分およびメルカプト基がタン
パク質上で利用可能である場合、それらを所望により補足的結合部位として用い
てもよい。
残基と活性化ポリマーの間にウレタン(カルバメート)結合が形成される。本発
明の好ましい態様の一つにおいては、活性化ポリマーは米国特許第5,650,234号 (この開示は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されたもののようなベ
ンゾトリアゾールカーボネート-活性化ポリマーである。別の態様においては、 ウレタン結合は、スクシンイミジルカーボネート基などの末端オキシカルボニル
-オキシ-N-ジカルボキシミド基を用いて形成される。別の活性化基としては、N-
スクシンイミド、N-フタルイミド、N-グルタルイミド、N-テトラヒドロフタルイ
ミドおよびN-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシドが挙げられる。これらのウレタ ン-形成基は、米国特許第5,122,614号(この開示は参照により本明細書に組み込
まれる)に記載されている。これらの好ましい活性化ポリマーを本発明の一部と
して用いる場合、当業者は、全範囲の位置異性体を含んでも含まなくてもよい複
数のタンパク質-ポリマー結合体を形成することが可能になる。しかしながら、 溶液ベースの反応で形成された結合体の凝集集合体(aggregate collection)には
、標的タンパク質、すなわちαインターフェロン上のヒスチジン残基に共有結合
したポリマー鎖を含む結合体がかなりの部分含まれ、リシン残基結合またはN-末
端結合ポリマー鎖を有するものもより少量含まれる。
ンオキシド(PAO)、例えばモノメトキシ末端ポリエチレングリコール(mPEG)が好 ましく、ビス-活性化ポリエチレンオキシド(グリコール)も、タンパク質を架橋 するか、または例えば肝臓などの特定の領域にタンパク質-ポリマー結合体を局 在化させるための標的薬剤のようなその他の成分を結合するための手段を提供す
る目的で用いられる。
0〜約25,000の分子量が好ましく、2,000〜約20,000が特に好ましい。
リマーとしては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)また はポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポ
リオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーならびにそれらのブロック
コポリマー(そのブロックコポリマーの水溶性が維持されるという条件で)が挙
げられる。mPEGに加えて、C1-4アルキル末端ポリマーも有用である。
らのコポリマーなどを用いることができる。当業者には、上記リストが単なる例
示的なものであり、本明細書に記載された性質をもつポリマー材料が全て含まれ
るものであることは認識されるであろう。本発明の目的に関し、「実質的にまた
は事実上非抗原性の」とは、非毒性であり、哺乳動物において免疫原性応答をほ
とんど誘発しないと当技術分野で理解されている物質全てを意味するものである
。
パク質生物活性が最大化され得るということである。αIFN、特にαIFN2bの場合
、好ましい結合点はHis34である。αIFNの様々な種はアミノ酸34にヒスチジンを
有する場合も有さない場合もあるが、それでもなお反応条件が、好ましくは、利
用可能なヒスチジンに結合したポリマーを含む少なくともいくつかの位置異性体
を提供し得ることが、当業者には理解されるであろう。当業者には、αIFN以外 のタンパク質についてポリマー結合に最適なヒスチジン残基を過度の実験を行う
ことなく決定し得ることも認識されるであろう。
ネート活性化ポリマーまたはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミド-活 性化ポリマーとを、該タンパク質と該活性化ポリマーとの共有結合を促進し、複
数のタンパク質-ポリマー結合体を形成させるのに十分な条件下で反応させるこ と;および 2) 前記タンパク質のヒスチジン残基に結合したポリマーを含むタンパク質-ポ
リマー結合体を、複数の残りのタンパク質-ポリマー結合体から実質的に分離す ること を含む。
組成物には、実質的にαIFN-2bのHis34に結合したポリマーが含まれる。
少なくとも一部の共有結合を促進するのに十分なpHで行われる。特に、pHは好ま
しくはわずかに酸性、すなわち約7.0以下であり、より好ましくは約6.8以下であ
り、最も好ましくは約4.5〜約6.8の範囲である。
相対的に少しモル過剰の活性化ポリマーを用いて結合反応を行うことが含まれる
。この点に関し、本方法は、約1〜25倍モル過剰のポリマー、好ましくは約1.5〜
7倍モル過剰のポリマー、最も好ましくは約1.75〜5倍モル過剰のポリマーを用い
て行うことができる。当業者の選択により、活性化ポリマーは標的タンパク質に
対して固体として、または溶液にして添加し得る。結合反応は、比較的広い温度
範囲、例えば約0〜25℃で行うことができる。反応時間も当業者の選択によって 変動し、選択した活性化ポリマーに依存して1時間未満から24時間、またはさら にそれ以上の範囲であり得る。反応のクエンチングは任意である。これらの反応
条件により、予想外に比較的多量のHis-位置異性体を含むタンパク質-ポリマー 位置異性体の混合物が得られる。好ましくは、各異性体にはアミノ酸残基を介し
てタンパク質に結合した1個のポリマー鎖が含まれる。別の実施形態においては
、結合プロセスの結果2個以上の結合したポリマー鎖が存在し得る。これらの複
数鎖のポリマー結合体を含む溶液も、分子量を基準に結合体を分離してモノポリ
マー結合体を得るためにさらに処理されるか、または処理し得るので、有用であ
る。
量をもつ結合体も生じる。結合していない残留PAOおよびタンパク質も存在し得 る。この混合物は、典型的にはリン酸イオン、塩化物イオンおよび重炭酸イオン
の1種以上を含む反応バッファー中である。PAO、タンパク質および結合体混合物
は、好ましくは約1〜約10mg/mlのタンパク質結合体を含むバッファー溶液中で分
画される。適当な分画溶液のpHは約7.0〜約9.0であり、好ましくは約7.5〜約8.5
である。この溶液には、好ましくは、KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、Na
H2PO4、NaHCO3、NaBO4、(NH4)2CO3、およびグリシンNaOHから選択される1種以上
のバッファー塩が含まれる。リン酸ナトリウムバッファーが好ましい。
は界面活性剤が存在する場合にはその大部分も同様に除去する。
換媒体を用いて行われる。そのような媒体は、所定の、すなわち1個以上のポリ マー鎖を有するタンパク質-ポリマー結合体、過剰のポリマーおよび非修飾タン パク質を選択的に結合することが可能である。この分画は、様々な置換の程度の
タンパク質分子は多少予測可能な様式で変化する等電点を有するために生じる。
例えば、タンパク質の等電点は、タンパク質の表面上の利用可能なアミノ基の数
で決定される。またこれらのアミノ基はポリアルキレンオキシド結合体の結合点
としても作用する。したがって、ポリアルキレンオキシドの置換の程度が増大す
るにつれて、等電点は低下し、結合体が陰イオン交換樹脂に結合する能力が弱ま
る。ゲル濾過HPLCを用いて高分子量(複数鎖)結合体を除去することもできる。
る理由で、第4級アミンで被覆した陰イオン交換樹脂が用いられる。第4級アミン
樹脂は、ポリマーまたはシリカマトリックス上に被覆され得るが、ポリマーマト
リックスが好ましい。支持体マトリックス上にテトラメチルアミン、または第4 級メチルアミンを被覆した多数の陰イオン交換樹脂が市販されている。本発明で
使用するのに適した市販の第4級陰イオン交換樹脂の中には、Bio-Sepraから市販
されているQ-HD;IBF(Garenne, フランス)によりSepracor社(Marlborough,マサ チューセッツ)に対して製造された第4級アミン樹脂で被覆したポリマーマトリッ
クスQA TRISACRYL(登録商標)およびQMA-SPHEROSIL(登録商標);EM-Separators(G
ibbstown, ニュージャージー)により製造されたテトラメチルアミノエチル樹脂 で被覆したポリマーマトリックスTMAE650M(登録商標);TosoHaas(Montgomeryvil
le, PA)により製造されたポリマーマトリックスをそれぞれ第4級アミン樹脂で被
覆したQAE550C(登録商標)およびSUPERQC(登録商標)がある。Millipore(Millford
, MA)により製造されたQMA AccellおよびJT Baker(Phillipsburg, NJ)により製 造されたPEI樹脂も使用できる。
質溶液と同じpHおよび浸透圧モル濃度のバッファーが用いられる。次いで、結合
体含有溶液をカラム上に吸着させる。添加が完了したら、塩濃度の上昇を伴う溶
離バッファーの勾配フローをカラムに適用し、ポリアルキレンオキシド-結合タ ンパク質の所望の画分を溶出させる。この画分の分子量および置換度は実質的に
均一である。しかしながら、種々の位置異性体の分離はこのタイプの分離の間に
は行われない。
2個、最も好ましくは約1個のポリマーを含む。溶離バッファーには、好ましくは
KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4および(NH4)2CO 3 から選択される1種以上の塩が含まれる。これらの画分は、実質的に他の結合体
を含まない。次いで、通常の技術により非結合種をカラムから逆洗し得る。
を利用する技術も用いることができる。濃度を増大させる多重アイソクラチック
溶離ステップにより、タンパク質-ポリマー結合体の連続溶離が生じる。各画分 に含まれるポリマー結合体の程度は実質的に均一であろう。しかしながら、各画
分についてのポリマー結合の程度は、溶出時間の経過につれて低下するであろう
。結合体のイオン交換精製も、例えばBioSepra社製のQ-HDカラムを希薄なリン酸
ナトリウム溶液とともに用いて行うことができる。例えば、PEG-IFNサンプルを 含むサンプルを10mMのNaPO4で洗浄して未反応のPAOをすべて除去し、その後NaCl
を用いた段階的勾配溶離を行う。10mMのNaClでの溶出によってIFN 1分子当たり3
個以上のポリマー鎖PAOを有する結合体を含む画分が回収され、50mMのNaClでの 溶出によって1〜2個の鎖を含む結合体が回収され、150mMのNaClでの溶出によっ て修飾されていないIFNが回収される。
度で行われる。PAO-αIFN画分の溶出は、254nmにおけるUV吸光度により検出され
る。画分回収は、単純時間溶出特性(simple time elution profiles)により行う
ことができる。その他のタンパク質結合体も同様に溶出される。
、タンパク質の種々の部位に結合した1個または複数のポリマー鎖を含む化学種 の不均質な混合物である。結合体を含む溶液または反応プールにはいずれも実質
的に全範囲の位置異性体が存在すると考えられる。αIFN-2bの場合、好ましい結
合体含有溶液には、ポリマーがHis34などの3個の利用可能なヒスチジン残基の1
つに結合し、任意にαインターフェロン-2bのCys1、Lys31、Lys49、Lys83、Lys1
21、Lys131およびLys134の中の1つ以上に結合した結合体が含まれる。本明細書
に記載した反応条件および活性化ポリマーを用いる場合、αインターフェロン2b
上のHis残基におけるポリマーの結合は反応プール全体の少なくとも約50%であ り、好ましくは反応プール中の結合体の少なくとも約75%であり、最も好ましく
は少なくとも約85%である。例えば、BTC-活性化mPEGを用いてIFNα-2b結合体を
形成した場合、形成された結合体の約90%がIFN-His-PEG位置異性体であった。S
C-PEGを用いた場合、形成された結合体の約55%がIFN-His-PEG位置異性体であっ
た。少量のその他の位置異性体も見出された。別のIFNならびにその他のタンパ ク質により、その出発物質のアミノ酸配列に依存して位置異性体の別の分布が得
られることは理解されるであろう。
の位置異性体の生物活性が異なるということを確認した。本発明者らは理論に縛
られるものではないが、種々の位置異性体の活性の相違は一般に予測不能である
と考えられる。このような確認に鑑みると、本発明の方法によって当業者はどの
異性体が多量の特定の位置異性体をもたらすものであるかを決定でき、反応プー
ルから特定の位置異性体を単離するにはどの方法が非常に望ましいかを決定でき
る。
、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法により行うことができる。本発明の
目的に関し、イオン交換には陽イオンおよび/または陰イオン交換が含まれる。
種々の位置異性体の形成をもたらす結合プロセスによって異なる荷電分布を有す
る個々の位置異性体が形成される。次いで荷電分布の相違を用いることにより、
イオン交換クロマトグラフィー(すなわち陽イオンおよび/または陰イオン)に
て任意の所望の位置異性体を分離(回収)することができる。例えば、分離前に
、結合反応から得られた広範な種々の位置異性体を、約0.5〜約10重量%の結合 体を含むバッファー溶液に加える。このバッファー溶液には、限定するものでは
ないがKCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4、(NH4)2 CO3およびグリシンNaOHから選択される1種以上のバッファー塩が含まれる(本発
明で使用するにはこれらのバッファーが好ましい)。もちろん、溶出条件は当業
者の要求および求められる位置異性体に依存するであろう。
分離を行うためのそのような装置の1つは、Pharmacia Biotechから市販されて いる、Mini-S陽イオン交換カラムを含むHPLCシステムである。当業者には、別の
装置およびカラム、例えばToso Haasから市販されているSP-5PWカラムを含むHPL
Cシステムなども所望の分離を達成するために用いられることは明白であろう。 分離を行うのに適した樹脂としては、限定するものではないが、SP-、およびCM-
、Q-またはDEAEセファロース(Pharmacia製)およびCM-、Q-Hyper D-(BioSepra製)
のような陽イオンまたは陰イオン交換樹脂が挙げられる。
ち90%以上を含む組成物は、ゲル濾過後陽イオン交換する、または陰イオン交換
後陽イオン交換する、などのようにクロマトグラフィーカラムを用いて反応プー
ル中のIFN-ポリマー結合体から単離できる。そのような技術により、少なくとも
約85%のIFNα2b-His34-ポリマー結合体、好ましくは少なくとも約90%のIFNα2
b-His34-ポリマー結合体を含む組成物が得られる。組成物の残りのパーセントに
は、所望の実質的に純粋な位置異性体の治療上の有効性をほとんど損なわないよ
うなその他の位置異性体が含まれるであろう。インターフェロンまたはその他の
タンパク質のその他の位置異性体も同様に単離される。その他のタンパク質結合
体については、同様の分離技術が用いられる。直線および/または逐次勾配分離
技術も特定のピークに対応する結合体を得るのに有用であることも前述の記載か
ら理解されるであろう。さらに、各ピークに関連した結合体は、所望によりこの
様式で単離できる。必要に応じて、回収された画分を供給体積のカラム床体積に
対する割合が同じになるようにクロマトグラフィー装置に再注入し、回収された
画分の純度を高めることができる。修飾されたアミノ酸残基を決定するために、
実質的に純粋な位置異性体をペプチド配列決定にかけることができる。
回収し得る。各ピークは直線勾配(A-40mMの酢酸ナトリウム、B-40mMの酢酸ナト リウム、100mMのNaCl)を用いて、pH4.7〜5.3で214ナノメートルの波長にて陽イ オン交換クロマトグラフィーシステム上で精製される。上記の溶離バッファーの
濃度を増大させる多重アイソクラチックステップを用いる技術を、モノ-ポリマ ー結合体を回収するために、特定のピークに対応する所望の結合体の回収に適合
させることもできる。
り大きく影響を受けるという発見を利用したものである。反応液のpHは様々であ
るので、α-アミン、イミダゾールおよびε-アミンなど種々の官能基の、活性化
ポリマーの特定の形態に対する反応性は様々であろう。典型的には、リシンε- アミノ基での結合を最大化するために、ポリマー結合反応は塩基性pHで行われる
。例えば、ZalipskyらのBiotech.&App.Biochem, 15巻, p.100-114;(1992)は、PE
G化(PEGylation)に対してSC-PEG試薬を評価し、最適な反応性はpH約9.3における
ものであることを報告した。しかしながら、本発明の方法は、活性化ポリマー鎖
のかなりの部分をヒスチジンアミノ基に結合させ、リシンおよびN末端部位への 結合を重視するのをやめる(しかし排除はしない)ために、かなり低いpH値で反
応を行うことを含む。
ることが測定された。例えば、pHを塩基性からわずかに酸性のpH(約4.5〜6.8)に
変えると、IFNα2bのHis34、ならびにより少ない程度であるが、N末端(Cys1)お よびリシン残基に結合した結合体の形成が促進される。一方、結合反応時にpH(8
〜10)を用いると、リシン関連結合部位の形成が促進され、これは陽イオン交換 クロマトグラフィーにより確認される。もちろん、IFNα2bを含有しない場合は 、His残基は異なるであろう。それでもなお、その反応条件により、活性化ポリ マーはHisへ共有結合し得る。
位に結合しているものを含まない。したがって、該組成物について、結合体タン
パク質の治療的効果を最大化するような、in vivo薬物動態および生物活性プロ ファイルを予測可能である。
であるものもある。その組成物は、非修飾タンパク質の生物活性の、少なくとも
約20%、好ましくは少なくとも約35%および最も好ましくは少なくとも約50%を
維持する。維持されている活性量および循環寿命(circulating life)の長さが、
タンパク質、ならびにそのタンパク質に結合するポリマー鎖の数および分子量を
含むいくつもの要因に依存するであろうことは理解されるだろう。
法を提供する。該方法には、本明細書中の記載に従って調製した有効量のタンパ
ク質−ポリマー 結合体を、そのような治療が必要な哺乳動物に投与することを 含む。前記結合体は、とりわけ非修飾タンパク質を用いて治療される症状の治療
に対して有用である。例えば、酵素置換治療または血液因子を必要とする哺乳動
物に、所望の物質を含む、実質的に純粋なポリマー結合体を与えることができる
。αインターフェロンの場合、インターフェロン感受性症状、またはインターフ
ェロンに基づく治療にポジティブに (positively)または有利に (favorably)(こ
れらは医療業界では公知の専門用語である)反応するであろう症状がある。
療に感受性がある場合である。例えば、感受性のある症状には、インターフェロ
ンαに基づく治療に対し、ポジティブに(positively)または有利に(favorably)(
これらは医療業界で公知の専門用語である)反応するであろう症状が含まれる。 本発明の意図として、インターフェロンα療法で治療できる症状には、インター
フェロンαを用いた療法がなんらかの有効性を示すが、負の副作用が治療の利益
を上回るためにインターフェロンαでは治療できない可能性のある症状を含む。
例えば、α療法に伴う副作用によって、インターフェロンαを用いたエプスタイ
ン・バーウイルスの治療は事実上不可能になった。本発明の実施により、従来の
インターフェロンα治療と比較して、副作用を大幅に減らし、または無くすこと
ができる。
いが、細胞増殖障害、特に癌(例えば、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄 性白血病、多発性骨髄腫、基底細胞癌および悪性黒色腫、卵巣癌、皮膚T細胞リ
ンパ腫)、およびウイルス感染を含む。限定するものではないが、インターフェ ロンによる治療は、インターフェロン感受性ウイルスの複製を阻害することが有
効である症状を治療するために用いることができる。本発明に従って治療され得
るウイルス感染としては、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、他の非A型/非B型 肝炎、ヘルペスウイルス(エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウ イルス(CMV)、単純ヘルペス、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6))、パピローマ 、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒ
トリンパ球向性ウイルス1型および2型(HTLV-1/-2)、ヒトロタウイルス、狂犬病 、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)を含むレトロウイルス、脳炎および呼吸器ウイ ルス感染が例として挙げられる。本発明の方法は種々の免疫反応を改変するため
に用いることもできる。
いぼ、カポジ肉腫、および慢性非A型/非B型肝炎の治療用に認可されている。 インターフェロンα-2bは商品名INTRON(登録商標) A(Schering Corporation, Ke
nilworth N.J.)として市販され、インターフェロンα-2aは商品名Roferon(登録 商標) A(Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.)として市販され、共通インターフェ
ロンは商品名InfergenTM(Amgen, Thousand, Oaks, CA)として市販されている。 全てのインターフェロンの中でも、インターフェロンα-2bは、慢性C型肝炎の 治療のために世界中で最も広く認可されているので、本発明の実施に従って慢性
C型肝炎の治療に用いるにはこれが最も好適である。
各投与量を通常、24週以上にわたり注射によって投与する。
の手法で投与することができる。担当医の判断に基づき、投薬量および用いる治
療上の投薬計画は当然、治療を受ける患者の年齢、性別および病歴、好中球数( 例えば好中球減少の重症度)、特定の病状の重症度、ならびに局所的毒性および 全身性の副作用によって明示される、患者の該治療に対する耐性に依存するであ
ろう。投与する量および頻度は、好中球数の最初のスクリーニングの際に決定す
ることもあり得る。
することもできる。該製剤は、治療上有効な量の、実質的に純粋なインターフェ
ロン−ポリマー 結合体組成物を製薬上許容される担体と共に含む。もし必要で あれば、例えば、アジュバント、希釈剤、保存剤、および/または可溶化剤を本
発明の実施の際に用いてもよい。本発明の組成物を含むインターフェロンの医薬
組成物には、ある範囲のpHおよびイオン強度を有する種々のバッファー(例えばT
ris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)である希釈剤、担体(例えば、ヒト血清アルブミン)
、可溶化剤(例えば、トゥイーン、ポリソルベート)、および保存剤(例えば、チ メロソール(thimerosol)、ベンジルアルコール)を含有してもよい。例えば、米 国特許第4,496,537号を参照のこと。
、ポリマー結合体のIFN活性に基づく。それは、ポジティブな臨床反応に大きな 影響を及ぼすのに十分な量である。患者の中には、臨床投薬量によって多少のレ
ベルの副作用が引き起こされる人もいるであろうが、ヒトを含む哺乳動物に対す
る最大投与量は、手に余る臨床上重大な副作用を引き起こさないような最高投与
量である。本発明の意図としては、そういった臨床上の重大な副作用とは、重篤
なインフルエンザ様症状、中枢神経系抑制、重篤な胃腸障害、脱毛症、重篤な掻
痒症または発疹を引き起こすために治療の中断が必要になるであろう場合である
。白血球および/もしくは赤血球および/もしくは肝酵素の実質的異常または貧
血症様症状も、投薬量が制限される。
ーにある程度依存しており、様々である。しかし一般的に、上記結合体は一日に
つき約100,000〜約数百万IU/m2の範囲の量を、その哺乳動物の症状に基づいて投
与する。前記範囲は例示であり、当業者であれば、臨床経験および治療指標に基
づいて、選択した結合体の最適な投与量を決定するであろう。
態であって、当技術分野で周知の方法により調製したものでありうる。これらの
組成物は主に非経口経路によって投与されるが、経口または吸入経路も当業者の
必要性に応じて用いられ得ることも意図する。
の有効な範囲をいかようにも制限することを意図しない。
orporation, Kenilworth, New Jerseyの製品を、分子量12,000の活性化ポリエチ
レングリコール-N-スクシンイミジルカルボナート(SC-PEG)(米国特許第5,122,61
4に記載の通りに調製)と結合させた。該結合反応は、室温およびpH約6.5で行わ れた。IFN 1gに対し、SC-PEG12,000 2.6gの比率で用いた。SC-PEGを固体で加え 、その反応は約4℃で行った。反応の最後に、グリシンを加えて残留するPEG化 試薬を抑制した。次いでQ-HyperD樹脂を用い、pH8で、未反応成分および多PEG 化種を塩溶出によって除去し、反応物から生成物を精製した。Q-HyperDから回収
したモノ-PEG-IFNは、His-34結合PEG-IFNが約55%、N末端結合PEG-IFNが20%、
リシン121結合PEG-IFNが12%で、残りはLys 131、Lys 1134、Lys 49およびLys 8
3結合性である。次にいくつかの位置異性体を含むこの物質を、pH4.9の20mM酢酸
バッファーに対し透析し、pH4.9の10mM酢酸バッファーで平衡化したSP-Sepharos
e High Performanceを充填したカラム上にロードした(樹脂4mlに対し物質約4m
g)。この物質は酢酸バッファー中の塩化ナトリウム濃度勾配(0〜500mM)を用いて
溶出した。図1は、カラムからの溶出プロファイルを示している。ピーク1は、Hi
s-34結合PEG-IFNが90%以上であることが見出された。
った。
トリウムpH5.3バッファーおよび25%2-プロパノールを含む。流動相Bは流動相 Aに、溶解させた500mM塩化ナトリウムを含む。流速は0.5ml/minに定め、溶出タ
ンパク質は214nmで検出した。それぞれのPEG-IFN溶液は、2-プロパノールを5% 含む10mM酢酸ナトリウム(pH5.3)で希釈して、タンパク質濃度1mg/mlにした。注 入量は、タンパク質濃度に依存して10〜30μlの範囲であった。
ク3が主たる成分であると測定されたことがわかる。さらに、クロマトグラフィ ー分離によって、主な異なる強度のピークを回収した。しかしながら、個々の化
学種、すなわち位置異性体は、この系では互いに十分に分離されないことに注意
すべきである。例えばピーク3を含む画分は、His-34位置異性体を約90%、およ びlys-31位置異性体を約10%含むと測定された。この画分の単離および回収によ
り、実質的に純粋なαIFN2b- His-34-PEGを含む組成物が得られた。位置異性体 溶出においては多少重複がある。しかし、該ピークつまり画分3は全PEG-インタ ーフェロン種の約50%に相当したことがわかる。
EG-IFN;ピーク6:Lys-121結合PEG-IFNおよびLys-131結合PEG-IFN;ピーク8:Cys-
1結合PEG-IFN これらの結果は、結合体の大部分がピーク3および4(His-34結合PEG-IFN)に見 出されたことを示している。該結果は予測されたものとは対照的に、結合体の大
部分が、リシンアミノ基の1つよりもむしろヒスチジンにポリマーが結合するこ とによって形成されたことも示している。
交換を数サイクル用いることにより回収した。次いで、回収したクロマトグラフ
ィー画分の各々をCPEバイオアッセイ(抗ウイルス活性)により試験した。以下の 表2は天然インターフェロンと比較した生物活性を示している(天然=100%とす る)。
がわかる。したがって、この画分(主にHis-34位置異性体である)のみを含有する
実質的に純粋な組成物は、広範な位置異性体を有する結合体よりも有用である。
析スキームと、続く精製のためのサイズ排除クロマトグラフィー工程によって、
特性付けた。その物質についてタンパク質配列解析を行い、該インターフェロン
ペプチド内のPEG化アミノ酸残基の存在をタンパク質配列の欠位により推測した 。この特性評価作業により、PEGがα-インターフェロン-2b分子の異なる8つの部
位(Cys1、Lys31、His34、Lys49、Lys83、Lys121、Lys131およびLys134)に結合し
ていることが明示された。詳細は以下に提供する。
lの濃度で行った。全部で60mgのIFNを用いた。反応混合物を、100mMリン酸ナト リウムバッファーおよび150mM塩化ナトリウム(pH5.0)を含有するゲル濾過バッフ
ァーに対して透析した。透析した物質5mlを、ゲル濾過バッファーで平衡化され たSuperdex 200 カラム 200ml上にロードし、複鎖種からモノ-PEG種を分離した 。
てヒドロキシルアミン感受性テストを行い、ヒスチジン部位(IFN-His34を含む) でPEG化された結合体のパーセンテージを測定した。ヒドロキシルアミンは、PEG
をIFNヒスチジン残基から選択的に切断することが知られている。サンプルの各 々一部(50μl)を、10mMリン酸ナトリウム(pH7.0) 0.45mlで希釈した。このタン パク質溶液の一部(150μl)を0.5Mヒドロキシルアミン 150μlで処理し、室温で6
0分間インキュベートした。前記結合体の90%以上がヒドロキシルアミン感受性 であると測定され、このことは、その物質の90%以上がHis結合PEGインターフェ
ロンであることを示唆している。反応混合物をさらに特性付けすることによって
、His34が結合している唯一のヒスチジン残基であることが確認された。Superde
x 200 プールのHPLCクロマトグラフィーにより、実際にHis34が主なPEG化部位で
あることが示唆された。このことはさらに、実施例3に記載された手法とよく似 た酵素的切断解析スキームを用いて、最終産物を特性付けることによっても確認
され、His34がPEG化の主たる部位であることが示された。この位置異性体の比活
性は、89 MIU/mgであることがわかった。
濃度勾配(0〜500mM)を用いて溶出した。産物プールのHis34-PEG-IFN純度は、少 なくとも94%であった。プール中のdi-PEG-IFNは、約3〜5%と測定された。
例6では20,000)を用いて、実施例4の工程を繰り返した。ヒドロキシルアミン反 応によって、実施例5のHis-PEGインターフェロン量は約90〜95%、実施例6では 約91%と決定された。次いでゲル濾過を用いてPEG-IFNの種々の位置異性体を単 離し、非モノ鎖結合体を除去した。PEG5,000-結合体の比活性は約119 MIU/mg、P
EG20,000-His34位置異性体の比活性は89 MIU/mgと測定された。
る。一方、天然インターフェロンは予想通り、測定時間の間、活性の低下を示す
。本発明者らは理論に拘束されるものではないが、His34結合物質の活性の増加 は、His-PEG結合の比較的緩慢な加水分解および続いて起こる遊離IFNの放出と関
係があると思われる。この図は、一定の条件下ではHis-PEG結合はLys-PEG結合よ
り弱く、つまりその開裂によって、延長されたすなわち「緩放出性の」送達機構
が与えられるというHis-PEG結合の固有の特性を示している。
H6.5でBTC-PEG12,000(実施例8)またはSC-PEG12,000(実施例9)と結合させ、得ら れた反応プール中のヒスチジン結合位置異性体の程度を測定した。IL-10には3 つの利用可能なヒスチジンがある。
各場合について2〜3倍モル濃度過剰の活性化ポリマーおよびゲル濾過を使用した
。ヒドロキシルアミン感受性テストを各バッチについて行い、His含有位置異性 体の量を測定した。BTCベースの結合体は、SCベースの結合体よりもヒドロキシ ルアミンに不安定な結合体を約50%多く含有することが見出された。BTCベース の結合体の比生物活性は、MC-9バイオアッセイを用いて約84%と測定された。SC
-PEGベースの結合体は、約49%の比生物活性を有することが見出された。
明の他の実施形態が明らかであろう。以下の請求項により明示された本発明の正
当な範囲および精神をもってすれば、本明細書の記載および実施例が典型的なも
のとしてのみ考えられると意図される。
で言及したグラフである。
Claims (33)
- 【請求項1】 実質的に純粋なタンパク質-ポリマー結合体であって、タン パク質上のヒスチジン残基にポリマーが共有結合したタンパク質を含む上記結合
体。 - 【請求項2】 前記ポリマーがポリアルキレンオキシドを含む、請求項1に
記載のタンパク質-ポリマー結合体。 - 【請求項3】 前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールであ
る、請求項2に記載のタンパク質-ポリマー結合体。 - 【請求項4】 前記ポリエチレングリコールがモノメトキシ-ポリエチレン グリコール(mPEG)である、請求項3に記載のタンパク質-ポリマー結合体。
- 【請求項5】 前記ポリマーが約200〜約35,000の分子量のものである、請 求項1に記載のタンパク質-ポリマー結合体。
- 【請求項6】 前記ポリマーが約1,000〜約25,000の分子量のものである、 請求項5に記載のタンパク質-ポリマー結合体。
- 【請求項7】 前記ポリマーが約2,000〜約20,000の分子量のものである、 請求項6に記載のタンパク質-ポリマー結合体。
- 【請求項8】 前記タンパク質がαインターフェロンまたはIL-10である、 請求項1に記載のタンパク質-ポリマー結合体。
- 【請求項9】 前記αインターフェロンがインターフェロンα2bである、請
求項8に記載のタンパク質-ポリマー結合体。 - 【請求項10】 タンパク質が該タンパク質上のヒスチジン残基にてポリマ
ーに共有結合しているタンパク質-ポリマー結合体の製造方法であって、 a) タンパク質と十分な量の活性化ポリマーとを該タンパク質の該活性化ポリ マーへの共有結合を促進するのに十分な条件下で反応させることにより複数のタ
ンパク質-ポリマー結合体を形成すること、および b) 前記複数のタンパク質-ポリマー結合体から、タンパク質のヒスチジンに結
合したポリマーを含むタンパク質-ポリマー結合体を実質的に分離すること を含む、上記方法。 - 【請求項11】 前記タンパク質がαインターフェロンまたはIL-10である 、請求項10に記載の方法。
- 【請求項12】 前記活性化ポリマーがベンゾトリアゾールカーボネート- 活性化ポリマーである、請求項10に記載の方法。
- 【請求項13】 前記活性化ポリマーがオキシカルボニル-オキシ-N-ジカル
ボキシミド-活性化ポリマーである、請求項10に記載の方法。 - 【請求項14】 前記オキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミドがスク
シンイミジルカーボネートである、請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 前記分離が、ゲル濾過クロマトグラフィー、次いでイオン
交換クロマトグラフィーにより行われる、請求項10に記載の方法。 - 【請求項16】 前記イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマ
トグラフィーである、請求項15に記載の方法。 - 【請求項17】 前記分離が、陰イオン交換クロマトグラフィー、次いで陽
イオン交換クロマトグラフィーにより行われる、請求項10に記載の方法。 - 【請求項18】 前記条件が、約7.0以下のpHで前記反応を行うことを含む 、請求項10に記載の方法。
- 【請求項19】 前記条件が、約6.8以下のpHで前記反応を行うことを含む 、請求項18に記載の方法。
- 【請求項20】 前記条件が、約4.5〜約6.8のpHで前記反応を行うことを含
む、請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 前記αインターフェロンがαインターフェロン2bである、
請求項11に記載の方法。 - 【請求項22】 前記活性化ポリマーが前記タンパク質に対してモル過剰で
存在する、請求項10に記載の方法。 - 【請求項23】 前記ポリマーがポリアルキレンオキシドを含む、請求項1
0に記載の方法。 - 【請求項24】 前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールで
ある、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 前記ポリマーが約200〜約35,000の分子量のものである、 請求項10に記載の方法。
- 【請求項26】 前記ポリマーが約1,000〜約25,000の分子量のものである 、請求項25に記載の方法。
- 【請求項27】 前記ポリマーが約2,000〜約20,000の分子量のものである 、請求項26に記載の方法。
- 【請求項28】 有効量の請求項1に記載の結合体を投与することを含む、
哺乳動物における医学的症状を治療する方法。 - 【請求項29】 請求項10に記載の方法により製造されたインターフェロ
ン-ポリマー結合体。 - 【請求項30】 請求項1に記載のタンパク質-ポリマー結合体を含む医薬 組成物。
- 【請求項31】 前記ポリマーの少なくとも約50%が、前記αインターフェ
ロンのヒスチジン残基にて該αインターフェロンに結合している、請求項8に記
載のタンパク質-ポリマー結合体。 - 【請求項32】 前記ポリマーの少なくとも約75%が、前記αインターフェ
ロンのヒスチジン残基にて該αインターフェロンに結合している、請求項31に
記載のタンパク質-ポリマー結合体。 - 【請求項33】 前記ポリマーの少なくとも約85%が、前記αインターフェ
ロンのヒスチジン残基にて該αインターフェロンに結合している、請求項32に
記載のタンパク質-ポリマー結合体。
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