JP2022516725A - 改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータポリペプチドおよび使用方法 - Google Patents

改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータポリペプチドおよび使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022516725A
JP2022516725A JP2021538046A JP2021538046A JP2022516725A JP 2022516725 A JP2022516725 A JP 2022516725A JP 2021538046 A JP2021538046 A JP 2021538046A JP 2021538046 A JP2021538046 A JP 2021538046A JP 2022516725 A JP2022516725 A JP 2022516725A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
l97ba
modified
polypeptide
t97ai
complement
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021538046A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020140101A5 (ja
Inventor
エル マディソン，エドウィン
サノス，クリストファー
ソロス，バネッサ
ポプコフ，ミハイル
ティプトン，キンバリー
ジョン トレイラー，マシュー
スティーブン ファーファイン，エリック
チャールズ ウェイ，ジェフリー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gyre Therapeutics Inc
Original Assignee
Catalyst Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Catalyst Biosciences Inc filed Critical Catalyst Biosciences Inc
Publication of JP2022516725A publication Critical patent/JP2022516725A/ja
Publication of JPWO2020140101A5 publication Critical patent/JPWO2020140101A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21031—Urokinase (3.4.21.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Abstract

提供されるのは、ｕ－ＰＡポリペプチド、およびｕ－ＰＡポリペプチドを含有する融合タンパク質である。ｕ－ＰＡポリペプチドは、活性および／または特異性を変更して、補体タンパク質Ｃ３等の補体タンパク質を切断することによって、補体活性化を阻害するように改変されている。補体活性化を阻害する改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質は、補体活性化によって媒介される、または補体活性化が役割を果たす疾患および状態の処置に用いることができる。これらの障害として、心筋梗塞および卒中を含む虚血再灌流障害、敗血症、自己免疫疾患、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、移植臓器拒絶、炎症性疾患、ならびに炎症性要素を有する疾患が挙げられる。

Description

関連出願
２０１８年１２月２８日出願の米国仮特許出願第６２／７８６，３０２号明細書（表題「MODIFIED UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE」、発明者Edwin L. Madison、Christopher Thanos、Mikhail Popkov、Vanessa SorosおよびKimberly Tipton、ならびに出願人Catalyst Biosciences, Inc.）の優先権の利益を主張する。許可される場合、この出願の主題は、その全体が参照によって組み込まれる。
電子的に提供される配列表の参照による組込み
配列表の電子バージョンを一緒に提出する。この内容は、その全体が参照によって組み込まれる。電子ファイルは、２０１９年１２月２６日に作成した。サイズは２，２９４キロバイトであり、表題は4940seqPC1.txtである。
本発明の分野
提供されるのは、補体タンパク質を切断することによって補体活性化を阻害する改変ｕ－ＰＡポリペプチドである。この阻害によって、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを、補体によって媒介される、または補体活性化が役割を果たす疾患および状態の処置に用いることができる。これらの疾患および状態として、以下に限定されないが、黄斑変性、例えば加齢黄斑変性（ＡＭＤ）およびシュタルガルト病を含む眼科徴候；移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）；心筋梗塞および卒中を含む虚血再灌流障害；敗血症；自己免疫疾患；炎症性疾患；ならびにアルツハイマー病および他の神経変性障害を含む、炎症性要素を有する疾患が挙げられる。
背景
補体（Ｃ）系は、免疫系の一部であり、侵入病原体を除外し、炎症反応を開始する役割を果たす。ヒトおよび他の哺乳動物の補体系は、補体活性化をもたらす系統立った反応に関与する、３０を超える可溶性の膜結合タンパク質を包含する。血液補体系は、抗微生物作用および抗ウイルス作用が挙げられる、広い範囲の宿主防御機構と関連する広いアレイの機能を有する。Ｃ要素の活性化に由来する生成物として、非自己認識分子Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、およびＣ５ｂ、ならびに種々の細胞免疫応答に影響するアナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａが挙げられる。また、これらのアナフィラトキシンは、炎症誘発剤としての機能を果たす。
補体系は、酵素、非酵素タンパク質、および受容体のアレイで構成される。補体活性化は、「古典」経路、「別」経路、および「レクチン」経路として知られている３つの一次モードの１つによって起こる（図１参照）。補体は、典型的に、これらの３つの経路の１つによって活性化またはトリガされる。これらは、図１に示されるように、Ｃ３活性化に収束する。内因性経路と呼ばれる第４の補体－活性化機構において、凝固／線維素溶解カスケードと関連するセリンプロテアーゼが、古典経路、副経路、およびレクチン経路と独立して、Ｃ３またはＣ５の切断を介して直接的に補体系を活性化する。
これらの経路は、補体活性化を開始するプロセスによって識別することができる。古典経路は、抗体－抗原複合体、または免疫グロブリンの凝集形態によって開始される；副経路は、微生物表面上での、細胞表面上での構造の認識によって開始される；抗体から独立した経路であるレクチン経路は、マンナン結合性レクチン（ＭＢＬ、マンノース結合タンパク質とも称される）が、炭水化物、例えば、細菌またはウイルスの表面上に提示されるものに結合することによって開始される。カスケードの活性化は、タンパク質分解または細胞溶解に関与する複合体、ならびにオプソニン作用、アナフィラキシー、および走化性に関与するペプチドの生成をもたらす。
動物の免疫応答の中心的な要素である補体カスケードは、不可逆性のカスケードである。多数のタンパク質補因子がプロセスを調節する。プロセスの不適切な調節、典型的には不適切な活性化は、不適切な炎症性の免疫応答、例えば、急性炎症性疾患および慢性炎症性疾患、ならびに不適切な免疫応答を伴う他の状態において観察される不適切な炎症性の免疫応答を伴う種々の障害の側面であり得る、または当該種々の障害において起こり得る。これらの疾患および障害として、自己免疫疾患、例えば関節リウマチおよび狼瘡、心臓障害、ならびに他の炎症性疾患、例えば敗血症および虚血再灌流傷害が挙げられる。
種々の疾患および状態における補体経路が関与するため、補体経路の要素は、治療的介入のための、特に経路の阻害のための標的である。そのような治療法の例として、合成小分子療法および天然小分子療法、抗体阻害剤、ならびに膜補体調節因子の組換え可溶性形態が挙げられる。そのような治療法を準備する戦略には限りがある。小分子は、半減期がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で短く、補体阻害を維持するために絶えず注入される必要があることによって、その役割が、とりわけ慢性疾患において、限られる。治療抗体は、対象において免疫応答をもたらし得るので、処置、特に免疫応答を調節するように設計された処置において、複雑化をもたらし得る。ゆえに、補体媒介疾患、および補体活性化が役割を果たす疾患の処置のための治療法が必要とされている。これらの疾患として、急性炎症性疾患および慢性炎症性疾患が挙げられる。したがって、本明細書中の目的の中で、補体カスケードの活性化を標的化するような治療法を提供すること、および疾患の治療法および処置の方法を提供することを目的とする。
野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインと比較して、補体タンパク質Ｃ３に対する切断活性の増大をもたらす、プロテアーゼドメイン内にアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を含む（プロテアーゼドメインは、凝集を低減する／消失させるための、遊離Ｃｙｓの、Ｓｅｒとの置換を含み得る）改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ（ｕ－ＰＡ）ポリペプチドが提供される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プロテアーゼドメイン、例えば全長活性化プロテアーゼ、そのチモーゲン形態、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する融合タンパク質、および薬理学的な性質または活性を付与する融合パートナーを含むものである。改変ｕ－ＰＡポリペプチド、および改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する融合タンパク質は、活性形態である場合、補体活性化を阻害する。特に、これらのポリペプチドおよび融合タンパク質は、Ｃ３を切断することによって、Ｃ３活性が阻害され、または消失する。
本明細書中に記載される、アミノ酸の欠失、置換、および挿入を含む改変は、プロテアーゼドメイン内にある。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プロテアーゼドメインを含むか、またはプロテアーゼドメインである。改変ｕ－ＰＡポリペプチドはさらに、一次アミノ酸配列以外に対する翻訳後改変および他の改変、例えば、他のポリペプチドおよび部分へのコンジュゲーションまたは結合を含み得、これらは、性質、例えば血清半減期、および内因性プロテアーゼに対する耐性を変更する。そのような改変として、以下に限定されないが、アルブミンへの結合、多量体化ドメインへの結合、およびペグ化が挙げられる。ゆえに、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、当該技術において知られているペグ化、アルブミン化、ファルネシル化（ｆａｒｎｙｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および他のポリペプチド改変によって改変することができる。改変には、特にインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で発現すると、凝集を低減するような、キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２等の、チモーゲン内の遊離システインの、セリンまたはアラニンとの置換がある。この置換は、あってもなくてもよく、必ずしも、インビボでペグ化または発現されることとなるようにポリペプチド内に含まれるわけではない。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３を切断によって不活性化する。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ３を切断することによって補体活性化を阻害する。例えば、活性部位内の部位にてＣ３を切断して、Ｃ３活性を不活性化または阻害することによって、補体活性化を阻害する。本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ＱＨＡＲＡＳＨＬＧ内を切断するように選択され設計されており、特にここでは、Ｐ１－Ｐ１’はＲＡである（ＱＨＡＲ↓ＡＳＨＬ；配列番号４７残基７３７～７４４参照。切断は、残基７４０と７４１との間である）。結果として、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ３活性の阻害により障害、疾患、および／または状態を処置することができるように補体活性化が役割を果たす、障害、疾患、および／または状態を処置する治療法として用いることができる。また、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、野生型ｕ－ＰＡと比較して、またはキモトリプシンナンバリングによるＣ１２２Ｓに相当する置換を有するだけのものと比較して、天然の基質、例えばプラスミノゲンについて、活性を低減することができる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドが対象とする疾患および状態には、あらゆるＣ３媒介疾患および状態、または補体媒介もしくは補体関与疾患および状態がある。これらとして、眼科障害、例えば加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および糖尿病性網膜症、ならびに臓器拒絶、例えば移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）、ならびに補体活性化を阻害することによって処置することができる他の疾患、障害、および状態が挙げられる。ＡＭＤは、硝子液への投与によって、例えば硝子体内注射、または網膜内注射もしくは網膜下注射によって処置され、ＤＧＦは、静脈内投与または他の全身投与によって処置される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質は、例えばペグ化によって、さらに改変されて、半減期の延長および／または免疫原性の低下が挙げられる所望の薬理学的性質を増強するか、向上させるか、与えることができる。他の疾患および状態の例として、関節リウマチ（ＲＡ）、眼疾患、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、虚血再灌流傷害、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、および補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）が挙げられる。
非改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、前駆体形態、成熟形態、触媒ドメイン、およびその触媒活性形態、さらには融合タンパク質、例えば実施例１４～１６に記載されるものを含む。非改変ｕ－ＰＡポリペプチドの例は、配列番号１～６に示される配列を有するものである。非改変ｕ－ＰＡポリペプチドに含まれるものとして、触媒ドメイン内の遊離システイン（キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２に相当する）が、別のアミノ酸、例えばＳまたはＡ、特にＳによって置き換えられているものがあり、これは、触媒活性を変更しないが、ポリペプチドの凝集を低下させる。全ての改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２に相当する残基での置換（通常Ｓ）を含んでもよいことが理解される。
本明細書中で提供される改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ（ｕ－ＰＡ）ポリペプチドには、Ｒ３５Ｑ、Ｈ３７Ｙ、Ｖ４１Ｒ、Ｖ４１Ｌ、Ｙ４０Ｑ、Ｄ６０ａＰ、Ｌ９７ｂＡ、Ｔ９７ａＩ、およびＨ９９Ｑに相当する置換、ならびにそれらの保存的アミノ酸改変から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含有することによって、ｕ－ＰＡポリペプチドの非改変活性形態と比較して、補体タンパク質に対して増大した活性／特異性を有する、改変ｕ－ＰＡポリペプチドがあり、ここで、アミノ酸改変は、置換、挿入、および欠失から選択され；対応する残基は、ｕ－ＰＡの成熟形態とのアラインメントによって決定することができ；改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質を切断することによって、アミノ酸改変を含有しない非改変ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、補体活性化を阻害するか、または低減し；残基は、キモトリプシンナンバリングによって付番され；非改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号１～６（野生型ヒト全長ｕ－ＰＡ、野生型プロテアーゼ（触媒）ドメインｕ－ＰＡ、野生型成熟ｕ－ＰＡ、Ｃ１２２Ｓに相当する置換を有する全長ｕ－ＰＡ、Ｃ１２２Ｓに相当する置換を有するプロテアーゼドメインｕ－ＰＡ、およびＣ１２２Ｓに相当する置換を有する成熟ｕ－ＰＡ）のいずれかに示される配列、およびその、アミノ酸置換を含む触媒活性断片を含む。保存的改変は、Ｒ３５Ｙ、Ｗ、Ｆ、またはＮ；Ｈ３７Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｗ、またはＦ、Ｖ４１Ｋ、Ｄ６０ａＳ、Ｔ９７ａＤ、Ｌ、またはＶ、Ｌ９７ｂＧまたはＳ、およびＨ９９Ｎ（キモトリプシンナンバリングによる）から選択される。
特に、これらの改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ（ｕＰＡ）ポリペプチドには、Ｒ３５Ｑ、Ｈ３７Ｙ、Ｖ４１Ｒ、Ｖ４１Ｌ、Ｙ４０Ｑ、Ｄ６０ａＰ、Ｌ９７ｂＡ、Ｔ９７ａＩ、およびＨ９９Ｑに相当する置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含有するものがある。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲン内の基質配列の切断に対する低減した活性および／または特異性を有する。ポリペプチドが増大した特異性／活性を有する補体タンパク質はＣ３であり、切断がＣ３を不活性化する。切断部位の例は、Ｃ３の活性部位内にある。改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、配列番号５の非改変ｕ－ＰＡポリペプチド（Ｃ１２２Ｓ置換を有するプロテアーゼドメイン）よりも最低３倍大きい、Ｃ３の切断に対して増大した活性を有するものがある。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、置換Ｈ３７Ｙ、例えば置換Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅを含有するものが挙げられる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、置換Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７ＫまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｋを含有するもの、例えば、置換Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８ＥまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅを含有するものが挙げられる。
また、提供されるのは、先に記載されるものが挙げられる、置換Ｌ９７ｂＡおよび／またはＲ３５Ｑおよび／またはＨ９９Ｑおよび／またはＤ６０ａＰおよび／またはＴ９７ａＩを含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドである。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドはさらに、Ｔ３９Ｙ、Ｔ３９Ｗ、Ｔ３９Ｆ、例えばＴ３９Ｙに相当するアミノ酸置換、またはＴ３９ＭもしくはＴ３９Ｌから選択される保存的置換を含んでもよい。改変ｕ－ＰＡポリペプチドの他のものは、アミノ酸置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙおよび／またはＶ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ１４９Ｒを含むか、またはさらに含む。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドの他のものとして、改変Ｖ４１Ｒを含むもの、例えば、改変Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒを含む改変ｕ－ＰＡポリペプチドがあり、位置Ｒ３５、Ｈ３７、およびＶ３８の１つまたは複数での置換をさらに含むものが挙げられる。これらとして、Ｖ３８での置換がＥである改変ｕ－ＰＡポリペプチドが挙げられ、例えば、Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒ、Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ、ならびに、例えば体液内での、Ｃ３の切断および／または安定性に寄与する残基の他の組合せを含む改変ｕ－ＰＡポリペプチドである。
本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ３の不活性化切断についてのＥＤ５０が、インビトロアッセイにおいて、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、または２５ｎＭ以下である。これらの例として、表１４に示される、ＥＤ５０が１００ｎＭ以下であるものがあり、または表１４に示される、ＥＤ５０が５０ｎＭ未満のものがあり、または表１４に示される、ＥＤ５０が３０ｎＭ未満のものがあり、または表１４に示される、ＥＤ５０が２５ｎＭ未満のものがある。ＥＤ５０を評価するアッセイの例として、ＥＤ５０を求めるための、基質補体タンパク質ヒトＣ３の、種々の濃度の各改変プロテアーゼとの３７℃にて１時間のインキュベーションを含むものがある。特に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、５０ｎＭ以下のＥＤ５０でＣ３を切断するあらゆるものである。
非改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号１～６のいずれかに示されるアミノ酸の配列からなってもよいし、追加の挿入および欠失が挙げられる追加の改変を含んでもよい。本明細書中の置換、挿入、または欠失のいずれかが、非改変ｕ－ＰＡポリペプチド、例えばプロテアーゼドメイン、特に配列番号５のプロテアーゼドメイン内に含まれ得る。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号１～６またはその触媒活性部分のいずれかのポリペプチドに対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号１～６のいずれかの非改変ｕ－ＰＡポリペプチド、またはその触媒活性部分と比較して、１つ、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、もしくは１７個のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含有し得る。
それゆえに、提供されるのは、改変Ｖ４１Ｒ、もしくはＨ３７Ｙ、もしくはＬ９７ｂＡ、もしくはＲ３５Ｑ、もしくはＨ９９Ｑ、もしくはＤ６０ａＰ、もしくはＴ９７ａＩ、またはそれらの組合せを含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドである。改変ｕ－ＰＡポリペプチドはいずれもさらに、Ｔ３９Ｙ、Ｔ３９Ｗ、Ｔ３９Ｆに相当するアミノ酸置換、またはそれらの、Ｔ３９ＭもしくはＴ３９Ｌから選択される保存的置換を含有してもよい。特に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドはさらに、アミノ酸置換Ｔ３９Ｙ、例えば組合せＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ、および最大１２または１３個の追加の改変を含有してもよく、Ｃ１２２Ｓを含有してもよい。改変ｕ－ＰＡポリペプチドはいずれもさらに、アミノ酸置換Ｖ３８Ｅを含有してもよく、アミノ酸改変Ｒ３５Ｑ、Ｙ６０ｂＱ、および／またはＹ１４９Ｒの１つまたは複数をさらに含有してもよい。改変ｕ－ＰＡポリペプチドはいずれもさらに、アミノ酸改変Ｒ３７ａＥまたはＲ３７ａＳを含有してもよい。それゆえに、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１ＲまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｃ１２２Ｓを含有してもよい。改変ｕ－ＰＡポリペプチドはいずれも、Ｈ９９Ｑに相当する置換を含有してもよい。
本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、アミノ酸改変Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ、またはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９ＱまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓを含有するものがある。また、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡまたはＲ３７ａＳ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９ＱまたはＲ３７ａＳ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓに相当するアミノ酸改変を含有するものがある。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドに含まれるのは、改変：
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒまたは
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒ
を含有するものである。
提供されるのは、アミノ酸改変を含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドであり、改変：
Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓまたは
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＡ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ｌ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ｍ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ａ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｔ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ
または
Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒまたは
Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒまたは
Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＬ／Ｄ９７Ｔ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＧ／Ａ９８Ｓ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓまたは
Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｋ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ａまたは
Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｖ／Ｒ３７ａＷ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｔまたは
Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｋ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｔまたは
Ｃ１２２にて置換のない各々を有するポリペプチドが含まれる。これらの改変ｕ－ＰＡポリペプチドの例として、改変Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒを含有するものがある。
これらのポリペプチドの例として、配列番号８～４４および９８７、例えば２１および３９～４４のいずれかに配列が示されるもの、ならびに配列番号８～４４に配列が示されるポリペプチド、およびそれらの触媒活性部分を含有する前駆体および全長改変ｕ－ＰＡポリペプチドがある。また、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれにおいても、キモトリプシンナンバリングによる残基１２２のＣｙｓは、Ｓｅｒで置換されていてもよいし、Ｃｙｓのままであってもよいことが理解される。Ｃｙｓは、遊離Ｃ１２２が、ポリペプチド内の別の遊離Ｃｙｓとジスルフィド結合を形成するか、またはＣｙｓが、例えばペグ化によって改変される、二本鎖形態として、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含有する、融合タンパク質が挙げられるポリペプチドが用いられることが意図される実施形態について、保持される。本明細書中で記載される全ての実施形態において、位置１２２は、ＣｙｓであってもＳｅｒであってもよい。当業者であれば、意図される用途次第で、適切な残基を選択することができる。
非改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号１～６のいずれかのプロテアーゼドメイン、またはその触媒活性部分を含み、配列番号２または配列番号５のプロテアーゼドメインのみを含むか、または含有する。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、翻訳後改変、グリコシル化部位を導入または除去する改変、ポリマー、例えばＰＥＧへの、血清半減期を延長し、かつ／または免疫原性を低減するような結合またはコンジュゲーション等の改変が挙げられる、追加の改変を含有してもよい。特に、本明細書中に記載され、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれか、全てが、ペグ化されていてもよい。本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する融合タンパク質、例えば、Ｆｃドメインとの融合、または標的細胞もしくは標的抗原に特異的な標的化剤も提供される。
本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質として、安定性が、ＰＢＳ中での、または体液、例えば水様液もしくは血清中での７日間のインキュベーションの後に５０％または８０％を超えるものがある。また、改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、活性形態である場合、非改変ｕ－ＰＡポリペプチドの対応する形態と比較して、プラスミンに対する活性が１００分の１以下に低下しているものがある。
また、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質として、Ｃ３の不活性化切断についてのＥＤ５０が、インビトロアッセイにおいて、１００ｎＭ以下、または５０ｎＭ以下、または３０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下、または１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、例えば、本明細書中の実施例において例示されるいずれかであるものがある。これらとして、多数の突然変異ストリングを記載し、改変ｕ－ＰＡポリペプチドプロテアーゼドメインについてのＥＤ５０が、実施例２に記載されるように評価されたＥＤ５０を示す表１４に示されるプロテアーゼドメインを含有するか、またはこれであるポリペプチドが挙げられる。１００ｎＭ以下、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満のＥＤ５０を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合ポリペプチドには、プロテアーゼドメインとして、またはより長いｕ－ＰＡ形態に、かつ／もしくは本明細書中に記載される融合タンパク質に用いることができるものがある。
提供されるのは、コンジュゲートタンパク質であり、非プロテアーゼポリペプチドまたはその部分に融合した改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または当該改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれかの触媒活性部分を含有する融合タンパク質が挙げられる。非プロテアーゼポリペプチド、例えば、多量体化ドメイン、例えばＦｃドメイン、血清安定性を増大させるポリペプチド、例えばアルブミン、またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含むものが提供される。
先で考察したように、改変は全て、配列が配列番号１～６のいずれかに示される非改変ポリペプチド、およびその触媒活性部分にあり得る。ポリペプチドに含まれるものとして、非改変ポリペプチドが、配列番号５に示される配列を有するもの（Ｃ１２２Ｓ置換を有するプロテアーゼドメイン）がある。
本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチド、および追加のポリペプチド、例えば血清アルブミン、多量体化ドメイン、シグナル配列、ならびに発現および単離を促進するための他の輸送配列およびタグを含有する融合タンパク質も提供される。また、融合タンパク質は、ｕ－ＰＡ部分を活性化するための活性化配列を含み得る。融合タンパク質の活性形態は、発現、ならびに、シグナル配列、およびＣ３を切断する活性融合タンパク質を生じさせるための他のあらゆるプロセシングシグナルおよび輸送シグナルの除去により、生成される。融合タンパク質の活性形態として、二本鎖活性化形態、さらには二量体、例えば多量体化ドメインの包含に由来するものが挙げられる。
融合タンパク質として、改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または改変ｕ－ＰＡポリペプチドの触媒活性部分を含有するもの、例えば、表１４における、非プロテアーゼポリペプチドまたはその部分に融合したものがある。また、融合タンパク質は、活性化配列、ならびに、プロセシングの前に、シグナル配列および他の輸送シグナルを含んでもよい。非プロテアーゼポリペプチドとして、以下に限定されないが、所望の医薬的活性または医薬的性質を付与する、当業者に知られているあらゆるもの、多量体化ドメイン、例えばＦｃ、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ヒアルロン酸結合ドメイン（ＨＡＢＤ）、特定の抗原を標的化する抗体が挙げられる。また、融合タンパク質は、活性化配列、例えば天然のｕ－ＰＡ活性化配列またはフューリン活性化配列を含んでもよい。フューリン活性化配列の例として、ＱＳＧＱＫＴＬＲＲＲＫＲ（配列番号９９６）もしくはＱＣＧＱＫＴＬＲＲＲＫＲ（配列番号９９５）もしくはＱＳＧＱＫＴＬＲＲＫＲ（配列番号１０４４）、またはこれらと少なくとも９８％の配列同一性を有するフューリン活性化部位であるか、またはこれらを含むものがある。
例えば、本明細書中に記載されるか、または本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質はまた、プロセシングまたは活性化の前に、シグナル配列、および改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む。融合タンパク質の分泌をコードするシグナル配列の例として、Ｉｌ－２、ｕ－ＰＡ、またはＩｇＧκ由来のシグナル配列が挙げられる。
融合タンパク質は、融合パートナー、例えば多量体化ドメイン、または血清半減期を延長させるポリペプチド、または別の所望の薬理学的性質もしくは薬理学的活性を付与するものを含んでもよい。これらの例として、アルブミン、またはＦｃドメイン、または単鎖抗体もしくは抗体の他の抗原結合断片、またはヒアルロン酸結合ドメイン（ＨＡＢＤ）がある。例示的な融合パートナーとして、以下に限定されないが、腫瘍壊死因子刺激遺伝子－６（ＴＳＧ－６）；ＨＳＡ、ＩｇＧ Ｆｃ、抗体またはその抗原結合断片、例えば、抗ＩＩ型コラーゲン抗体ｓｃＦｖ断片、または抗ＶＥＧＦＲ抗体もしくはその断片が挙げられる。
また、融合タンパク質は、ｕ－ＰＡを含有する、結果として生じる融合タンパク質が、活性形態、例えば二本鎖形態であるように、活性化配列を含んでもよい。活性化配列は、システインを含有してもよいし、システインを含有するように改変されていてもよく、当該システインは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドにおいて、遊離Ｃｙｓ、例えばＣ１２２とジスルフィド結合を形成することによって、活性化すると、結果として生じる活性化ポリペプチドは、２本の鎖を含むことができる。例示的な活性化配列は、ｕ－ＰＡ活性化配列およびフューリン活性化配列、ならびにそれらの改変形態、例えば、配列番号９９５～９９８、１０４１、および１０４４のいずれかに示される配列を有する活性化配列、またはこれと少なくとも９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列である。
例示的な融合タンパク質は、活性化配列、改変ｕ－ＰＡポリペプチド、およびＨＳＡを含有するあらゆるもの、例えば、配列番号１０１４、１０１５、１０１６、１０１９、および１０４０のいずれかに示されるアミノ酸の配列、またはその、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する（ｕ－ＰＡ部分の配列内に改変を含有する）改変形態を含むものである。処置の方法に用いるために、融合タンパク質は通常、シグナル配列を含有しない。遺伝子治療法に用いるために、核酸は、シグナル配列をコードしてもよい。
提供されるのは、そのような融合タンパク質、例えば配列番号１００４～１０１９および１０３４～１０４０のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有するもの、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する（ｕ－ＰＡ部分の配列内に改変を含有する）あらゆるものである。融合タンパク質の例として、配列番号１０１５または１０１９に示されるアミノ酸の配列を有するものがある。特に、シグナル配列は、使用前に、またはインビボで発現すると、またはインビトロで生成される場合に、除去される。これらとして、Ａ鎖およびＢ鎖を含有する二本鎖活性化形態であるものが挙げられる。例えば、Ｂ鎖が、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの残基ＩＩＧＧから始まって、融合タンパク質のＣ末端にて終わる融合タンパク質、例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよびＨＳＡを含有するもの、配列番号１００５、１０１１、１０１４、１０１５、および１０３６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有するが、シグナル配列を欠いているもの。活性化形態の融合タンパク質の例として、残基２１～１７８のＡ鎖、および残基１７９からタンパク質のＣ末端までのＢ鎖を含有し、残基１６８～２９９間にジスルフィド結合を有する融合タンパク質がある。また、これらとして、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する（ｕ－ＰＡ部分の配列内に改変を含有する）融合タンパク質が挙げられることが理解される。例えば、提供されるのは、Ａ鎖およびＢ鎖を含有する融合タンパク質であり、Ａ鎖は、配列番号１０１５の残基２１～１７８からなり、Ｂ鎖は、残基１７９～１０２２からなり；Ａ鎖およびＢ鎖は、配列番号１０１５のＣ１６８とＣ２９９との間で、ジスルフィド架橋を介して連結している。
本明細書中で提供される他の融合タンパク質は、プロセシングすると、Ｆｃドメイン等の相補的多量体化ドメインの相互作用を介して形成される二量体等の多量体を形成するように、多量体化ドメインを含有する。
また、提供されるのは、キットとしてパッケージングすることができる、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する第１の組成物（全ての実施形態において、融合タンパク質、特に、活性化形態のもの、またはそれらの複数が挙げられる）、および補体媒介疾患または障害を処置するための１種または複数の第２の薬剤を含有する第２の組成物を含有する組合せである。１種または複数の第２の薬剤は、例えば、抗炎症剤であっても抗凝固剤であってもよい。そのような薬剤の例として、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、代謝拮抗薬、副腎皮質ステロイド、鎮痛薬、細胞傷害剤、炎症誘発性サイトカイン阻害剤、抗炎症サイトカイン、Ｂ細胞標的化剤、Ｔ抗原標的化化合物、接着分子遮断薬、ケモカイン受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ－γ（ガンマ）リガンド、補体阻害剤、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、シトラート、オキサラート、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランのいずれか１つまたは複数から選択される抗炎症剤がある。
提供されるのは、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質のいずれかをコードする核酸分子である。また、提供されるのは、そのような核酸分子を含有し、改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードするベクターである。ベクターとして、原核生物ベクターおよび真核生物ベクターが挙げられ、哺乳動物ベクターおよび昆虫ベクター、例えば、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ならびにウイルスベクター、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、遺伝子治療のための、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの産生用の発現ベクター、ならびに／またはアデノウイルスおよびＡＡＶウイルス等のベクター、特に、目的の組織、例えば肝臓または眼に指向性があるものであってもよい。
提供されるのは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクターまたは核酸を含有する細胞を、ベクターが発現される条件下で増殖させ、適宜、発現された改変ｕ－ＰＡポリペプチドを単離または回収することによって、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを生成する方法である。
また、提供されるのは、核酸分子またはベクターを含有する単離された細胞および細胞培養体である。細胞は、非ヒト細胞であってもヒト細胞培養体であってもよいが、ヒトに発達するいかなる接合子も細胞も含まない。細胞として、哺乳動物細胞および細菌細胞が挙げられ、以下に限定されないが、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０、ＢＨＫ、昆虫細胞、酵母細胞、および、ポリペプチドの組換え発現にルーチン的に用いられる他の細胞が挙げられる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドを生成する方法は、コードされる改変ｕ－ＰＡポリペプチドが発現される条件下で細胞を増殖させることと、適宜、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを単離または精製することとを含む。通常、改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよびそのコンジュゲート、例えば融合タンパク質は、タンパク質をグリコシル化する細胞内で産生される。単離された改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えばペグ化によって、さらに改変されてもよい。
また、提供されるのは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質および／または核酸および／またはベクターを含有する医薬組成物である。提供されるのは、補体活性化を阻害することによって、補体活性化によって媒介される、または疾患もしくは障害の病因もしくは基礎をなす病因において補体活性化が役割を果たす疾患または障害を処置するための、医薬組成物、核酸、または改変ｕ－ＰＡポリペプチドの使用である。特に、提供されるのは、補体活性化によって媒介されるか、または補体活性化が関与するような疾患、障害、および状態を処置するための遺伝子治療用の核酸分子および／またはベクターの使用であり、補体活性化の阻害は、疾患または状態の処置または寛解をもたらす。また、提供されるのは、ベクターを投与するか、または核酸分子を投与することによって、補体活性化によって媒介されるか、または補体活性化が関与する疾患または状態を処置する方法である。特に、疾患、障害、および状態は、補体活性化を阻害するか、または低減するＣ３の不活性化が処置をもたらすものである。
補体媒介疾患、補体媒介障害、もしくは補体媒介状態、または病因もしくは基礎をなす病因において補体活性化が役割を果たす疾患、障害、および状態として、以下に限定されないが、あらゆる炎症性障害、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、眼疾患または眼科疾患、心血管障害、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、虚血再灌流傷害、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、および移植臓器拒絶、特に遅発性の移植臓器拒絶が挙げられる。特定の疾患および障害として、眼疾患または眼科疾患、例えば黄斑変性もしくは糖尿病性網膜症、または移植臓器に起因する炎症が挙げられる。疾患、障害、および状態に含まれるのは、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）である。
補体活性化を阻害する方法が提供される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドを補体タンパク質Ｃ３と接触させることで、補体活性化が低減されるか、または阻害されるように補体タンパク質Ｃ３を切断することによって、当該方法は実施される。接触させることは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを、補体の不活性化または低減が所望される対象に投与することによって、インビトロで実施されてもよいが、通常インビボである。投与は、全身性であってよく、例えば非経口投与であり、例えば、静脈内投与、または、罹患組織、例えば眼を接触させることによる局所的投与が挙げられる。眼への投与として、目薬によるもの、改変ｕ－ＰＡポリペプチドをタンパク質形質導入ドメインに連結することによるもの、あるいは硝子体内注射、網膜内注射、もしくは網膜下注射、またはその他のそのような方法によるものが挙げられる。疾患および状態、例えばＤＧＦのための投与は、静脈内投与によって実施することができる。他の方法として、皮下投与および経皮投与が挙げられる。
方法および使用として、補体活性化の阻害が、炎症性障害、神経変性障害、眼科障害、および心血管障害から選択される補体媒介疾患または補体媒介障害と関連する炎症性症状の軽減をもたらす、あらゆる疾患、障害、または状態の処置が挙げられる。これらとして、以下に限定されないが、炎症性の疾患、状態、および障害、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、眼障害、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、眼科障害、例えばＡＭＤ、および糖尿病患者網膜症、ならびに虚血再灌流傷害が挙げられる。虚血再灌流傷害は、心筋梗塞症（ＭＩ）、卒中、血管形成術、冠状動脈バイパス移植、心肺バイパス（ＣＰＢ）、および血液透析から選択される事象もしくは処置、または対象の処置を包含し得、またはこれによって引き起こされ得る。改変ｕ－ＰＡポリペプチドによる処置は、対象の処置前に実施される。処置として、臓器移植が挙げられる。疾患、障害、または状態として、眼科の状態が挙げられ、または眼疾患であり、または移植臓器に起因する拒絶もしくは炎症、例えば糖尿病性網膜症もしくは黄斑変性である。特に、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の処置の方法が提供され、移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）の処置の方法と同じである。処置は、静脈内に、または皮下に、または局所的に、例えば眼中への改変ｕ－ＰＡポリペプチドの注射によって、実施することができる。含まれるのは、硝子液中への、形質導入を促進するための、硝子体内注射、網膜内注射、もしくは網膜下注射、またはタンパク質形質導入ドメインへの改変ｕ－ＰＡポリペプチドの連結である。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、特定の臓器もしくは組織に向けたポリペプチドの標的化を実施する部分、または血清半減期を延長させるか、もしくは免疫原性を低減する部分に連結もしくはコンジュゲートすることができ、例えば、Ｆｃドメインへの、または抗体もしくはその抗原結合部分へのペグ化および／または結合がある。
それゆえに、提供されるのは、補体媒介障害もしくは補体媒介状態、または補体活性化が役割を果たす障害もしくは状態の対象を、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを投与することによって処置する方法である。また、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質のそのような使用が提供される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質は、処置をもたらすか、またはそのような処置に用いることができる。なぜなら、補体タンパク質Ｃ３を切断することによって、補体活性化を阻害するか、または低減するからである。補体活性化の阻害は、炎症反応を包含する補体媒介障害、補体媒介疾患、または補体媒介状態と関連する炎症性症状の軽減をもたらし、炎症性障害、神経変性障害、および心血管障害から選択される、補体媒介疾患、補体媒介状態、または補体媒介障害と関連する炎症性症状の軽減をもたらす。これらとして、眼科状態、例えば糖尿病性網膜症および黄斑変性、さらには遅発性の器官拒絶、例えばＤＧＦが挙げられる。
使用および方法についての投薬量、ならびに単回投薬量の製剤形態が、本明細書中で提供される。単回投薬量は、熟練した医師が実験に基づいて決定することができ、例えば、局所投与について０．１ｍｇから１ｍｇの範囲に、全身投与、例えば静脈内投与について０．１ｍｇ～１０、１５、２０、３０ｍｇ、またはそれ以上にある単回投薬量が挙げられる。特定の投薬量は、特定の障害または疾患または状態、処置される対象、疾患、障害、または状態の病期、投与経路、レジメン、および他のそのようなパラメータによって決まる。投薬量は、毎日、２日毎に、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、もしくは７日毎に、少なくとも隔週で、少なくとも２週毎に、３週毎に、４週毎に、またはより長い間隔で繰り返すことができる。特定のレジメンおよび投薬量は、例えば、処置される障害、投与モード、および対象の詳細、例えば体重によって決まる。その決定は、熟練した医師の技術の範囲内である。
また、提供されるのは、方法、使用、および組合せ、ならびに改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび融合タンパク質であり、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、改変Ｖ４１ＲまたはＶ４１Ｌ、特にＶ４１Ｒ、例えばＶ４１Ｉ、またはＲおよびＶ３８Ｅ、ならびにＨ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅを含有するものを含む。そのような改変ｕ－ＰＡポリペプチドの例は、改変Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ＢＡ、またはＲ３７ａＳ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ、またはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒを含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドである。改変は、配列番号１～６のいずれかに示されるもの、およびその、Ｖ４１に相当する残基を含む触媒活性部分が挙げられる、あらゆる非改変ｕ－ＰＡポリペプチド内にある。そのような改変ｕ－ＰＡポリペプチドの例は、配列番号２１または９８７に、または配列番号４０～４４、改変がキモトリプシンナンバリングによるＣ１２２にない配列番号４０～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列を含む改変ｕ－ＰＡポリペプチド、およびその触媒活性部分、およびその改変形態、例えばペグ化形態、ならびにそれらの融合タンパク質および改変形態である。
配列番号２１および４０～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列を含む改変ｕ－ＰＡポリペプチド、ならびにその改変形態、例えばペグ化形態を含む、本明細書中に記載され提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質（活性化形態である）を静脈内に投与することによって、障害、例えばＤＧＦを処置する方法も提供される。単回投薬量は、熟練した医師が実験に基づいて決定することができ、０．１ｍｇ～１ｍｇの範囲にある単回投薬量が挙げられる。投薬量は、対象、疾患または障害、例えばＤＧＦの重症度または病期によって決まる。処置は複数回、例えば、１日２、３、または４回繰り返され、１日１回、毎日、２日毎に、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、毎週、月に２回、または毎月繰り返される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、置換／挿入（キモトリプシンナンバリングによる、Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；および成熟ナンバリング（ｍａｔｕｒｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）による、Ｒ２０Ｑ／Ｈ２２Ｙ／Ｒ２３Ｅ／Ｖ２７Ｅ／Ｔ２８Ｙ／Ｖ３０Ｒ／Ｄ５０Ｐ／Ｙ５１Ｑ／Ｔ９１Ｉ／Ｌ９２Ａ／Ｈ９４Ｑ／Ｃ１２１Ｓ／Ｙ１４８Ｒ）を含むものであり得る。その例は、配列番号２１に示されるプロテアーゼドメインを含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチド、またはその触媒活性部分、またはプロテアーゼドメインを含有する全長または前駆体形態、およびその改変形態、例えばペグ化形態および融合タンパク質である。投与は、適切なあらゆる方法によって実施することができ、静脈内、皮下、経皮、局所、筋肉内、経口、および他の全身投与経路が挙げられる。通常、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドの投与形態は、活性化形態であり、これは、通常、タンパク質の要素に応じて（例えば実施例１５を参照）、二本鎖形態である。
以上および以下に記載される、本明細書中に記載される方法として、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチド、およびその改変形態のいずれか、例えばペグ化形態および融合タンパク質、例えばタンパク質形質導入ドメインを含有するものを眼に投与することによって、眼科障害または眼障害を処置する方法が挙げられる。補体活性化が関与する眼科障害、疾患、または状態として、糖尿病性網膜症および黄斑変性、例えばＡＭＤが挙げられる。投薬量は、先に記載される通りであり、０．１ｍｇ～１ｍｇの単回投薬量が挙げられる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９ＲまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒ、Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡを含有するもの、ならびに配列番号２１および４０～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列、およびその触媒活性部分を含有するもの、ならびにそれらの改変形態が挙げられる。処置は、複数回、例えば１日１回、繰り返すことができる。ＡＭＤまたはＤＧＦを処置するための改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよびその改変形態の使用が提供される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドとして、本明細書中に記載されるあらゆるものが挙げられ得、置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９ＲまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９ＲまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡを含有するもの、およびその、ペグ化されている、または本明細書中に記載される融合タンパク質である改変形態が挙げられる。
図１は、古典補体経路、レクチン補体経路、および副補体経路および終末補体複合体である膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の活性化の概要を表す。図は、補体カスケードに関与する３０個を超えるタンパク質の多く、カスケード内のそれらの作用、および適用可能である場合には、補体経路間でのそれらの収束点を表す。例えば、Ｃ３転換酵素の生成時に、３つの経路が収束しており、Ｃ３転換酵素は、Ｃ３を切断し、Ｃ５転換酵素を形成して、ＭＡＣ複合体の形成をもたらす。図はまた、補体切断産物の多くの生成を表す。 図２Ａ～図２Ｂは、Ｎ末端ｕ－ＰＡ融合タンパク質の概略図である。図２Ａは、ｕ－ＰＡ触媒ドメインのＮ末端にある融合パートナー（即ち、Ｆｃ）を含有するＮ末端ｕ－ＰＡ融合タンパク質の概略図である。例示的なＮ末端融合タンパク質は、配列番号１００４に示されており、それは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）シグナル配列、Ｆｃ（融合パートナー）、ＡＧＳ（リンカー）、ｕ－ＰＡ活性化配列、および改変ｕ－ＰＡ触媒ドメインを含有する。図２Ｂは、融合パートナーを含有しないＮ末端野生型タンパク質の概略図である。例示的なＮ末端野生型タンパク質は、配列番号１００５に示されており、それは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）シグナル配列、ｕ－ＰＡのＮ末端、ｕ－ＰＡ活性化配列、および改変ｕ－ＰＡ触媒ドメインを含有する。 図３Ａ～図３Ｃは、Ｃ末端ｕ－ＰＡ融合タンパク質の概略図である。図３Ａは、融合タンパク質が、ｕ－ＰＡ触媒ドメインのＮ末端にある活性化配列を欠いているｕ－ＰＡ触媒ドメインに対してＣ末端にある融合パートナーを含有するＣ末端ｕ－ＰＡ融合タンパク質の概略図である。例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１００６に示されており、それは、ヒトＩＬ２シグナル配列（ｈＩＬ２ＳＰ）、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＦｃ（融合パートナー）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１００７に示されており、それは、ヒトＩＬ２シグナル配列（ｈＩＬ２ＳＰ）、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＨＳＡ（融合パートナーとしてのヒト血清アルブミン）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１００８に示されており、それは、ヒトＩＬ２シグナル配列（ｈＩＬ２ＳＰ）、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびコラーゲンＩＩを結合するｓｃＦＶ（Ｃ２ｓｃＦｖ）（融合パートナー）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１００９に示されており、それは、ヒトＩＬ２シグナル配列（ｈＩＬ２ＳＰ）、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＨＡＢＤ（ヒアルロン酸結合ドメイン）（融合パートナー）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１０１２に示されており、それは、ヒトＩＬ２シグナ配列（ｈＩＬ２ＳＰ）、野生型ｕ－ｐＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＦｃ（融合パートナー）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１０１３に示され、それは、ヒトＩＬ２シグナル配列（ｈＩＬ２ＳＰ）、野生型ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＨＳＡ（融合パートナー）を含有する。図３Ｂは、ｕ－ＰＡ触媒ドメインに対してＣ末端にある融合パートナー（即ち、ＦｃまたはＨＳＡ）を含有するＣ末端ｕ－ＰＡ融合タンパク質の概略図である。例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１０１０に示されており、それは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）シグナル配列、フューリン活性化部位、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＦｃ（融合パートナー）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１０１６に示されており、それは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）シグナル配列、フューリン活性化配列、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＨＳＡ（融合パートナー）を含有する。図３Ｃは、ｕ－ＰＡ触媒ドメインに対してＣ末端にある融合パートナー（即ち、ＦｃまたはＨＳＡ）およびｕ－ＰＡ触媒ドメインのＮ末端にある融合パートナー（即ち、ｕ－ＰＡの野生型Ｎ末端）を含有するｕ－ＰＡ融合タンパク質の概略図である。例示的な融合タンパク質は、配列番号１０１１に示されており、それは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）シグナル配列、ｕ－ＰＡ Ｎ末端ドメイン、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＦｃ（融合パートナー）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１０１４に示されており、それは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）シグナル配列、ｕ－ＰＡのＮ末端領域、フューリン活性化部位、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＨＳＡ（融合パートナー）を含有する。別の例示的なＣ末端融合タンパク質は、配列番号１０１５に示されており、それは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）シグナル配列、ｕ－ＰＡのＮ末端領域、ｕ－ＰＡ活性化配列、改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン、リンカー、およびＨＳＡ（融合パートナー）を含有する。 図４Ａ～図４Ｈは、融合タンパク質の活性化形態の概略図であり、ここで、ＳＰＤは、セリンプロテアーゼドメイン（本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドプロテアーゼドメイン）を指し、ｕ－ＰＡ Ｎ末端は一般的に、ｕ－ＰＡの残基１～１７８またはそれらの任意の改変形態を指す。図４Ａは、配列番号１０１０の融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）のＣ末端にあるＦｃドメインおよびフューリン活性化配列を含有し、二量体を形成するためにＦｃドメイン間のジスルフィド結合が二量体を形成する。図４Ｂは、配列番号１０１１の融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）のＣ末端にあるＦｃドメイン、およびｕ－ＰＡのＮ末端およびタンパク質のＮ末端にあるｕ－ＰＡ活性化配列を含有し、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合が二量体を形成する。図４Ｃは、配列番号１０３６に示される融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）のＣ末端にあるＦｃドメイン、およびｕ－ＰＡのＮ末端および融合タンパク質のＮ末端にあるフューリン活性化配列を含有し、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合が二量体を形成する。図４Ｄは、配列番号１０１４に示される融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）のＣ末端にあるＨＳＡ、およびｕ－ＰＡのＮ末端および融合タンパク質のＮ末端にあるフューリン活性化配列を含有する。図４Ｅは、配列番号１０１５に示される融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）のＣ末端にあるＨＳＡ、およびｕ－ＰＡのＮ末端および融合タンパク質のＮ末端にあるｕ－ＰＡ活性化配列を含有する。図４Ｆは、配列番号１０１６に示される融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）のＣ末端にあるＨＳＡおよびプロテアーゼドメインのＮ末端にあるフューリン活性化配列を含有する。図４Ｆは、配列番号１０１７に示される融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）のＣ末端にあるＨＳＡおよびプロテアーゼドメインのＮ末端にあるＳＵＭＯ活性化配列を含有する。図４Ｈは、配列番号１０１８に示される融合タンパク質の概略図であり、それは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）のＣ末端にあるＦｃドメインおよびｕ－ＰＡのＮ末端およびプロテアーゼドメインのＮ末端にあるＳＵＭＯ活性化配列を含有し、Ｆｃドメイン間のジスルフィド結合が二量体を形成する。
概略
Ａ．定義
Ｂ．ｕ－ＰＡの構造および機能
１．セリンプロテアーゼ
２．構造
３．機能／活性
Ｃ．Ｃ３を標的化することによる補体阻害
１．補体タンパク質Ｃ３、およびその、補体の開始における役割
ａ．古典経路
ｂ．副経路
ｃ．レクチン経路
ｄ．補体媒介エフェクタ機能
ｉ．補体媒介溶解：膜攻撃複合体
ｉｉ．炎症
ｉｉｉ．走化性
ｉｖ．オプソニン作用
ｖ．体液性免疫応答の活性化
２．Ｃ３の構造および機能
ａ．Ｃ３ａ
ｂ．Ｃ３ｂ
ｃ．Ｃ３ｂの阻害剤
Ｄ．Ｃ３を切断する改変ｕ－ＰＡポリペプチド
１．例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチド
２．さらなる改変
ａ．低下した免疫原性
ｂ．Ｆｃドメイン
ｃ．ポリマーへのコンジュゲーション
ｄ．タンパク質形質導入ドメイン
Ｅ．補体媒介性機能に関して、ｕ－ＰＡ活性を評価またはモニタリングするためのアッセイ
１．補体タンパク質Ｃ３の機能に関して、ｕ－ＰＡ活性を評価する方法
ａ．タンパク質検出
ｉ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ｉｉ．酵素イムノアッセイ
ｉｉｉ．放射免疫拡散（ＲＩＤ）
ｂ．溶血性アッセイ
ｃ．切断部位を決定する方法
２．野生型ｕ－ＰＡ活性を評価する方法
ａ．プラスミノゲンの切断
ｂ．プラスミノゲン活性化アッセイ
ｃ．ｕ－ＰＡ－ｕＰＡＲ結合アッセイ
ｄ．Ｃ３切断
ＡＣＣ－ＡＧＲ＋ＥＬＩＳＡ
ペプチドライブラリーを使用した特異性の評価
３．特異性
４．疾患モデル
Ｆ．その改変Ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を産生する方法
１．ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
２．変異体または改変核酸およびコードポリペプチドの生成
３．ベクターおよび細胞
４．発現
ａ．原核生物の細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．昆虫および昆虫細胞
ｄ．哺乳類発現
ｅ．植物
５．精製
６．追加の改変
ａ．ＰＥＧ化
ｂ．融合タンパク質および他のコンジュゲート
７．核酸分子
Ｇ．組成物、製剤および投与
１．改変ｕ－ＰＡポリペプチドの投与
２．改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子療法）
Ｈ．治療上の使用および処置方法
１．補体活性化により介在される疾患
ａ．関節リウマチ
ｂ．敗血症
ｃ．多発性硬化症
ｄ．アルツハイマー疾患
ｅ．虚血性再灌流損傷
ｆ．眼の障害
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）
ｇ．臓器移植および臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）
２．治療上の使用
ａ．免疫媒介性炎症疾患
ｂ．神経変性疾患
ｃ．心血管疾患
ｄ．加齢黄斑変性（ＡＭＤ）
ｅ．臓器移植
臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）
３．併用療法
Ｉ．実施例
Ａ．定義
別途定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中の開示全体を通して参照される全ての特許、特許出願、特許公報、および刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイト、ならびに他の公開材料は、特に明記しない限り、その全体が参照によって組み込まれる。本明細書中の用語について複数の定義がある場合には、当該セクションのものを優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスが参照される場合、そのような識別子が変更していて、インターネットに関する特定の情報が定まらない場合があるが、例えばインターネットおよび／または適切なデータベースを検索することによって、等しい情報を知って、容易にアクセスすることができると理解される。その参照は、そのような情報の可用性および一般的周知性を明示する。
本明細書中で用いられる切断は、プロテアーゼによるペプチド結合の切断を指す。プロテアーゼの切断部位モチーフは、切れやすい結合に対してＮ末端残基およびＣ末端残基（プライミングされない側およびプライミングされる側は、プロテアーゼの切断部位をそれぞれ有し、…Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｐ１’－Ｐ２’－Ｐ３’…として定義され、切断が、Ｐ１残基とＰ１’残基との間で生じる）を包含する。ヒトＣ３において、Ｃ３転換酵素による切断は、Ｃ３の残基ＲとＳとの間で起こる［配列番号４７の残基７４６～７５１を参照（ヒトＣ３において、残基７４８と７４９間で切断）］：
Ｐ３ Ｐ２ Ｐ１ Ｐ１’ Ｐ２’ Ｐ３’
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ ↓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ
典型的には、生化学経路内での基質の切断は、活性化切断または阻害切断である。活性化切断は、不活性形態から活性形態までのポリペプチドの切断を指す。これは、例えば、チモーゲンの、活性酵素への切断を含む。また、活性化切断は、それ自体が活性を有する１つまたは複数のタンパク質にタンパク質が切断される切断である。例えば、補体系は、タンパク質分解切断事象の不可逆性のカスケードである。その終了は、炎症を刺激し、抗原ファゴサイトーシスを促進し、一部の細胞を直接的に溶解させる複数のエフェクタ分子の形成をもたらす。ゆえに、Ｃ３転換酵素によるＣ３の、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへの切断は、活性化切断である。これに対して、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば活性部位における切断によって、Ｃ３の阻害切断を実施する。
本明細書中で用いられる阻害切断または不活性化切断は、機能的でない１つまたは複数の分解生成物へのタンパク質の切断である。阻害切断は、タンパク質の活性の減少または低下をもたらす。典型的には、タンパク質の活性の低下は、タンパク質が関わる経路またはプロセスを低減する。一例において、阻害切断であるいずれか１つまたは複数の補体タンパク質の切断は、補体の古典経路、レクチン経路、または機能的な副経路のいずれか１つまたは複数の同時に生じる低減または阻害をもたらす。阻害性であるように、切断は、タンパク質の天然の形態と比較して、少なくとも、または少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上、活性を低減する。切断が阻害性であることが必要とされるタンパク質の切断パーセントは、タンパク質間で変動するが、タンパク質の活性についてアッセイすることによって求めることができる。
本明細書中で用いられる「補体活性化」は、補体経路の活性化を指し、例えば、補体活性化は、プロテアーゼによる補体経路のいずれか１つもしくは複数の機能もしくは活性の増大、または補体経路内のタンパク質のいずれかの活性の増大を指す。補体活性化は、補体媒介細胞溶解をもたらす虞もあるし、細胞または組織の破壊をもたらす虞もある。宿主組織に対する不適切な補体活性化は、多くの自己免疫および炎症性疾患の病理において重要な役割を果たし、さらには、生体不和合性と関連する多くの病態の原因となるか、またはこれと関連する。活性化が、既存の活性の増大、および新しい活性の誘導を意味し得ることが理解される。補体活性化は、インビトロでもインビボでも起こり得る。アッセイすることができ、本明細書中で記載される補体の例示的な機能として、溶血アッセイ、および補体エフェクタ分子のいずれか１つまたは複数を測定するアッセイ、例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥに続くウエスタンブロットもしくはクーマシーブリリアントブルー染色によるもの、またはＥＬＩＳＡによるものが挙げられる。一部の実施形態において、補体活性化は、プロテアーゼ、例えば本明細書中に記載されるプロテアーゼによって、プロテアーゼの不在下での補体の活性と比較して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはそれ以上阻害される。
本明細書中で用いられる「補体活性化の阻害」または「補体不活性化」は、プロテアーゼによる、補体経路のいずれか１つもしくは複数の補体媒介機能もしくは活性の、または経路内のタンパク質のいずれかの活性の低減または低下を指す。補体の機能または活性は、インビトロでもインビボでも生じ得る。アッセイすることができ、本明細書中に記載される補体の例示的な機能として、溶血アッセイ、および補体エフェクタ分子のいずれか１つまたは複数を測定するアッセイ、例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥに続くウエスタンブロットもしくはクーマシーブリリアントブルー染色によるもの、またはＥＬＩＳＡによるものが挙げられる。プロテアーゼは、補体活性化を１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上阻害することができる。他の実施形態において、補体活性化は、プロテアーゼによって、プロテアーゼの不在下での補体の活性と比較して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはそれ以上阻害される。
本明細書中で用いられる「補体タンパク質」または「補体要素」は、感染に対する宿主の防御においても炎症プロセスにおいても機能する補体系のタンパク質である。補体タンパク質として、古典経路において機能するもの、副経路において機能するもの、およびレクチン経路において機能するものが挙げられる。補体タンパク質として、補体経路に関与するプロテアーゼがある。
本明細書中で用いられる補体タンパク質として、補体カスケードが活性化すると形成されるあらゆる「切断産物」（「断片」とも称される）が挙げられる。また、補体タンパク質に挙げられるのは、補体タンパク質の、不活性であるか変更された形態、例えばｉＣ３ｂおよびＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇである。ゆえに、補体タンパク質として、以下に限定されないが：Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｇ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｆ、ｉＣ３、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、ｉＣ４、Ｃ４ａ－ｄｅｓＡｒｇ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ａ－ｄｅｓ－Ａｒｇ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＭＡＳＰ－１、ＭＡＳＰ－２、ＭＢＬ、因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｈ、因子Ｉ、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、プロパージン、Ｃ１Ｉｎｈ、Ｃ４ｂｐ、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＤ５９（ＭＩＲＬ）、クラステリン、およびＨＲＦ、ならびにいずれかの補体タンパク質の対立遺伝子および種変異体が挙げられる。
本明細書中で用いられる、補体タンパク質の「天然の」形態は、補体活性化の不在下で、脊椎動物等の生物から単離することができ、ラボ内で人によって故意に改変されていないものである。天然の補体タンパク質の例として、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、因子Ｂ、因子Ｄ、プロパージン、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ６、およびＣ９が挙げられる。
通常、「天然の補体タンパク質」は不活性であり、活性化すると活性を得る。活性化は、活性化切断、成熟切断、および／または他のタンパク質との複合体形成を必要とする場合がある。これに対する例外が、天然の形態で酵素的活性を有する因子Ｉおよび因子Ｄである。一部の例において、天然の補体タンパク質の活性化は、タンパク質の切断後に起こる。例えば、Ｃ３等の補体チモーゲンは、それ自体、Ｃ３転換酵素Ｃ４ｂ２ｂによるＣ３の切断が活性断片Ｃ３ａおよびＣ３ｂを生成するようなプロテアーゼ切断によって活性化されるプロテアーゼである。別の例において、不活性の天然の補体タンパク質の切断は、タンパク質の構造的安定性の変化をもたらして、タンパク質の活性化をもたらす。例えば、Ｃ３は、天然のタンパク質内で安定する内部チオエステル結合を含有するが、タンパク質の切断に由来する構造変化の後に、非常に反応性となり得、活性化され得る。ゆえに、Ｃ３の切断産物は、生物学的に活性である。また、Ｃ３の活性化が、切断の不在下で自発的に起こる場合がある。これは、補体の副経路の開始事象である、天然のＣ３内でのチオエステル結合の自発的変換である。他の例において、天然の補体タンパク質の活性化は、そうでなければ活性である天然の補体タンパク質の活性を阻害する、複合体形成された調節分子の放出の後に、起こる。例えば、Ｃ１ｉｎｈは、Ｃ１ｑとの複合体でない限り、Ｃ１ｓおよびＣ１ｒに結合して、これらを不活性化する。
本明細書中で用いられる「成熟切断」は、チモーゲンの活性化に必要とされるあらゆる切断を指す一般用語である。当該切断として、活性をもたらす構造変化をもたらす切断（すなわち活性化切断）が挙げられる。また、重要な結合部位が曝されるか、または立体障害が曝されるか、または阻害セグメントが除去もしくは移動される切断が挙げられる。
本明細書中で用いられる、補体タンパク質の「変更された形態」は、その分子構造の改変に由来する、非天然の形態で存在する補体タンパク質を指す。例えば、チオエステルの、水とのＣ３反応は、転換酵素切断の不在下で起こって、ｉＣ３と呼ばれるＣ３の加水分解された不活性形態を与え得る。別の例において、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、およびＣ４ａが挙げられるアナフィラトキシンは、カルボキシペプチダーゼＮによって、より安定した、あまり活性でない形態に脱アルギネート化（ｄｅｓａｒｇｉｎａｔｅｄ）され得る。
本明細書中で用いられる、補体タンパク質の「断片」または「切断産物」は、天然の補体タンパク質のポリペプチド配列の一部を含有する補体タンパク質の領域またはセグメントである。補体タンパク質の断片は、通常、補体カスケードの活性化の後に生じる。通常、断片は、天然の補体タンパク質のタンパク質分解切断に由来する。例えば、補体タンパク質Ｃ３は、Ｃ３転換酵素によって酵素的に切断されて、２つの断片：Ｃ３のＮ末端部分を構成するＣ３ａ；およびＣ末端部分を構成し、セリンプロテアーゼ部位を含有するＣ３ｂが生じる。また、補体タンパク質の断片は、補体タンパク質の別の断片のタンパク質分解切断に由来する。例えば、Ｃ３の切断から生成される断片、Ｃ３ｂは、因子Ｉによって切断されて、断片ｉＣ３ｂおよびＣ３ｆを生成する。通常、補体タンパク質の切断産物は、生物学的に活性な生成物であり、補体系の切断エフェクタ分子として機能する。それゆえに、補体タンパク質の断片または部分として、補体タンパク質の切断産物、さらには補体タンパク質の少なくとも１つの活性を保持するか、または示すタンパク質の部分が挙げられる。
本明細書中で用いられる「切断エフェクタ分子」または「切断エフェクタタンパク質」は、補体系のトリガされた酵素カスケードの結果として生成される活性切断産物を指す。補体活性化に由来する切断エフェクタ分子、断片、または切断産物は、オプソニン作用、アナフィラキシー、細胞溶解、および炎症が挙げられる補体媒介機能または活性の１つまたは複数のいずれかに寄与し得る。切断またはエフェクタ分子の例として、以下に限定されないが、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ－９、およびＢｂが挙げられる。補体系の切断エフェクタ分子は、カスケードへの関与によって、炎症を刺激すること、抗原ファゴサイトーシスを促進すること、および一部の細胞を直接的に溶解させることが挙げられる活性を示す。補体切断産物は、補体経路の活性化を促進するか、これに関与する。
本明細書中で用いられる「アナフィラトキシン」は、特に寄生虫に対する防御の一部として、炎症反応に関与する、肥満細胞または好塩基球の脱顆粒、またはこれらからの物質の放出をトリガする切断エフェクタタンパク質である。脱顆粒が強過ぎれば、アレルギー反応を引き起こす虞がある。アナフィラトキシンの例として、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａが挙げられる。また、アナフィラトキシンは、平滑筋細胞の発作（例えば気管支痙攣）、毛細血管の浸透性、および走化性の増大を間接的に媒介する。
本明細書中で用いられる「走化性」は、典型的にはその濃度を増大させる方向への、例えば、アナフィラトキシンの濃度を増大させる方向への、化学誘引に向けた白血球の受容体媒介移動を指す。
本明細書中で用いられる「オプソニン作用」は、食細胞によって摂取され得るような、病原体または他の粒子の表面の変更を指す。病原体の表面に結合するか、またはこれを変更するタンパク質が、オプソニンと呼ばれる。抗体および補体タンパク質は、食細胞、例えば好中球およびマクロファージによる吸収および破壊のために、細胞外細菌をオプソニン化する。
本明細書中で用いられる「細胞溶解」は、壁または膜の破壊による細胞の破壊開放（ｂｒｅａｋｉｎｇ ｏｐｅｎ）を指す。赤血球の溶血現象は、細胞溶解の尺度である。
本明細書中で用いられる「補体タンパク質Ｃ３」または「Ｃ３」は、感染に対する宿主の防御においても、炎症プロセスにおいても機能する補体系の補体タンパク質Ｃ３を指す。ヒト補体タンパク質Ｃ３は、配列番号４７に示される１６６３アミノ酸単鎖プレプロタンパク質またはチモーゲンであり、これは、２２アミノ酸シグナルペプチド（配列番号４７のアミノ酸１～２２）、およびフューリン様酵素によって除去されるテトラアルギニン配列（配列番号４７のアミノ酸６７８～６７１）（残基Ｃ５５９とＣ８１６間のジスルフィド結合によって連結されたベータ鎖（配列番号４７のアミノ酸２３～６６７）およびアルファ鎖（配列番号４７のアミノ酸６７２～１６６３）を含有する成熟二本鎖タンパク質が生じる）を含有する。補体タンパク質Ｃ３はさらに、配列番号４７のアミノ酸７４８と７４９間の、Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂまたはＣ３ｂＢｂ）によるタンパク質分解切断（アナフィラトキシンＣ３ａおよびオプソニンＣ３ｂが生成する）によって活性化される。
本明細書中で用いられる「チモーゲン」は、タンパク質分解切断（成熟切断、例えば、活性化切断が挙げられる）、ならびに／または他のタンパク質および／もしくは補因子との複合体形成によって活性化されるタンパク質を指す。チモーゲンは、タンパク質の不活性前駆体である。そのような前駆体は、通常、活性形態よりも、必ずしもではないが、大きい。ｕ－ＰＡまたは補体タンパク質Ｃ３に関して、チモーゲンは、触媒切断および自己触媒的切断が挙げられる特異的切断によって、または活性化補因子の結合によって、活性酵素に変換されて、活性酵素が生成する。ゆえに、チモーゲンは、アクティベータの作用によってタンパク質分解酵素に変換される酵素的不活性タンパク質である。切断は、自己触媒的に実施され得る。いくつかの補体タンパク質が、チモーゲンである；これらは不活性であるが、感染後の補体系が開始すると切断され活性化される。チモーゲンは、通常、不活性であり、チモーゲンからのプロ領域の触媒的または自己触媒的な切断によって、成熟活性ポリペプチドに変更され得る。
本明細書中で用いられる「プロ領域」、「プロペプチド」、または「プロ配列」は、成熟タンパク質を生成するように切断されるタンパク質の領域またはセグメントを指す。これは、触媒機構をマスクすることで、触媒中間体の形成を妨げることによって（すなわち、基質結合部位を立体的に塞ぐことによって）、酵素活性を抑制するように機能するセグメントを含み得る。プロ領域は、生物学的に活性な成熟ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸の配列であり、数アミノ酸ほどであり得るか、またはマルチドメイン構造であり得る。
本明細書中で用いられる「活性化配列」は、活性プロテアーゼを形成するのに活性化切断または成熟切断に必要とされる部位であるチモーゲン内のアミノ酸の配列を指す。活性化配列の切断は、自己触媒的に触媒され得、またはパートナーを活性化することによって触媒され得る。活性化切断は、活性に必要とされる構造変化が生じる一種の成熟切断である。これは、例えば、触媒残基等の触媒機構の保存領域と相互作用する新しいＮ末端を切断が生成して、活性に必要とされる構造変化を誘導する、セリンプロテアーゼについての古典活性化経路である。活性化は、プロテアーゼの多鎖形態の生成をもたらし得る。ある場合には、プロテアーゼの単鎖形態は、タンパク質分解活性を示し得る。
本明細書中で用いられる「ドメイン」は、分子の他の部分と構造的かつ／または機能的に異なり、識別可能である分子、例えばタンパク質またはコードする核酸の部分を指す。例示的なポリペプチドドメインは、１つもしくは複数の構造モチーフ（例えば、ループ領域によって連結されるアルファ螺旋および／またはベータ鎖の組合せ）で構成されるポリペプチド内の、独立して折り畳まれる構造を形成することができ、かつ／または特定の機能的活性、例えば酵素的活性、二量体化、もしくは基質結合によって認識される、ポリペプチドの部分である。ポリペプチドは、１つまたは複数の、典型的には複数の、異なるドメインを有し得る。例えば、ポリペプチドは、１つまたは複数の構造的ドメインおよび１つまたは複数の機能的ドメインを有し得る。単一のポリペプチドドメインは、構造および機能に基づいて、区別することができる。ドメインは、アミノ酸の連続した線状配列を包含し得る。これ以外にも、ドメインは、ポリペプチドのアミノ酸の線状配列に沿って非連続的である、複数の非連続アミノ酸部分を包含し得る。典型的には、ポリペプチドは、複数のドメインを含有する。例えば、セリンプロテアーゼは、プロテアーゼドメインの配列に基づいて特徴付けられ得る。当業者であれば、ポリペプチドドメインに精通しており、これを、他のそのようなドメインとの構造的かつ／または機能的な相同性によって識別することができる。本明細書中での例示のために、定義を記載するが、特定のドメインを名前によって認識することが、十分に当該技術の範囲内であることが理解される。必要であれば、適切なソフトウェアを使用して、ドメインを識別することができる。
本明細書中で用いられる、ポリペプチドの「構造的領域」は、少なくとも１つの構造的ドメインを含有するポリペプチドの領域である。
本明細書中で用いられる、「プロテアーゼドメイン」は、プロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインへの言及は、当該タンパク質のいずれかの単鎖形態、二本鎖形態、および多鎖形態を含む。タンパク質のプロテアーゼドメインは、そのタンパク質分解活性、例えば、その触媒中心に必要とされるタンパク質の必須の性質を全て含有する。
本明細書中で用いられる、プロテアーゼの「触媒活性部分」または「触媒活性ドメイン」、例えばｕ－ＰＡポリペプチドは、プロテアーゼドメイン、またはその、プロテアーゼ活性を保持するあらゆる断片もしくは部分を指す。例えば、ｕ－ＰＡポリペプチドの触媒活性の部分は、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインであり得、プロテアーゼドメインの単離された単鎖形態または活性化二本鎖形態が挙げられる。意義深いことには、少なくともインビトロで、プロテアーゼ、およびその触媒ドメインまたはタンパク質分解活性部分（典型的にはＣ末端トランケーション）の単鎖形態は、プロテアーゼ活性を示す。
本明細書中で用いられる「プロテアーゼドメインまたはプロテアーゼの触媒活性部分をコードする核酸」は、列挙される単鎖プロテアーゼドメインまたはその活性部分のみをコードし、プロテアーゼの他の連続部分を連続配列としてコードしない核酸を指す。
本明細書中で用いられる、ポリペプチドがプロテアーゼドメインから本質的になるという説明は、ポリペプチドの一部のみが、プロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分であることを意味する。ポリペプチドは、通常、アミノ酸の追加の非プロテアーゼ由来の配列を含んでもよい。
本明細書中で用いられる「プロテアーゼの活性部位」は、基質の触媒作用が生じる基質結合部位を指す。活性部位の構造および化学的性質は、基質の認識および結合、ならびに以降の加水分解、および基質内の切れやすい結合の切断を可能にする。プロテアーゼの活性部位は、ペプチド切断の触媒機構に寄与するアミノ酸、例えばアミノ酸Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ（Ｃ３の活性部位；配列番号４７の残基７３７～７４４）、および基質配列認識に寄与するアミノ酸、例えば長い基質結合特異性に寄与するアミノ酸を含有する。例えば、Ｃ３の活性部位内の切断は、その活性を阻害することができ、例えば：
Ｑ Ｈ Ａ Ｒ ↓Ａ Ｓ Ｈ Ｌ（配列番号４７の残基７３７～７４４）
Ｐ４ Ｐ３ Ｐ２ Ｐ１ ↓Ｐ１’ Ｐ２’ Ｐ３’ Ｐ４’
である。
本明細書中で用いられる「基質認識部位」または「切断配列」は、プロテアーゼによって切断されるプロテアーゼの活性部位によって認識される配列を指す。典型的には、セリンプロテアーゼについての切断配列は、多くのプロテアーゼの長い基質特異性にマッチするような６残基長であるが、プロテアーゼに応じて、より長くてもより短くてもよい。典型的には、例えば、セリンプロテアーゼについて、切断配列は、基質内のＰ１－Ｐ４およびＰ１’～Ｐ４’アミノ酸で構成され、切断は、Ｐ１位置の後ろで生じる。典型的には、セリンプロテアーゼについての切断配列は、多くのプロテアーゼの長い基質特異性にマッチするような６残基長であるが、プロテアーゼに応じて、より長くてもより短くてもよい。
本明細書中で用いられる「標的基質」は、プロテアーゼによって切断される基質を指す。典型的には、標的基質は、その基質認識部位にて、プロテアーゼによって特異的に切断される。最小限には、標的基質は、切断配列を形成するアミノ酸を含む。標的基質は、切断配列および他の何らかのアミノ酸を含有するペプチドを含んでもよい。プロテアーゼによって認識される切断配列を含有する全長タンパク質、対立遺伝子変異体、アイソフォーム、またはそれらのあらゆる部分が、そのプロテアーゼについての標的基質である。例えば、補体不活性化が意図される本明細書中の目的のために、標的基質は、ｕ－ＰＡポリペプチドによって認識される切断配列を含有する補体タンパク質Ｃ３、またはそのあらゆる部分もしくは断片である。そのような標的基質は、精製されたタンパク質であってもよいし、混合物、例えばインビトロでの混合物またはインビボでの混合物中に存在してもよい。混合物として、例えば、血液もしくは血清、または他の組織流体が挙げられ得る。加えて、標的基質として、プロテアーゼによる基質の切断に影響を与えない追加の部分を含有するペプチドまたはタンパク質が挙げられる。例えば、標的基質として、蛍光性部分に化学的に連結された４アミノ酸ペプチドまたは全長タンパク質が挙げられ得る。プロテアーゼは、標的基質に対してより大きな基質特異性を示すように改変されていてもよい。
本明細書中で用いられる「ｕ－ＰＡ」または「ｕＰＡ」または「ｕ－ＰＡポリペプチド」は、以下に限定されないが、組換えにより生成されたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、ならびに、肝臓および血液が挙げられるがこれらに限定されない細胞または組織から抽出または単離されたｕ－ＰＡポリペプチドが挙げられるあらゆるｕ－ＰＡポリペプチドを指す。ｕ－ＰＡについて互換的に用いられる他の名前として、ウロキナーゼおよび尿プラスミノゲンアクティベータおよびウロキナーゼプラスミノゲンアクティベータおよび尿型プラスミノゲンアクティベータおよびウロキナーゼ－型プラスミノゲンアクティベータが挙げられる。ｕ－ＰＡとして、以下に限定されないが、ヒトおよび非ヒト起源の動物が挙げられる様々な種由来の関連ポリペプチドが挙げられる。ヒトｕ－ＰＡとして、ｕ－ＰＡ、対立遺伝子変異体、アイソフォーム、核酸由来の合成分子、ヒトの組織および細胞から単離されたタンパク質、ならびにそれらの改変形態が挙げられる。例示的な非改変ヒトｕ－ＰＡポリペプチドとして、以下に限定されないが、非改変かつ野生型の天然の成熟ｕ－ＰＡポリペプチド（配列番号３）、プロペプチドおよび／またはシグナルペプチドを含む非改変かつ野生型の前駆体ｕ－ＰＡポリペプチド（例えば、配列番号１に示されるｕ－ＰＡポリペプチド）、ならびにプロテアーゼドメイン（例えば、配列番号２に示されるｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン）が挙げられる。当業者であれば、成熟ｕ－ＰＡポリペプチド（配列番号３）の参照位置が、シグナルペプチド配列を含有するｕ－ＰＡポリペプチドである前駆体ｕ－ＰＡポリペプチド（配列番号１）と比較した場合に、２０アミノ酸残基異なると認識するであろう。ゆえに、配列番号３の第１のアミノ酸残基は、配列番号１の２１番目の（第２１）アミノ酸残基「に相当する」。
「ｕ－ＰＡ」の説明は、残基１４８Ｃと２７９Ｃ間のジスルフィド結合によって連結されたＮ末端Ａ鎖（配列番号３のアミノ酸１～１５８）およびＣ末端Ｂ鎖（配列番号３のアミノ酸１５９～４１１）を含有するｕ－ＰＡポリペプチドの活性化された、または二本鎖形態を包含する（配列番号３に示される成熟ｕ－ＰＡポリペプチドに相当する）。二本鎖形態または高分子量（ＨＭＷ）ｕ－ＰＡは、アミノ酸残基Ｌｙｓ１５８の後ろ、残基Ｉｌｅ１５９の前でのタンパク質分解切断によって、成熟ｕ－ＰＡポリペプチド（例えば、配列番号３に示される）から形成される。タンパク質分解切断は、例えば、プラスミン、カリクレイン、カテプシンＢ、マトリプターゼ、および神経成長因子ガンマによって実行することができる。本明細書中で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドはさらに、例えば化学的改変または翻訳後改変によって、改変されていてもよい。そのような改変として、以下に限定されないが、当該技術において知られているグリコシル化、ペグ化、アルブミン化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および他のポリペプチド改変が挙げられる。
ｕ－ＰＡとして、ヒトおよび非ヒト種が挙げられるあらゆる種由来のｕ－ＰＡが挙げられる。非ヒト起源のｕ－ＰＡポリペプチドとして、以下に限定されないが、マウス、イヌ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、および他の霊長類のｕ－ＰＡポリペプチドが挙げられる。非ヒト起源の例示的なｕ－ＰＡポリペプチドの例として、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号５２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、配列番号５３）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、配列番号５４）、ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、配列番号５５）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、配列番号５６）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、配列番号５７）、キイロヒヒ（Ｐａｐｉｏ ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ、配列番号５８）、スマトラオランウータン（Ｐｏｎｇｏ ａｂｅｌｉｉ、配列番号５９）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ、配列番号６０）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ、配列番号６１）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ、配列番号６２）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、配列番号６３）、キタホオジロテナガザル（Ｎｏｍａｓｃｕｓ ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ、配列番号６４）、およびチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、配列番号６５）が挙げられる。
また、ｕ－ＰＡポリペプチドへの言及は、単鎖形態または二本鎖形態、それらの、活性を有する切頂形態の、前駆体ポリペプチドおよび成熟ｕ－ＰＡポリペプチド、単離されたプロテアーゼドメインを含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、ならびに、配列番号１に示される前駆体ポリペプチド、またはその成熟形態（配列番号３）、またはそのプロテアーゼドメイン（配列番号２）に対して、少なくとも、または少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む他の変異体を含む。ｕ－ＰＡポリペプチドとして、以下に限定されないが、組織特異的アイソフォームおよびその対立遺伝子変異体、核酸の翻訳によって調製される合成分子、化学合成、例えば、組換え法による、より短いポリペプチドのライゲーションが挙げられる合成によって生成されるタンパク質、ヒトおよび非ヒトの組織および細胞から単離されるタンパク質、キメラｕ－ＰＡポリペプチド、ならびにそれらの改変形態が挙げられる。また、ｕ－ＰＡポリペプチドとして、（必要ならば、活性化すると）全長成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するのに十分な長さのものであるか、またはそうするのに適した領域を含むｕ－ＰＡの断片または部分が挙げられる。一例において、ｕ－ＰＡの部分は、プロテアーゼドメイン、例えば配列番号２に示されるプロテアーゼドメイン（これは、配列番号１に示されるｕ－ＰＡ配列のアミノ酸１７９～４３１に相当する）である。また、ｕ－ＰＡポリペプチドとして、化学的改変または翻訳後改変を含有するもの、および化学的改変または翻訳後改変を含有しないものが挙げられる。そのような改変として、以下に限定されないが、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、ＨＥＳ化（生物分解性ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）への薬物分子のカップリングによる半減期延長）、ＰＡＳ化（薬理活性化合物、例えばタンパク質、ペプチド、および低分子量の薬物の、小さなＬ－アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／またはＳｅｒからなる元々無秩序の生合成ポリマーとの遺伝的融合または化学的カップリングを介したコンジュゲーション）、および当該技術において知られている他のポリペプチド改変が挙げられる。
本明細書中で用いられる「ｕ－ＰＡプロテアーゼ」または「ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン」として、以下に限定されないが、組換えにより生成されたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、ならびに、肝臓および血液が挙げられるがこれらに限定されない細胞または組織から抽出または単離されたｕ－ＰＡポリペプチドが挙げられるあらゆるｕ－ＰＡポリペプチドを指す。ｕ－ＰＡプロテアーゼとして、以下に限定されないが、ヒトおよび非ヒト起源の動物が挙げられる様々な種由来の関連ポリペプチドが挙げられる。ヒトｕ－ＰＡプロテアーゼまたはｕ－ＰＡプロテアーゼドメインとして、ｕ－ＰＡ、対立遺伝子変異体、アイソフォーム、核酸由来の合成分子、ヒト組織および細胞から単離されたタンパク質、ならびにそれらの改変形態が挙げられる。例示的な参照ヒトｕ－ＰＡプロテアーゼドメインとして、以下に限定されないが、非改変かつ野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２）および他のプロテアーゼドメイン（例えば、配列番号５に示されるｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン）が挙げられる。当業者であれば、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２）の参照位置が、完全長のＷＴ配列を含有するｕ－ＰＡポリペプチドである成熟ｕ－ＰＡポリペプチド（配列番号１）と比較した場合に、１７８アミノ酸残基異なることを認識するであろう。ゆえに、配列番号２の第１のアミノ酸残基は、配列番号１の１７９番目の（第１７９）アミノ酸残基「に相当する」。
本明細書中で用いられる「改変」は、ポリペプチドのアミノ酸の配列、または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変を指し、それぞれ、アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入、および置換が挙げられる。ポリペプチドを改変する方法は、例えば組換えＤＮＡ方法論を用いることによる、当業者にとってのルーチンである。ポリペプチドのアミノ酸の配列への改変と、ポリペプチドの改変との間には、差異がある。前者は、アミノ酸の挿入、欠失、および置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔまたはｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を指す；後者は、ポリペプチドの改変、例えば、タンパク質の翻訳後改変、ペグ化、ならびに他の、性質および／または活性を変更するような改変を指す。
本明細書中で用いられる「置換」は、天然、標的、野生型、または、他の核酸またはポリペプチドの配列内の１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を、分子の長さ（残基の数で記載される）を変えることなく、他のヌクレオチドまたはアミノ酸で置換することを指す。ゆえに、分子内の１つまたは複数の置換は、分子のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を変えない。アミノ酸置換は、特定のポリペプチドと比較して、ポリペプチド配列の長さに沿うアミノ酸残基の数に換算して表すことができる。例えば、アミノ酸配列の第３５の位置でのアミノ酸の改変［アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）の、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）との置換である］を有する改変ポリペプチドは、Ｒ３５Ｑ、Ａｒｇ３５Ｇｌｎ、または３５Ｑとして表すことができる。単純に、Ｒ３５は、改変された第３５の位置のアミノ酸がアルギニンであることを示すのに用いることができる。
本明細書中で用いられる「改変ｕ－ＰＡ」または「改変ｕ－ＰＡポリペプチド」は、非改変形態と比較して、変更された活性、例えば変更された基質特異性を示すｕ－ＰＡプロテアーゼを指す。そのようなプロテアーゼは、野生型ｕ－ＰＡと比較して、補体タンパク質Ｃ３を切断するｕ－ＰＡプロテアーゼの活性、例えば基質特異性または選択性が変更されるような、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の改変（すなわち、アミノ酸の変化）を含む。改変ｕ－ＰＡは、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼが、プロテアーゼの活性または基質特異性を変更する領域内に改変を含有し、当該プロテアーゼが、タンパク質分解活性である限り、全長ｕ－ＰＡプロテアーゼであってもよいし、その、全長プロテアーゼの一部、例えばｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインであってもよい。また、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼ、または改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインは、他の改変を、プロテアーゼの基質特異性に影響を与えない領域内に含んでもよい。それゆえに、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは典型的に、野生型ｕ－ＰＡポリペプチドのアミノ酸の対応配列に対して、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。改変ｕ－ＰＡポリペプチドの改変全長ｕ－ＰＡポリペプチド、またはその触媒活性部分、またはそのプロテアーゼドメインは、融合タンパク質が標的特異性を有する限り、融合タンパク質であるポリペプチドを含み得る。
本明細書中で用いられるキモトリプシンナンバリングは、配列番号７６の成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸ナンバリングを指す。別のプロテアーゼのプロテアーゼドメイン、例えばｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインのアラインメントは、キモトリプシンにより実施することができる。そのような例では、キモトリプシンのアミノ酸に対応するｕ－ＰＡポリペプチドのアミノ酸は、キモトリプシンアミノ酸のナンバリングが与えられる。対応する位置は、手動アラインメントを用いる当業者によるアラインメントによって、または入手可能な多数のアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）を用いることによって、決定することができる。また、対応する位置は、例えばタンパク質構造のコンピュータシミュレートアラインメントを用いることによる、構造的アラインメントに基づいてもよい。ポリペプチドのアミノ酸が、開示される配列内のアミノ酸に対応するという説明は、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えばＧＡＰアルゴリズムを用いて、（保存アミノ酸がアラインされた場合に）同一性または相同性を最大にするような、開示される配列とのポリペプチドのアラインメントにより識別されるアミノ酸を指す。配列番号３に示されるｕ－ＰＡポリペプチドのアミノ酸位置１５９～４１１の対応するキモトリプシン番号が、表１に記載される。配列番号３に示される配列に対するアミノ酸位置は、標準フォントであり、当該位置のアミノ酸残基は、太字であり、対応するキモトリプシン番号は、イタリック体である。例えば、成熟キモトリプシンとのｕ－ＰＡ（配列番号２）のセリンプロテアーゼドメインのアラインメントにより、ｕ－ＰＡ内の位置１５９のイソロイシン（Ｉ）は、Ｉ１６のキモトリプシンナンバリングが与えられる。以降のアミノ酸は、それに応じて付番される。一例において、成熟ｕ－ＰＡ（配列番号３）のアミノ酸位置１７３のフェニルアラニン（Ｆ）は、キモトリプシンナンバリングに基づいて、アミノ酸位置Ｆ３０に相当する。残基がプロテアーゼ内に存在するが、キモトリプシン内に存在しない場合、アミノ酸残基は文字表記が与えられる。例えば、キモトリプシンナンバリングに基づいて、アミノ酸６０を有するループの部分であるが、キモトリプシンと比較して、ｕ－ＰＡ配列内に挿入されているキモトリプシン内の残基は、例えば、Ｄ６０ａ、Ｙ６０ｂ、またはＰ６０ｃと称される。これらの残基は、配列番号３に示される成熟ｕ－ＰＡ配列に対するナンバリングによって、それぞれＤ２０８、Ｙ２０９、およびＰ２１０に相当する。
表1.u-PAのキモトリプシンナンバリング
Figure 2022516725000001

Figure 2022516725000002
本明細書中で用いられるｋｃａｔは、酵素の触媒活性を測定する；ｋｃａｔの単位は、秒－１である。ｋｃａｔの逆数は、一基質分子を「代謝回転する（ｔｕｒｎ ｏｖｅｒ）」のに酵素分子によって必要とされる時間である；ｋｃａｔは、毎秒酵素分子毎に代謝回転される基質分子の数を測定する。ｋｃａｔは、時折、代謝回転数と称される。酵素学において、ｋｃａｔ（代謝回転数とも称される）は、所定の酵素について単一の触媒部位が実行する、毎秒の基質分子の化学変換の最大数である。これは、全ての酵素触媒部位が基質で飽和される場合の、反応の最大速度（Ｖｍａｘ）である。
本明細書中で用いられる、標的基質に対する特異性は、非標的基質と呼ばれる別の基質と比較した、プロテアーゼによる標的基質の切断に対する優先性を指す。特異性は、特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）で反映され、これは、基質に対するプロテアーゼの親和性および酵素の効率の尺度である。ｋｃａｔ／Ｋｍは、酵素効率の尺度である；ｋｃａｔの大きな値（迅速な代謝回転）またはＫｍの小さな値（基質に対する高い親和性）は、ｋｃａｔ／Ｋｍを大きくする。
本明細書中で用いられる、切断に対する特異性定数は、（ｋｃａｔ／Ｋｍ）であり、式中、Ｋｍはミカエリス・メンテン定数（［Ｓ］はＶｍａｘの半分）であり、ｋｃａｔはＶｍａｘ／［ＥＴ］であり、ＥＴは最終酵素濃度である。パラメータｋｃａｔ、Ｋｍ、およびｋｃａｔ／Ｋｍは、基質濃度の逆数を、基質切断の速度の逆数に対してグラフ化して、ラインウィーバー・バーク式［１／速度＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ；ここでＶｍａｘ＝［ＥＴ］ｋｃａｔ］に適合させることによって算出することができる。基質の種々の濃度の存在下での経時的な切断の増大速度を求めるあらゆる方法を用いて、特異性定数を算出することができる。例えば、基質を、プロテアーゼによって切断されると放出される蛍光性部分と連結する。様々な酵素濃度にて切断の速度を求めることによって、ｋｃａｔを、特定のプロテアーゼについて求めることができる。特異性定数を用いて、一方の標的基質の、もう一方の基質に対するプロテアーゼの優先性を判定することができる。
本明細書中で用いられる基質特異性は、一方の標的基質の、もう一方に対するプロテアーゼの優先性を指す。基質特異性は、特異性定数の比率として測定することができる。
本明細書中で用いられる基質特異性比率は、特異性定数の比率であり、これを用いて、２つ以上のプロテアーゼの、または２つ以上の基質に対するプロテアーゼの特異性を比較することができる。例えば、競合基質に対するプロテアーゼの、または基質に対する競合プロテアーゼの基質特異性を、ｋｃａｔ／Ｋｍを比較することによって比較することができる。例えば、特異性定数が標的基質に対して２×１０６Ｍ－１ｓｅｃ－１であり、非標的基質に対して２×１０４Ｍ－１ｓｅｃ－１であるプロテアーゼは、当該標的基質に対してより特異的である。上述由来の特異性定数を用いて、プロテアーゼは、標的基質に対して基質特異性比率が１００である。
本明細書中で用いられる、標的基質の優先性または基質特異性は、基質特異性比率として表すことができる。優先性を反映する比率の特定の値は、論争中の基質およびプロテアーゼの関数である。１よりも大きい基質特異性比率は、標的基質に対する優先性を表し、１未満の基質特異性は、非標的基質に対する優先性を表す。通常、少なくとも１、または約１の比率は、プロテアーゼを候補治療薬と考えるのに十分な差異を反映する。
本明細書中で用いられる、特異性の変更は、出発野生型プロテアーゼと比較した、改変プロテアーゼの基質特異性の変化を指す。通常、特異性の変化は、プロテアーゼの野生型基質（本明細書中で、非標的基質と称される）と比較した、標的基質に対する改変プロテアーゼの優先性の変化の反映である。典型的には、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡプロテアーゼは、野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼの基質特異性と比較して、補体タンパク質Ｃ３に対する基質特異性の増大を示す。例えば、非標的基質に対して、標的基質に対する基質特異性比率が１００である改変プロテアーゼは、基質特異性比率が１０である足場プロテアーゼと比較して、１０倍の特異性の増大を示す。別の例において、０．１の基質特異性比率と比較して、比率が１である改変プロテアーゼは、１０倍の基質特異性の増大を示す。足場プロテアーゼと比較して特異性の増大を示すには、改変プロテアーゼは、補体タンパク質のいずれか１つまたは複数に対する基質特異性が、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、またはそれ以上大きい。
本明細書中で用いられる「選択性」は、競合基質の混合物から１つの標的基質を選択して切断するプロテアーゼの能力を指す場合、特異性と互換的に用いることができる。標的基質に対するプロテアーゼの、他のいずれか１つまたは複数の標的基質と比較した選択性の増大は、例えば、プロテアーゼによる標的基質の切断の特異性定数を比較することによって、判定することができる。例えば、プロテアーゼの切断の特異性定数が、標的基質に対して２×１０６Ｍ－１ｓｅｃ－１であり、他のいずれか１つまたは複数の基質に対して２×１０４Ｍ－１ｓｅｃ－１であるならば、プロテアーゼは、標的基質に対してより選択的である。
本明細書中で用いられる、ポリペプチド、例えばプロテアーゼの「活性」または「機能的活性」は、ポリペプチドによって示されるあらゆる活性を指す。そのような活性は、実験に基づいて判定することができる。例示的な活性として、以下に限定されないが、例えば、基質結合、ＤＮＡ結合、または二量体化を介して、生体分子と相互作用する能力、酵素活性、例えば、キナーゼ活性またはタンパク質分解活性が挙げられる。プロテアーゼ（プロテアーゼ断片を含む）について、活性として、以下に限定されないが、特定の基質に特異的に結合する能力、基質結合の親和性および／または特異性（例えば、高いか、または低い親和性および／または特異性）、エフェクタ機能、例えば、基質（例えばタンパク質、すなわちＣ３）の阻害、中和、切断、またはクリアランスを促進する能力、ならびにインビボ活性、例えば、タンパク質切断またはクリアランスを促進する能力が挙げられる。活性は、認識されているアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、表面プラスモン共鳴、または結合速度もしくは解離速度（ｏｎ－ ｏｒ ｏｆｆ－ｒａｔｅ）を測定するための等価のアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡観察、細胞ベースのアッセイ、ならびに結合アッセイを用いて、インビトロまたはインビボで評価することができる。例えば、プロテアーゼ、例えば改変ｕ－ＰＡプロテアーゼについて、基質タンパク質の切断、代謝回転、残留活性、安定性、および／またはレベルをインビトロかつ／またはインビボで測定することによって、活性を評価することができる。ポリペプチドが活性を示すことを示すそのようなインビトロアッセイの結果は、ポリペプチドの活性にインビボ相関し得、インビボ活性は、治療活性または生物活性と称することができる。改変ポリペプチドの活性は、非改変ポリペプチドの活性のあらゆるパーセンテージレベルであり得、以下に限定されないが、非改変ポリペプチドと比較して、活性の１％もしくは約１％、活性の２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上が挙げられる。改変（または変異体）プロテアーゼの機能または活性を判定するアッセイは、当該技術において周知である。
機能的活性として、以下に限定されないが、生物活性、触媒活性または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に結合するポリペプチドに結合するか、またはこれと競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、およびポリペプチドの受容体またはリガンドに特異的に結合する能力が挙げられる。
本明細書中で用いられる、補体タンパク質に関する機能的活性は、アナフィラキシー、オプソニン作用、走化性、または細胞溶解が挙げられるがこれらに限定されない補体媒介機能を指す。補体活性の活性を試験するアッセイの例として、赤血球の溶血現象、および、例えばＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、補体エフェクタ分子の検出が挙げられる。
本明細書中で用いられる、触媒活性または切断活性は、選択される基質のタンパク質分解を検出するインビトロタンパク質分解アッセイで評価されるようなプロテアーゼの活性を指す。切断活性は、プロテアーゼの触媒効率を評価することによって測定することができる。
本明細書中で用いられる、標的基質に向けられる活性は、切断活性および／もしくは機能的活性、または標的基質に対する、もしくは標的基質に向けられるプロテアーゼの活性を反映する他の測定値を指す。プロテアーゼによる補体タンパク質標的基質の機能的活性は、補体アッセイ、例えば赤血球溶解、または補体活性を評価するのに当業者によって知られているか、もしくは本明細書中で提供される他のアッセイでＩＣ５０を評価することによって、測定することができる。切断活性は、プロテアーゼの触媒効率を評価することによって測定することができる。本明細書中の目的のために、活性は、プロテアーゼが、プロテアーゼの不在下と比較して、標的基質のより大きなタンパク質分解もしくは切断を示し、かつ／または補体タンパク質の機能的活性を調節（すなわち、活性化または阻害）するならば、増大する。
本明細書中で用いられる、改変ｕ－ＰＡポリペプチドに関する「活性の増大」は、同じ条件下で試験した場合に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、アミノ酸置換を含有しない非改変ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、より大きな活性を示すことを意味する。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、非改変または参照ｕ－ＰＡポリペプチドの活性の少なくとも、または少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上を示す。
本明細書中で用いられる用語「同じ」は、抗体結合性親和性に関して用いられる場合、ＥＣ５０、結合定数（Ｋａ）、または解離定数（Ｋｄ）が、参照抗体のものの約１～１００倍または１～１０倍以内（参照抗体よりも１～１００倍大きい親和性、もしくは１～１００倍小さい親和性、またはそのような範囲内のあらゆる数値もしくは範囲もしくは値）であることを意味する。
本明細書中で用いられる「結合活性」は、１つまたは複数の結合パートナーに結合するか否か、またはどのように結合するかに関する、分子、例えばポリペプチドの特徴を指す。結合活性として、結合パートナーに結合する能力、結合パートナーに結合する親和性（例えば、高い親和性）、結合パートナーとの結合の強度、および／または結合パートナーと結合する特異性が挙げられる。
本明細書中で用いられる、見かけのＫｄとも称されるＥＣ５０は、プロテアーゼの濃度（例えばｎＭ）であり、最大活性の５０％が、基質の固定量に関して観察される（例えば、利用できるｈＣ３の５０％を切断するのに必要とされる改変ｕ－ＰＡポリペプチドの濃度）。典型的には、ＥＣ５０値は、シグモイド用量－反応曲線から求められ、ＥＣ５０は、変曲点での濃度である。基質に対する高いプロテアーゼ親和性は、低いＥＣ５０値と相関し、低い親和性は、高いＥＣ５０値に相当する。親和性定数は、プロテアーゼ反応についての標準的な動態方法論、例えばイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに続く曲線適合分析によって求めることができる。
本明細書中で用いられる「親和性定数」は、プロテアーゼと基質間の親和性または分子結合強度を測定するのに用いられる結合定数（Ｋａ）を指す。親和性定数が高いほど、基質に対するプロテアーゼの親和性は大きい。親和性定数は、逆数モル濃度の単位（すなわち、Ｍ－１）で表され、プロテアーゼ－基質反応についての標準的な動態方法論（例えば、当該技術において知られているイムノアッセイ、表面プラスモン共鳴、または他の動態相互作用アッセイ）によって測定される結合－解離反応についての速度定数から算出することができる。また、プロテアーゼの結合親和性は、解離定数またはＫｄとして表すことができる。解離定数は、結合定数の逆数、Ｋｄ＝１／Ｋａである。それゆえに、親和性定数もまた、Ｋｄによって表すことができる。親和性定数は、プロテアーゼ反応についての標準的な動態方法論、例えば、イムノアッセイ、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）［Rich and Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54；Englebienne (1998) Analyst. 123:1599］、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、または当該技術において知られている他の動態相互作用アッセイ［例えば、Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989)参照］によって求めることができる。結合速度のリアルタイムの検出および監視のための機器類および方法が知られており、商業的に入手可能である［例えば、BIAcore 2000, BIAcore AB, Uppsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences；Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335］。
親和性を算出する方法が周知であり、例えば、本明細書中で例示されるものが挙げられる、ＥＣ５０値を求める方法、または結合／解離定数を求める方法がある。例えば、ＥＣ５０に関して、高い結合親和性は、プロテアーゼが、約１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ未満、またはそれ以下であるＥＣ５０で標的タンパク質に特異的に結合することを意味する。また、高い結合親和性は、１０－６Ｍ以下、例えば、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、もしくは１０－１２Ｍ、またはそれ以下の平衡解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けることができる。平衡結合定数（Ｋａ）に関して、高い結合親和性は、通常、約１０６Ｍ－１以上、約１０７Ｍ－１以上、約１０８Ｍ－１以上、または約１０９Ｍ－１、１０１０Ｍ－１、１０１１Ｍ－１、もしくは１０１２Ｍ－１以上のＫａ値を伴う。親和性は、実験に基づいて推定することができ、または親和性は、比較的に、例えば、例えば試験される抗体の親和性のペアワイズ比率を算出することによって、特定の抗原について、２つ以上の抗体の親和性を比較することによって、求めることができる。例えば、そのような親和性は、従来の技術を用いて、例えばＥＬＩＳＡ；平衡透析；表面プラスモン共鳴によって；放射性標識された標的抗原を用いるラジオイムノアッセイによって；または当業者に知られている別の方法によって、容易に求めることができる。親和性データを、例えば、Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)の方法によって、または、例えば、式：ｙ＝（（Ａ－Ｄ）／（１＋（（ｘ／Ｃ）＾Ｂ）））＋Ｄ［式中、Ａは最小漸近線であり、Ｂはスロープ因子であり、Ｃは変曲点（ＥＣ５０）であり、Ｄは最大漸近線である］を用いる４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを用いる、曲線適合分析によって、分析することができる。
本明細書中で用いられる「ＥＤ５０」は、総集団（例えば、試料中に存在するＣ３の総量）の５０％において、定めた結果（例えば、補体タンパク質Ｃ３の切断）をもたらすプロテアーゼ（例えば改変ｕ－ＰＡ）の用量（例えば、ｍｇ／ｋｇまたはｎＭ）である。
本明細書中で用いられる用語「表面プラスモン共鳴」は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によるリアルタイム相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
本明細書中で用いられるヒトタンパク質は、全ての対立遺伝子変異体およびその保存的変形物が挙げられる、ヒトのゲノム中に存在する核酸分子、例えばＤＮＡによってコードされるものである。タンパク質の変異体または改変は、当該改変がヒトタンパク質の野生型または主要な（ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ）配列に基づくならば、ヒトタンパク質である。
本明細書中で用いられる、天然に存在するα－アミノ酸の残基は、ヒトにおいて、同族ｍＲＮＡコドンでチャージされたｔＲＮＡ分子の特異的認識によってタンパク質中に組み込まれる、自然界に見出される２０個のα－アミノ酸の残基である。
本明細書中で用いられる、天然に存在しないアミノ酸は、遺伝的にコードされないアミノ酸を指す。
本明細書中で用いられる「核酸」は、少なくとも２つの連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を指し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびにそれらの、典型的にはホスホジエステル結合によって、一緒に結合された類似体が挙げられる。また、用語「核酸」に含まれるのは、核酸の類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオアートＤＮＡ、ならびに他のそのような類似体および誘導体、またはそれらの組合せである。また、核酸は、例えば、リン酸ジエステル結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミダート結合、ホスホロチオアート結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（ペプチド核酸）以外のヌクレオチド類似体または「骨格」結合を含有するＤＮＡ誘導体およびＲＮＡ誘導体を含む。また、当該用語は、ヌクレオチド類似体から形成されるＲＮＡまたはＤＮＡの等価物、誘導体、変異体、および類似体として、一本（センスまたはアンチセンス）鎖核酸および二本鎖核酸を含む。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについて、ウラシル塩基はウリジンである。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。例えば蛍光または放射性標識等の検出可能な標識で標識されていてもよいプローブまたはプライマーに言及する場合、一本鎖分子が意図される。そのような分子は、典型的に、標的が統計学的に特有であるような長さのものであるか、またはライブラリをプロービングもしくはプライミングする低コピー数（典型的には５未満、通常３未満）のものである。通常、プローブまたはプライマーは、目的の遺伝子と相補的であるか同一である配列の少なくとも１４個の、１６個の、または３０個の連続したヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
本明細書中で用いられる「単離された核酸分子」は、核酸分子の天然の源内に存在する他の核酸分子から分離されたものである。「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術によって生成された場合、他の細胞材料もしくは培地が実質的にあり得ないか、または化学的に合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質が実質的にあり得ない。本明細書中で提供される例示的な単離された核酸分子として、提供されるｕ－ＰＡプロテアーゼをコードする単離された核酸分子が挙げられる。
本明細書中で用いられる、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関する「合成の」は、組換え方法によって、かつ／または化学合成方法によって生成される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」は、共有結合される２つ以上のアミノ酸を指す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で互換的に用いられる。
本明細書中で用いられる「ペプチド」は、２から約４０アミノ酸長であるポリペプチドを指す。
本明細書中で用いられる、本明細書中で提供されるアミノ酸の種々の配列において出現するアミノ酸は、知られている三文字略語または一文字略語に従って識別される（表２）。種々の核酸断片において出現するヌクレオチドは、当該技術においてルーチン的に用いられる標準的な一文字表示で示される。
本明細書中で用いられる「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含有する。本明細書中の目的のために、アミノ酸として、２０個の天然に存在するアミノ酸（表２）、天然に存在しないアミノ酸、およびアミノ酸類似体（すなわち、α－炭素が側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。本明細書中で用いられる、本明細書中で出現するポリペプチドの種々のアミノ酸配列において出現するアミノ酸は、周知である三文字略語または一文字略語に従って識別される（表２参照）。種々の核酸分子および断片において出現するヌクレオチドは、当該技術においてルーチン的に用いられる標準的な一文字表示で示される。
本明細書中で用いられる「アミノ酸残基」は、ポリペプチドおよびそのペプチド結合の化学的消化（加水分解）により形成されるアミノ酸を指す。本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であると推定される。「Ｄ」異性体形態の残基（そのように明示される）は、所望の機能的性質がポリペプチドによって保持される限り、あらゆるＬ－アミノ酸残基の代わりに用いることができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載され、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１～１．８２２において採択される標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基についての略語を表２に示す：
表2-対応表
Figure 2022516725000003

本明細書中で式によって表されるアミノ酸残基の配列は全て、左から右の向きが、アミノ末端の、カルボキシル末端に向かう従来の方向である。フレーズ「アミノ酸残基」は、対応表（表２）に記載されるアミノ酸、改変アミノ酸、非天然アミノ酸、および異常（ｕｎｕｓｕａｌ）アミノ酸を含む。さらに、アミノ酸残基配列の開始または末端のダッシュは、１つもしくは複数のアミノ酸残基のさらなる配列への、またはアミノ末端基、例えばＮＨ２への、またはカルボキシル末端基、例えばＣＯＯＨへのペプチド結合を示す。
本明細書中で用いられる「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチドにおいて出現する２０個のＬ－アミノ酸を指す。本明細書中で用いられる、天然に存在するα－アミノ酸の残基は、ヒトにおいて、同族ｍＲＮＡコドンでチャージされたｔＲＮＡ分子の特異的認識によってタンパク質中に組み込まれる、自然界に見出される２０個のα－アミノ酸の残基である。
本明細書中で用いられる「非天然のアミノ酸」は、天然のアミノ酸と類似の構造を有するが、天然のアミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に改変されている有機化合物を指す。ゆえに、天然に存在しないアミノ酸の例として、２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体が挙げられ、以下に限定されないが、アミノ酸のＤ－立体異性体が挙げられる。例示的な非天然のアミノ酸が、当業者に知られており、以下に限定されないが、パラ－アセチルフェニルアラニン、パラ－アジドフェニルアラニン、２－アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３－アミノアジピン酸（ｂＡａｄ）、β－アラニン／β－アミノプロピオン酸（Ｂａｌａ）、２－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４－アミノ酪酸／ピペリジン酸（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（４Ａｂｕ）、６－アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２－アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３－アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２－アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’－ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ－エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ－エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、アロ－ヒドロキシリシン（Ａｈｙｌ）、３－ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４－ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロ－イソロイシン（Ａｉｌｅ）、Ｎ－メチルグリシン、サルコシン（ＭｅＧｌｙ）、Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、６－Ｎ－メチルリシン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）が挙げられる。例示的な非天然のアミノ酸が、本明細書中に記載されており、当業者に知られている。
本明細書中で用いられる等速性混合物は、アミノ酸のモル比が、報告される反応速度に基づいて調整されたものである［例えば、Ostresh et al. (1994) Biopolymers 34:1681参照］。
本明細書中で用いられるＤＮＡコンストラクトは、自然界に見出されない様式で組み合わされて並べられたＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖または二本鎖の、線状または環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーが挙げられる。
本明細書中で用いられるＤＮＡセグメントは、定めた属性を有する、より大きなＤＮＡ分子の部分である。例えば、定めたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、より長いＤＮＡ分子、例えばプラスミドまたはプラスミド断片の部分であり、これは、５’から３’の方向に読んだ場合、定めたポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
本明細書中で用いられる用語オルソログは、異なる種由来のポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である一種から得たポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オルソログ間の配列差異は、種形成の結果である。
本明細書中で用いられる用語ポリヌクレオチドは、５’から３’末端に読んだデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドとして、ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられ、天然源から単離することができるか、インビトロで合成することができるか、または天然分子および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略）または塩基対（「ｂｐ」と省略）に換算して、本明細書中で与えられる。用語ヌクレオチドは、文脈が許す場合、一本鎖分子および二本鎖分子に用いられる。当該用語は、二本鎖分子に用いられる場合、全長を示すのに用いられ、用語塩基対と等価であることが理解される。当業者であれば、二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、僅かに長さが異なり得ること、その末端が、互い違いにされ得；ゆえに、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のヌクレオチドが全て対形成され得るわけではないことを理解する。そのような対になってない末端は、通常、２０ヌクレオチド長を超えない。
本明細書中で用いられる配列のアラインメントは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２つ以上の配列をアラインするための相同性の使用を指す。典型的には、５０％以上の同一性によって関連する２つ以上の配列がアラインされる。アラインされた配列セットは、対応する位置にてアラインされた２つ以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアラインされた、ＥＳＴおよび他のｃＤＮＡ等の、ＲＮＡに由来する配列をアラインすることを含み得る。関連する、または変異体のポリペプチドまたは核酸分子は、当業者に知られているあらゆる方法によってアラインすることができる。そのような方法は、典型的に、マッチを最大にする、例えば、手動アラインメントを用いる、利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）その他を用いることによる、当業者に知られている方法が挙げられる。ポリペプチドまたは核酸の配列をアラインすることによって、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、類似した部分または位置を識別することができる。また、さらに、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基またはヌクレオチド残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列間で、対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基を見出すことができる。また、対応する位置は、例えばタンパク質構造のコンピュータシミュレートアラインメントを用いることによって、構造的アラインメントに基づいてもよい。他の例において、対応する領域を識別することができる。また、当業者であれば、保存されたアミノ酸残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列間で、対応するアミノ酸残基を見出すことができる。
本明細書中で用いられる「配列同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較における、同一であるか類似のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。配列同一性は、核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントによって判定されて、領域の類似性または同一性を識別することができる。本明細書中の目的のために、配列同一性は、通常、同一残基を識別するためのアラインメントによって判定さる。アラインメントは、局所的であっても包括的であってもよい。マッチ、ミスマッチ、およびギャップを、比較する配列間で識別することができる。ギャップは、同一であるか類似の文字がアラインされるように、アラインされる配列の残基間に挿入されるヌルアミノ酸またはヌルヌクレオチドである。通常、内部および末端のギャップが存在し得る。配列同一性は、同一残基の数／最も短い配列の長さ×１００としてギャップを考慮することによって判定することができる。ギャップペナルティを用いる場合、配列同一性は、末端ギャップについてペナルティなしで（例えば、末端のギャップがペナルティを課されない）判定することができる。これ以外にも、配列同一性は、同一の位置の数／総アライン配列の長さ×１００としてギャップを考慮することなく判定することができる。
本明細書中で用いられる「に対応する位置にて」、またはヌクレオチドもしくはアミノ酸の位置が、開示される配列内のヌクレオチドもしくはアミノ酸の位置に「対応する」という説明（例えば配列表に示される）は、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えばＧＡＰアルゴリズムを用いて、同一性を最大にするような、開示される配列とのアラインメントにより識別されるヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。本明細書中の目的のために、ｕ－ＰＡ配列のアラインメントは、配列番号２または５に示されるヒトｕ－ＰＡ、特に配列番号５の参照ヒトｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインのアミノ酸配列に対するものである。配列をアラインすることによって、当業者であれば、対応する残基を、例えば保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、識別することができる。一般に、対応する位置を識別するために、最も高いオーダーマッチが得られるように、アミノ酸の配列がアラインされる［例えば：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；およびCarillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照］。これ以外にも、当業者であれば、キモトリプシン数によって残基が付番されることによって、対応する残基を識別することができる。密接に関連した配列について、コンピュータアルゴリズムは必要とされない；視覚的にアラインメントすることができる。
本明細書中で用いられる「包括的アラインメント」は、始めから終わりまで２つの配列をアラインして、各配列内の各文字を一回のみアラインするアラインメントである。アラインメントは、配列間に類似性または同一性があるか否かを問わず、生成される。例えば、「包括的アラインメント」に基づく５０％の配列同一性は、各々１００ヌクレオチド長の２つの比較される配列の完全配列のアラインメントにおいて、残基の５０％が同じことであることを意味する。また、包括的アラインメントは、アラインされた配列の長さが同じでない場合でさえ、配列同一性を判定するのに用いることができることが理解される。配列の末端における差異は、「末端ギャップについてペナルティなし」が選択されない限り、配列同一性を判定する際に考慮される。通常、包括的アラインメントは、全長のほとんどにわたって大きな類似性を共有する配列に用いられる。包括的アラインメントを実行するための例示的なアルゴリズムとして、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが挙げられる［Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443］。包括的アラインメントを実行するための例示的なプログラムが公的に利用でき、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/）にて利用可能なＧｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ、およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlにて利用可能なプログラムが挙げられる。
本明細書中で用いられる「局所的アラインメント」は、２つの配列をアラインするが、類似性または同一性を共有する配列の部分のみをアラインするアラインメントである。それゆえに、局所的アラインメントは、一方の配列の下位セグメントが、もう一方の配列内に存在するかを判定する。類似性がなければ、アラインメントは返されない。局所的アラインメントアルゴリズムとして、ＢＬＡＳＴおよびＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが挙げられる［Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)］。例えば、「局所的アラインメント」に基づく５０％の配列同一性は、任意の長さの２つの比較される配列の完全配列のアラインメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域の、残基の５０％が、類似性または同一性の領域において同じであることを意味する。
本明細書中の目的のために、配列同一性は、各供給者によって確立されたデフォルトギャップペナルティが用いられる標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって判定することができる。ＧＡＰプログラムについてのデフォルトパラメータとして、以下を挙げることができる：（１）Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載される、単項比較マトリックス（同一性については１、非同一性については０の値を含有する）およびGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745の重み付けした比較マトリックス；（２）ギャップ毎に３．０のペナルティ、各ギャップにおける記号毎に追加の０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップについて、ペナルティなし。任意の２つの核酸分子または任意の２つのポリペプチドが、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％「同一である」ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列（または、同一性パーセントを説明する他の類似の変形物）を有するかは、局所的アラインメントまたは包括的アラインメントに基づく、知られているコンピュータアルゴリズム（例えば、wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software参照、何十もの知られていて公的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供している）を用いて判定することができる。通常、本明細書中の目的のために、配列同一性は、包括的アラインメント、例えば、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴから入手可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔツール（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome）；ＬＡｌｉｇｎ［ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒアルゴリズムを実行するＷｉｌｌｉａｍ Ｐｅａｒｓｏｎ（Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357）］；およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlにて利用可能なＸｉａｏｑｕｉ Ｈｕａｎｇ由来のプログラムに基づくコンピュータアルゴリズムを用いて判定される。通常、本明細書中でヌクレオチド配列を比較する場合、末端ギャップについてペナルティがあるアラインメントが用いられる。また、局所的アラインメントは、比較されることとなる配列が実質的に同じ長さである場合に用いることもできる。
本明細書中で用いられる用語「同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較またはアラインメントを表す。非限定的な一例において、「と少なくとも９０％同一」は、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドに対して９０％から１００％の同一性パーセントを指す。９０％以上のレベルでの同一性は、例示目的のために、１００のアミノ酸またはヌクレオチドの試験ポリペプチド長または試験ポリヌクレオチド長および参照ポリペプチド長または参照ポリヌクレオチド長が比較されることを想定して、試験ポリペプチドまたは試験ポリヌクレオチドにおける１０％（すなわち、１００中１０）以下のアミノ酸またはヌクレオチドが、参照ポリペプチドのものと異なるという事実を示す。類似の比較を、試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布する点突然変異として表すことができ、または、様々な長さの１つもしくは複数の位置内に、例えば１０／１００のアミノ酸差異（おおよそ９０％の同一性）の最大許容量まで、クラスター化し得る。また、差異は、アミノ酸残基の欠失またはトランケーションに起因する場合がある。差異は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失と定義される。比較される配列の長さに応じて、約８５～９０％を超える相同性または同一性のレベルにて、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットから独立し得る；同一性のそのような高いレベルは、多くの場合ソフトウェアに依存することなく、容易に評価することができる。
本明細書中で用いられるジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合またはジスルフィド架橋とも称される）は、チオール基のカップリングに由来する単一の共有結合である。タンパク質内のジスルフィド結合は、システイン残基のチオール基間で形成されて、ポリペプチドドメイン間の相互作用を安定させる。
本明細書中で用いられる「カップリングされた」または「コンジュゲートされた」は、共有結合または非共有結合性の相互作用を介して付着されることを意味する。本明細書中で提供されるコンジュゲートは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドプロテアーゼドメイン（「ＳＰＤ」と称され、例えば図４参照）、および、別の部分［例えば、性質（例えば血清半減期の増大）を付与する（すなわち、ヒト血清アルブミンＨＳＡ）、または発現もしくは精製を促進する（すなわち、ＳＵＭＯ、ｈｉｓ－ＳＵＭＯ、ＴＳＧ－６）、またはタンパク質を受容体に標的化する（例えば受容体に結合する抗体）ポリペプチド］に直接的に、またはリンカーを介して連結された、残りのｕ－ＰＡポリペプチドの全てまたは部分を含有する。ポリペプチドは、直接的に、またはポリペプチドリンカー（通常、短い、約４～２０アミノ酸、例えばＳｅｒおよびＧｌｙ残基の組合せ）を介して、連結され得る。ポリペプチドを含有するコンジュゲートは、通常、融合タンパク質である。また、コンジュゲートは、アミノ酸残基が部分、例えばＰＥＧ部分、グリコシル化部分、および他のそのような部分に連結されている改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含む。
本明細書中で用いられる「プライマー」は、適切なバッファ中での、適切な温度での、適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合剤、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素の存在下）で、鋳型による（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＮＡ合成の開始点としての機能を果たすことができる核酸分子を指す。当業者であれば、特定の核酸分子が、「プローブ」として、「プライマー」として機能することができることを理解する。しかしながら、プライマーは、伸長のための３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、キャプチャＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、インサイチュＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、ならびに他の増幅プロトコルが挙げられる種々の方法に用いることができる。
本明細書中で用いられる「プライマー」は、プライマー伸長生成物の合成が開始され得る、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド（典型的には３つを超える）を含有するオリゴヌクレオチドを指す。合成を引き起こす実験条件は、ヌクレオシド三リン酸、ならびに重合および伸長用の薬剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに適切なバッファ、温度、およびｐＨの存在を含む。
本明細書中で用いられるプライマー対は、（例えばＰＣＲによって）増幅されることとなる配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流側）プライマー、および増幅されることとなる当該配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’（下流側）プライマーを含む一セットのプライマーを指す。
本明細書中で用いられる「特異的にハイブリダイズする」は、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）の、標的核酸分子への相補的な塩基対合によるアニーリングを指す。当業者であれば、特異的ハイブリダイゼーション、例えば特定の分子の長さおよび組成に影響を与える、インビトロパラメータおよびインビボパラメータに精通している。さらに、インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメータとして、アニーリングおよび洗浄の温度、バッファ組成、および塩濃度が挙げられる。非特異的に結合した核酸分子を高いストリンジェンシーにて除去するための例示的な洗浄条件は、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃であり、中程度のストリンジェンシーでのものは、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳ、５０℃である。同等のストリンジェンシー条件が、当該技術において知られている。当業者であれば、特定の用途に適した標的核酸分子への核酸分子の特定のハイブリダイゼーションを達成するように、これらのパラメータを容易に調整することができる。
本明細書中で用いられる、生成物に実質的に同一であるは、目的の性質が十分に不変であるので、生成物の代わりに、実質的に同一の生成物を用いることができるほど十分に類似していることを意味する。
また、本明細書中で用いられる用語「実質的に同一である」または「類似の」は、関連する技術の当業者によって理解される文脈により変わることが理解される。
本明細書中で用いられる、ポリペプチドまたは核酸分子の野生型形態は、遺伝子によってコードされる形態、または遺伝子によってコードされるコーディング配列によってコードされる形態である。典型的には、遺伝子、またはこれによってコードされる分子の野生型形態は、機能または構造を変更する突然変異または他の改変を含有しない。また、用語野生型は、種間で生じる対立遺伝子変異を有する形態を包含する。本明細書中で用いられる、ポリペプチドまたは核酸分子の優位な形態（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｆｏｒｍ）は、遺伝子から生成される主要な形態である分子の形態を指す。「優位な形態」は、源によって変わる。例えば、様々な細胞または組織型が、例えば、選択的スプライシングによって、かつ／または選択的タンパク質プロセシングによって、ポリペプチドの様々な形態を産生することができる。各細胞または各組織型において、異なるポリペプチドが、「優位な形態」であり得る。
本明細書中で用いられる対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の択一型の形態のいずれかを参照する。対立遺伝子変異は、突然変異を通して自然に生じて、集団内の表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントであり得（コードされるポリペプチド内に変化なし）、または変更したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。また、用語「対立遺伝子変異体」は、本明細書中で、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を意味するのに用いられる。典型的には、遺伝子の参照形態は、種の集団または単一参照メンバー由来のポリペプチドの野生型形態および／または優位な形態をコードする。典型的には、種間での変異体が挙げられる対立遺伝子変異体は、同じ種由来の野生型および／または優位な形態とのアミノ酸同一性が、少なくとも８０％、９０％、またはそれ以上である；同一性の程度は、遺伝子によって決まり、比較が種間であるか種内であるかに拘わらない。通常、種内の対立遺伝子変異体は、野生型および／または優位な形態との同一性が、少なくとも、または少なくとも約８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはそれ以上であり、少なくとも、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の、ポリペプチドの野生型および／または優位な形態との同一性が挙げられる。
本明細書中で「対立遺伝子変異体」と互換的に用いられる、本明細書中で用いられる「対立遺伝子」は、遺伝子またはその部分の択一型の形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上で同じ遺伝子座または位置を占める。対象が、遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合、対象は、当該遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であると言われる。対象が、遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、対象は、当該遺伝子についてヘテロ接合性であると言われる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドが互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入が挙げられ得る。また、遺伝子の対立遺伝子は、突然変異を含有する遺伝子の形態であり得る。
本明細書中で用いられる種変異体は、マウスおよびヒト等の様々な哺乳動物種が挙げられる様々な種間のポリペプチド内の変異体を指す。通常、種変異体は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。種変異体間の対応する残基は、配列を比較して、マッチするヌクレオチドまたは残基の数を最大にするように、例えば配列間の同一性が９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上となるようにアラインすることによって、判定することができる。続いて、目的の位置に、参照核酸分子において割り当てられる番号が与えられる。アラインメントは、特に配列同一性が８０％よりも大きい場合、マニュアルで、または眼で見てもたらすことができる。
本明細書中で用いられるスプライス変異体は、複数のｍＲＮＡ型が生じるゲノムＤＮＡの一次転写産物の示差プロセシングによって生成される変異体を指す。
本明細書中で用いられる、ポリペプチドのアミノ酸の一次配列、または核酸分子内のヌクレオチドの配列の改変に関する改変として、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入、および置換が挙げられる。これには、ポリペプチドそれ自体の改変と対照的に、翻訳後修飾、例えばグリコシル化、ファルネシル化、ペグ化、および融合、例えば、例えばアルブミン化による、血清半減期等の性質を変えるような他のポリペプチドとの融合、ヒト血清アルブミン等のアルブミンとの融合、ならびにポリペプチドへの他のそのような改変が挙げられる。ゆえに、アミノ酸の配列の改変への言及は、挿入、欠失、置換、およびそれらの組合せを指す。ポリペプチドの改変は、その配列を変えない、ポリペプチドに加えられる改変を指す。
本明細書中の目的のために、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入が、あらゆるｕ－ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性断片内にもたらされてもよいが、結果として生じるタンパク質が、プロテアーゼ活性または他の活性を示す場合に限る（または、所望されるならば、そのような変化が、活性を消失させるようにもたらされてもよい）。改変は、保存的アミノ酸置換、さらには非保存的アミノ酸置換を形成することによってもたらすことができる。例えば、タンパク質の性質を、所望されるように、または有利に変更するアミノ酸置換もたらすことができる。一実施形態において、ポリペプチドの分解を予防する突然変異をもたらすことができる。多くのプロテアーゼは、塩基性残基、例えばＲおよびＫの後ろを切断する；そのような切断を消失させるために、塩基性残基を、非塩基性残基と置換する。阻害剤とのプロテアーゼの相互作用は、プロテアーゼとの阻害剤の相互作用の部位にて非保存的変化をもたらすことによって、ブロックされる一方で、触媒活性を保持し得る。また、他の活性を変更することもできる。例えば、受容体結合は、触媒活性を変更することなく変更することができる。
意図されるアミノ酸置換として、保存的置換が挙げられ、例えば表３に示されるものがあり、これらはタンパク質分解活性を消失させない。本明細書中に記載される、タンパク質の性質を変更する置換、例えば、切断部位および他のそのような部位の除去もまた意図される；そのような置換は、通常、非保存的であるが、当業者であれば容易に実施することができる。
本明細書中で用いられる、アミノ酸の適切な保存的置換が、当業者に知られており、通常、結果として生じる分子の生物活性を変更することなく形成することができる。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224参照）。そのような置換は、以下の表３に示すものに従って形成することができる：
Figure 2022516725000004

また、他の置換も許容可能であり、実験に基づいて、または知られている保存的置換に従って決定することができる。
本明細書中で用いられる用語プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を実現するＤＮＡ配列を含有する遺伝子の部分を意味する。プロモータ配列は、常にではないが一般的に、遺伝子の５’非コード領域内に見出される。
本明細書中で用いられる、単離されたか、または精製された、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、タンパク質が由来する組織の細胞由来の細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質が実質的にないか、または化学的に合成される場合に化学前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない。調製物は、標準的な分析方法、例えば、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、純度を評価するために当業者によって用いられる、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって判定して、容易に検出可能な不純物がないように思われるならば、または更なる精製が、物質の物理化学的性質、例えば酵素活性および生物活性を検出可能的に変更しないほど十分に純粋であるならば、実質的に遊離していると判定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するような化合物の精製方法が、当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。そのような場合には、更なる精製が、化合物の特定の活性を増大させるかもしれない。
用語、細胞物質が実質的にないは、タンパク質が単離されているか、または組換えにより生成される細胞の細胞要素からタンパク質が分離されている、タンパク質の調製物を含む。一実施形態において、用語、細胞物質が実質的にないは、非プロテアーゼタンパク質（本明細書中では夾雑タンパク質とも称される）が約３０（乾燥重量）％未満、通常、非プロテアーゼタンパク質が約２０％未満、非プロテアーゼタンパク質が１０％、または非プロテアーゼタンパク質が約５％未満であるプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分が、組換えにより生成される場合、培地も実質的にない、すなわち、培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の約２０％、１０％、または５％以下を表す。
本明細書中で用いられる用語、化学前駆体または他の化学物質が実質的にないは、タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離されている、プロテアーゼタンパク質の調製物を含む。当該用語は、化学前駆体または非プロテアーゼ化学物質または要素が、約３０（乾燥重量）％、２０％、１０％、または５％以下であるプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。
本明細書中で用いられる、組換えＤＮＡ法を用いることによる組換え手段による生成は、クローニングしたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を指す。
本明細書中で用いられる「発現」は、ポリヌクレオチドの転写および翻訳によってポリペプチドが産生されるプロセスを指す。ポリペプチドの発現レベルは、例えば、宿主細胞から産生されるポリペプチドの量を判定する方法が挙げられる、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて評価することができる。そのような方法として、以下に限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ゲル電気泳動後のクマシーブルー染色、ローリータンパク質アッセイ、およびブラッドフォードタンパク質アッセイによる、細胞溶解液中のポリペプチドの定量化が挙げられ得る。
本明細書中で用いられる「宿主細胞」は、ベクターを受けて、維持して、再生させて、かつ／または増幅させるのに用いられる細胞である。また、宿主細胞は、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現するのに用いることができる。ベクター内に含有される核酸は、宿主細胞が分裂する際に複製されることによって、核酸が増幅する。
本明細書中で用いられる「ベクター」または「プラスミド」は、適切な宿主細胞にベクターが形質転換された場合に、１つまたは複数の異種タンパク質が発現され得る複製可能核酸である。ベクターへの言及は、発現または複製のために細胞中に異種核酸を導入するのに用いられる別々のエレメントを含む。また、ベクターへの言及は、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が、典型的には制限消化およびライゲーションによって導入され得るベクターを含む。また、ベクターへの言及は、プロテアーゼ、例えば改変ｕ－ＰＡをコードする核酸を含有するベクターを含む。ベクターは、核酸の増幅用の、または核酸によってコードされるポリペプチドの発現／提示用の宿主細胞中に、ポリペプチドをコードする核酸を導入するのに用いられる。ベクターは典型的に、エピソームのままであるが、ゲノムの染色体中への遺伝子またはその部分の統合をもたらすように設計され得る。また、意図されるのは、人工染色体、例えば酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体であるベクターである。そのような媒体の選択および使用は、当業者に周知である。また、ベクターは、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒまたはｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」を含む。ウイルスベクターは、外来遺伝子を細胞中に（媒体またはシャトルとして）運ぶ外来遺伝子に作動可能に連結されている操作されたウイルスである。
本明細書中で用いられる「発現ベクター」は、ＤＮＡ断片の発現をもたらすことができる調節配列、例えばプロモータ領域と作動可能に連結されている、ＤＮＡを発現することができるベクターを含む。そのような追加のセグメントは、プロモータ配列およびターミネーター配列を含んでもよいし、１つまたは複数の複製起源、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル等を含んでもよい。発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに通常由来し、または双方のエレメントを含有し得る。ゆえに、発現ベクターは、適切な宿主細胞中に導入されると、クローニングしたＤＮＡの発現をもたらす組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクト、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、真核生物細胞および／もしくは原核生物細胞において複製可能であるもの、ならびにエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノム中に統合されるものが挙げられる。
また、本明細書中で用いられるベクターは、「ウイルスベクター」を含む。ウイルスベクターは、外来遺伝子を細胞中に（媒体またはシャトルとして）運ぶ、外来遺伝子に作動可能に連結されている操作されたウイルスである。
本明細書中で用いられるアデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上部気道感染を引き起こす一群のＤＮＡ含有ウイルスのいずれかを指す。本明細書中で用いられる裸のＤＮＡは、ワクチンおよび遺伝子治療に用いることができるヒストンフリーＤＮＡを指す。裸のＤＮＡは、形質転換と呼ばれる遺伝子移入処理中に細胞から細胞へ伝えられる遺伝的材料である。形質転換において、精製されたか、または裸のＤＮＡは、レシピエント細胞によって受け入れられて、レシピエント細胞に新しい特徴または表現型を与えることとなる。
本明細書中で用いられる、核酸の配列、領域、エレメント、またはドメインに関して「作動可能に連結されている」は、核酸領域が互いに機能的に関連していることを意味する。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されることによって、核酸は転写され翻訳されて、機能的融合タンパク質を発現することができ、リーダーペプチドは、融合ポリペプチドの分泌をもたらす。ある場合には、第１のポリペプチド（例えばリーダーペプチド）をコードする核酸は、第２のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されており、核酸は、単一のｍＲＮＡ転写産物として転写されるが、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳は、２つのポリペプチドのうちの１つを発現し得る。例えば、アンバー終止コドンは、部分的なアンバーサプレッサ細胞中に導入された場合に、結果として生じる単一のｍＲＮＡ転写産物が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含有する融合タンパク質を産生するように翻訳され得るか、または第１のポリペプチドのみを産生するように翻訳され得るように、第１のポリペプチドをコードする核酸と、第２のポリペプチドをコードする核酸との間に位置決めされてよい。別の例において、プロモータは、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されることによって、プロモータは、核酸の転写を調節または媒介することができる。
本明細書中で用いられる「一次配列」は、ポリペプチド内のアミノ酸残基の配列、または核酸分子内のヌクレオチドの配列を指す。
本明細書中で用いられるタンパク質結合配列は、他のタンパク質もしくはペプチド配列に、通常、一セットのタンパク質もしくはペプチド配列に、または特定のタンパク質もしくはペプチド配列に特異的に結合することができるタンパク質またはペプチド配列を指す。
本明細書中で用いられる「タグ」または「エピトープタグ」は、典型的には、本明細書中で提供されるｕ－ＰＡ等のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に加えられる、アミノ酸の配列を指す。ポリペプチドに融合したタグの包含は、ポリペプチドの精製および／または検出を促進することができる。典型的には、タグまたはタグポリペプチドは、抗体によって認識されるエピトープを提供するのに十分な残基を有するか、または検出もしくは精製に役立ち得るが、連結されるポリペプチドの活性に干渉しないほど十分に短い、ポリペプチドを指す。タグポリペプチドは典型的に、特異的に結合する抗体が、連結されるポリペプチド内のエピトープと実質的に交差反応しないほど十分に特有のものである。エピトープタグを付けられたタンパク質は、タグに対して高められた非常に特異的な抗体を用いて、アフィニティ精製することができる。
適切なタグポリペプチドは、通常少なくとも５つまたは６つのアミノ酸残基を、大抵約８～５０個のアミノ酸残基を、典型的には９～３０個の残基を有する。タグは、１つまたは複数のタンパク質に連結されて、サンプルまたは混合物からのタンパク質の検出またはその回収を可能にすることができる。そのようなタグは周知であり、容易に合成し設計することができる。例示的なタグポリペプチドとして、アフィニティ精製に用いられるものが挙げられ、Ｓｍａｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ＳＵＭＯ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165］；ｃ－ｍｙｃタグならびにその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体［例えば、Evan et al. (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616参照］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborsky et al. (1990) Protein Engineering 3:547-553］が挙げられる。エピトープタグを付けられた抗体を検出するのに用いられる抗体は典型的に、本明細書中で二次抗体と称される。
本明細書中で用いられる金属結合配列は、通常金属イオンに、一セットの金属イオンに、または特定の金属イオンに特異的に結合することができるタンパク質またはペプチド配列を指す。
本明細書中で用いられる用語、評価することは、サンプル中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性についての絶対値を得る、さらには活性のレベルを示すインデックス、比率、パーセンテージ、視覚によるかまたは他の値を得るという意味において、定量的かつ質的な判定を含むことが意図される。評価は、直接的であっても間接的であってもよく、実際に検出される化学種は勿論、それ自体がタンパク質分解生成物である必要はないが、例えば、その誘導体であってもよいし、一部の更なる物質であってもよい。例えば、補体タンパク質の切断産物の検出、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびクマシーブルーによるタンパク質染色がある。
本明細書中で用いられる生物活性は、化合物、組成物、または他の混合物のインビボ投与により起こる化合物のインビボ活性または生理学的応答を指す。ゆえに、生物活性は、そのような化合物、組成物、および混合物の治療効果および医薬的活性を包含する。生物活性は、そのような活性を試験または使用するように設計されたインビトロ系において観察することができる。ゆえに、本明細書中の目的のために、プロテアーゼの生物活性は、ポリペプチドが加水分解される触媒活性である。
本明細書中で用いられる等価物は、核酸の２つの配列に言及する場合、問題となっている２つの配列が、同じ配列のアミノ酸または等価のタンパク質をコードすることを意味する。２つのタンパク質またはペプチドに言及する際に等価物が用いられる場合、これは、２つのタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変更しないアミノ酸置換（例えば、以下に限定されないが、先で表３に示されるもの等の保存的変化）のみ有する、実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。等価物が性質に言及する場合、性質は、同程度に存在することを必要としない（例えば、２つのペプチドが、同じタイプの酵素活性の、異なる速度を示してもよい）が、活性は通常、実質的に同じである。相補的なは、２つのヌクレオチド配列に言及する場合、ヌクレオチドの２つの配列が、典型的には、対向するヌクレオチド間に２５％、１５％、または５％未満のミスマッチがあってもハイブリダイズすることができることを意味する。必要であれば、相補性のパーセンテージが特定されることとなる。典型的には、２つの分子は、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることとなるように選択される。
本明細書中で用いられる、タンパク質の活性、または遺伝子もしくは核酸の発現を調節する薬剤は、タンパク質の活性を低下させるか、増大させるか、そうでなければ変更するか、一部の様式では上方制御もしくは下方制御し、またはそうでなければ細胞内での核酸の発現を変更する。
本明細書中で用いられる「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」プロテアーゼは、異なるポリペプチドに作動可能に連結されたポリペプチドを指す。本明細書中で提供されるキメラタンパク質または融合タンパク質として、１つまたは複数のプロテアーゼまたはその部分、例えばその単鎖プロテアーゼドメイン、ならびに転写／翻訳制御シグナル、シグナル配列、局在化用のタグ、精製用のタグ、免疫グロブリンＧのドメインの一部、および／または標的化剤のいずれか１つまたは複数用の１つまたは複数の他のポリペプチドが挙げられ得る。これらのキメラタンパク質または融合タンパク質として、組換え手段によって融合タンパク質として産生されるもの、例えばスルフヒドリル基へのカップリングによる、化学的カップリング等の化学的手段によって生成されるもの、および他のあらゆる方法によって生成されるもの（それによって、少なくとも一方のプロテアーゼまたはその部分が、リンカーを介して、もう一方のポリペプチドに直接的または間接的に連結される）が挙げられる。
本明細書中で用いられる、融合タンパク質に言及する場合の作動可能に連結されるは、インフレームで互いに融合されるプロテアーゼポリペプチドおよび非プロテアーゼポリペプチドを指す。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
本明細書中で用いられる標的化剤は、細胞表面受容体へのコンジュゲートの特定の結合を実現するあらゆる部分、例えばタンパク質またはその有効部分であり、これは、場合によっては、結合したコンジュゲートまたはその部分を内在化することができる。また、標的化剤は、例えば、コンジュゲートのアフィニティ単離もしくは精製；コンジュゲートの、表面への付着；またはコンジュゲートもしくはコンジュゲートを含有する複合体の検出を促進するか、または容易にするものであり得る。
本明細書中で用いられる「リンカー」は、２つのポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）を結合するアミノ酸の短い配列を指す。「ペプチドリンカー」は、２つのポリペプチド配列を結合するアミノ酸の短い配列を指す。ポリペプチドリンカーの例として、合成抗体断片、例えばｓｃＦｖ断片において２本の抗体鎖を結合するリンカーがある。リンカーは周知であり、知られているあらゆるリンカーを、記載される方法に用いることができる。ポリペプチドリンカーの例として、溶解性を増大させるために全体にわたっていくつかのＧｌｕ残基またはＬｙｓ残基が分散されている（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎアミノ酸配列がある。他の例示的なリンカーが、本明細書中に記載されている；これらおよび他の知られているリンカーはいずれも、記載される組成物および方法に用いることができる。
本明細書中で用いられる分子の誘導体または類似体は、分子に由来する部分、または分子の改変バージョンを指す。
本明細書中で用いられる「疾患または障害」は、以下に限定されないが、感染、後天性の状態、遺伝的状態、環境への曝露およびヒトの挙動に関連した状態、ならびに定義可能な症状によって特徴付けられる状態が挙げられる原因または状態に由来する、生物における病的状態を指す。疾患または障害として、臨床的に診断された疾患、および臨床的疾患と診断されなかった、生物の正常な状態における混乱が挙げられる。本明細書中の目的の疾患および障害として、補体活性化を包含するものがあり、補体活性化によって媒介されるもの、および補体活性化が病因または病理において役割を果たすものが挙げられる。本明細書中の目的の疾患および障害として、補体活性化によって特徴付けられるもの（例えば、加齢黄斑変性および移植腎機能発現遅延）が挙げられる。
本明細書中で用いられる黄斑変性は、網膜の小さな中心部分（黄斑として知られている）が悪化した場合に起こる。ＡＭＤの２つの型：乾燥（萎縮性）および湿潤（血管新生または滲出性）が存在する。ほとんどのＡＭＤは、乾燥型として始まり、個体の１０～２０％において、湿潤型に進行する。加齢黄斑変性は常に、両側性である（すなわち、双方の眼において発生する）が、双方の眼において必ずしも同じペースで進行するわけではない。
本明細書中で用いられる加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、視覚障害および失明を高齢者に引き起こす炎症性疾患である。補体系のタンパク質は、この疾患の発症の中心である。ＡＭＤにおける局所的炎症および全身性炎症は、補体系の別の経路の調節解除された（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）作用によって媒介される。
本明細書中で用いられる移植機能発現遅延（ＤＧＦ）は、移植プロセスに特有の属性がある急性腎損傷（ＡＫＩ）の徴候である。これは、移植手術後に起こる。移植機能発現遅延（ＤＧＦ）は、最初の移植後の週の間に透析が必要であるとしばしば定義される、共通の合併症である。第３の補体構成要素Ｃ３（Ｃ３）の固有の腎合成が、Ｔ細胞媒介応答を開始させることによって、急性拒絶に寄与する。例えば、脳死ドナーにおいて、局所的腎Ｃ３レベルは、入手時により高くて、移植の１４日後には腎機能と逆向きの関係にある。
本明細書中で用いられる補体媒介疾患または補体媒介障害は、補体タンパク質もしくは補体関連タンパク質の不在もしくは存在、または補体もしくは補体関連タンパク質の活性化もしくは不活性化に起因して、補体タンパク質のいずれか１つまたは複数が疾患において役割を果たすあらゆる障害である。一部の実施形態において、補体媒介障害は、補体タンパク質の欠乏に起因するものである。本明細書中に記載される他の実施形態において、補体媒介障害は、補体タンパク質の活性化または過度の活性化に起因するものである。また、補体媒介障害は、補体タンパク質のいずれか１つもしくは複数の存在、および／または補体経路の継続的な活性化に起因するものである。
本明細書中で用いられる「黄斑変性関連障害」は、（例えば、黄斑の細胞の増殖の低減の結果、黄斑の細胞（例えばＲＰＥ細胞）の死もしくは再配置の増大、正常な生物学的機能の損失、またはこれらの事象の組合せとして）網膜黄斑が変質するか、または機能不全になるいくつかの状態のいずれかを指す。黄斑変性は、細胞の立体組織構造の完全性の損失および／または標準的な黄斑の細胞外マトリックスおよび／または黄斑の細胞の機能の損失に終わる。黄斑変性関連障害の例として、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、ノースカロライナ黄斑ジストロフィ、ソースビー眼底ジストロフィ、シュタルガルト病、パターンジストロフィ、ベスト病、ドミナントドルーゼン、およびマラッティアレベンティネース（ｍａｌａｔｔｉａ ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）（ラジアルドルーゼン）が挙げられる。また、黄斑変性関連障害は、黄斑の機能不全および／または衰退の前に、または後に起こる追加の黄斑（ｅｘｔｒａｍａｃｕｌａｒ）変化を包含する。ゆえに、用語「黄斑変性関連障害」はまた、黄斑の完全性または機能を変更するか、またはこれに損傷を与えるあらゆる状態（例えば、ＲＰＥまたはブルッフ膜の損傷）を広く含む。例えば、当該用語は、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、感光体変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィ、錐体桿体ジストロフィ、および錐体変性を包含する。
本明細書中に記載される黄斑変性関連障害として、黄斑変性、例えばＡＭＤ黄斑変性が挙げられる。黄斑変性関連障害として、抗ＶＥＧＦ処置、例えば抗ＶＥＧＦ抗体、またはレーザー処置もしくは移植可能スコープによって処置される障害が挙げられる。
本明細書中で用いられる、疾患または状態のある対象を「処置する」ことは、対象の症状が、処置の後に、部分的に、または全体として軽減されるか、静的なままであることを意味する。それゆえに、処置は、予防、治療、および／または治癒を包含する。予防は、潜在的な疾患の予防および／または疾患の症状もしくは進行の悪化の予防を指す。また、処置は、改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび本明細書中で提供される組成物のあらゆる医薬的使用を包含する。
本明細書中で用いられる「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎまたはｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、疾患または状態を進行させるリスクまたは可能性が低減される方法を指す。
本明細書中で用いられる「治療剤」、「治療レジメン」、「放射線保護剤」、または「化学療法薬」は、当業者に知られている、ワクチンが挙げられる従来の薬物および薬物療法を意味する。放射線治療剤は、当該技術において周知である。
本明細書中で用いられる「処置」は、状態、障害、または疾患の症状が寛解するか、そうでなければ有益に変更されるあらゆる様式を意味する。また、処置は、本明細書中の組成物のあらゆる医薬的使用を包含する。
本明細書中で用いられる、処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の「症状の寛解」は、組成物または治療薬の投与に起因し得るか、またはこれと関連し得る症状の、永続的であるか一時的であるか、長持ちするか一時的現象であるかに拘わらない、あらゆる軽減を指す。
本明細書中で用いられる「医薬的に有効な薬剤」は、以下に限定されないが、例えば、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、および従来の治療薬（小分子薬物および治療タンパク質が挙げられる）が挙げられるあらゆる治療剤または生物活性剤が挙げられる。
本明細書中で用いられる、特定の疾患を処置する化合物または組成物の「有効な量」は、疾患と関連する症状を寛解させるのに、または一部の様式において軽減するのに十分な量である。そのような量は、単回投薬量として投与されてもよいし、レジメンに従って、有効であるように投与されてもよい。当該量は、疾患を治癒することができるが、典型的には、疾患の症状を寛解させるために投与される。典型的には、繰り返される投与は、症状の所望の寛解を達成するのに必要とされる。
本明細書中で用いられる「治療的に有効な量」または「治療的に有効な用量」は、対象への投与の後に治療効果をもたらすのに少なくとも十分な化合物を含有する薬剤、化合物、材料、または組成物の量を指す。それゆえに、これは、疾患または障害の症状を予防するか、治癒するか、寛解させるか、抑制するか、部分的に抑制するのに必須の量である。
本明細書中で用いられる「治療効果」は、疾患もしくは状態の症状を変更する、典型的には向上もしくは寛解させる、または疾患もしくは状態を治癒する、対象の処置に由来する効果を意味する。
本明細書中で用いられる「予防的に有効な量」または「予防的に有効な用量」は、対象に投与された場合に、意図される予防的効果、例えば、疾患もしくは症状の発症もしくは再発を予防するか、もしくは遅延させる効果、疾患もしくは症状の発症もしくは再発の見込みを低減する効果、またはウイルス感染の発病率を低減する効果を有する化合物を含有する薬剤、化合物、材料、または組成物の量を指す。完全な予防的効果は、一回用量の投与によって必ずしも生じるわけではなく、一連の用量の投与の後にのみ生じる場合がある。ゆえに、予防的に有効な量は、１回または複数回の投与で投与されてよい。
本明細書中で用いられる、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼ等の「非補体プロテアーゼの投与」は、非補体プロテアーゼをその基質と接触させるあらゆる方法を指す。投与は、インビボで、エクスビボで、またはインビトロで実施され得る。例えば、エクスビボ投与について、体液、例えば血液が、対象から取り出されて、体外で、改変非補体プロテアーゼ、例えば改変ｕ－ＰＡプロテアーゼと接触させられる。インビボ投与のために、改変非補体プロテアーゼ、例えば改変ｕ－ＰＡプロテアーゼを、例えば局所的な（ｌｏｃａｌ，ｔｏｐｉｃａｌ）、全身の、かつ／または他の導入経路によって、体内に導入することができる。インビトロ投与は、細胞培養法等の方法を包含する。
本明細書中で用いられる「単位用量形態」は、ヒトおよび動物対象に適した、当該技術において知られているように個々にパッケージングされた、物理的に個別の単位を指す。
本明細書中で用いられる、処置されることとなる「患者」または「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。哺乳動物として；霊長類、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、およびサル；家畜化された動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、およびウシ；ならびに齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびスナネズミが挙げられる。
本明細書中で用いられる「組合せ」は、２つ以上のアイテム間のあらゆる結合を指す。結合は、空間的であり得、または共通の目的のための２つ以上のアイテムの使用を指す。組合せは、２つ以上の別個のアイテム、例えば、２つの組成物または２つの収集物、それらの混合物、例えば２つ以上のアイテムの単一の混合物、またはそれらのあらゆる変形物であり得る。組合せのエレメントは、通常、機能的に関連している。
本明細書中で用いられる「組成物」は、２つ以上の生成物または化合物［例えば、薬剤、調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ，ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）その他］のあらゆる混合物を指す。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性もしくは非水性の製剤、またはそれらのあらゆる組合せであってよい。
本明細書中で用いられる安定化剤は、例えば、本明細書中の製剤が保存されるか、または用いられる条件（例えば温度）下で、抗体またはコンジュゲートを保護するために製剤に加えられる化合物を指す。ゆえに、挙げられるのは、組成物中でタンパク質が他の要素から分解するのを妨げる薬剤である。そのような薬剤の例として、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール、塩およびバッファ、界面活性剤、阻害剤または基質、ならびに本明細書中に記載される他の薬剤がある。
本明細書中で用いられる「流体」は、流れることができるあらゆる組成物を指す。ゆえに、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合液、ジェル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形態である組成物を包含する。
本明細書中で用いられる「製造品」は、製造されて販売される生成物である。本出願の全体を通して用いられる当該用語は、同じ、または別個のパッケージング品内に改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは核酸分子が含有される治療剤を包含することが意図される。
本明細書中で用いられる「キット」は、試薬、ならびに組合せのエレメントを用いて方法を実践する他の生成物および／または要素を含んでもよい、パッケージングされた組合せを指す。例えば、改変プロテアーゼポリペプチド、例えば本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡプロテアーゼ、または本明細書中で提供される核酸分子、ならびに、以下に限定されないが、投与、診断、および生物活性または性質の評価が挙げられる目的のための別のアイテムを含有するキットが提供される。キットは、使用説明書を備えてもよい。
本明細書中で用いられる「細胞抽出物」は、溶解したか、または破壊された細胞からできる調製物または画分を指す。
本明細書中で用いられる「動物」として、あらゆる動物、例えば、以下に限定されないが；ヒト、ゴリラ、およびサルが挙げられる霊長類；齧歯類、例えばマウスおよびラット；家禽、例えばニワトリ；反芻動物、例えば、ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ；ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、例えばブタ（ｐｉｇ）、および他の動物が挙げられる。非ヒト動物は、意図される動物として、ヒトを排除する。本明細書中で提供されるプロテアーゼは、あらゆる源、動物、植物、原核生物、および菌類由来である。ほとんどのプロテアーゼは、動物起源のものであり、哺乳動物起源のものが挙げられる。
本明細書中で用いられる「単回投薬量の」製剤は、直接的投与用の治療剤の単回用量を含有する製剤を指す。単回投薬量の製剤は、通常、いかなる防腐剤も含有しない。
本明細書中で用いられるマルチドーズ製剤は、複数回用量の治療剤を含有し、直接的に投与されて、治療剤のいくつかの単回用量を提供する製剤を指す。用量は、分、時間、週、日、または月にわたって投与することができる。マルチドーズ製剤は、用量調整、用量プーリング、および／または用量分割を可能にし得る。マルチドーズ製剤は、長い期間をかけて用いられるので、通常、微生物の増殖を妨げるために１つまたは複数の防腐剤を含有する。
本明細書中で用いられる「対照」または「標準」は、試験パラメータにより処理されておらず、または、血漿試料であるならば、目的の状態に罹患していない正常なボランティア由来のものであり得ることを除いて、試験試料と実質的に同一である試料を指す。また、対照は、内部対照であり得る。例えば、対照は、知られている性質または活性を有する試料、例えばウイルスであってよい。
本明細書中で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つまたは複数の薬剤を含む。
本明細書中で用いられる用語「または」は、選択肢にのみ言及することが明示的に示されない限り、または選択肢が互いに相容れないならば、「および／または」を意味するのに用いられる。
本明細書中で用いられる範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表され得る。また、約は、正確な量を含む。それゆえに、「約５塩基」は、「約５塩基」、さらには「５塩基」を意味する。
本明細書中で用いられる「適宜の」または「適宜に」は、その後に記載される事象または状況が起こるか、または起こらないことを、記載が、前記事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。例えば、適宜に置換される基は、基が置換されていないか、または置換されていることを意味する。
本明細書中で用いられる、あらゆる保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、特に明記しない限り、それらの共通の使用、認識されている略語、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ［(1972) Biochem. 11:1726参照］
に従う。
制限するためではなく、開示を明確にするために、詳細な説明を、以下に続くサブセクションに分割する。
Ｂ．Ｕ－ＰＡ構造および機能
ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ（ｕ－ＰＡ、ウロキナーゼまたは尿プラスミノゲンアクティベータとも称される）は、プラスミノゲンの、プラスミンへの加水分解を触媒するセリンプロテアーゼである。ｕ－ＰＡは、尿、血液、精液中に、多くの癌組織内に見出される。これは、プラスミノゲンの、プラスミンへの変換に関係する、種々の生物学的プロセスに関与する（それ自体がセリンプロテアーゼである）。プラスミンは、例えば、フィブリン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、およびラミニンが挙げられる種々の分子の切断を通した細胞移動および組織破壊を含む、種々の標準的かつ病理学的なプロセスにおける役割を有する。ｕ－ＰＡは、創傷治癒、炎症性細胞移動、新血管形成、および腫瘍細胞侵入中の組織リモデリングに関与する。また、ｕ－ＰＡは、以下に限定されないが、肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ－ＳＰ１）の潜在的な形態、血小板由来増殖因子その他が挙げられる他の基質を切断して、活性化する。
本明細書中で提供されるのは、Ｃ３ａ断片およびＣ３ｂ断片へのＣ３の活性化が阻害されるようにＣ３内の阻害配列を切断するよう改変されている、改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ（ｕ－ＰＡ）ポリペプチドである。本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性／特異性は、特に配列番号１～６のいずれかの、非改変ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、より大きな活性および／もしくは特異性またはｋｃａｔ／ｋｍにより、Ｃ３を切断するようなものである。また、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、非改変ｕ－ＰＡポリペプチドの天然の生理学的基質プラスミノゲンについて、活性もしくは特異性、または双方を低減することができた。ゆえに、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体経路において補体活性化を阻害する。また、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、他のｕ－ＰＡ基質、例えばプラスミノゲンと比較して、Ｃ３を切断する選択性の増大を示す。したがって、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、天然の生理学的ｕ－ＰＡ基質に対して不所望の切断活性を示さないので、不所望の副作用を示さない。一部の実施形態において、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プロテアーゼドメインまたは単鎖形態である；そのような場合には、遊離システイン（キモトリプシンナンバリングによる残基位置１２２）は、セリンで置換されて、タンパク質を調製すると、凝集を減らすか、または消失させる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、切断によって活性化される完全長または他の形態である実施形態において、位置１２２（キモトリプシンナンバリングによる）の残基は、通常、ジスルフィド結合が形成されて、二本鎖活性化ポリペプチドを生成し得るように、Ｓで置換されていない。
１．セリンプロテアーゼ
分泌された酵素、および細胞質保存細胞小器官内で隔離された酵素が挙げられるセリンプロテアーゼ（ＳＰ）は、血液凝固、創傷治癒、消化、免疫応答、ならびに腫瘍の侵入および転移が挙げられる、種々の生理学的役割を有する。例えば、キモトリプシン、トリプシン、およびエラスターゼは、消化管内で機能する；因子１０、因子１１、トロンビン、およびプラスミンは、凝固および創傷治癒に関与する；Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、およびＣ３転換酵素は、補体活性化において役割を果たす。
ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼと称される細胞表面タンパク質のクラスは、細胞外ドメインにより膜固定されたタンパク質であるプロテアーゼである。これは、細胞表面タンパク質として、細胞内シグナル伝達においても、細胞表面タンパク質分解事象の媒介においても、役割を果たす。他のセリンプロテアーゼも同様に膜結合して、機能する。他のものは分泌される。多くのセリンプロテアーゼは、細胞表面受容体に結合すると、活性を発揮するので、細胞表面にて作用する。細胞表面タンパク質分解は、種々の細胞機能を媒介する、生物学的に活性なタンパク質の生成についての機構である。
分泌される膜貫通セリンプロテアーゼが挙げられるセリンプロテアーゼは、新生物形成の発症および進行が挙げられるプロセスに関与する。当該プロテアーゼの正確な役割は、完全には詳述していないが、セリンプロテアーゼおよびその阻害剤は、多くの細胞内生理学的プロセスおよび細胞外生理学的プロセスの制御に関与し、癌細胞侵入および転移性拡散、ならびに腫瘍進行に関与する腫瘍の新血管形成における分解作用が挙げられる。プロテアーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解およびリモデリングに関与し、かつ組織リモデリングに寄与し、癌の侵入および転移に必須である。一部のプロテアーゼの活性および／または発現は、腫瘍の進行および発症と相関することが示されている。
セリンプロテアーゼの２０を超えるファミリー（Ｓ１～Ｓ２７を表す）が識別されており、構造的類似性および他の機能的証拠に基づいて、６つのクラン（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦ、およびＳＧ）に分類されている［Rawlings ND et al. (1994) Meth. Enzymol. 244: 19-61］。いくつかのセリンペプチダーゼの反応機構において、類似性がある。キモトリプシン、サブチリシン、およびカルボキシペプチダーゼＣのクランは、共通して、セリン、アスパルテート、およびヒスチジンの触媒性三つ組を有する：セリンは求核分子として、アスパルテートは求電子剤として、ヒスチジンは塩基としての機能を果たす。触媒残基の幾何学的向きは、様々なタンパク質折畳みにもかかわらず、ファミリー間で類似する。触媒残基の線状配置は、一般的に、クラン関係を反映する。例えば、触媒性三つ組は、キモトリプシンクラン（ＳＡ）においてＨＤＳと順序付けられるが、サブチリシンクラン（ＳＢ）においてＤＨＳ、カルボキシペプチダーゼクラン（ＳＣ）においてＳＤＨと順序付けられる。
キモトリプシンスーパーファミリーのセリンプロテアーゼの例として、組織型プラスミノゲンアクティベータ（ｔＰＡ）、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼ（または尿型プラスミノゲンアクティベータ、ｕ－ＰＡ）、アクロシン、活性化タンパク質Ｃ、Ｃ１エステラーゼ、カテプシンＧ、キマーゼ、および血液凝固カスケードのプロテアーゼ（カリクレイン、トロンビン、ならびに因子ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ、およびＸＩＩａが挙げられる）が挙げられる［Barret, A.J., In: Proteinase Inhibitors, Ed. Barrett, A.J., et al., Elsevier, Amsterdam, Pages 3-22 (1986)；Strassburger, W. et al., (1983) FEBS Lett., 157 : 219-223；Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol 5, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, Md. (1972)；およびRosenberg, R.D. et al. (1986) Hosp. Prac., 21: 131-137］。
セリンプロテアーゼファミリー内のプロテアーゼの活性は、活性部位を形成する一セットのアミノ酸残基によって決まる。残基の１つは、常にセリンである；それゆえに、セリンプロテアーゼとして指定される。例えば、キモトリプシン、トリプシン、およびエラスターゼは、類似の構造を共有し、それらの活性セリン残基は、３つ全てにおいて、同じ位置にある（Ｓｅｒ１９５）。それらは、類似性にもかかわらず、様々な基質特異性を有する；それらは、タンパク質消化中に様々なペプチド結合を切断する。例えば、キモトリプシンは、カルボニル炭素が、切断されることとなるペプチド結合の部分である残基上の芳香族側鎖を選ぶ。トリプシンは、正に帯電するＬｙｓまたはＡｒｇ残基を、この位置にて選ぶ。セリンプロテアーゼは、基質認識の性質が著しく異なる：高度に特異的であるものもある（すなわち、血液凝固および免疫補体系に関与するプロテアーゼ）；部分的にのみ特異的であるものもある（すなわち、哺乳動物の消化プロテアーゼトリプシンおよびキモトリプシン）；サブチリシン（細菌のプロテアーゼ）のように、完全に非特異的であるものもある。特異性のこれらの差異にもかかわらず、セリンプロテアーゼの触媒機構は、十分に保存されている。
セリンプロテアーゼによる標的タンパク質の切断の機構は、セリンによる標的ペプチド結合の求核攻撃に基づく。また、アスパルテートまたは金属と付随するシステイン、トレオニン、または水分子は、この役割を果たすことができる。多くの場合、基の求核特性は、アスパルテートによって「プロトン受容体状態」に保持される、ヒスチジンの存在によって向上される。セリン、ヒスチジン、およびアスパルテートのアラインされた側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通の触媒性三つ組を構築する。例えば、キモトリプシンの活性部位残基、およびＭＴＳＰ－１等のキモトリプシンと同じファミリーのメンバーであるセリンプロテアーゼは、Ａｓｐ１０２、Ｈｉｓ５７、およびＳｅｒ１９５である。
キモトリプシンスーパーファミリーの全てのセリンプロテアーゼの触媒ドメインは、配列相同性および構造的相同性を有する。配列相同性は、１）特有の活性部位残基（例えば、トリプシンの場合、Ｓｅｒ１９５、Ｈｉｓ５７、およびＡｓｐ１０２）；２）オキシアニオンホール（例えば、トリプシンの場合、Ｇｌｙ１９３、Ａｓｐ１９４）；および３）構造においてジスルフィド架橋を形成するシステイン残基の保存［Hartley, B.S., (1974) Symp. Soc. Gen. Microbiol., 24: 152-182］を含む。構造的相同性は、１）２つのグリークキー構造によって特徴付けられる共通の折畳み［Richardson, J. (1981) Adv. Prot. Chem., 34:167-339］；２）触媒残基の共通の動態；および３）分子のコア内の構造の詳細な保存［Stroud, R.M. (1974) Sci. Am., 231: 24-88］を含む。
セリンプロテアーゼのキモトリプシンファミリーの全体を通じて、基質と酵素間の骨格相互作用は、完全に保存されるが、側鎖相互作用はかなり変動する。活性部位のＳ１～Ｓ４ポケットを含有するアミノ酸の同一性は、その特定のポケットの基質特異性を決定する。一方のセリンプロテアーゼのアミノ酸の、同じ折畳みのもう一方への移植は、一方の特異性を、他方に向けて改変する。典型的には、Ｓ１～Ｓ４ポケットを含有するプロテアーゼのアミノ酸は、基質の４～５オングストローム以内に側鎖を有するものである。これらのアミノ酸の、プロテアーゼ基質との相互作用は、通常、「第１の殻」相互作用と称される。なぜなら、基質と直接的に接触するからである。しかしながら、最終的に第１の殻アミノ酸を配置する「第２の殻」および「第３の殻」相互作用が存在し得る。第１の殻と第２の殻の基質結合効果は、ベータ－バレルドメイン間のループによって主に決定される。これらのループは、タンパク質のコアエレメントでないので、折畳みの完全性が維持される一方、新規の基質特異性を有するループ変異体が、進化の経過中に選択されて、分子レベルでの必須の代謝または調節ニッチを満たし得る。典型的には、セリンプロテアーゼについて、一次配列内の以下のアミノ酸が、特異性の決定因子である：１９５、１０２、５７（触媒性三つ組）；１８９、１９０、１９１、１９２、および２２６（Ｓ１）；５７、５８と６４間のループ、および９９（Ｓ２）；１９２、２１７、２１８（Ｓ３）；Ｃｙｓ１６８とＣｙｓ１８０間のループ、２１５、および９７～１００（Ｓ４）；ならびに４１および１５１（Ｓ２’）（キモトリプシンナンバリングに基づく）、ここで、Ｓ１位置内のアミノ酸は、Ｐ１特異性に影響を与え、Ｓ２位置内のアミノ酸は、Ｐ２特異性に影響を与え、Ｓ３位置内のアミノ酸は、Ｐ３特異性に影響を与え、Ｓ４位置内のアミノ酸は、Ｐ４特異性に影響を与える。セリンプロテアーゼ内の位置１８９は、Ｓ１特異性を決定するポケットの底に埋まる残基である。ｕ－ＰＡについての構造的決定因子が、表４に記載されており、指定されたプロテアーゼの各々についてのプロテアーゼドメインが、キモトリプシンのプロテアーゼドメインのものとアラインされている。Ｃｙｓ１６８～Ｃｙｓ１８２の下の番号、６０のループの欄の見出しは、２つのアミノ酸間のループ内の、ループ内のアミノ酸の番号を示す。Ｃｙｓ１９１～Ｃｙｓ２２０の欄の見出しの下のｙｅｓ／ｎｏ表示は、ジスルフィド架橋がプロテアーゼ内に存在するかを示す。これらの領域は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのファミリー内で可変であり、それら自体の構造的決定因子を表す。
２．構造
ｕ－ＰＡ ｃＤＮＡを、多数の哺乳動物種からクローニングした。例示的なｕ－ＰＡ前駆体ポリペプチドまたはプレプロウロキナーゼポリペプチドとして、以下に限定されないが、ヒト（配列番号１、および配列番号７によってコードされる）、マウス（配列番号５２）、ラット（配列番号５３）、ウシ（配列番号５４）、ブタ（配列番号５５）、ウサギ（配列番号５６）、ニワトリ（配列番号５７）、キイロヒヒ（配列番号５８）、スマトラオランウータン（配列番号５９）、イヌ（配列番号６０）、ヒツジ（配列番号６１）、マーモセット（配列番号６２）、アカゲザル（配列番号６３）、キタホオジロテナガザル（配列番号６４）、およびチンパンジー（配列番号６５）のｕ－ＰＡポリペプチドが挙げられる。ｍＲＮＡ転写産物は、典型的に、Ｎ末端にて２０アミノ酸シグナル配列を含有する前駆体タンパク質を生成するように翻訳される。ＥＲへの運搬の後に、シグナルペプチドは除去されて、プロウロキナーゼポリペプチドが生じる。例示的なプロウロキナーゼポリペプチドとして、以下に限定されないが、ヒト（配列番号３）、マウス（配列番号６６）、ラット（配列番号６７）、ウシ（配列番号６８）、ブタ（配列番号６９）、ウサギ（配列番号７０）、ニワトリ（配列番号７１）、キイロヒヒ（配列番号７２）、スマトラオランウータン（配列番号７３）、イヌ（配列番号７４）、およびヒツジ（配列番号７５）のｕ－ＰＡポリペプチドが挙げられる。例えば、ヒトｕ－ＰＡ ｍＲＮＡ転写産物は、通常、Ｎ末端にてＭｅｔ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙの２０アミノ酸シグナル配列（配列番号１のアミノ酸残基１～２０）を含有する４３１アミノ酸前駆体タンパク質（配列番号１）を形成するように翻訳される。ゆえに、ＥＲへの運搬およびシグナルペプチドの除去の後に、配列番号３に示されるアミノ酸の配列を有する４１１アミノ酸プロウロキナーゼポリペプチドが生成される。以下でさらに詳細に記載されるプロウロキナーゼは、タンパク質分解切断によってさらに処理されて、二本鎖成熟ｕ－ＰＡポリペプチドが生成するチモーゲンまたはプロ酵素である。ゆえに、例えば、成熟ｕ－ＰＡ（配列番号３）を参照して、野生型鎖活性化ｕ－ＰＡは、Ｃｙｓ１４８（Ｃ９７ａキモトリプシンナンバリング）とＣｙｓ２７９（Ｃ１２２キモトリプシンナンバリング）間のジスルフィド結合を介して、残基１５９～４１１（Ｂ鎖）にジスルフィド結合した第１の鎖（Ａ鎖）（残基１～１５８）を含有する。それゆえに、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドにおいて、プロテアーゼドメインが生成される場合、置換Ｃ１２２Ｓを含有するが、二本鎖形態である活性化形態が生成される場合、１２２（キモトリプシンナンバリング）の残基は、Ｃであるので、通常、活性化配列内で、別のＣとのジスルフィド結合を形成する（以下の考察および実施例１５を参照）。
ヒト前駆体ｕ－ＰＡは、配列番号１に示されるアミノ酸の配列を有し、配列番号７に示されるヌクレオチドの配列によってコードされる。成熟ｕ－ＰＡとも称されるヒトプロ－ｕ－ＰＡは、シグナル配列を欠いており、配列番号３に示される。選択的スプライシングによって生成される、ヒトｕ－ＰＡの２つのアイソフォームが存在する。ヒトｕ－ＰＡのアイソフォーム１は、配列番号１に示される、先に記載される標準的な形態である。ヒトｕ－ＰＡのアイソフォーム２において、配列番号１のアミノ酸１～２９は、配列番号５１のアミノ酸１～１２と置換されて、結果として生じるタンパク質は、４１４個のアミノ酸（配列番号５１に示される）を含有する。ヒトｕ－ＰＡの対立遺伝子変異体および他の変異体が知られている。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸の配列においてアミノ酸改変Ｖ１５Ｌを含有するｕＰＡ変異体が知られている。別の例において、配列番号１に示されるアミノ酸の配列（配列番号４に示されるアミノ酸の配列に相当する）においてアミノ酸改変Ｃ２９９Ｓ（キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２Ｓ）を含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドが知られている。更なる変異体として、配列番号３に示される成熟ｕ－ＰＡにおいてアミノ酸改変Ｐ１２１Ｌ、Ｄ１３０Ｇ、Ｃ１３１Ｗ、Ｉ１９４Ｍ、Ｋ２１１Ｑ、Ｇ３６６ｃ、およびＡ４１０Ｖ（配列番号１におけるアミノ酸改変Ｐ１４１Ｌ、Ｄ１５０Ｇ、Ｃ１５１Ｗ、Ｉ２１４Ｍ、Ｋ２３１Ｑ、Ｇ３８６Ｃ、およびＡ４３０Ｖに相当する）を含有するものが挙げられる。
ｕ－ＰＡポリペプチドは、単鎖チモーゲン分子（プロウロキナーゼまたは単鎖ウロキナーゼとも称される）として合成かつ分泌され、これは、例えば、プラスミン、カリクレイン、カテプシンＢ、マトリプターゼ、および神経成長因子－ガンマが挙げられる種々のプロテアーゼによって、活性二本鎖ｕ－ＰＡに変換される。二本鎖形態を生成するような切断が、ヒトプロウロキナーゼ配列において、残基１５８と１５９（配列番号３）（配列番号１内のアミノ酸残基１７８および１７９に相当する）間で生じる。２本の結果として生じる鎖は、Ｃｙｓ１４８とＣｙｓ２７９間のジスルフィド結合によって連結されることによって、ｕ－ＰＡの二本鎖形態を形成する。また、ｕ－ＰＡの二本鎖形態は、高分子量ｕ－ＰＡ（ＨＭＷ－ｕ－ＰＡ）と称される。ＨＭＷ－ｕ－ＰＡはさらに、Ａ鎖の、短鎖Ａ（Ａ１、配列番号３のアミノ酸１３６～１５７）およびアミノ末端断片への切断によって、低分子量ｕ－ＰＡ（ＬＭＷ－ｕ－ＰＡ）に処理され得る。２１～１７８連結ジスルフィドは、Ｃｙｓ１４８およびＣｙｓ２７９（配列番号３）に相当するＣｙｓを介して、１７９～４１１に連結される。
ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ、ｕ－ＰＡは、Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ触媒性三つ組を含有する古典的なセリンプロテアーゼであり、プラスミノゲン内の特有のＡｒｇ－Ｖａｌ結合を切断して、プラスミンを形成する。プラスミンは、次に、配列番号３のＬｙｓ１５８－Ｉｌｅ１５９（キモトリプシンナンバリングによるＬｙｓ１５－Ｉｌｅ１６に相当する）にてｕ－ＰＡを切断して、先に記載される二本鎖形態を形成することができる。ヒトｕ－ＰＡの触媒性三つ組は、配列番号３のアミノ酸Ｈｉｓ２０４、Ａｓｐ２５５、およびＳｅｒ３５６（キモトリプシンナンバリングによるＨｉｓ５７、Ａｓｐ１０２、およびＳｅｒ１９５に相当する）を含む。配列番号３に示されるヒトｕＰＡの残基Ｓｅｒ１３８およびＳｅｒ３０３は、リン酸化される［Franco et al. (1997) J Cell Biol 137:779-791］。ヒトｕ－ＰＡは、配列番号３のアミノ酸残基Ｔｈｒ１８でのＯリンクグリコシル化、例えばフコシル化［Buko et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:3992-3996］、および配列番号３のアミノ酸残基Ａｓｎ３０２でのＮ－リンクグリコシル化を含有する。成熟ヒトｕ－ＰＡは、配列番号３の残基Ｃ１１－Ｃ１９、Ｃ１３－Ｃ３１、Ｃ３３－Ｃ４２、Ｃ５０－Ｃ１３１、Ｃ７１－Ｃ１１３、Ｃ１０２－Ｃ１２６、Ｃ１８９－Ｃ２０５、Ｃ１９７－Ｃ２６８、Ｃ２９３－Ｃ３６２、Ｃ３２５－Ｃ３４１とＣ３５２－Ｃ３８０間の鎖内ジスルフィド結合、および配列番号３の残基Ｃ１４８－Ｃ２７９間の鎖間ジスルフィド結合を含有する。
ｕ－ＰＡの成熟形態は、４１１残基のタンパク質（２０アミノ酸シグナルペプチドを含有する前駆体形態である、配列番号１に示されるアミノ酸の配列内のアミノ酸残基２１～４３１に相当する）である。ｕ－ＰＡは、３つのドメイン：セリンプロテアーゼドメイン、クリングルドメイン、および増殖因子ドメインを含有する。ヒトｕ－ＰＡの成熟形態において、アミノ酸１～１５８は、増殖因子ドメイン（アミノ酸１～４９）、クリングルドメイン（アミノ酸５０～１３１）、およびドメイン間リンカー領域（アミノ酸１３２～１５８）を含むＮ末端Ａ鎖を表す。アミノ酸１５９～４１１は、Ｃ末端セリンプロテアーゼドメインまたはＢ鎖を表す。ｕ－ＰＡは、単鎖チモーゲン分子として合成かつ分泌され、これは、例えば、プラスミン、カリクレイン、カテプシンＢ、および神経成長因子－ガンマが挙げられる種々のプロテアーゼによって、活性二本鎖ｕ－ＰＡに変換される。二本鎖形態への切断は、成熟ｕ－ＰＡ配列内の残基１５８と１５９（配列番号３内のアミノ酸残基１７８および１７９に相当する）間で生じる。２本の結果として生じる鎖は、ジスルフィド結合によって一緒に維持されることによって、ｕ－ＰＡの二本鎖形態を形成する。
ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータは、３つのドメイン：セリンプロテアーゼドメイン、クリングルドメイン、および増殖因子ドメインを含有する。ヒトｕ－ＰＡのチモーゲンまたはプロ酵素形態において、配列番号３のアミノ酸１～１５８は、上皮増殖因子ドメイン（アミノ酸１～４９）、クリングルドメイン（アミノ酸５０～１３１）、およびドメイン間リンカー領域（アミノ酸１３２～１５８）を含むＮ末端Ａ鎖（または長鎖Ａ）を表し、アミノ酸１５９～４１１は、触媒活性Ｃ末端セリンプロテアーゼドメインまたはＢ鎖を表す。上皮増殖因子ドメインは、細胞表面固定ｕ－ＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）へのｕ－ＰＡの結合を担う。細胞外マトリックスにおいて、ｕ－ＰＡは、ｕ－ＰＡ受容体に結合することによって、細胞膜につながれる。ＬＭＷ－ｕ－ＰＡは、タンパク質分解活性であるが、ｕ－ＰＡ受容体に結合しない。セリンプロテアーゼドメインは、キモトリプシンナンバリングによる残基３７、６０、９６、１１０、１７０、および１８５の周りに、表面露出ループを含有する。活性化または切断されると、触媒プロテアーゼドメインの疎水性結合裂溝（ｃｌｅｆｔ）中へのアミノ末端挿入物が、疎水性相互作用を形成し、Ａｓｐ１９４のサイドポケットへの塩架橋が、触媒的に生成的な（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）構造の基質結合ポケットおよびオキシアニオンホールを安定させる。キモトリプシンナンバリングに従うＡｓｐ１９４は、Ｇｌｙ１４２の主鎖アミノ基、およびＬｙｓ１４３の主鎖カルボニル基への水素結合に関与する［Blouse et al. (2009) J Biol Chem 284:4647-4657］。切断後の構造的変化は、活性化ループ（残基１６～２１）、自己分解ループ（残基１４２～１５２）、オキシアニオン安定化ループ（残基１８４～１９４）、およびＳ１エントランスフレーム（残基２１６～２２３）（全てのナンバリングは、キモトリプシンナンバリングに従う）が挙げられる、活性化ドメインの４つの無秩序な領域を包含する［Blouse et al. (2009) J Biol Chem 284:4647-4657；Hedstrom (2002) Chem Rev 102:4501-4524；Huber and Bode (1978) Acc Chem Res 11:114-122；Madison et al. (1993) Science 262:419-421参照］。
ｕ－ＰＡに対する構造的決定因子を、成熟キモトリプシンのナンバリングに基づくナンバリングと共に、以下の表４に示す。Ｃｙｓ１６８～Ｃｙｓ１８２および６０のループの欄の見出しの下の番号は、２つのアミノ酸間のループ内の、ループ内のアミノ酸の番号を示す。Ｃｙｓ１９１～Ｃｙｓ２２０の欄の見出しの下のｙｅｓ表示は、ジスルフィド架橋が存在することを示す。これらの領域は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのファミリー内で可変であり、それら自体の構造的決定因子を表す。Ｓ１～Ｓ４ポケット内のアミノ酸のいずれか１つまたは複数を改変するようなｕ－ＰＡポリペプチドの改変は、標的基質に対するｕ－ＰＡポリペプチドの特異性または選択性に影響を与える。拡張基質特異性（Ｐ１～Ｐ４）は、ｕ－ＰＡが、Ｐ１ Ａｒｇ後の切断に対する高い特異性、Ｐ２位置での小アミノ酸に対する選択性、Ｐ３位置での極性のある小アミノ酸（ＴｈｒおよびＳｅｒ）に対する選択性を有し、Ｐ４位置にて選択性がないことを明らかにしている［Ke et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:16603-16609；Harris et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97:7754-7759］。
Figure 2022516725000005

３．機能／活性
ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータは、プラスミノゲンの、プラスミンへの加水分解を触媒するセリンプロテアーゼである。プラスミンは、細胞外マトリックスタンパク質の分解に直接的に作用する［Andreasen et al. (2000) Cell. Mol. Life Sci. 57: 25-40］。ｕ－ＰＡは、細胞の接着、移動、および侵入、組織リモデリング、ならびに癌において、重要な役割を果たす［Blasi et al. (2002) Rev Mol Cell Biol 3:932；Andreasen et al. (2000) Cell. Mol. Life Sci. 57: 25-40；Mondino and Blasi (2004) Trends Immunol 25:450；Ploug (2003) Curr Pharm Des 9:1499］。ｕ－ＰＡの異常な発現は、関節リウマチ、アレルギー性脈管炎、色素性乾皮症、および悪性腫瘍の侵襲性能力と関連してきた。
ｕ－ＰＡは、高親和性細胞表面受容体ｕＰＡＲへの結合によって調節される。ｕ－ＰＡの、ｕＰＡＲへの結合は、プラスミノゲン活性化の速度を増して、細胞外マトリックス分解および細胞侵入を増強する。ｕＰＡＲとｕ－ＰＡ間に形成される二元複合体は、膜結合プラスミノゲンと相互作用して、プラスミノゲン活性化についてのＫｍ（すなわち、基質に対するおおよその親和性の動態速度定数）を低減する、より高いオーダーの活性化複合体を形成する［Bass et al. (2002) Biochem. Soc. Trans., 30: 189-194］。ｕ－ＰＡの、ｕＰＡＲへの結合は、同族阻害剤、すなわちＰＡＩ－１による阻害から、プロテアーゼを保護する。これは、血漿中に正常に存在する単鎖ｕ－ＰＡが、ＰＡＩ－１による阻害に影響され易くないから、血漿中のあらゆる活性ｕ－ＰＡが、ＰＡＩ－１によって阻害されることとなるからである。受容体結合される活性ｕ－ＰＡは、ＰＡＩ－１による阻害について、完全に利用可能である。しかしながら、ＰＡＩ－１は、結合活性分子にアクセスすることができない［Bass et al. (2002) Biochem. Soc. Trans., 30: 189-194］。結果として、ｕ－ＰＡは、主に細胞表面に対して機能し、その機能は、プラスミン依存性細胞周囲タンパク質分解の活性化と相関する。
また、ｕ－ＰＡは、肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ－ＳＰ１；マトリプターゼ）の潜在的な形態、血小板由来増殖因子Ｃ（ＰＤＧＦ－Ｃ）、血小板由来増殖因子Ｄ（ＰＤＧＦ－Ｄ）、血小板由来増殖因子ＤＤ（ＰＤＧＦ－ＤＤ）、および他のタンパク質を切断する［例えば、Hurst et al. (2012) Biochem J 441:909-918；Ustach and Kim (2005) Mol Cell Biol 5:6279-6288；Ehnman et al. (2009) Oncogene 28(4): 534-544参照］。プラスミンは、フィブリンクロットを分解して、フィブリン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、およびフォンウィルブランド因子を切断して、補体系のメディエータをタンパク質分解して、コラゲナーゼを活性化する。したがって、プラスミンは、血栓溶解または細胞外マトリックス分解に関与して、プラスミンは血管疾患および癌に関連する。例えば、プラスミノゲン活性化系の要素が、悪性腫瘍において高度に発現されることが観察されてきた。肝細胞増殖因子／散乱因子は、活性化されたＨＧＦの、ＨＧＦ－受容体ｃ－Ｍｅｔへの結合によって、細胞増殖、細胞運動性、および形態形成を調節し、有糸分裂誘発、細胞運動性、およびマトリックス侵入を刺激する能力は、血管新生、腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、および組織再生に関連する。血小板由来増殖因子は、細胞の増殖および分裂を調節し、血管新生において重大な役割を果たす（これは、無制御である場合、癌の特徴である）。一旦タンパク質分解開裂によって活性化されると、ＰＤＧＦは、ＰＧＤＦ受容体チロシンキナーゼに結合して、癌に関与するリン酸化およびいくつかの下流側シグナル伝達経路をもたらす。血管疾患におけるｕ－ＰＡおよび上述のタンパク質の役割に起因して、本明細書中で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドは、これらのタンパク質に向けた選択性が低減するように、変更されている。特異性および活性の変化によって、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３に対する非改変ｕ－ＰＡと比較して、天然の基質に対する活性の低下もしくは活性なし、または実質的な活性なし、および高い活性を示す。結果として、治療的な投薬量にて、本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体活性化を特異的に阻害するが、天然のｕ－ＰＡ標的の切断由来の副作用が何もないか、またはごく少数ある。
Ｃ．Ｃ３を標的化することによる補体阻害
本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、アミノ酸改変を含有しないｕ－ＰＡ［例えば、野生型ヒトｕ－ＰＡ（配列番号１または３参照）］、またはその触媒ドメインもしくはプロテアーゼドメイン（配列番号２参照）、または、置換Ｃ１２２Ｓ（キモトリプシンナンバリングによる）を含む、対応する非改変ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、補体タンパク質Ｃ３内の阻害切断配列に対する特異性および／または活性の増大を示す。残基１２２でのＳとの置換は、Ｃ３に対する特異性または活性を改変しないが、凝集を低減する。Ｃ３が、補体の３つの開始経路に関与する（例えば図１参照）ので、タンパク質分解阻害によるＣ３標的化は、補体カスケードの不活性化用の一般的かつ広い治療標的を提供する。Ｃ３の不活性化切断は、補体の末端活性、および別の経路増幅ループをブロックする。３つの経路は全て、Ｃ３に収束する（例えば図１参照）。補体活性化を阻害する能力によって、そのような改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体活性化と関連する種々の疾患、状態、および病理、例えば、炎症反応および自己免疫疾患を処置するのに用いることができる。補体活性化は、エフェクタ分子および膜攻撃複合体の生成によって部分的に引き起こされる、組織に対する局所的炎症および損傷を促進することによる、疾患および状態の進行と関連する。一例において、例えば多くの自己免疫疾患において、補体は、組織損傷をもたらす。なぜなら、例えば宿主組織に対する抗体によって、不適切な条件下で活性化されるからである。他の状況では、補体は、例えば敗血症によって、正常に活性化され得るが、なお、例えば呼吸窮迫症候群において、疾患進行に寄与する。病理学的に、補体は、十分に制御されなければ、血管（脈管炎）、腎基底膜、ならびに付随する内皮細胞および上皮細胞（腎炎）、関節滑膜（関節炎）、ならびに赤血球（溶血現象）に対する実質的な損傷を引き起こす虞がある。補体活性化におけるＣ３の役割を、以下でさらに詳細に考察する。
１．補体タンパク質Ｃ３、およびその、補体の開始における役割
補体系は、抗体媒介免疫応答においてだけでなく、病原体、例えば、細菌、ウイルス感染細胞、および寄生虫を認識して死滅させる先天性免疫応答においても機能する、３０種以上の可溶性の細胞膜結合タンパク質を包含する。補体活性化は、３つの異なる経路：古典経路、副経路、およびレクチン経路を介して、病原体の表面上で開始される。これらの経路は、開始に必要とされる要素が異なるという点で、異なっているが、経路は最終的に、補体タンパク質Ｃ３を切断して、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成をトリガする同じセットのエフェクタ分子（例えばＣ３転換酵素）を生成する（例えば図１参照）。ゆえに、補体タンパク質Ｃ３は、治療薬の魅力的な標的である。なぜなら、Ｃ３の調節が、種々のオプソニン、アナフィラトキシン、およびＭＡＣの調節をもたらすからである。さらに、天然に存在する補体阻害剤タンパク質は、因子Ｈ（ＦＨ）、ＣＲ１、補体受容体Ｉｇ（ＣＲ１ｇ）、ＤＡＦ、およびＭＣＰが挙げられ、Ｃ３レベルにて阻害する。
補体活性化の３つの（３）経路が存在する（これらの経路を示す図１参照）。補体の経路は異なっている；各々が、開始について、異なる分子および機構に依存する。経路は、同じセットのエフェクタ分子、すなわち、Ｃ３転換酵素を生成するように収束するという点で、類似している。古典経路およびレクチン経路において、Ｃ４ｂ２ｂは、Ｃ３転換酵素としての機能を果たす；副経路において、Ｃ３ｂＢｂは、Ｃ３転換酵素である（表５参照）。Ｃ３の切断は、オプソニンとしても、以降の補体反応のための補体系の主要なエフェクタ分子としても作用するＣ３ｂ、および炎症のペプチドメディエータであるＣ３ａを生成する。Ｃ３ｂの、各Ｃ３転換酵素への付加が、Ｃ５転換酵素を形成し、これはＣ５ａおよびＣ５ｂを生成する。Ｃ５ａは、Ｃ３ａのように、炎症のペプチドメディエータである。Ｃ５ｂは、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の生成に達する反応のシーケンスを開始する補体活性化の「後期の」事象を媒介する。３つの経路が、様々なＣ３転換酵素およびＣ５転換酵素を生成するが、経路は全て、Ｃ３およびＣ５の分割した生成物を生成して、ＭＡＣを形成する。これ以外にも、Ｃ３は、外部プロテアーゼ、例えばリソソーム酵素およびエラスターゼによって切断され活性化され得る［Markiewski and Lambris (2007) Am J Pathology 171:715-727；Ricklin and Lambris (2007) Nat Biotechnol 25:1265-1275］。
Figure 2022516725000006

ａ．古典経路
Ｃ１ｑは、補体の古典経路の第１の要素である。Ｃ１ｑは、全体的な共有される構造的相同性に起因して、タンパク質のコレクチンファミリーと関連するカルシウム依存性結合タンパク質である［Malhotra et al., (1994) Clin Exp Immunol. 97(2): 4-9；Holmskov et al. (1994) Immunol Today 15(2): 67-74］。コレクチンは、多くの場合、パターン認識分子と呼ばれ、通常、免疫細胞によるファゴサイトーシスのために病原体を標的化するオプソニンとして機能する。従来のコレクチン、例えばＭＢＬと対照的に、Ｃ１ｑのカルボキシ末端球状認識ドメインは、レクチン活性を有していないが、その球状ドメインの静電表面電位の著しい差異に起因して、「帯電した」パターン認識分子として機能することができる［Gaboriaud et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(47): 46974-46982］。
Ｃ１ｑは、２つの異なる方法で、補体の古典経路を開始する。第１に、古典経路は、Ｃ１ｑの、免疫複合体（すなわち、抗原－抗体複合体または凝集ＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体）との相互作用によって活性化されるので、抗体媒介体液性免疫応答は補体活性化と関連する。ＩｇＭまたはＩｇＧのＦａｂ部分（可変領域）が抗原に結合すると、Ｆｃ（定常）領域の構造は変更されて、Ｃ１ｑは結合することができる。Ｃ１ｑは、活性化されるには、少なくとも２つのＦｃ領域に結合しなければならない。しかしながら、Ｃ１ｑはまた、抗体の不在下で補体を活性化することによって、感染に対する先天性の、または即時の免疫応答において機能することができる。抗体による開始の他に、補体活性化はまた、Ｃ１ｑの、非免疫分子、例えばポリアニオン（細菌のリポ多糖、ＤＮＡ、およびＲＮＡ）、特定の小多糖、ウイルス膜、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ要素（ＳＡＰ）、ならびに細菌、真菌、およびウイルスの膜要素との相互作用によって達成される。
Ｃ１ｑは、Ｃ１複合体の一部であり、これは、各々チモーゲンＣ１ｒおよびＣ１ｓである２つの分子に結合した単一のＣ１ｑ分子を含有する。１つを超えるＣ１ｑ球状ドメインの、標的表面（例えば凝集抗体または病原体）への結合は、（Ｃ１ｒ：Ｃ１ｓ）２複合体に構造変化を引き起こし、これがＣ１ｒプロテアーゼの活性化をもたらして、Ｃ１ｓを切断して活性セリンプロテアーゼを生成する。活性Ｃ１ｓは、以降の補体要素Ｃ４およびＣ２を切断して、Ｃ４ｂおよびＣ２ｂを生成する。これらは合わさって、古典経路のＣ３転換酵素を形成する。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３を、病原体表面に共有結合的に付着してオプソニンとしての機能を果たすＣ３ｂ、および炎症を刺激するＣ３ａに切断する。一部のＣ３ｂ分子は、Ｃ４ｂ２ｂ複合体と結合して、古典カスケードＣ５転換酵素であるＣ４ｂ２ｂ３ｂをもたらす。表６は、補体の古典経路に関与するタンパク質を要約する。
Figure 2022516725000007

ｂ．副経路
副経路は、抗体の不在下で、外来病原体によって開始される。副経路による補体の開始は、Ｃ３の、Ｃ３ｂへの自然発生的な加水分解により起こる。少量のＣ３ｂが常に、血清および組織プロテアーゼ活性に起因して、体液中に存在する。宿主自己細胞は通常、結合すればＣ３ｂを不活性化する高いレベルの膜シアル酸を含有するが、細菌は、低いレベルの外部シアル酸を含有することによって、Ｃ３ｂに、不活性化することなく結合する。病原体表面上のＣ３ｂは、プロテアーゼチモーゲン因子Ｂによって認識される。因子Ｂは、因子Ｄによって切断される。因子Ｄは、チモーゲンとしてではなく活性酵素として循環する、補体系の唯一の活性化プロテアーゼであるが、因子Ｂが因子Ｄの唯一の基質であることから、正常な血清中の低レベルの活性プロテアーゼの存在は、宿主にとって概して安全である。因子Ｄによる因子Ｂの切断は、活性生成物Ｂｂをもたらし、これは、Ｃ３ｂと結合して、副経路のＣ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂを形成し得る。古典経路と類似して、Ｃ３転換酵素は、Ｃ３からより多くのＣ３ｂおよびＣ３ａを生成する。Ｃ３ｂは、病原体表面に共有結合的に付着して、オプソニンとしての機能を果たし、加えて、副経路を開始する一方、Ｃ３ａは、炎症を刺激する。一部のＣ３ｂは、複合体に結合して、副経路のＣ５転換酵素であるＣ３ｂＢｂ３ｂを形成する。Ｃ３ｂＢｂ３ｂは、微生物の表面に結合して転換酵素を安定させる血漿タンパク質プロパージンまたは因子Ｐによって安定する。表７は、補体の副経路に関与するタンパク質を要約する。
Figure 2022516725000008

ｃ．レクチン経路
レクチン経路（ＭＢＬ経路とも称される）は、レクチンタンパク質による病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ；すなわち炭水化物部分）の認識および結合の後に開始される。補体のレクチン経路を活性化するレクチンタンパク質の例として、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリン（すなわち、Ｌ－フィコリン、Ｍ－フィコリン、およびＨ－フィコリン）が挙げられる。ＭＢＬは、タンパク質のコレクチンファミリーのメンバーであることによって、同一ポリペプチド鎖で構成されるサブユニット（各々、システインリッチ、コラーゲン様、ネック、および炭水化物－認識またはレクチンドメインを含有する）のオリゴマーとして存在する。ＭＢＬは、病原体の表面上の炭水化物部分、特に中性糖、例えばマンノースまたはＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を、その球状レクチンドメインを介して、カルシウム依存的に認識するパターン認識分子としての機能を果たす。また、ＭＢＬは、食細胞による、細菌、ウイルス、および菌類の病原体のファゴサイトーシスを促進するオプソニンとしての機能を果たす。レクチン経路の更なるイニシエータとして、フィコリンが挙げられ、Ｌ－フィコリン、Ｍ－フィコリン、およびＨ－フィコリンが挙げられる［例えば、Liu et al. (2005) J Immunol. 175:3150-3156参照］。ＭＢＬと類似して、フィコリンは、炭水化物部分、例えばＮ－アセチルグルコサミンおよびマンノース構造を認識する。
ＭＢＬまたはフィコリンによる副経路の活性化は、Ｃ１ｑによる古典経路の活性化に類似しており、これにより、単一のレクチン分子が、２つのプロテアーゼチモーゲンと相互作用する。レクチンタンパク質の場合、チモーゲンは、ＭＢＬ－関連セリンプロテアーゼ、ＭＡＳＰ－１およびＭＡＳＰ－２である。これらは、古典経路のＣ１ｒチモーゲンおよびＣ１ｓチモーゲンに密接に相同である。レクチンタンパク質によって、例えば病原体表面に結合することによってＰＡＭＰを認識すると、ＭＡＳＰ－１およびＭＡＳＰ－２は、Ｃ４およびＣ２を切断してＭＢＬカスケードＣ３転換酵素を形成するように活性化される。続いて、Ｃ３ｂは、複合体に結合して、ＭＢＬカスケードＣ５転換酵素を形成する。ＭＡＳＰ活性化は、微生物に対する応答にだけでなく、以下に限定されないが、組織損傷、例えば臓器移植において観察されるものが挙げられる、中性糖を曝すことを包含するあらゆる応答にも関係する。別カスケードのように、ＭＢＬカスケードは、抗体と独立して活性化される；古典カスケードのように、ＭＢＬカスケードは、Ｃ４およびＣ２を利用して、Ｃ３転換酵素を形成する。表８は、補体のレクチン経路に関与するタンパク質を要約する。
Figure 2022516725000009

ｄ．補体媒介エフェクタ機能
どの開始経路が用いられるかに拘らず、最終的な結果は、補体タンパク質の活性化された断片（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａアナフィラトキシン、ならびにＣ５ｂ－９膜攻撃複合体）の形成であり、これらは、多様なエフェクタ機能を媒介するエフェクタ分子としての機能を果たす。エフェクタ機能（例えば走化性およびオプソニン作用）の開始のための細胞による補体エフェクタ分子の認識は、補体受容体の多様な基によって媒介される。補体受容体は、赤血球、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、および肥満細胞が挙げられる広範な細胞型上に分布する。補体要素が受容体に結合すると、受容体は、細胞内シグナル伝達カスケードを開始して、細胞応答をもたらす、例えば、細菌のファゴサイトーシスを刺激して、細胞から炎症性分子を分泌する。例えば、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、およびそれらの生成物を認識する補体受容体ＣＲ１およびＣＲ２は、走化性を刺激するのに重要である。ＣＲ３（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）およびＣＲ４（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）は、同様に、食細胞の応答に重要であるが、ｉＣ３ｂに応答して白血球の接着および移動においても役割を果たすインテグリンである。Ｃ５ａ受容体およびＣ３ａ受容体は、Ｃ５ａアナフィラトキシンおよびＣ３ａアナフィラトキシンの炎症誘発媒介機能の多くにおいて役割を果たすＧタンパク質共役型受容体である。例えば、Ｃ３ａの受容体、Ｃ３ａＲは、肥満細胞、好酸球、好中球、好塩基球、および単球上に存在し、Ｃ３ａの炎症誘発作用に直接関与する。
ゆえに、補体受容体を通して、これらの補体エフェクタ分子断片は、白血球走化性、マクロファージの活性化、血管浸透性、および細胞溶解が挙げられるいくつかの機能を媒介する［Frank, M. and Fries, L. Complement. In Paul, W. (ed.) Fundamental Immunology, Raven Press, 1989］。補体生成物の一部のエフェクタ機能の概要を、表９に記載する。
Figure 2022516725000010

ｉ．補体媒介溶解：膜攻撃複合体
３つ全ての経路による補体カスケードの最終工程は、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成である（図１）。Ｃ５は、あらゆるＣ５転換酵素によってＣ５ａおよびＣ５ｂに切断され得る。Ｃ５ｂは溶液中でＣ６およびＣ７と組み合わさって、Ｃ５ｂ６７複合体は、Ｃ７上の疎水性部位を介して病原体脂質膜と結合する。Ｃ８、およびＣ９のいくつかの分子（これらも疎水性部位を有する）が結合して、Ｃ５ｂ６７８９またはＣ５ｂ－９とも称される膜攻撃複合体を形成する。Ｃ５ｂ－９は、膜中に、水および溶質が通過することができる孔を形成して、浸透圧溶解および細胞死をもたらす。補体が、Ｃ５ｂ６７が付着し得る脂質膜のない抗原上で活性化されるならば、Ｃ５ｂ６７複合体は、細胞のすぐ近くに結合して、バイスタンダー溶解を開始することができる。単一のＭＡＣは、赤血球を溶解させることができるが、複数のＭＡＣが存在しない限り、有核細胞は、ＭＡＣをエンドサイトーシスにより取り込んで、損傷を修復することができる。露出した外膜を有するグラム陰性菌、およびエンベロープウイルスは、補体媒介溶解に概して影響され易い。厚いペプチドグリカン層によって血漿膜が保護されているグラム陽性菌、カプセルもしくは粘液層が細胞壁の周りにある細菌、または脂質エンベロープを有していないウイルスは、あまり影響されない。同様に、ＭＡＣは、補体（ＳＩＣ）およびクラステリンの連鎖球菌阻害剤等の膜挿入の前に、複合体に結合するタンパク質によって崩壊され得る。典型的には、ＭＡＣは、グラム陰性菌、および外来抗原を提示するヒト細胞（ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、その他）を、それらの溶解を引き起こすことによって破壊するのを補助し、さらにはエンベロープウイルスのエンベロープに損傷を与えることができる。
ｉｉ．炎症
炎症は、血管が拡張して、より浸透性になることで、生体防御細胞および防御化学物質が血液から離れて、組織に入ることを可能にするプロセスである。補体活性化は、いくつかの炎症誘発性メディエータ、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａの形成をもたらす。血清または血漿中のインタクトアナフィラトキシンは、カルボキシペプチダーゼＮによって、より安定した、あまり活性でないＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ、Ｃ４ａ－ｄｅｓＡｒｇ、またはＣ５ａ－ｄｅｓＡｒｇ形態に急速に変換される。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａ、ならびに、それほどではないにせよ、それらのｄｅｓＡｒｇ誘導体は、炎症性活性が理由のため、アナフィラトキシンと呼ばれる強力な生物活性ポリペプチドである。アナフィラトキシンは、種々の細胞型上の受容体に結合して、平滑筋収縮を刺激し、血管浸透性を増大させ、肥満細胞を活性化して炎症性メディエータを放出させる。最も強力なアナフィラトキシンであるＣ５ａは、主に、白血球、特に好中球に作用する。Ｃ５ａは、接着分子の発現の増大を刺激することによって、感染の部位にて、血管壁への白血球付着を刺激するので、白血球は、血管から組織中に絞り出され得る（ｓｑｕｅｅｚｅ）（漏出性出血と呼ばれるプロセスである）。また、Ｃ５ａは、好中球を刺激して、細胞外死滅、タンパク質分解酵素、およびロイコトリエンのための活性酸素種を生成する。また、Ｃ５ａはさらに、ケモカイン、サイトカイン、および他の炎症誘発性メディエータの産生を誘導することによって、炎症性プロセスを間接的に拡大することができる。また、Ｃ５ａは、肥満細胞と相互作用して、ヒスタミン等の血管拡張物質を放出するので、血管はより浸透性になる。また、Ｃ３ａは、白血球と相互作用する。好酸球に及ぼす主要な作用は、アレルギー性炎症におけるＣ３ａの役割を示唆している。Ｃ３ａは、平滑筋収縮を誘導し、血管浸透性を増強し、好塩基球の脱顆粒、ならびにヒスタミンおよび他の血管作動性物質の放出を引き起こす。Ｃ２ａは、Ｃ２キニンに変換され得、これは、血管を拡張させることによって血圧を調節する。
技術的にはアナフィラトキシンと考えられないが、Ｃ３ｂの不活性誘導体であるｉＣ３ｂは、血管内皮への白血球接着を誘導し、その細胞表面インテグリン受容体への結合を介して炎症誘発性サイトカインＩＬ－１の産生を誘導するように機能する。また、Ｃ５ｂ－９は、細胞接着分子、例えばＥセレクチンの発現を誘導し、インターロイキン－８分泌を誘導することによって、白血球の接着、活性化、および走化性を間接的に刺激する［Bhole et al. (2003) Crit Care Med 31(1): 97-104］。また、Ｃ５ｂ－９は、炎症、例えば、プロスタグランジンＥ２、ロイコトリエンＢ４、およびトロンボキサンに寄与する二次メディエータの放出を刺激する。
ヒト補体要素Ｃ３およびＣ５の、それぞれのアナフィラトキシン生成物を産するような変換は、以下が挙げられる特定の、天然に存在する病理学的状態に関係してきた：自己免疫不全、例えば、全身エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性腫瘍、心筋梗塞、Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒ網膜症、敗血症、および成人呼吸窮迫症候群。Ｃ３ａおよびＣ５ａの循環レベルの増大は、医原性の補体活性化、例えば：心肺バイパス手術、腎透析、およびナイロン繊維白血球分離（ｌｅｕｋａｐｈｏｒｅｓｉｓ）と関連する特定の状態において検出されてきた。
ｉｉｉ．走化性
走化性は、細胞が環境内で化学物質に応答して移動するように導かれるプロセスである。免疫応答において、種々のケモカインが、食細胞等の細胞の移動を、感染の部位に導く。例えば、Ｃ５ａは、循環好中球の主要な走化因子であるが、単球の走化性を誘導することもできる。食細胞は、濃度が増大しているＣ５ａに向けて移動してから、ＣＲ１受容体を介して、抗原に付着されたＣ３ｂ分子に付着する。好塩基球、好酸球、好中球、および単核食細胞により観察されるＣ５ａの走化性作用は、１０－１０Ｍもの低い濃度にて有効である。
ｉｖ．オプソニン作用
補体の重要な作用は、食細胞による病原体の吸収および破壊を促進することである。これは、オプソニン作用と呼ばれるプロセスによって起こり、これにより、標的細菌に結合された補体要素が、好中球またはマクロファージ等の食細胞の表面上の補体受容体と相互作用する。この例では、補体エフェクタ分子は、オプソニンと呼ばれる。病原体のオプソニン作用は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの主要な機能である。また、ｉＣ３ｂは、オプソニンとして機能する。Ｃ３ａおよびＣ５ａは、食細胞上でのＣ３ｂ受容体の発現を増大させて、その代謝活性を増大させる。
Ｃ３ｂ、および、それほどではないにせよ、Ｃ４ｂは、生体から有害な免疫複合体を除去するのを補助する。Ｃ３ｂおよびＣ４ｂは、免疫複合体を、赤血球上のＣＲ１受容体に付着させる。続いて、赤血球は、破壊のために、脾臓および肝臓内の固定マクロファージに複合体を届ける。免疫複合体は、有害なＩＩＩ型過敏症をもたらし得る。
ｖ．体液性免疫応答の活性化
Ｂ細胞の活性化は、抗原によるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のライゲーションを必要とする。しかしながら、補体は、抗原に対するＢ細胞応答の閾値を最大１０００倍低下させる役割を果たすことが示された。これは、Ｃ３の分解断片から生成される補体生成物であるＣ３ｄまたはＣ３ｄｇの、ＢＣＲと同時ライゲートすることができるＢ－リンパ球上のＣＲ２受容体への結合によって起こる。同時ライゲーションは、Ｃ３ｄによりオプソニン化された、免疫複合体等の抗原性粒子が、Ｃ３ｄを介してＣＲ２受容体に、抗原を介してＢＣＲに結合する場合に起こる。また、抗原複合体の同時ライゲーションは、Ｃ３ｄが抗原に結合して、抗原提示細胞、例えば樹状細胞による吸収を増強する場合に起こり得、これはその後、抗原をＢ細胞に提示して、抗体応答を増強することができる。ＣＲ２の欠損マウスは、天然抗体のレベルの低減および体液性免疫応答の障害をもたらす、Ｂ細胞機能の欠陥を提示する。
２．Ｃ３の構造および機能
本明細書中で提供される変異体ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３またはそのタンパク質分解断片を切断することによって、補体を阻害する。ヒト補体タンパク質Ｃ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１０２４）は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する１６６３アミノ酸単鎖プレプロタンパク質である。タンパク質は、第１９染色体上に位置決めされる４１ｋｂ遺伝子（配列番号４６に示されるヌクレオチド配列）によってコードされる。プレプロタンパク質は、２２アミノ酸シグナルペプチド（配列番号４７のアミノ酸１～２２）、およびテトラアルギニン配列（配列番号４７のアミノ酸６７８～６８１）を含有し、これが、フーリン様酵素によって除去されて、アミノ酸残基Ｃｙｓ５５９とＣｙｓ８１６間の鎖間ジスルフィド結合によって連結されるベータ鎖（配列番号４７のアミノ酸２３～６６７）およびアルファ鎖（配列番号４７のアミノ酸６７２～１６６３）を含有する成熟二本鎖タンパク質の形成をもたらす。成熟した二本鎖タンパク質は、配列番号７７に示されるアミノ酸の配列を有する。
補体カスケードの間に、補体タンパク質Ｃ３が、タンパク質分解切断によってさらに処理されて、種々のＣ３タンパク質分解断片を形成する。先に記載されるように、３つの補体開始経路は全て、Ｃ３転換酵素Ｃ４ｂ２ｂおよびＣ３ｂＢｂに収束する。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３を、配列番号４７（以下の表１０を参照）の残基７４８と７４９間で切断して、アナフィラトキシンＣ３ａ（配列番号４７のアミノ酸６７２～７４８）およびオプソニンＣ３ｂ（Ｃ３ｂアルファ’鎖；配列番号４７のアミノ酸７４９～１６６３）を生成する。Ｃ３ａは、炎症に関与し、Ｃ３ｂは、Ｃ５転換酵素を形成して、最終的にＣ５ａアナフィラトキシンおよびＭＡＣをもたらす。本明細書中で提供される変異体ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体を阻害するので、Ｃ３をこのＧＬＡＲ切断部位にて切断しない。
Ｃ３ｂは、Ｃ５、プロパージン（Ｐ）、因子Ｈ、Ｂ、およびＩ、補体受容体１（ＣＲ１）、ならびに膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）が挙げられる種々の補体要素のための結合部位を有する［Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48参照］。補因子Ｈ、ＣＲ１、およびＭＣＰの存在下での、血漿プロテアーゼである因子Ｉの結合は、Ｃ３ｂの不活性化をもたらすが、因子Ｄの存在下での因子ＢおよびＰの結合は、Ｃ３転換酵素の増幅およびＭＡＣの開始をもたらす。因子Ｉは、補因子の存在下で、Ｃ３ｂを、配列番号４７（以下の表１０を参照）の残基１３０３～１３０４、１３２０～１３２１、および９５４～９５５間で切断して、断片ｉＣ３ｂ（配列番号４７のアミノ酸７４９～１３０３）およびＣ３ｆ（配列番号４７のアミノ酸１３０４～１３２０）を生成する。その後、因子Ｉは、ｉＣ３ｂを切断して、Ｃ３ｃ（Ｃ３ｃアルファ’鎖断片１；配列番号４７のアミノ酸７４９～９５４）およびＣ３ｄｇ（配列番号４７のアミノ酸９５５～１３０３）を生成する。最終的な結果は、Ｃ３ｂが常時不活性化されるというものである［Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48参照］。因子ＩがＣ３ｂを不活性化するので、因子Ｉ切断部位は、本明細書中で提供される変異体ｕ－ＰＡポリペプチドによる切断の候補である。更なるＣ３ｂタンパク質分解断片として、Ｃ３ｇ（配列番号４７のアミノ酸９５５～１００１）、Ｃ３ｄ（配列番号４７のアミノ酸１００２～１３０３）、およびＣ３ｃアルファ’鎖断片２（配列番号４７のアミノ酸１３２１～１６６３）が挙げられる。補体タンパク質Ｃ３内の切断配列が、以下の表１０に示されており、これは、Ｐ４－Ｐ１残基、切断部位（Ｐ１－Ｐ１’部位）のアミノ酸残基、および切断を担うプロテアーゼを記載する。本明細書中で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、これらの部位にて切断しない。
Figure 2022516725000011

ａ．Ｃ３ａ
Ｃ３ａ（配列番号４７のアミノ酸６７２～７４８）は、炎症、好塩基球および肥満細胞の脱顆粒、血管浸透性の増強、平滑筋収縮、ならびにサプレッサＴ細胞の誘導に関与するアナフィラトキシンである。
ｂ．Ｃ３ｂ
Ｃ３ｂ（配列番号４７のアミノ酸７４９～１６６３）は、補体カスケードにおける種々の役割を有する。Ｃ３ｂは、食細胞による病原体の吸収および破壊を促進するオプソニンである。加えて、Ｃ３ｂは、Ｃ３転換酵素と組み合わさって、Ｃ５転換酵素を生成し、これは、補体タンパク質Ｃ５を活性化することによって、Ｃ５ａアナフィラトキシンおよびＣ５ｂを生成し、これらは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９と組み合わさって、膜攻撃複合体を形成する。さらに、先のセクション１ｂに記載されるように、Ｃ３ｂは、補体開始の副経路に関与する。Ｃ３ｂは、血漿プロテアーゼである補体調節タンパク質因子Ｉによって調節され、これは、Ｃ３ｂを、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｆ、およびＣ３ｄｇが挙げられる種々の断片に分解することによって、Ｃ３ｂを常時不活性化する。
Ｃ３ｂは、Ｃ３転換酵素Ｃ４ｂ２ｂおよびＣ３ｂＢｂに結合することによってＣ５転換酵素Ｃ４ｂ２ｂ３ｂおよびＣ３ｂＢｂ３ｂを生成する能力によって、補体媒介エフェクタ機能における重要な役割を果たす。Ｃ５転換酵素は、チモーゲンＣ５をその活性断片、すなわちＣ５ａアナフィラトキシンおよびＣ５ｂに切断する。Ｃ５ａは、走化性および炎症に関与し、Ｃ５ｂは、ＭＡＣの形成に関与する。
ｃ．Ｃ３ｂの阻害剤
Ｃ３ｂは、Ｃ５、プロパージン（Ｐ）、因子Ｈ、Ｂ、およびＩ、補体受容体１（ＣＲ１）、ならびに膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）が挙げられる種々の補体要素のための結合部位を有する［Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48参照］。補因子Ｈ、ＣＲ１、およびＭＣＰの存在下での、血漿プロテアーゼである因子Ｉの結合は、Ｃ３ｂの不活性化をもたらすが、因子Ｄの存在下での因子ＢおよびＰの結合は、Ｃ３転換酵素の増幅およびＭＡＣの開始をもたらす。因子Ｉは、補因子の存在下で、Ｃ３ｂを、配列番号４７の残基１３０３～１３０４、１３２０～１３２１、および９５４～９５５間で切断して、断片ｉＣ３ｂ（配列番号４７のアミノ酸７４９～１３０３）およびＣ３ｆ（配列番号４７のアミノ酸１３０４～１３２０）を生成する。技術的にはアナフィラトキシンと考えられないが、Ｃ３ｂの不活性誘導体であるｉＣ３ｂは、血管内皮への白血球接着を誘導し、その細胞表面インテグリン受容体への結合を介して炎症誘発性サイトカインＩＬ－１の産生を誘導するように機能する。タンパク質ｉＣ３ｂは、オプソニンとして機能する。その後、因子Ｉは、ｉＣ３ｂを切断して、断片Ｃ３ｃ（Ｃ３ｃアルファ’鎖断片１；配列番号４７のアミノ酸７４９～９５４、およびＣ３ｃアルファ’鎖断片２：配列番号４７のアミノ酸１３２１～１６６３）、およびＣ３ｄｇ（配列番号４７のアミノ酸９５５～１３０３）を生成する。最終的な結果は、Ｃ３ｂが常時不活性化されるというものである［Sahu and Lambris (2001) Immunological Reviews 180:35-48参照］。Ｃ３ｄｇは、さらに切断されて、断片Ｃ３ｇ（配列番号４７のアミノ酸９５５～１００１）およびＣ３ｄ（配列番号４７のアミノ酸１００２～１３０３）を生成し得る。
Ｄ．Ｃ３を切断する改変ｕ－ＰＡポリペプチド
改変または変異体ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ（ｕ－ＰＡ）ポリペプチドが、本明細書で提供される。また、融合タンパク質等の改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有するコンジュゲートも提供され、結果として得られたそれらの活性化形態がＣ３を切断する。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、野生型、天然または参照ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、変更された活性または特性を示す。例えば、本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号１～６のいずれかに示される野生型、自然もしくは参照ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、または配列番号５に示される参照ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン等の配列番号１～６のいずれかに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、特に少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドにおいて、改変を含有する。補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断をもたらすことによって、補体活性化を変更させる（阻害する）ｕ－ＰＡポリペプチドは、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドに包含される。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドの中には、補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断をもたらすものもある。改変（置換、欠失および／または挿入）を含有しないｕ－ＰＡの対応する形態と比較して、または配列が配列番号１～６のいずれかに示される非改変ｕ－ＰＡの対応する形態と比較して、より大きな活性または特異性、Ｋｃａｔ／ＫｍでＣ３の阻害性切断をもたらすものが包含される。また、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、アミノ酸改変を含有しない対応するｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、プラスミノゲンの切断および／またはｕＰＡＲへの結合を含む、非改変ｕ－ＰＡによって切断または認識される基質および標的に対する低下した特異性および／または選択性を有し得る。
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断または不活性化切断を通じて、補体を阻害または不活性化する。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ３の阻害または不活性化をもたらす切断部位で、補体タンパク質Ｃ３を切断することによって、補体を阻害または不活性化する。得られたＣ３の切断が、補体の不活性化または活性化の阻害をもたらす限りは、補体タンパク質Ｃ３の不活性化または阻害切断は、Ｃ３における任意の配列に存在し得る。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、補体活性化を阻害するため、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ３の酵素前駆体形態の切断をもたらさず、Ｃ３ａおよびＣ３ｂ活性化断片を生成する。したがって、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号４７の残基７４８～７４９間でＣ３を切断せず、このことが、Ｃ３ａおよびＣ３ｂの生成をもたらす。補体タンパク質Ｃ３の阻害または不活性化切断部位は、経験的に決定または同定され得る。必要に応じて、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、以下のセクションＥで記載されるように、および実施例において例示されるように、補体を阻害するための能力に関して検査することができる。
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断または不活性化切断を触媒する。得られたＣ３断片が、不活性であるか、または補体媒介性エフェクタ機能を活性化することができない限りは、任意の切断配列で、補体タンパク質Ｃ３を切断する。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲンおよびｕＰＡＲを含む、ｕ－ＰＡの天然標的に対して、変更された（即ち、低下した）特異性および／または選択性を有する。一例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲンの切断に対して低減した特性を有する。別の例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ｕＰＡＲへの結合に対して低減した選択性を有する。幾つかの例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲンの切断に対して低減した特性を、またｕＰＡＲへの結合に対して低減した選択性を有する。他の例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３の切断に対して増大した特異性を、またプラスミノゲンの切断に対して低下した特異性を有する。他の例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３に対して増大した選択性を、またプラスミノゲンおよび／またはｕＰＡＲに対して低下した選択性を有する。
本明細書で提供され、かつ実施例に記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、ｕ－ＰＡの単離されたプロテアーゼドメインである。プロテアーゼ活性を保持する、それらのより小さな部分も意図される。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインの突然変異体、特に、遊離している（即ち、タンパク質中の任意の他のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成しない）プロテアーゼドメイン中のＣｙｓ残基が、別のアミノ酸置換で、好ましくは保存的アミノ酸置換または例えばセリンによる置換等の活性を排除しない置換で置換されている改変ｕ－ＰＡポリペプチド、およびグリコシル化部位が排除されている改変ｕ－ＰＡポリペプチドである。触媒活性が保持される他の保存的アミノ酸置換を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドもまた、意図される（例えば、例示的なアミノ酸置換に関して、表３を参照されたい）。
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、それらが、補体の不活性化または阻害をもたらす様式で、補体タンパク質Ｃ３を切断するように、１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。改変は、単一アミノ酸置換（置換）、挿入もしくは欠失等の単一アミノ酸改変、または多重アミノ酸置換、挿入もしくは欠失等の多重アミノ酸改変であり得る。例示的な改変は、単一または多重アミノ酸置換を含む、アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、表３に示されるような保存的置換、または本明細書に記載されるいずれか等の非保存的置換であり得る。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、改変を含有しないｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、少なくともまたは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個もしくはそれよりも多い改変位置を含有し得る。
本明細書に記載される改変は、任意のｕ－ＰＡポリペプチドにおいて行われ得る。例えば、改変は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するヒトｕ－ＰＡポリペプチド、あるいはそれらの対立遺伝子変異体；配列番号５２もしくは６６を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するマウスｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号５３もしくは６７を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するラットｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号５４もしくは６８を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するウシｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号５５もしくは６９を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するブタｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号５６もしくは７０を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するウサギｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号５７もしくは７１を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するニワトリｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号５８もしくは７２を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するキイロヒヒｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号５９もしくは７３を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するスマトラオランウータンｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号６０もしくは７４を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するイヌｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号６１もしくは７５を含むか、またはそれらに示されるアミノ酸の配列を有するヒツジｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号６２を含むか、またはそれに示されるアミノ酸の配列を有するマーモセットｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号６３を含むか、またはそれに示されるアミノ酸の配列を有するアカゲザルｕ－ＰＡポリペプチド；配列番号６４を含むか、またはそれに示されるアミノ酸の配列を有するキタホオジロテナガザルｕ－ＰＡポリペプチド；および配列番号６５を含むか、またはそれに示されるアミノ酸の配列を有するチンパンジーｕ－ＰＡポリペプチドにおいて、あるいは配列番号１～６および５２～７５のいずれかに対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を示す配列変異体または触媒活性断片において行われる。
改変ｕ－ＰＡポリヌクレオチドが、補体タンパク質Ｃ３の不活性化切断または阻害性切断をもたらす、その能力を保持する限りは、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリヌクレオチドは、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリヌクレオチドの任意の領域またはドメインにおいて改変され得る。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリヌクレオチドは、単鎖または二本鎖ポリペプチド、例えば、それらのプロテアーゼドメイン等の、スプライス変異体、対立遺伝子変異体、アイソフォーム、または触媒活性断片であり得る。本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリヌクレオチドは、完全長または切断型ｕ－ＰＡポリペプチドであり得る。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリヌクレオチドは、ｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインまたはｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインの改変形態であり得る。また、ｕ－ＰＡポリヌクレオチドが、補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断または活性化切断をもたらす、それらの能力を保持すれば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの酵素前駆体、前駆体または成熟形態は、本明細書での使用に関して意図される。また、ｕ－ＰＡポリヌクレオチドにおける改変は、一次配列の改変およびポリペプチドの一次配列中ではない改変を含む、他の改変も含有するｕ－ＰＡポリペプチドに対して行われ得る。例えば、本明細書に記載される改変は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドであるｕ－ＰＡポリペプチドに存在し得る。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、ＰＥＧ試薬等のポリマーにコンジュゲートされるポリペプチドを包む。
本明細書中の目的で、本明細書中の、アミノ酸置換（単数または複数）を含む改変に関する位置およびアミノ酸に対する言及は、配列番号１～６のいずれかに示されるｕ－ＰＡポリペプチドに関するものである。配列番号１～６のいずれかに示されるｕ－ＰＡポリヌクレオチドまたは配列番号１～６のいずれかに示されるｕ－ＰＡポリペプチドに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を示すそれらの変異体等の、別のｕ－ＰＡポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を同定することによって、別のｕ－ＰＡポリペプチドにおいて本明細書で提供される改変のいずれかを行うことは、当業者のレベルの範囲内である。別のｕ－ＰＡポリペプチドにおける対応する位置は、ｕ－ＰＡポリペプチドの、配列番号１～６のいずれかに示される参照ｕ－ＰＡポリペプチドとのアラインメントによって同定され得る。改変（例えば、アミノ酸置換）の目的で、対応するアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であってもよく、配列番号１～６のいずれかに示される残基と同一である必要はない。通常、例えば、配列番号５における残基とのアラインメントによって同定される対応するアミノ酸残基は、配列番号５と同一であるアミノ酸残基であるか、またはそれに対する保存的もしくは半保存的アミノ酸残基である。また、本明細書で提供される例示的な置換は、置換がｕ－ＰＡのプロテアーゼドメイン等のｕ－ＰＡポリペプチドの非改変形態に存在するものと異なる限りは、ｕ－ＰＡのプロテアーゼドメイン等のｕ－ＰＡポリペプチドにおける対応する残基で行われ得ることが理解されよう。この説明および本明細書中の他の場所の説明に基づいて、記載される突然変異の任意の１つまたは複数を含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドを生成して、本明細書に記載されるように、特性または活性に関してそれぞれを検査することは、当業者のレベルの範囲内である。
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３のタンパク質分解媒介性阻害または不活性化によって、補体活性を変更させる。さらに、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲンの切断および／またはｕＰＡＲへの結合に対して低下した特異性を有する。例えば、本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドは、アミノ酸改変を含有しない対応するポリペプチド等の、野生型または参照ｕ－ＰＡポリペプチドのプラスミノゲンの切断に対する９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満またはそれ未満の活性等の、プラスミノゲンの切断に対するｕ－ＰＡポリペプチドの野生型活性の１００％未満を示す。別の例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、アミノ酸改変を含有しない対応するポリペプチド等の、野生型または参照ｕ－ＰＡポリペプチドのｕＰＡＲへの結合に対する９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満またはそれ未満の活性等の、ｕＰＡＲに対するｕ－ＰＡポリペプチドの野生型結合活性の１００％未満を示す。
また、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子もまた、本明細書で提供される。幾つかの例では、コード核酸分子はまた、ポリペプチドの発現および分泌を変更させる（例えば、増大させる）ための異種シグナル配列を含有するように改変され得る。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよびコード核酸分子は、天然供給源からの単離、細胞、組織および生物における組換え的に産生されたタンパク質の単離を含む当該技術分野で公知の任意の方法によって、また組換え方法によって、またインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）ステップを含む方法、合成方法および当業者に公知の方法によって、産生または単離され得る。本明細書で提供される改変ポリペプチドおよびコード核酸分子は、当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ技法によって産生され得る。標的タンパク質における任意の１つまたは複数のアミノ酸の突然変異をもたらすための当該技術分野で公知の任意の方法を用いることができる。方法として、コード核酸分子の標準的な部位特異的もしくはランダム突然変異誘発、または固相ポリペプチド合成法が挙げられる。例えば、ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸分子は、コード核酸のランダム突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発、オーバーラップＰＣＲ、遺伝子シャフリング、または他の組換え方法等の突然変異誘発が対象となり得る。続いて、ポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞に導入されて、異種的に発現され得る。したがって、本明細書で提供される改変ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子もまた、本明細書で提供される。幾つかの例では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、固相または溶液相ペプチド合成を使用して、合成的に産生される。核酸分子は、例えば、眼内での、もしくは全身投与用の、インビボでの（ｉｎ ｖｉｖｏ）、コードされた改変ｕ－ＰＡポリペプチドの発現のための、ＡＡＶまたはアデノウイルスベクター等の遺伝子療法ベクターにおいて提供され得る。コードされたｕ－ＰＡポリペプチドは、完全長ポリペプチドまたはプロテアーゼドメインまたは活性であるか、もしくは活性化され得る他の形態であり得る。
本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断または不活性化切断配列の切断に対して増大した特異性および／または選択性を有するように改変されている。ｕ－ＰＡポリペプチドは、タンパク質の改変に関して、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して改変され得る。こうした方法として、部位特異的突然変異誘発およびランダム突然変異誘発が挙げられる。本明細書で提供され、かつ当該技術分野で公知の補体活性化の生物学的機能に関するアッセイ等のアッセイを使用して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの生物学的機能を評価して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、切断および不活性化のために補体タンパク質Ｃ３を標的とするかどうかを決定することができる。ｕ－ＰＡポリペプチドおよび改変ｕ－ＰＡポリペプチドを同定する例示的な方法は、本明細書で提供される。
１．例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチド
補体が阻害または不活性化されるように、ｕ－ＰＡポリペプチドにおいて、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個およびそれよりも多いアミノ酸改変を含む１つまたは複数のアミノ酸改変を含有して、補体タンパク質Ｃ３を切断する改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、本明細書で提供される。改変は、一次アミノ酸配列において存在し、アミノ酸残基の置換、欠失および挿入を含む。改変は、活性形態である場合に、ｕ－ＰＡポリペプチドの特異性／活性を変更させる。本明細書中の改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質、特にＣ３において標的部位を認識および切断して、それを不活性化させるように選択される。本明細書中の改変ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、プラスミノゲン等のインビボ基質に対して低減した特異性／活性を有するように、さらに改変およびスクリーニングされ得る。本明細書中の改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、任意の好適なプロテアーゼスクリーン法によって選択および同定され得る。本明細書中の改変ｕ－ＰＡポリペプチドはまず、米国特許第８，２１１，４２８号に記載されるスクリーニング法を使用して同定され、そこでは、改変プロテアーゼのライブラリーを、反応部位ループにおける標的配列を含むように改変されている同族または他の阻害性セルピンと反応させて、こうした標的を切断する改変プロテアーゼを捕捉する。
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ３を不活性化させる部位で、補体タンパク質Ｃ３に対して増大した活性または特異性またはＫｃａｔ／Ｋｍを示し、また、プラスミノゲンに対して低減した活性または特異性を有することができ、および／または標的部位補体タンパク質Ｃ３に対して増大した選択性、特異性および／または活性を示し、それにより、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、Ｃ３を不活性化する。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、野生型、または置換Ｃ１２２Ｓ（キモトリプシンナンバリングによる）を有する野生型の対応する形態と比較して、Ｃ３の切断および不活性化に対して増大した活性を示す。特に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドのプロテアーゼドメインは、配列番号５のｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（Ｃ１２２Ｓを有するｕ－ＰＡプロテーゼドメイン）と比較して、Ｃ３の増大した不活性化切断活性を示す。活性の増大は、非改変ｕ－ＰＡと比較して、１０％、２０％、５０％、１００％、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍およびそれよりも多い可能性がある。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲン等の自然基質に対して低減した活性を有し得る。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲンに対して、配列番号５に示されるｕ－ＰＡポリペプチド等の野生型または参照ｕ－ＰＡポリペプチドの０～９９％の、およびＣ３を切断して、それを不活性化するための、少なくとも０．５倍、１倍、２倍、３倍またはそれよりも多いｕ－ＰＡ活性を示し得る。例えば、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、アミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有しない対応するポリペプチド、例えば、配列番号５に示されるｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン等の野生型または参照ｕ－ＰＡポリペプチドの約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満またはそれ未満のｕ－ＰＡ活性を示す。
例えば、アミノ酸置換または置換によって改変され得る例示的な位置として、配列番号３に示されるアミノ酸の配列に関して、１７３、１７８、１７９、１８０、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、２０８、２０９、２４９、２５０、２５２、３０６、３１４または３５３位（キモトリプシンナンバリングに従うと、３０、３５、３６、３７、３７ａ、３８、３９、４０、４１、６０ａ、６０ｂ、９７ａ、９７ｂ、９９、１４９、１５７または１９２位に対応する）に対応する位置のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アミノ酸位置は、配列番号３に示されるアミノ酸位置に関して、１７３、Ｒ１７８、Ｒ１７９、Ｈ１８０、Ｒ１８１、Ｖ１８５、Ｔ１８６、Ｙ１８７、Ｖ１８８、Ｄ２０８、Ｙ２０９、Ｔ２４９、Ｌ２５０、Ｈ２５２、Ｙ３０６、Ｍ３１４またはＱ３５３位（それぞれ、キモトリプシンナンバリングに従うと、Ｆ３０、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｈ３７、Ｒ３７ａ、Ｖ３８、Ｔ３９、Ｙ４０、Ｖ４１、Ｄ６０ａ、Ｙ６０ｂ、Ｔ９７ａ、Ｌ９７ｂ、Ｈ９９、Ｙ１４９、Ｍ１５７およびＱ１９２に対応する）の１つまたは複数でのフェニルアラニン（Ｆ）の置換に対応する位置での置換であり得る。
上記位置のいずれかでの例示的なアミノ酸置換は、表１１に示される。表１１における対応する位置に対する基準は、配列番号３に示される位置に対する基準である。（以下の実施例も参照されたい）。置換は、配列番号３に示される配列とのアラインメントによって、別のｕ－ＰＡポリペプチドにおける対応する位置において行われ得ること、それにより、対応する位置は、アラインメントされた位置であることが理解されよう。例えば、置換は、配列番号２に示される配列により、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインにおいて、または配列番号５に示される配列により、参照ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインにおいて行われ得る。幾つかの例では、得られた改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、プラスミノゲンに対するｕ－ＰＡ活性と比較して、補体タンパク質Ｃ３に対して、変更された（例えば、増強された）特異性、および／または補体タンパク質Ｃ３に対して、変更された選択性を示す限りは、アミノ酸置換は、配列番号５に示されるようなｕ－ＰＡポリペプチドまたはそれに対して、少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に９５％、またはそれよりも高い配列同一性を有するその変異体における対応する位置に存在し得る。一例では、得られた改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、プラスミノゲンに対するｕ－ＰＡ活性と比較して、補体タンパク質Ｃ３に対して、変更された（例えば、増強された）特異性、および／または補体タンパク質Ｃ３に対して、変更された選択性を示す限りは、置換の任意の１つまたは複数が、配列番号１～６のいずれかにおいて存在する。
Figure 2022516725000012

本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドにおける例示的なアミノ酸改変として、１７３位（キモトリプシンナンバリングによると、３０）に対応する位置でのチロシン（Ｙ）；１７８位（キモトリプシンナンバリングによると、３５）に対応する位置でのＷ；１７８位に対応する位置でのＹ；１７８位に対応する位置でのＱ；１７９位（キモトリプシンナンバリングによると、３６）に対応する位置でのＨ；１８０位（キモトリプシンナンバリングによると、３７）に対応する位置でのＥ；１８０位に対応する位置でのＰ；１８０位に対応する位置でのＤ；１８０位に対応する位置でのＮ；１８０位に対応する位置でのＧ；１８０位に対応する位置でのＫ；１８０位に対応する位置でのＹ；１８１位（キモトリプシンナンバリングによると、３７ａ）に対応する位置でのＱ；１８１位に対応する位置でのＰ；１８１位に対応する位置でのＥ；１８１位に対応する位置でのＮ；１８１位に対応する位置でのＳ；１８５位（キモトリプシンナンバリングによると、３８）に対応する位置でのＤ；１８５位に対応する位置でのＥ；１８６位（キモトリプシンナンバリングによると、３９）に対応する位置でのＷ；１８６位に対応する位置でのＹ；１８６位に対応する位置でのＦ；１８７位（キモトリプシンナンバリングによると、４０）に対応する位置でのＨ；１８７位に対応する位置でのＦ；１８７位に対応する位置でのＱ；１８８位（キモトリプシンナンバリングによると、４１）に対応する位置でのＲ；１８８位に対応する位置でのＬ；２０８位に対応する位置でのＰ；２０８位（キモトリプシンナンバリングによると、６０ａ）に対応する位置でのＴ；２０９位（キモトリプシンナンバリングによると、６０ｂ）に対応する位置でのＱ；２０９位に対応する位置でのＨ；２０９位に対応する位置でのＳ；２０９位に対応する位置でのＡ；２０９位に対応する位置でのＴ；２０９位に対応する位置でのＬ；２４９位（キモトリプシンナンバリングによると、９７ａ）に対応する位置でのＥ；２４９位に対応する位置でのＩ；２５０位（キモトリプシンナンバリングによると、９７ｂ）に対応する位置でのＡ；２５０位に対応する位置でのＧ；２５２位（キモトリプシンナンバリングによると、９９）に対応する位置でのＱ；３０６位（キモトリプシンナンバリングによると、１４９）に対応する位置でのＫ；３０６位に対応する位置でのＲ；３１４位（キモトリプシンナンバリングによると、１５７）に対応する位置でのＫ；または３５３位（キモトリプシンナンバリングによると、１９２）に対応する位置でのＨによる置換が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれが、配列番号３に示されるアミノ酸位置を基準にしている。２７９位に対応する位置でのＳ（キモトリプシンナンバリングによると、１２２Ｓ）は、遊離Ｃｙｓを置換して、それにより、凝集する傾向を低減させる。
２個以上のアミノ酸改変を含有する例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、以下の表１２に示され、Ｃ３を切断するそれらの活性は、表１４に記載される。配列番号は、列挙される置換を含有する例示的なｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを参照し、それは、凝集を低減または排除するためのＣ１２２Ｓでの置換を含む。Ｃ１２２は、遊離システインであり、それは、プロテアーゼポリペプチド間での架橋をもたらし得る。プロテアーゼドメインは例示的であり、完全長および前駆体分子、ならびにプロテアーゼドメインの他の触媒活性部分、完全長および前駆体ポリペプチドは、完全長の活性化された改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび他の形態を形成するように、列挙された置換を含み得ることが理解されよう。
Figure 2022516725000013


Figure 2022516725000014


Figure 2022516725000015


Figure 2022516725000016

２．さらなる改変
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれかは、任意の１つまたは複数のさらなる改変を含有し得る。さらなる改変として、例えば、当該技術分野で公知の任意のアミノ酸置換、欠失または挿入、通常、プラスミノゲンに対するｕ－ＰＡ活性と比較して、補体タンパク質Ｃ３に対して、特異性を増大させ、および／または補体タンパク質Ｃ３に対して、選択性を変更させる任意のものが挙げられ得る。また、目的の任意の他の活性を変更させる改変も意図される。一次配列のアミノ酸改変が、付加的であることは、長期にわたって公知である［例えば、Wells (1990) Biochem 29:8509-8517を参照されたい］。本明細書で提供される任意の改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、さらなる活性を提供するか、または活性を変更させるように、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれよりも多いアミノ酸改変を含有し得る。
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドに含まれ得るさらなる改変の例として、米国特許第４，９９７，７６６号；同第５，１２６，１３４号；同第５，１２９，５６９号；同第５，２７５，９４６号；同第５，５７１，７０８号；同第５，５８０，５５９号；同第５，６４８，２５３号；同第５，７２８，５６４号；同第５，７５９，５４２号；同第５，８１１，２５２号；同第５，８９１，６６４号；同第５，９３２，２１３号；同第５，９８０，８８６号；同第６，２４８，７１２号；同第６，４２３，６８５号；同第７，０７０，９２５号；同第７，０７４，４０１号；同第７，８０７，４５７号；同第７，８１１，７７１号；同第８，２１１，４２８号；米国特許出願公開第２００２／０１０６７７５号；同第２００４／０２６５２９８号；同第２００４／０１４６９３８号；同第２００９／００１０９１６号；同第２０１１／００５５９４０号；同第２００８／００２０４１６号；同第２００６／０１４２１９５号；国際特許出願公開第１９８８／００８４５１号；同第１９８９／０１０４０１号；同第１９９０／００４６３５号；同第１９９６／０１３１６０号；同第２００２／４０５０３号；Petersen et al. (2001) Eur J Biochem 268:4430-4439；Skeldal et al. (2006) FEBS J 273:5143-5149；Sun et al. (1997) J Biol Chem 272:23818-23823；Blouse et al. (2009) J Biol Chem 284:4647-4657；Nelles et al. (1987) JBC 262:5682-5689；Crowley et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5021-5025；Zeslawska et al. (2000) J Mol Biol 301:465-475；Zeslawska et al. (2003) J Mol Biol 328:109-118；Quax et al. (1998) Arterioscler Thromb Vasc Biol 18:693-701；Homandberg and Wai (1990) Thrombin Res 58:403-412；Zaitsev et al. (2010) Blood 115:5241-5248；Yang et al. (1994) Biochemistry 33:606-612；Davidow et al. (1991) Protein Eng 4:923-928；Boutad and Castellino (1993) Arch Biochem Biophys 303:222-230；Tsujikawa et al. (1996) Yeast 12:541-553；Carriero et al. (2002) Biol Chem 383:107-113；Stopelli et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4939-4943；Stoppelli et al. (1987) J Biol Chem 262:4437-4440；Franco et al. (1998) J Biol Chem 273:27734-27740；Franco et al. (1997) J Cell Biol 137:779-791；Li et al. (1995) J Biol Chem 270:30282-30285；Botkjaer et al. (2009) Biochemistry 48:9606-9617；Bdeir et al. (2003) Blood 102:3600-3608；Eguchi et al. (1990) J Biochem 108:72-79；Miyake et al. (1988) J Biochem 104:643-647；Bergstrom et al. (2003) Biochem 42:5395-5402；Sun and Liu (2005) Proteins 61:870-877；Sun et al. (1998) Biochemistry 37:2935-2940；Anderson et al. (2008) Biochem J 412:447-457；Li et al. (1992) Biochim Biophys Acta 1159:37-43；Lijnen et al. (1988) Eur J Biochem 177:575-582；Lijnen et al. (1988) Eur J Biochem 172:185-188；Lijnen et al. (1992) Eur J Biochem 205:701-709；Lijnen et al. (1994) Eur J Biochem 224:567-574；Lijnen et al. (1990) J Biol Chem 265:5232-5236；Yoshimoto et al. (1996) Biochim Biophys Acta 1293:83-89；Magdolen et al. (1996) Eur J Biochem 237:743-751；Nienaber et al. (2000) J Biol Chem 275:7239-7248；Gurewich et al. (1988) J Clin Invest 1956-1962；Liu et al. (1996) Biochemistry 35:14070-14076；Liu et al. (2002) Circ Res 90:757-763；Mukhina et al. (2000) J Biol Chem 275:16450-16458；Peng et al. (1997) Biochem Mol Biol Int 41:887-894；Turkmen et al. (1997) Electrophoresis 18:686-689；Peng et al. (1999) Biotechnol Lett 21:979-985；Ueshima et al. (1994) Thromb Haemost 71:134-140；およびMelnick et al. (1990) J Biol Chem 265:801-807に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において記載される例示的なアミノ酸改変の非限定的な例として、配列番号３に示されるアミノ酸の配列に従って、Ｓ９Ａ、Ｃ１３Ａ、Ｔ１８Ａ、Ｃ１９Ａ、Ｖ２０Ａ、Ｓ２１Ａ、Ｎ２２Ｙ、Ｎ２２Ａ、Ｎ２２Ｑ、Ｎ２２Ｒ、Ｋ２３Ａ、Ｋ２３Ｈ、Ｋ２３Ｑ、Ｋ２３Ｅ、Ｙ２４Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｓ２６Ａ、Ｓ２６Ｆ、Ｎ２７Ａ、Ｎ２７Ｒ、Ｉ２８Ａ、Ｈ２９Ａ、Ｈ２９Ｒ、Ｗ３０Ａ、Ｗ３０Ｒ、Ｗ３０Ｆ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３５Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｅ４３Ａ、Ｉ４４Ａ、Ｄ４５Ａ、Ｋ４６Ａ、Ｓ４７Ａ、Ｓ４７Ｇ、Ｋ４８Ａ、Ｋ４８Ｐ、Ｔ４９Ａ、Ｙ５１Ａ、Ｎ５４Ａ、Ｌ８０Ｈ、Ｑ８１Ｒ、Ｑ８２Ｐ、Ｔ８３Ｒ、Ｈ９９Ｙ、Ｐ１０５Ａ、Ｄ１０６Ａ、Ｎ１０７Ａ、Ｒ１０８Ａ、Ｒ１０８Ｄ、Ｒ１０９Ａ、Ｒ１１０Ａ、Ｇ１１８Ｎ、Ｌ１１９Ｒ、Ｋ１２０Ｒ、Ｋ１２０Ａ、Ｐ１２１Ｌ、Ｌ１２２Ｔ、Ｌ１２２Ｒ、Ｖ１２３Ｙ、Ｖ１２３Ｗ、Ｑ１２４Ａ、Ｅ１２５Ａ、Ｈ１２９Ａ、Ｄ１３０Ｇ、Ｃ１３１Ｗ、Ｋ１３５Ｇ、Ｋ１３５Ｓ、Ｋ１３５Ｙ、Ｋ１３５Ｑ、Ｋ１３６Ｐ、Ｓ１３８Ｅ、Ｃ１４８Ｓ、Ｃ１４８Ａ、Ｋ１５１Ｅ、Ｔ１５２Ａ、Ｒ１５４Ｇ、Ｒ１５４Ｐ、Ｒ１５４Ａ、Ｐ１５５Ｒ、Ｐ１５５Ｌ、Ｐ１５５Ａ、Ｐ１５５Ｎ、Ｐ１５５Ｓ、Ｐ１５５Ｇ、Ｐ１５５Ｑ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１５６Ａ、Ｒ１５６Ｈ、Ｒ１５６Ｓ、Ｒ１５６Ｙ、Ｒ１５６Ｅ、Ｒ１５６Ｇ、Ｒ１５６Ｌ、Ｆ１５７Ｌ、Ｆ１５７Ｔ、Ｆ１５７Ｇ、Ｆ１５７Ｑ、Ｆ１５７Ｄ、Ｆ１５７Ｅ、Ｋ１５８Ｒ、Ｋ１５８Ｅ、Ｋ１５８Ａ、Ｋ１５８Ｈ、Ｋ１５８Ｓ、Ｋ１５８Ｙ、Ｋ１５８Ｇ、Ｋ１５８Ｗ、Ｋ１５８Ｖ、Ｋ１５８Ｍ、Ｉ１５９Ｒ、Ｉ１５９Ａ、Ｉ１５９Ｐ、Ｉ１５９Ｇ、Ｉ１６０Ａ、Ｉ１６０Ｋ、Ｇ１６２Ｒ、Ｅ１６３Ａ、Ｆ１６４Ｖ、Ｆ１６４Ａ、Ｆ１６４Ｖ、Ｉ１６７Ｌ、Ｐ１７１Ｌ、Ｆ１７３Ｉ、Ｆ１７３Ｖ、Ｆ１７３Ｌ、Ｆ１７３Ｔ、Ｆ１７３Ｇ、Ｆ１７３Ｍ、Ａ１７５Ｓ、Ｙ１７７Ａ、Ｒ１７８Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｈ１８０Ａ、Ｒ１８１Ａ、Ｓ１８４Ａ、Ｔ１８６Ａ、Ｔ１８６Ｅ、Ｔ１８６Ｄ、Ｙ１８７Ａ、Ｙ１８７Ｈ、Ｖ１８８Ａ、Ｓ１９２Ｎ、Ｉ１９４Ｍ、Ｓ１９５Ａ、Ｈ２０４Ａ、Ｈ２０４Ｑ、Ｆ２０６Ａ、Ｄ２０８Ａ、Ｙ２０９Ａ、Ｐ２１０Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｋ２１１Ｑ、Ｋ２１２Ａ、Ｅ２１３Ａ、Ｄ２１４Ａ、Ｙ２１５Ａ、Ｉ２１６Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｒ２２１Ａ、Ｓ２２２Ｌ、Ｒ２２３Ｇ、Ｒ２２３Ａ、Ｌ２２４Ａ、Ｌ２２４Ｐ、Ｎ２２５Ａ、Ｓ２２６Ｐ、Ｎ２２７Ａ、Ｑ２２９Ａ、Ｅ２３１Ｇ、Ｋ２３３Ｅ、Ｋ２３３Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｅ２３５Ｋ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ２３７Ａ、Ｉ２４０Ｖ、Ｋ２４３Ｅ、Ｋ２４３Ａ、Ｄ２４４Ａ、Ｙ２４５Ａ、Ｄ２５５Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｋ２６４Ａ、Ｅ２６５Ａ、Ｒ２６７Ａ、Ｃ２６８Ｙ、Ｃ２７９Ｓ、Ｃ２７９Ａ、Ｆ２８９Ｌ、Ｇ２９０Ｄ、Ｅ２９４Ｇ、Ｉ２９５Ｔ、Ｇ２９７Ｄ、Ｆ２９８Ａ、Ｇ２９９Ａ、Ｇ２９９Ｈ、Ｋ３００Ａ、Ｋ３００Ｈ、Ｋ３００Ｗ、Ｅ３０１Ｄ、Ｅ３０１Ａ、Ｅ３０１Ｈ、Ｎ３０２Ａ、Ｎ３０２Ｑ、Ｎ３０２Ｖ、Ｎ３０２Ｌ、Ｎ３０２Ｉ、Ｎ３０２Ｓ、Ｎ３０２Ｔ、Ｓ３０３Ｅ、Ｓ３０３Ａ、Ｓ３０３Ｅ、Ｔ３０４Ａ、Ｔ３０４Ｖ、Ｔ３０４Ｍ、Ｄ３０５Ａ、Ｙ３０６Ａ、Ｙ３０６Ｇ、Ｙ３０６Ｖ、Ｙ３０６Ｈ、Ｌ３０７Ａ、Ｙ３０８Ａ、Ｐ３０９Ａ、Ｐ３０９Ｓ、Ｐ３０９Ｔ、Ｐ３０９Ｖ、Ｐ３０９Ｇ、Ｐ３０９Ｎ、Ｐ３０９Ｌ、Ｐ３０９Ｄ、Ｐ３０９Ｒ、Ｐ３０９Ｈ、Ｐ３０９Ｆ、Ｐ３０９Ｗ、Ｅ３１０Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｌ３１２Ｐ、Ｌ３１２Ｖ、Ｌ３１２Ｍ、Ｋ３１３Ｙ、Ｋ３１３Ｔ、Ｋ３１３Ａ、Ｋ３１３Ｈ、Ｔ３１５Ａ、Ｔ３１５Ｉ、Ｖ３１６Ａ、Ｖ３１７Ａ、Ｙ３３０Ｈ、Ａ３４３Ｔ、Ｄ３４４Ａ、Ｑ３４６Ａ、Ｗ３４７Ａ、Ｋ３４８Ａ、Ｋ３４８Ｅ、Ｔ３４９Ｉ、Ｄ３５０Ａ、Ｓ３５１Ａ、Ｑ３５３Ａ、Ｇ３５４Ｒ、Ｄ３５５Ａ、Ｓ３５６Ａ、Ｇ３５７Ｅ、Ｇ３６６Ｃ、Ｒ３７８Ｃ、Ｒ３７８Ａ、Ｋ３８３Ａ、Ｋ３８５Ａ、Ｒ４００Ａ、Ｈ４０２Ａ、Ｋ４０４Ａ、Ｅ４０５Ａ、Ｅ４０６Ａ Ｇ４０８Ａ、またはＡ４１０Ｖの任意の１つまたは複数が挙げられる。さらなる改変として、グリコシル化部位を導入するアミノ酸置換が挙げられる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、化学的改変または翻訳後改変を含有するものを含む。幾つかの例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、化学改変も、翻訳後改変も含有しない。化学改変および翻訳後改変として、ペグ化、シアリル化（ｓｉａｌａｔｉｏｎ）、アルブミン化、グリコシル化、ファネシル化（ｆａｒｎｙｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＰＡＳ化、ＨＥＳ化、リン酸化、Ｆｃ等の多量体化ドメインへの結合、および当該技術分野で公知の他のポリペプチド改変が挙げられるが、これらに限定されない。得られたポリペプチドが、活性形態の際に、補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断または不活性化切断をもたらす能力を保持するのであれば、本明細書で提供される、アミノ酸置換、挿入、欠失、およびそれらの組合せ等の任意の１つまたは複数のアミノ酸改変の他に、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、化学的方法および組換え方法を含む、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、任意の部分にコンジュゲートまたは融合させることができる。
例えば、本明細書で提供される、アミノ酸置換等の任意の１つまたは複数のアミノ酸改変の他に、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、炭水化物部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、シアリル化（ｓｉｌａｔｉｏｎ）部分、免疫グロブリンＧ由来のＦｃドメイン、または任意の他のドメインもしくは部分を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの一次配列に存在するか、または存在しない他の改変を含有し得る。例えば、こうしたさらなる改変は、タンパク質の安定性または血清半減期を増大させるために行われ得る。
ａ．低下した免疫原性
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、低下した免疫原性を有するように改変され得る。低下した免疫原性は、ポリペプチドから、抗原性エピトープを排除する配列変化によって、または翻訳後改変を変更させることによってもたらされ得る。当業者は、ポリペプチドにおける抗原性エピトープを同定する方法に精通している［例えば、Liang et al. (2009) BMC Bioinformatics, 10:302；Yang et al. (2009) Rev. Med. Virol., 19:77-96を参照されたい］。幾つかの例では、１つまたは複数のアミノ酸は、抗原性エピトープを除去または変更するように改変され得る。別の例では、タンパク質のグリコシル化の変更もまた、免疫原性に影響を及ぼし得る。例えば、ポリペプチドが、補体タンパク質Ｃ３の阻害性切断または不活性化切断をもたらす能力を保持する限りは、ポリペプチドのグリコシル化の変更は意図される。グリコシル化部位は、単一突然変異によって除去され得る。グリコシル化部位は、例えば、ＮＸＳ（Ｔ）（ここで、Ｘは、プロリンではない）等の、挿入または単一もしくは複数の突然変異によって、カノニカル配列を導入することによって付加され得る。グリコシル化部位はまた、血清半減期を増大し得る。
ｂ．Ｆｃドメイン
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に連結され得る。通常、こうした融合体は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。例えば、ＩｇＧ１の完全長Ｆｃ配列は、以下の配列番号４５に示される配列のアミノ酸９９～３３０を含む。
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
ｈＩｇＧ１に関する例示的なＦｃ配列は、配列番号５０に示されている：
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
ＩｇＧ１の完全長Ｆｃ配列は、配列番号４５のアミノ酸１００～１１０に対応するヒンジ配列、配列番号４５に示されるようなＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに関する完全配列のほぼ全てを含有する。
別の例示的なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願公開第９３／１０１５１号に示されており、Ｎ末端ヒンジ領域から、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の自然Ｃ末端まで伸長する単鎖ポリペプチド（配列番号５０）である。結合が作られる正確な部位は重要ではない：特定の部位が周知であり、ＨＡＢＰポリペプチドの生物活性、分泌、または結合特性を最適化するように選択され得る。例えば、他の例示的なＦｃポリペプチド配列は、配列番号４５に示される配列のアミノ酸Ｃ１０９またはＰ１１３を起点としている（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号を参照されたい）。
ｈＩｇＧ１ Ｆｃの他に、他のＦｃ領域および他の多量体化ドメインもまた使用され得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用によって媒介されるエフェクタ機能が最低限に抑えられる場合、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ等の、補体またはエフェクタ細胞を不十分に動員するＩｇＧアイソタイプとの融合体が意図される。さらに、Ｆｃ融合体は、抗体のＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭクラスを含むがこれらに限定されない抗体クラスのいずれかに属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる。リンカーを使用して、Ｆｃを別のポリペプチドに共有結合させて、Ｆｃキメラを生成することができる。
改変Ｆｃドメインもまた、周知である。幾つかの例では、Ｆｃ領域は、それがＦｃＲへの変更された結合を示して、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクタ機能よりも変更された（即ち、より多くのまたはより少ない）エフェクタ機能をもたらすように改変される。したがって、改変Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する増大した親和性または低親和性もしくは親和性なしを含むがこれらに限定されない変更された親和性を有し得る。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は通常、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好に、受容体に結合する。異なるＦｃγＲは、異なるエフェクタ機能を媒介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とする、活性化を引き起こす免疫複合体の正の調節因子である。しかしながら、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、阻害性である。Ｆｃ領域の、受容体に対する親和性を変更させることにより、Ｆｃドメインによって関連付けられるエフェクタ機能および／または薬物動態特性を調節することができる。改変Ｆｃドメインは、当業者に公知であり、また文献に記載されており、例えば、例示的な改変に関して、米国特許第５，４５７，０３５号、米国特許出願第２００６／００２４２９８号、および国際特許出願公開第２００５／０６３８１６号を参照されたい。
Ｆｃ部分を含有する得られたキメラポリペプチド、およびそれらから形成される多量体は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィによって容易に精製することができる。
別の例では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ＨＳＡの残基２５～６０８等のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその完全長もしくは一部に連結され得る。
Figure 2022516725000017
ｃ．ポリマーへのコンジュゲーション
幾つかの例では、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、他のポリマーにコンジュゲートされる。ポリマーは、ポリペプチドのサイズを増大させて、腎臓クリアランスを低減させて、それにより、半減期を増大させるか、またはポリペプチドの構造を修正させて、半減期を増大させるか、または免疫原性を低減させることができる。ｕ－ＰＡポリペプチドにコンジュゲートされ得る例示的なポリマーとして、ポリオール類（即ち、ポリ－ＯＨ）、ポリアミン類（即ち、ポリ－ＮＨ２）およびポリカルボン酸（即ち、ポリ－ＣＯＯＨ）等の天然および合成ホモポリマー、ならびに他のヘテロポリマー、即ち、１つまたは複数の異なるカップリング基、例えば、水酸基およびアミノ基を含むポリマーが挙げられる。好適なポリマー分子の例として、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール類（ｍＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール類を含むポリアルキレングリコール類等のポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ＰＥＧ－グリシジルエーテル類（Ｅｐｏｘ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ－オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ－ＰＥＧ）、分岐状ポリエチレングリコール類（ＰＥＧｓ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート類、ポリビニルピロリドン、ポリ－Ｄ，Ｌ－アミノ酸類、ポリエチレン－コ－マレイン酸無水物、ポリスチレン－コーマレイン酸無水物、カルボキシメチル－デキストランを含むデキストラン類、ヘパリン、相同アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース類、キトサンの加水分解産物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン等のデンプン類、グリコーゲン、アガロース類およびそれらの誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物およびバイオポリマーが挙げられる。
通常、ポリマーは、ポリエチレンオキシド類、例えばＰＥＧ、通常、ｍＰＥＧ等のポリアルキレンオキシド類（ＰＡＯ）であり、それらは、架橋することが可能なわずかな反応基を有する。通常、ポリマーは、比較的簡素な化学を使用して、ｕ－ＰＡポリペプチドに（例えば、タンパク質表面上の結合基に）共有結合的にコンジュゲートされ得る（メトキシ）ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）等の無毒性ポリマー分子である。
ｕ－ＰＡポリペプチドへの結合に好適なポリマー分子として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧ誘導体、例えば、メトキシ－ポリエチレングリコール類（ｍＰＥＧ）、ＰＥＧ－グリシジルエーテル類（Ｅｐｏｘ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ－オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ－ＰＥＧ）、分岐状ＰＥＧ類、およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）が挙げられるが、これらに限定されない［例えば、Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476；Harris and Zalipsky (eds.)；"Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997；Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000；Harris and Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21；およびTsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004を参照されたい］。ポリマー分子は、通常約３ｋＤａ～約６０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、本明細書で提供されるＵ－ＰＡポリペプチドにコンジュゲートされているポリマー分子は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｋＤａの、または６０ｋＤａを超える分子量を有する。
ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体（即ち、「ＰＥＧ化」）を共有結合（コンジュゲート）することによってポリペプチドを改変する方法は、当該技術分野で周知されている（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号、米国特許第５，６７２，６６２号、同第６，７３７，５０５号、および米国特許出願公開第２００４／０２３５７３４号を参照されたい）。ＰＥＧ化に関する技法として、特殊リンカーおよびカップリング化学（例えば、Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002を参照されたい）、多重ＰＥＧ部分の、単一コンジュゲーション部位への結合（例えば、分岐状ＰＥＧの使用により、例えば、Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002を参照されたい）、部位特異的ＰＥＧ化および／またはモノ－ＰＥＧ化（例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999を参照されたい）、および部位特異的な酵素的ＰＥＧ化（例えば、Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない［また、例えば、Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138；Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993；Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64；Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404；Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95も参照されたい；また、Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8Sも参照されたい］。当該技術分野で記載される方法および技法は、単一タンパク質分子に結合された１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の、もしくは１０個よりも多いＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を生産することができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号を参照されたい）。
ＰＥＧ化用の多数の試薬が、当該技術分野で記載されている。こうした試薬として、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２－ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファ－メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３－ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能性ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ－ニトロフェニル－カーボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ－ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド、分岐状ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカー無し」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、Ｂｏｃ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ－ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ－ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ－ＮＨＳ、およびビオチンＰＥＧ－ＮＨＳが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995；Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997；米国特許第５，６７２，６６２号；同第５，９３２，４６２号；同第６，４９５，６５９号；同第６，７３７，５０５号；同第４，００２，５３１号；同第４，１７９，３３７号；同第５，１２２，６１４号；同第５，１８３，５５０号；同第５，３２４，８４４号；同第５，４４６，０９０号；同第５，６１２，４６０号；同第５，６４３，５７５号；同第５，７６６，５８１号；同第５，７９５，５６９号；同第５，８０８，０９６号；同第５，９００，４６１号；同第５，９１９，４５５号；同第５，９８５，２６３号；同第５，９９０，２３７号；同第６，１１３，９０６号；同第６，２１４，９６６号；同第６，２５８，３５１号；同第６，３４０，７４２；号；同第６，４１３，５０７号；同第６，４２０，３３９号；同第６，４３７，０２５号；同第６，４４８，３６９号；同第６，４６１，８０２号；同第６，８２８，４０１号；同第６，８５８，７３６号；米国特許出願公開第２００１／００２１７６３号；同第２００１／００４４５２６号；同第２００１／００４６４８１号；同第２００２／００５２４３０号；同第２００２／００７２５７３号；同第２００２／０１５６０４７号；同第２００３／０１１４６４７号；同第２００３／０１４３５９６号；同第２００３／０１５８３３３号；同第２００３/０２２０４４７号；同第２００４/００１３６３７号；同第２００４/０２３５７３４号；同第２００５／０００３６０号；同第２００５／０１１４０３７号；同第２００５／０１７１３２８号；同第２００５／０２０９４１６号；欧州特許第０１０６４９５１号；同第０８２２１９９号；国際公開第００１７６６４０号；同第０００２０１７号；同第０２４９６７３号；同第９４２８０２４号；および同第０１８７９２５号を参照されたい）。
ｄ．タンパク質形質導入ドメイン
抗体またはその抗原結合断片を含有する融合タンパク質等の、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは連結されて、眼等の粘膜部位等の療法に関する標的部位で、抗体の保持を増大させるタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）にコンジュゲートされ得る。ＰＴＤが、治療部位（例えば、粘膜部位）での標的細胞表面への結合および／または治療部位（例えば、眼等の粘膜部位）での標的細胞による改変ｕ－ＰＡポリペプチドの取込みを促進する限りは、任意のＰＴＤを用いることができる。
一般的に、ＰＴＤは、細胞膜への静電気的結合を通じて細胞表面へ結合することができ、また膜トランスロケーションにより細胞によって取り込まれ得る短いカチオン性ペプチドを含む［Kabouridis (2003) TRENDS Biotech 21(11) 498-503］。提供されるＰＴＤは一般的に、例えば、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸またはコンドロイチン硫酸およびそれらの誘導体等のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）への結合を介して、標的細胞と相互作用する。
タンパク質形質導入ドメインは、任意の長さを有し得る。一般的に、ＰＴＤの長さは、５または約５～１００または約１００アミノ酸長の範囲である。例えば、ＰＴＤの長さは、５または約５～２５または約２５アミノ酸長の範囲であり得る。幾つかの例では、ＰＴＤは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長である。
単一ＰＴＤまたはそれらの複数は、改変ｕ－ＰＡポリペプチドにコンジュゲートされ得る。これらは、ＡＭＤを含む、糖尿病性網膜症または黄斑変性等の眼疾患または眼科疾患の処置に有利に用いられる。例えば、同じＰＴＤの多重コピー（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体またはそれよりも大きい多量体）または異なるＰＴＤが、改変ｕ－ＰＡポリペプチドにコンジュゲートされ得る。
幾つかのタンパク質およびそれらのペプチド誘導体は、細胞内部移行特性を保有する。例示的なＰＴＤは、当該技術分野で公知であり、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）ＴＡＴ［配列番号１２５～１３５；Ruben et al. (1989) J. Virol. 63:1-8］、ヘルペスウイルステグメントタンパク質ＶＰ２２［配列番号１４０；Elliott and O' Hare (1997) Cell 88:223-233］、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）アンテナペディア（Ａｎｔｐ）タンパク質のホメオティックタンパク質［ペネトレイン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）ＰＴＤ；配列番号１１２；Derossi et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:18188-18193］、プロテグリン（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）１（ＰＧ－１）抗菌ペプチドＳｙｎＢ［例えば、ＳｙｎＢ１（配列番号１２１）、ＳｙｎＢ３（配列番号１２２）、およびＳｙｎＢ４（配列番号１２３）；Kokryakov et al. (1993) FEBS Lett. 327:231-236］およびカポジ線維芽増殖因子［配列番号１０５；Lin et al., (1995) J. Biol. Chem. 270-14255-14258］に由来するＰＴＤを含む、以下の表において列挙されるＰＴＤを含むが、これらに限定されない。
他のタンパク質およびそれらのペプチド誘導体は、類似した細胞内部移行特性を保有することが見出されている。これらのタンパク質に由来している担体タンパク質は、互いに配列相同性をほとんど示さず、全て、高いカチオン性であり、アルギニンまたはリシンリッチである。実際に、合成ポリアルギニンペプチドは、高レベルの有効性で内部移行されることがわかっており、提供される抗体へのコンジュゲーションに関して選択され得る［Futaki et al. (2003) J. Mol. Recognit. 16:260-264；Suzuki et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840］。ＰＴＤはまた、トランスポータン［配列番号１３６；Pooga et al. (1988) FASEB J. 12:67-77；Pooga et al. (2001) FASEB J. 15:1451-1453］、ＭＡＰ［配列番号１０３；Oehlke et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414:127-139］、ＫＡＬＡ［配列番号１０１；Wyman et al. (1997) Biochemistry 36:3008-3017］および例えば、各種β－カチオン性ペプチド［Akkarawongsa et al. (2008) Antimicrob. Agents and Chemother. 52(6):2120-2129］等の他のカチオン性ペプチドを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の合成ＰＴＤの中から選択され得る。さらなるＰＴＤペプチドおよび変異体ＰＴＤはまた、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６０７５６号、同第２００６／０１７８２９７号、同第２００６／０１００１３４号、同第２００６／０２２２６５７号、同第２００７／０１６１５９５号、同第２００７／０１２９３０５号、欧州特許出願公開第１８６７６６１号、ＰＣＴ出願公開第２０００／０６２０６７号、同第２００３／０３５８９２号、同第２００７／０９７５６１号、同第２００７／０５３５１２号および本明細書中の表１３（以下）で提供される。本明細書で提供されるか、または当該技術分野で公知の任意のこうしたＰＴＤは、提供される治療抗体にコンジュゲートされ得る。
Figure 2022516725000018


Figure 2022516725000019

Figure 2022516725000020

幾つかの例では、ＰＴＤは、リシンまたはアルギニンの、別の塩基性アミノ酸による置換、例えば、リシンの、アルギニンによる置換によって、またはアルギニンのリシンによる置換によって改変され得る。
Ｅ．補体媒介性機能に関して、ｕ－ＰＡ活性を評価またはモニタリングするためのアッセイ
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３に対して、変更された特異性および／または選択性を示す。例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３を特異的に切断して、それにより、補体活性化を変更させる。さらに、本明細書で提供される例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲン等のｕ－ＰＡの天然基質の切断、およびｕＰＡＲへの結合に対して変更されたか、もしくは低減した特異性および／または選択性を有する。
様々なインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボアッセイを使用して、ｕ－ＰＡポリペプチドを、補体タンパク質Ｃ３を切断するそれらの能力ならびに補体活性化および補体媒介性疾患および障害に対するそれらの影響に関して、モニタリングまたはスクリーニングすることができる。こうしたアッセイは、当業者に周知である。当業者は、補体タンパク質Ｃ３の切断に関して、特定のｕ－ＰＡポリペプチドを試験することができ、および／またはプロテアーゼの非存在と比較して、補体媒介性活性に対するｕ－ＰＡの影響の任意の変化を評価するために検査することができる。幾つかのこうしたアッセイが、本明細書で例示されている。
例示的なインビトロおよびインビボアッセイは、補体タンパク質Ｃ３の機能に関する改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性の比較のために、本明細書で提供される。上記で論述されるように、補体活性化を測定するためのアッセイ等の多数のアッセイが、当業者に周知である。また、プラスミノゲンの切断またはｕＰＡＲへの結合等の野生型ｕ－ＰＡ活性に対して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性を決定するための例示的なアッセイが、本明細書で提供される。また、補体タンパク質Ｃ３に対して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの特異性を決定するためのアッセイが提供される。例示的なアッセイが、以下に記載されている。
１．補体タンパク質Ｃ３の機能に関して、ｕ－ＰＡ活性を評価する方法
改変ｕ－ＰＡプロテアーゼは、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対して、特異性および／または選択性の変更を示すことができ、それにより、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼの対応する完全長、スカフォールドまたは野生型形態と比較して、例えばＣ３等の任意の１つまたは複数の補体タンパク質を不活性化することができる。改変ｕ－ＰＡプロテアーゼは、それらのプロテアーゼ活性を保持するが、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対して増大した特異性および／または選択性を示すことができる。例示的な改変ｕ－ＰＡプロテアーゼは、例えば、Ｃ３等の任意の１つまたは複数の補体タンパク質を特異的に切断して、それにより、補体タンパク質の活性を変更させる。任意の１つまたは複数の補体に対して増大した特異性および／または選択性を有するこうした改変ｕ－ＰＡプロテアーゼは全て、候補治療薬である。
改変ｕ－ＰＡプロテアーゼが、任意の１つまたは複数の補体タンパク質に対して増大した特異性および／または選択性を示す場合、インビトロおよびインビボアッセイを使用して、補体媒介性機能に対する効果に関して、プロテアーゼをモニタリングまたはスクリーニングすることができる。こうしたアッセイは、当業者に周知である。当業者は、例えば、Ｃ３等の任意の１つまたは複数の補体タンパク質の切断に関して、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼを検査することができ、および／または改変ｕ－ＰＡプロテアーゼの非存在と比較して、補体媒介性活性に対する、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼの影響の任意の変化を評価するために検査することができる。幾つかのこうしたアッセイが、本明細書で例示されている。
例示的なインビトロおよびインビボアッセイは、任意の１つまたは複数の標的とされる補体タンパク質の機能に関する改変ｕ－ＰＡプロテアーゼの活性の比較のために、本明細書で提供される。アッセイの多くが、他のプロテアーゼおよび改変プロテアーゼに適用可能である。上記で論述されるように、補体の活性に関するアッセイとして、例えば、Ｃ５ｂ－９ ＭＡＣ複合体等の補体活性化の活性化産物、ならびにＣ４ａ、Ｃ５ａ、Ｃ３ｂ、およびＣ３ｄ等の補体切断産物の任意の１つまたは複数の生成を測定するアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。また、補体活性化を測定するためのアッセイとして、例えば、古典経路、レクチン経路または副経路のいずれか１つの活性化を測定するのに使用される溶血性アッセイ等の、補体経路の特定の構成成分の機能的活性を測定する機能的アッセイが挙げられる。補体タンパク質および／または補体媒介性機能に対する、プロテアーゼおよび改変プロテアーゼの影響を評価するためのアッセイとして、ＳＤＳ分析、続くウェスタンブロットまたはクマシーブリリアントブルー染色、酵素イムノアッセイ、および溶血性アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。一例では、インビトロアッセイは、精製された補体タンパク質を使用して実施され得る。別の例では、インビボアッセイは、補体の機能的活性化に関して、哺乳動物またはヒト種を含む種の血清を検査することによって実施され得る。例示的なアッセイが、以下に記載されている。
一例では、インビトロアッセイは、実施例２～４で例示されるように、精製された補体タンパク質Ｃ３を使用して実施され得る。別の例では、インビトロアッセイは、実施例５で例示されるように、生理学的に適切な溶液（即ち、硝子体液）中で行われ得る。別の例では、インビトロアッセイは、ペプチドライブラリーを使用して実施されて、切断特異性を評価することができる。別の例では、アッセイは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの正常な機能、即ち、正常な基質に対する活性を評価するように行われ得る。当業者に公知の様々な疾患モデルを使用して、様々な補体媒介性疾患および障害に対する、本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドの有効性を検査することができる。
ａ．タンパク質検出
タンパク質検出は、試料中の個々の補体構成成分を測定する手段である。補体タンパク質は、補体タンパク質Ｃ３の切断に対する、ｕ－ＰＡポリペプチドの影響を直接評価するように検出され得るか、あるいは、補体タンパク質は、補体活性化を評価する手段として測定され得る。ｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下で処置された補体タンパク質Ｃ３は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続くクマシー染色またはウェスタンブロット、酵素イムノアッセイ、免疫組織化学、フローサイトメトリー、比濁分析、寒天ゲル拡散、または放射免疫拡散を含む、任意の１つまたは複数のアッセイによって分析され得る。タンパク質検出に関する例示的なアッセイが、以下で記載されている。
ｉ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
増大濃度のｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下での補体タンパク質分析は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでのタンパク質の分析、続く、それらのタンパク質の検出によって実施され得る。こうした例では、補体タンパク質は、例えば、クマシーブリリアントブルー染色、銀染色によって、または当業者に公知の任意の他の方法によって、または特定のタンパク質に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットによって、総タンパク質を染色することによって検出され得る。通常、例えば、補体タンパク質Ｃ３等の精製された補体タンパク質は、ｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下でインキュベートされ得る。処置した補体タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離されて、例えば、クマシーブリリアントブルーによる染色によって、ゲル中のタンパク質を検出する方法が行われ得る。処置したタンパク質は、その同族の完全長タンパク質と比較することができ、タンパク質のプロテアーゼ切断によって形成される分解産物が決定され得る。
別の実施形態では、例えばヒト血清または血漿等の試料は、ｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下で処置することができるか、またはｕ－ＰＡポリペプチドを用いて、または用いずに、動物またはヒトを処置した後に収集することができる。ｕ－ＰＡで処置した試料は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されて、例えば、Ｃ３、Ｃ５、またはＢ因子等の特定の補体タンパク質は、タンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロットによって検出され得る。補体タンパク質の切断は、ｕ－ＰＡポリペプチドで処置されなかった試料と比較され得る。さらに、試料は、例えば、古典経路の活性化を刺激するＩｇＧとのインキュベーションによって、または副経路の活性化を刺激するＬＰＳによって、補体活性化を開始させるように刺激され得る。試料は、自然補体タンパク質の任意の１つまたは複数の検出用のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離されて、ｕ－ＰＡポリペプチドで処置されていないタンパク質の試料と比較して、特定のタンパク質の切断産物の存在または非存在を決定することができる。こうした例では、自然補体タンパク質の切断エフェクタ分子もまた、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロットによって分析されて、補体経路の１つまたは複数の活性化を評価することができる。補体エフェクタ分子の例として、Ｃ３ａ、Ｃ３ｄ、ｉＣ３ｂ、Ｂｂ、およびＣ５－ｂ９が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｂｂの試料における低下した発現により、ｕ－ＰＡポリペプチドが、補体の副経路の活性を阻害したことが示され得る。また、エフェクタ分子の切断産物が決定されて、補体エフェクタ分子自体の切断に対する増大濃度のｕ－ＰＡポリペプチドの影響を評価することができる。
ｉｉ．酵素イムノアッセイ
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ；酵素結合免疫吸着アッセイ；ＥＬＩＳＡとも呼ばれる）は、試料中のタンパク質の存在を測定するために使用されるアッセイである。通常、タンパク質の測定は、タンパク質の、抗体への結合の間接的な測定であり、抗体自体が、酵素または蛍光化合物等の検出可能な基質で化学的に標識されている。ＥＩＡアッセイを使用して、補体活性化後に生成される補体エフェクタ分子の存在に関して測定することによって、補体活性化に対するｕ－ＰＡポリペプチドの影響を測定することができる。こうした例では、例えば、ヒト血清または血漿等の試料は、増大濃度のｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下で前処置されて、続いて、開始分子とのインキュベーションによって補体活性化を誘導するように活性化され得るか、またはｕ－ＰＡポリペプチドによる動物またはヒトの処置後に収集され得る。例えば、古典経路は、ＩｇＧとのインキュベーションによって活性化させることができ、副経路は、試料の、ＬＰＳとのインキュベーションによって活性化することができる。レクチン経路のＣ４／Ｃ２切断活性が、補体の古典経路と共有されるため、レクチン経路に特異的な補体活性化アッセイは、補体の古典経路が阻害されることを要する。古典経路の阻害は、Ｃ１ｑの、免疫複合体への結合を阻害して、Ｃ１複合体を崩壊させる高イオン強度緩衝剤を使用して達成することができる一方で、高イオン強度緩衝剤は、ＭＢＬの炭水化物結合活性に影響を及ぼさない。したがって、レクチン経路の活性化は、１Ｍ ＮａＣｌの存在下での、ヒト血清または血漿等の試料の、マンナンでコーティングされた表面とのインキュベーションによって誘導され得る。
活性化後、試料は、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｒｏｃｈｅ）およびＥＤＴＡの添加を用いてクエンチして、経路の継続した活性化を最低限に抑えることができる。試料は、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡアッセイによって、補体エフェクタ分子の存在に関して分析され得る。補体タンパク質を測定するためのＥＩＡおよびＥＬＩＳＡアッセイは、当業者に周知である。任意の補体活性化産物が評価され得る。補体活性化の測定に関する例示的な補体活性化産物として、ｉＣ３ｂ、Ｂｂ、Ｃ５ｂ－９、Ｃ３ａ、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇおよびＣ５ａ－ｄｅｓＡｒｇが挙げられる。活性化された補体経路は、測定された補体活性化産物に応じて決定され得る。例えば、Ｂｂ切断産物の測定は、副経路の特有のマーカーである。
幾つかの例では、ＥＩＡは、プロテアーゼ処置されて補体で刺激された試料の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析、続く特異的な補体構成成分の同定のためのウェスタンブロット分析によって、切断された補体タンパク質の検出と組み合わせることができる。デンシトメトリーソフトウェアを使用して、補体産物の切断は、アッセイ全体にわたって切断された完全長補体構成成分と比較することができ、全ての主要分解産物の出現および切断パーセントが決定され得る。
ｉｉｉ．放射免疫拡散（ＲＩＤ）
放射免疫拡散（ＲＩＤ）は、注がれるとアガロースゲルに取り込まれる抗体間で形成される免疫複合体の沈殿に依存する技法であり、環状の沈降素を生じる検査試料中に存在する抗原は、試料ウェル周辺に並ぶ。沈降素環の直径は、検査試料中に存在する抗体（または抗原）の濃度に比例している。検査検体沈降素環の直径を、公知の標準物質と比較することによって、特異的な抗体または抗原の濃度の比較的感度の低い推定が達成され得る。ＲＩＤを使用して、試料中の補体タンパク質の量を測定することができる。例えば、ヒト血清または血漿等の試料は、増大濃度のｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下で処置され得る。プロテアーゼ処置された試料は、例えばＣ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、またはＢ因子を含むがこれらに限定されない補体タンパク質のいずれか１つに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を取り込むように作製されたアガロースゲルのウェルに添加され得る。０．１５Ｍ ＮａＣｌへの曝露による、沈殿しないタンパク質の除去後、例えばクマシーブリリアントブルーまたはクロウリー（Ｃｒｏｗｌｅｓ）二重染色等のタンパク質染料による染色によって、沈殿したタンパク質環を評価することができる。
ｂ．溶血性アッセイ
機能的溶血性アッセイは、全体として、補体機能に関する情報を提供する。このタイプのアッセイは、抗体感作させたか、または抗体感作させていないヒツジ赤血球を使用する。溶血性アッセイは、総溶血性補体アッセイ（ＣＨ５０）を含み、それは、古典経路およびＭＡＣの、ヒツジＲＢＣを溶解させる能力を測定する。溶血性アッセイは、細胞性抗原－抗体複合体を作成するのに最適な量のウサギ抗ヒツジ赤血球抗体で感作させたヒツジ赤血球を溶解させるための、古典経路構成成分（Ｃ１～Ｃ９）の逐次活性化に依存する。溶血性アッセイはまた、副経路ＣＨ５０アッセイ（ウサギＣＨ５０またはＡＰＣＨ５０）を含んでもよく、それは、副経路およびＭＡＣの、ウサギＲＢＣを溶解させる能力を測定する。１つのＣＨ５０および／またはＡＰＣＨ５０単位は、検査において赤血球の５０％を溶解させるのに必要とされる血清の量または希釈度として定義される。通常、補体活性化評価するために、例えばヒト血清またはヒト血漿等の試料は、増大濃度のｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下で処置され得るか、またはｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下で、動物またはヒトの処置後に収集され得る。続いて、プロテアーゼ処置された試料は、ＩｇＧで活性化または感作されたヒツジの赤血球と混合され得る。ヒツジ赤血球と混合した水のみの試料は、分析された試料の溶解パーセントを正確に評価するための総溶解対照として作用し得る。試料への、０．１５Ｍ ＮａＣｌの添加は、溶解反応を停止させるために添加され得る。補体経路の終末構成成分の活性化によって誘導される赤血球の溶解は、ヘモグロビンの放出を測定することによって評価され得る。測定は、ＯＤ ４１５ｎｍで分光光度計を使用して、試料の光学密度（ＯＤ）読取りによるものであり得る。
一実施形態では、限界希釈溶血性アッセイを使用して、いずれかの経路の特定の構成成分の機能的活性を測定することができる。こうしたアッセイでは、過剰な補体構成成分全てを有する血清供給源が使用されるが、試料中で測定中のものに関して欠乏しており、即ち、培地または血清供給源は、特定のタンパク質に関して補体枯渇されている。したがって、溶血の程度は、検査試料中の測定される構成成分の存在に依存する。こうしたアッセイでは、例えば、Ｃ３を含むがこれに限定されない自然補体タンパク質のいずれか１つ等の精製された補体タンパク質は、増大濃度のｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下でインキュベートされ得る。続いて、プロテアーゼ処置された精製補体タンパク質は、補体枯渇培地または血漿およびＩｇＧで活性化させたヒツジ赤血球と混合させることができ、試料の溶血は、上記のように評価され得る。別の実施形態では、プロテアーゼ切断は、プロテアーゼ処置された試料の溶血性活性に関してアッセイすることと、続いて、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで試料を分析すること、続く例えばクマシーブルー等のタンパク質染色で染色することとによって、補体活性化と相関させることができる。プロテアーゼ処置した精製補体タンパク質は、切断に関して評価することができ、アッセイ全体にわたって切断される完全長補体構成成分のパーセンテージおよび全ての主要な分解産物の出現を算出することができる。あるいは、プロテアーゼ処置された補体タンパク質の分析は、ウェスタンブロットによるものであってもよい。
リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）と呼ばれる溶血性アッセイに代わる代替物を使用して、古典経路の活性化を評価することができる。ＬＩＡ（Ｗａｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ）は、酵素グルコース－６－リン酸脱水素酵素を含有するジニトロフェニル（ＤＮＰ）でコーティングされたリポソームを利用する。血清が、リポソームならびに抗ＤＮＰ抗体、グルコース－６－リン酸およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含有する基質と混合されると、活性化されたリポソームは溶解して、酵素比色反応が起こり、これは、総古典補体活性に比例している。
ｃ．切断部位を決定する方法
補体タンパク質Ｃ３における切断配列は、当業者に公知の任意の方法によって同定され得る（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１４６９３８号を参照されたい）。一例では、切断配列は、補体タンパク質Ｃ３を、本明細書で提供される任意の改変ｕ－ＰＡポリペプチドとともにインキュベートすることによって決定される。ｕ－ＰＡポリペプチドとのインキュベーション後、Ｃ３タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離させることができ、分解産物は、クマシーブリリアントブルー等のタンパク質色素で染色することによって同定され得る。タンパク質分解性断片は、配列決定されて、切断配列の同一性を決定することができる。同定後、所望の標的基質の切断配列に基づいて設計されている蛍光発生的基質を使用して、以下に記載するように、活性を評価することができる。
２．野生型ｕ－ＰＡ活性を評価する方法
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プラスミノゲンおよびｕＰＡＲに対して変更または低減した特異性を有する。ｕ－ＰＡポリペプチドを検査して、それらが、それらの自然基質プラスミノゲンに対して、触媒効率および／または基質特異性を保持するかどうかを決定することができる。例えば、プラスミノゲンの切断は、ｕ－ＰＡポリペプチドの、プラスミノゲンとのインキュベーションと、切断産物を検出することとによって評価することができる。別の例では、プラスミノゲンの切断は、インビトロで、ペプチド基質の蛍光発生的にタグ付けられたテトラペプチド、例えば、テトラペプチド基質に連結されているフルオロフォアＡＣＣ（７－アミノ－４－カルバモイル－メチルクマリン）またはＡＭＣ（７－アミノ－４－メチルクマリン）等の蛍光発生的基質の切断を測定することによって評価され得る。幾つかの例では、プラスミノゲン活性化アッセイを使用して、本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドの特異性を決定する。他の例では、本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドの、ｕ－ＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）に結合する能力が決定される。
ａ．プラスミノゲンの切断
一例では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、所望の切断配列に対応する個々の蛍光発生的ペプチド基質を使用してアッセイされ得る。例えば、所望の切断配列の任意の１つまたは複数を切断し得る改変ｕ－ＰＡプロテアーゼに関してアッセイする方法は、（ａ）ペプチド蛍光発生的試料（所望の標的切断配列を含有する）を、プロテアーゼが作用すると、蛍光発生的部分がペプチド基質配列から放出されるような方法で、プロテアーゼと接触させること、それにより、蛍光部分を産生することと、（ｂ）試料が、蛍光の検出可能な変化を受けるかどうかを観察することとを含み、検出可能な変化は、試料中の酵素的に活性なプロテアーゼの存在の指標である。こうした例では、所望の切断配列は、当該技術分野で公知の方法によって、蛍光発生的ペプチドになる。一実施形態では、個々のペプチド切断配列は、例えば、ＡＣＣまたはＡＭＣ蛍光発生的脱離基等の、蛍光発生的にタグ付けされた基質に結合させることができ、蛍光発生的部分の放出は、ペプチド切断配列に関するプロテアーゼの特異性の尺度として決定され得る。標的切断配列の蛍光の増大の速度は、例えば、蛍光分光光度計を使用することによって測定され得る。蛍光の増大の速度は、経時的に測定され得る。ミカエリスメンテン速度定数は、標準的な速度論的方法によって決定することができる。速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍは、基質濃度の逆数対基質切断の速さの逆数をグラフに書くことと、ラインウーバーバーク方程式（１／速さ＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ；式中、Ｖｍａｘ＝［ＥＴ］ｋｃａｔ）にフィッティングさせることとによって算出することができる。二次速度定数または特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、どれくらい良好に基質が特定のプロテアーゼによって切断されるかの尺度である。例えば、Ａｃ－ＣＰＧＲ－ＡＭＣ等のＡＣＣまたはＡＭＣ－テトラペプチドが作製されて、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドとともにインキュベートさせることができ、ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、蛍光発生的部分の放出に関してアッセイすることによって評価され得る。テトラペプチドの選択は、標的に対する所望の切断配列に依存し、経験的に決定され得る。
他の実施形態では、ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、活性形態で、ｕ－ＰＡポリペプチドが、完全長タンパク質の状況で提示された場合に所望の配列を切断することを確かめるためにアッセイすることができる。一例では、精製された標的タンパク質、即ち、プラスミノゲンは、選択したｕ－ＰＡポリペプチドの存在下、または非存在下でインキュベートさせることができ、切断事象は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続くタンパク質に関するクマシーブリリアントブルー染色、およびデンシトメトリーを使用した切断産物の分析によってモニタリングすることができる。
ｂ．プラスミノゲン活性化アッセイ
当業者に公知の任意のアッセイを使用して、ｕ－ＰＡポリペプチドがプラスミノゲンを活性化させるかどうかを決定することができる。一例では、プラスミノゲンの活性化は、プラスミノゲンおよび例えば、発色性基質Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ｐ－ニトロアナリド（ｎｉｔｒｏａｎａｌｉｄｅ）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｓ－２２５１）または蛍光発生的基質Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－７－アミド－４－メチルクマリン等の検出可能なプラスミン基質の存在下でインキュベートすることによって決定され得る。続いて、加水分解は、４０５ｎｍで吸光度を測定することによって、または励起波長３９０ｎｍおよび発光波長４８０ｎｍを有する蛍光プレートリーダーを使用して蛍光を検出することによって、モニタリングされる。別の例では、プラスミノゲンの活性化は、ｕ－ＰＡポリペプチドがｕＰＡＲに結合されている間に評価される。こうした例では、ｕ－ＰＡポリペプチドはまず、Ｕ３９７細胞等の、細胞表面上のｕＰＡＲに結合された後、プラスミノゲンおよび検出可能なプラスミン基質を添加して、上記するように、加水分解が測定される。
ｃ．ｕ－ＰＡ－ｕＰＡＲ結合アッセイ
ｕ－ＰＡポリペプチドの、ｕＰＡＲへの結合は、固相結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴およびＦＡＣＳを含むがこれらに限定されない、タンパク質－タンパク質結合相互作用を検出するための当業者に公知の任意のアッセイによって評価され得る。一例では、ＥＬＩＳＡが使用され得る。組換えｕＰＡＲは、マイクロタイタープレート上に固定化されて、ｕ－ＰＡポリペプチド結合は、例えば、ｕ－ＰＡ結合抗体等のｕ－ＰＡに特異的に結合する試薬の添加によって評価される。別の例では、結合は、ｕ－ＰＡ受容体を発現する、例えば、Ｕ３９７細胞等の細胞株を使用した細胞ベースのアッセイにおいて決定され得る。ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、発色性、蛍光発生的または放射性基質で標識されて、結合の検出をもたらし得る。
ｄ．Ｃ３切断
改変ｕＰＡポリペプチドの活性は、様々な濃度の改変ｕＰＡプロテアーゼとのインキュベーション後に残存する無傷のヒトＣ３の量を測定することにより、基質補体タンパク質ヒトＣ３の切断によって評価され得る。このアッセイによれば、シグナルは、無傷のヒトＣ３の存在下で発生されて、Ｃ３が切断されると失われる。他の例では、Ｃ３活性化アッセイは、本明細書で提供される改変ｕＰＡポリペプチドの特異性を決定するのに使用される。
精製されたＣ３タンパク質は、改変ｕ－ＰＡポリペプチドとともにインキュベートさせることができ、未消化のヒトＣ３の残留レベルは、例えばＡｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ Ｓｃｒｅｅｎ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、タンパク質濃度を評価するための当業者に公知の任意のアッセイによって定量化され得る。Ｃ３／ｕＰＡポリペプチド混合物は、α－マウスＩｇＧでコーティングされたアクセプタービーズとともにインキュベートされて、インキュベーション後、α－ｈＣ３ ｍＡｂ／アクセプタービーズ混合物は、ビオチン化α－ｈＣ３ ｐＡｂともにインキュベートされる。ストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズは、混合物に添加されて、続いて、「アルファスクリーン」シグナル（励起＝６８０ｎｍ、発光＝５７０ｎｍ）が測定される。このシグナルは、残存するＣ３タンパク質の濃度に対応する。５０％に至る利用可能なｈＣ３を切断するのに必要とされるｕＰＡポリペプチドの濃度（ＥＣ５０）が算出され得る。
ＡＣＣ－ＡＧＲ＋ＥＬＩＳＡ
改変ｕ－ＰＡポリペプチドの基質特異性を評価する方法が、本明細書で提供される。例えば、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光発生的ペプチド基質または７－アミノ－４－カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）蛍光発生的ペプチド基質等の蛍光発生的ペプチド基質を使用して、改変プロテアーゼの活性をアッセイすることができ、それにより、プロテアーゼが作用すると、蛍光発生的部分がペプチド基質から放出され、蛍光発生的部分の放出は、ペプチド切断配列に関するプロテアーゼの特異性の尺度として決定され得る。非標的基質切断配列または標的切断配列の蛍光の増大の速度は、例えば、蛍光分光光度計を使用することによって測定され得る。蛍光の増大の速度は、経時的に測定され得る。ミカエリスメンテン速度定数は、標準的な速度論的方法によって決定することができる。速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍは、基質濃度の逆数対基質切断の速さの逆数をグラフに書くことと、ラインウーバーバーク方程式（１／速さ＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）（１／［Ｓ］）＋１／Ｖｍａｘ；式中、Ｖｍａｘ＝［ＥＴ］ｋｃａｔ）にフィッティングさせることとによって算出することができる。特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、どれくらい良好に基質が特定のプロテアーゼによって切断されるかの尺度である。
一例では、補体タンパク質の切断配列の任意の１つまたは複数は、所望の標的切断配列として決定および使用され得る。例えば、Ｃ３切断配列の任意の１つまたは複数。別の例では、野生型プロテアーゼの基質に対応する配列を使用して、残留プロテアーゼ活性をアッセイすることができる。
さらなる実施形態では、完全長補体タンパク質を標的基質として使用して、プロテアーゼの完全長自然標的基質と比較して、プロテアーゼ特異性に関してアッセイすることができる。さらに、完全長補体タンパク質を使用して、完全長標的基質対標的基質内に含有される４つのアミノ酸Ｐ１～Ｐ４基質切断配列の、基質特異性と、プロテアーゼによる切断との間の相関関係を評価することができる。一例では、完全長Ｃ３タンパク質を、プロテアーゼの任意の１つまたは複数の所望の切断標的として使用して、特異性を評価することができる。この例では、改変プロテアーゼによるＣ３の切断は、別の完全長基質の切断と比較され得るか、または切断は、Ｃ３の蛍光発生的テトラペプチド切断配列と比較され得る。プロテアーゼによる完全長タンパク質の切断の特異性定数は、ゲルデンシトメトリーを使用して、プロテアーゼの存在下でインキュベートされた完全長標的基質バンドの経時的なデンシトメトリーの変化を評価することによって決定され得る。
さらなる実施形態では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、カニクイザル血漿または硝子体液中での長期にわたるインキュベーション後に評価され得る。一例では、残留プロテアーゼ活性は、８０％カニクイザル硝子体液中でのインキュベーション後に、蛍光発生的基質ＡＧＲ－ＡＣＣ（７－アミノ－４－カルバモイルメチル－クマリン）を用いてアッセイされる。例えば、配列番号２１の改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、硝子体液およびＰＢＳ中での７日間のインキュベーション後に、蛍光発生的基質ＡＧＲ－ＡＣＣを切断するのに匹敵する能力を示す。別の例では、配列番号２１の改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、硝子体液中での７日間のインキュベーション前および後に、同様のレベルで蛍光発生的基質ＡＧＲ－ＡＣＣを切断する。
ペプチドライブラリーを使用した特異性の評価
得られた改変ｕ－ＰＡポリペプチドの基質特異性を、蛍光発生的ペプチドにカップリングさせたペプチドライブラリーを使用して評価する方法が、本明細書で提供される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、蛍光発生的基質にカップリングされたペプチドライブラリーを使用して、任意の所与のサブサイトでＰ１～Ｐ４基質特異性に関して検証され得る［Harris et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:7754；米国特許出願公開第２００４／０１７５７７７号；同第２００４／０１４６９３８号］。ペプチドライブラリー（単数または複数）の使用により、タンパク質分解性基質の迅速かつ容易な決定が可能となる。この戦略は、ライブラリーの１つの位置が一定に保たれる（即ち、Ｐ１位置）一方で、残りの位置（即ち、Ｐ４～Ｐ２および／またはＰ１’および／またはＰ２’）が、ライブラリーを調製するのに使用されるアミノ酸の組合せ全てで構成される、ペプチドのライブラリーの使用を包含する。例えば、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光発生的ペプチド基質または７－アミノ－４－カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）蛍光発生的ペプチド基質等のコンビナトリアル蛍光発生的ペプチド基質ライブラリーの使用は、改変プロテアーゼの活性に関してアッセイするのに使用することができ、それにより、プロテアーゼが作用すると、蛍光発生的部分がペプチド基質から放出される。これらの方法が、広範囲の代替的なライブラリーフォーマットを提供することが、当業者に理解されよう。一例では、プロテアーゼは、Ｐ１－多様性ライブラリーを用いてプロファイリングされ得る。Ｐ１－多様性テトラペプチドライブラリーは、Ｐ１位置が、系統的に一定に保たれる一方で、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４位置が、１５個のアミノ酸の任意の１つまたは複数の等モル混合物を含有する、ＡＣＣまたはＡＭＣ－蛍光発生的テトラペプチドを含有する。任意の特定の酵素または基質配列特異性決定の方法に関連する決定および特定の限定の考慮は、当業者の能力の範囲内である。
ペプチドを調製するための多くの方法が存在することを、当業者は理解されよう。例示的な実施形態では、基質ライブラリーは、蛍光発生的にタグ付けられた基質を、固体支持体に結合することによってスクリーニングされる。一例では、基質ペプチド由来の蛍光発生的脱離基は、Ｎ－Ｆｍｏｃクマリン誘導体を、酸に不安定なＲｉｎｋリンカーに縮合させることによって合成されて、ＡＣＣ樹脂を提供する［Backes et al., (2000) Nat Biotechnol. 18:187］。Ｆｍｏｃ除去により、遊離アミンが産生される。天然、非天然および改変アミノ酸は、アミンにカップリングさせることができ、それらは、さらなるアミノ酸のカップリングによって合成され得る。代替的な実施形態では、蛍光発生的脱離基は、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）であり得る［Harris et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:7754］。ペプチドの合成が完了した後、ペプチド－蛍光発生的部分コンジュゲートは、固体支持体から切断され得るか、あるいはコンジュゲートは、固体支持体に係留されたままであり得る。
通常、蛍光発生的ペプチドおよび蛍光発生的ペプチドを含む材料を調製する方法は、（ａ）固体支持体に共有結合された蛍光発生的部分を含有する第１のコンジュゲートを提供することと、（ｂ）第１のコンジュゲートを、第１の保護アミノ酸部分および活性化剤と接触させて、それにより、カルボキシル基と、第１のコンジュゲートのアミン窒素との間にペプチド結合を形成することと、（ｃ）脱保護して、それにより、反応性アミン部分を有する第２のコンジュゲートを形成することと、（ｄ）第２のコンジュゲートを、第２の保護アミノ酸および活性化剤と接触させて、それにより、カルボキシル基と、反応性アミン部分との間にペプチド結合を形成することと、（ｅ）脱保護して、それにより、反応性アミン部分を有する第３のコンジュゲートを形成することとを含む。例示的な実施形態では、上記方法は、（ｆ）第３のコンジュゲートを、第３の保護アミノ酸および活性化剤と接触させて、それにより、カルボキシル基と反応性アミン部分との間にペプチド結合を形成することと、（ｅ）脱保護して、それにより、反応性アミン部分を有する第４のコンジュゲートを形成すること、とをさらに含む。
カップリングするのが困難なアミノ酸（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ等）に関して、遊離の未反応アミンは、支持体上に残存したままであり、続く合成およびアッセイ操作を複雑にし得る。ＤＭＦ中の酢酸の３－ニトロトリアゾール活性エステルを用いた特殊なキャッピングステップは、残存するアニリンを効率的にアシル化する。未精製の基質配列溶液中に存在し得る、得られた酢酸でキャップされたクマリンは一般的に、プロテアーゼ基質配列ではない。
配列のＣ末端アミノ酸が、不溶性支持体に結合され、続く配列における残存するアミノ酸の逐次添加が行われる固相ペプチド合成は、本明細書で提供されるポリペプチドのペプチド骨格を調製する例示的な方法である。固相合成に関する技法は、Narany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp.3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2; Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Gross and Meienhofer, eds. Academic press, N.Y., (1980)、およびStewart et al., (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Illに記載されている。固相合成は、Ｆｍｏｃまたはｔ－Ｂｏｃ化学を利用して、市販のペプチド合成剤を用いて、最も容易に遂行される。
例えば、ペプチド合成は、周知のＦｍｏｃ合成化学を使用して実施され得る。例えば、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｒｙの側鎖は、ｔ－ブチルを使用して保護され、Ｃｙｓ残基の側鎖は、Ｓ－トリチルおよびＳ－ｔ－ブチルチオを使用して保護され、Ｌｙｓ残基は、ｔ－Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃおよび４－メチルトリチルを使用して保護される。適切に保護されたアミノ酸試薬は、市販されているか、または当技術分野で認識されている方法を使用して調製され得る。多重保護基の使用により、選択的な脱ブロッキング（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）および任意の特定の所望の側鎖へのフルオロフォアのカップリングが可能となる。したがって、例えば、ｔ－Ｂｏｃ脱保護は、ジクロロメタン中でＴＦＡを使用することによって遂行される。Ｆｍｏｃ脱保護は、例えば、ＤＭＦまたはＮ－メチルピロリドン中で２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを使用して遂行され、４－メチルトリチル脱保護は、例えば、水中での１％～５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡまたはＤＣＭ中の１％ＴＦＡおよび５％トリイソプロピルシランを使用して遂行される。Ａ－ｔ－ブチルチオ脱保護は、例えば、メルカプトエタノール水（１０％）を使用して遂行される。ｔ－ブチル、ｔ－ｂｏｃ、およびＳ－トリチル基の除去は、例えば、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソ：エタンジチオ（８５：５：５：２．５：２．５）、またはＴＦＡ：フェノール：水（９５：５：５）を使用して遂行される。
任意の特定の位置または位置の組合せでの多様性は、少なくとも２個、６個、１２個、２０個、またはそれよりも多いアミノ酸の混合物を使用して導入されて、ペプチド鎖を成長させることができる。アミノ酸の混合物は、任意の有用な量の１つまたは複数の異なるアミノ酸と組み合わせた、任意の有用な量の特定のアミノ酸を包含し得る。一実施形態では、混合物は、アミノ酸の等速性混合物（構成成分全ての等モル反応性を可能にするのに適した比率の混合物）である。例えば、本明細書に記載される改変ｕ－ＰＡプロテアーゼ等の改変プロテアーゼは、所望の切断配列に対応する個々の蛍光発生的ペプチド基質を使用してアッセイすることができる。Ｃ３切断配列の任意の１つまたは複数を切断することができる改変プロテアーゼに関してアッセイする方法は、（ａ）ペプチド蛍光発生的試料（Ｃ３切断配列を含有する）を、プロテアーゼが作用すると、蛍光発生的部分がペプチド基質配列から放出されるような方法で、プロテアーゼと接触させて、それにより、蛍光部分を産生することと、（ｂ）試料が、蛍光の検出可能な変化を受けるかどうかを観察することとを含み、検出可能な変化が、試料中の酵素的に活性なプロテアーゼの存在の指標である。こうした例では、Ａｃ－ＡＧＲ－ＡＭＣ等のＡＣＣまたはＡＭＣ－テトラペプチドが作製されて、改変プロテアーゼとともにインキュベートさせることができ、プロテアーゼの活性は、蛍光発生的部分の放出に関してアッセイすることによって評価され得る。
溶液中でプロテアーゼに関してアッセイすることは、単に、プロテアーゼの大量のストック溶液を、蛍光発生的プロテアーゼ指示薬ペプチドに添加することと、続く、蛍光の増大または吸収スペクトルにおける励起バンドの減少を測定することとを必要とする。溶液および蛍光発生的指示薬はまた、組み合わせることができ、プロテアーゼの活性を最適化する「消化緩衝剤」中でアッセイされ得る。プロテアーゼ活性をアッセイするのに適した緩衝剤は、当業者に周知されている。一般的に、特定のプロテアーゼのｐＨ最適に対応するｐＨを有する緩衝剤が選択される。例えば、エラスターゼ活性をアッセイするのに特に好適な緩衝剤は、ｐＨ８．９で、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する。フルオロフォアに関する「励起」光源を提供して、続いて、特定の波長で発光される光を測定する機器である蛍光光度計において、測定は、最も容易に行われる。プロテアーゼを欠いている対照指示薬溶液との比較により、プロテアーゼ活性の尺度が提供される。活性レベルは、公知の活性のプロテアーゼ溶液によって生じる蛍光の変化の速度が決定されるプロテアーゼ／指示薬の組合せに関して、標準曲線を作成することによって、正確に定量化され得る。
蛍光発生的化合物の検出は、蛍光光度計を使用して遂行され得る一方で、検出はまた、当業者に周知の様々な他の方法によって遂行され得る。したがって、例えば、フルオロフォアが、可視波長で発光する場合、検出は、単に、光源による励起に応答した蛍光の目視検査によるものであり得る。検出はまた、デジタイザーまたは他の画像獲得システムに接続されたビデオカメラを利用した画像解析システムを用いるものであり得る。検出はまた、蛍光顕微鏡下等で、フィルターを通した可視化によるものであり得る。顕微鏡は、オペレーターによって単に可視化されるシグナルを提供し得る。あるいは、シグナルは、写真フィルムに、またはビデオ解析システムを使用して記録され得る。シグナルはまた、画像解析システムまたは光度計のいずれかを使用して、単にリアルタイムで定量化され得る。
したがって、例えば、試料のプロテアーゼ活性に関する基本的なアッセイは、例えば、Harris et al., (1998) J Biol Chem 273:27364に示されるように、緩衝剤中で（アッセイされる特定のプロテアーゼの最適ｐＨで）、または検査条件（例えば、硝子体液または血清）で、試料を懸濁または溶解することと、緩衝剤に蛍光発生的プロテアーゼペプチド指示薬を添加することと、分光蛍光光度計を使用して、蛍光の生じた変化をモニタリングすることとを包含する。分光蛍光光度計は、フルオロフォアの励起波長でフルオロフォアを励起するように設定される。蛍光発生的プロテアーゼ指示薬は、指示薬を切断するプロテアーゼに起因して、蛍光が変わるプロテアーゼの基質配列である。
改変プロテアーゼはまた、それらが、完全長タンパク質の文脈で提示された場合に、所望の配列を切断することを確かめるためにアッセイされる。Ｃ３切断部位を含有する標的基質タンパク質は、Ｃ３活性化切断または活性部位に存在する。標的タンパク質の切断を評価する方法は、本明細書に記載されており、および／または当該技術分野で周知である。一例では、精製された補体タンパク質、例えば、Ｃ３は、改変プロテアーゼの存在下、または非存在下でインキュベートさせることができ、切断事象は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続く、タンパク質に関するクマシーブリリアントブルー染色およびデンシトメトリーを使用した切断産物の分析によってモニタリングされ得る。標的タンパク質の活性はまた、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で周知である方法を使用して、例えば溶血アッセイ等でアッセイされて、その機能が、切断事象によって破壊されていることを検証する。
３．特異性
標的基質、例えば、補体タンパク質Ｃ３またはプラスミノゲンの、改変ｕ－ＰＡポリペプチドによる切断の特異性定数は、ゲルデンシトメトリーを使用することによって決定されて、ｕ－ＰＡポリペプチドの存在下でインキュベートされた完全長標的基質の経時的なデンシトメトリーの変化を評価することができる。特定の実施形態では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの特異性の比較を使用して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、野生型ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、Ｃ３に対して変更された、例えば、増大した特異性を示すかどうかを決定することができる。標的基質、例えば、補体タンパク質Ｃ３に対するｕ－ＰＡポリペプチドの特異性は、非標的基質（例えば、ｕ－ＰＡの自然野生型基質）と比較した、標的基質の切断の特異性定数から決定され得る。標的基質Ｃ３対プラスミノゲン等の非標的基質に対する改変ｕ－ＰＡポリペプチドの特異性定数の比は、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの切断の効率の比を決定するようになり得る。改変ｕ－ＰＡポリペプチドと、野生型ｕ－ＰＡポリペプチドとの間の切断の効率の比の比較を使用して、標的基質に対する特異性の倍数変化を評価することができる。特異性は、標的基質対非標的基質に関して、野生型ｕ－ＰＡポリペプチドの特異性と比較した場合に、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、もしくは１０００倍またはそれよりも多い倍数であり得る。
ｕ－ＰＡポリペプチドの自然基質の切断の動態分析は、補体タンパク質Ｃ３における所望の標的基質の切断の分析と比較されて、補体タンパク質Ｃ３に対する改変ｕ－ＰＡポリペプチドの特異性を評価することができる。阻害の二次速度定数（ｋｉ）を評価して、補体タンパク質Ｃ３に関する、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの有効性および反応性をモニタリングすることができる。本明細書の目的で、改変ｕ－ＰＡポリペプチドはＣ３を切断して、その結果、補体活性化が阻害されて、実施例に示されるように、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、非改変ｕ－ＰＡポリペプチド（またはＣ１２２Ｓ置換で改変されたｕ－ＰＡポリペプチド、これは、遊離システインを排除して、それにより凝集を低減させる）よりも、著しく大きな活性、例えば少なくとも５倍を上回る活性でそれを行う。例えば、配列番号２１の改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号５の野生型プロテアーゼドメインに関する３３８０ｎＭと比較して、１９ｎＭのＥＣ５０で、本明細書に記載されるアッセイにおいて、ヒトＣ３を切断する。
４．疾患モデル
本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、当業者に公知の任意の臨床的に意義のある疾患モデルにおいて使用され、補体媒介性疾患または障害に対するそれらの影響を決定することができる。例示的なアッセイとして、ヒト膵島細胞を用いたインビトロアッセイ［Tjernberg et al. (2008) Transplantation 85:1193-1199］およびブタの腎臓を用いたエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）アッセイ［Fiane et al. (1999) Xenotransplantation 6:52-65］を含む、移植；インビトロ人工表面誘導性炎症を含む生体不適合性（ｂｉｏｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）［Lappegard et al. (2008) J Biomed Mater Res A 87:129-135; Lappegard et al. (2005) Ann Thorac Surg 79:917-923；Nilsson et al. (1998) Blood 92:1661-1667；Schmidt et al. (2003) J Biomed Mater Res A 66:491-499］；インビトロ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）誘導性炎症［Mollnes et al. (2002) Blood 100:1867-1877］およびヒヒにおけるヘパリン／プロタミン複合体誘導性炎症［Soulika et al. (2000) Clin Immunol 96:212-221］を含む、炎症；ウサギおよびサルおよび齧歯類における加齢黄斑変性［Chi et al. (2010) Adv Exp Med Biol 703:127-135；Pennesi et al. (2012) Mol. Aspects Med. 33(4):487-509；Fletcher et al. (2014) Optm. Vis. Sci. 91(8):878-886；Forest et al., (2015) Disease Models and Mechanisms 8:421-427］；ならびにブタ［Hanto et al., (2010) Am J Transplant 10(11):2421-2430］およびイヌ［Petrinec et al., (1996) Surgery 61:1331-1337］における移植機能発現遅延に関するアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｆ．その改変Ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を産生する方法
本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのポリペプチドは、当該技術
分野において周知のタンパク質精製および組換えタンパク質発現方法により得ることができる。ポリペプチドはまた、化学的に合成することもできる。切断形態を含む、改変またはバリアントは、標準的組換えＤＮＡ方法を使用し、野生型ポリペプチドから操作することができる。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発により、野生型ポリペプチドから操作することができる。
１．ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
ポリペプチドは、当該技術分野において公知の、任意の利用可能な、核酸分子のクローニングおよび単離方法を使用し、クローニングするか、または単離することができる。このような方法は、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含む、核酸のＰＣＲ増幅およびライブラリーのスクリーニングを含む。
例えば、ポリペプチドが、組換え手段により産生されるとき、当業者に公知の任意の、所望の遺伝子をコードする核酸の同定方法を使用することができる。当該技術分野において利用可能な任意の方法を使用して、細胞または組織供給源から、ｕ－ＰＡをコードする全長もしくは部分的（すなわち、コード領域全体を包含する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。
核酸の増幅方法を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を含む、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。このような方法の例としては、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ＣｅｔｕｓサーマルサイクラーおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ）の使用が挙げられる。材料を含有する核酸は、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離し得る出発材料として使用することができる。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、液体試料（例えば、血液、血清、唾液）、ならびに健常および／または疾患対象由来の試料は、増幅方法において使用することができる。供給源は、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、および他の霊長類供給源を含むが、これらに限定されない、任意の真核生物種由来であり得る。核酸ライブラリーはまた、出発材料の供給源として使用することができる。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するよう設計することができる。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが生成される、発現した配列に基づき、設計することができる。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づき、設計することができる。所望されるなら、縮重プライマーは、増幅のため使用することができる。所望の配列の３’および５’末端において配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸試料からＰＣＲにより配列を増幅するためのプライマーとして使用することができる。プライマーを使用して、全長ｕ－ＰＡ全体、またはその切断された配列、例えば、本明細書において提供される可溶性ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれかをコードする核酸を増幅することができる。増幅により生成される核酸分子は、配列決定され、所望のポリペプチドをコードすることが確認され得る。
追加のヌクレオチド配列は、ベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードＤＮＡ配列の増幅のため設計されたベクターに合成遺伝子をクローニングする目的のため、制限酵素部位を含有するリンカー配列を含む、核酸分子をコードするポリペプチドに結合され得る。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを特定する追加のヌクレオチド配列は、核酸分子をコードするポリペプチドに作動可能に連結され得る。このような配列の例としては、細胞内タンパク質発現を促進するよう設計されたプロモーター配列、および分泌配列、例えば、タンパク質分泌を促進するよう設計された異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。このような配列は、当業者に公知である。追加のヌクレオチド残基配列、例えば、タンパク質結合領域を特定する塩基の配列はまた、酵素をコードする核酸分子に結合され得る。このような領域としては、特定の標的細胞への酵素の取り込みを促進するか、もしくはそうでなければ、合成遺伝子の産物の薬理動態を変更させるタンパク質を促進するか、またはコードする残基の配列が挙げられるが、これらに限定されない。
タグおよび／または他の部分は、例えば、ポリペプチドの検出または親和性精製の目的で、加えることができる。例えば、エピトープタグまたは他の検出可能なマーカーを特定する塩基の配列のような、追加のヌクレオチド残基配列はまた、酵素をコードする核酸分子に結合され得る。このような配列の例としては、ＳＵＭＯタグまたはＨｉｓタグまたはＦｌａｇタグをコードする核酸配列が挙げられる。
次に、同定され、単離された核酸は、適当なクローニングベクターに挿入され得る。当該技術分野において公知の、多数のベクター－宿主システムを使用することができる。可能性のあるベクターとしては、プラスミドまたは改変ウイルスが挙げられるが、これらに限定されず、しかしながら、ベクターシステムは、使用される宿主細胞と適合性でなければならない。このようなベクターとしては、ラムダ派生物のようなバクテリオファージ、またはｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド派生物のようなプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補性付着末端を有するクローニングベクターにＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、達成することができる。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、もたらされ得る。
ＤＮＡを断片化するために使用される相補性制限酵素部位が、クローニングベクターに存在しないなら、ＤＮＡ分子の末端は、酵素的に改変され得る。あるいは、所望の任意の部位は、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲーションすることにより産生することができ、これらのライゲーションされたリンカーは、制限酵素認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含有し得る。代替の方法では、切断されたベクターおよびタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングにより改変され得る。
多数のコピーの遺伝子配列が生成されるように、組換え分子は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションを介して宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、単離されたタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成されたＤＮＡ配列を取り込む組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換により、複数コピーの遺伝子の生成が可能になる。したがって、遺伝子は、形質転換体を成長させること、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離すること、および必要な場合は、単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、多量に得ることができる。
組換え産生に加えて、本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、固相技術を使用し、直接ペプチド合成により産生され得る［例えば、Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis、WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc., 85:2149-2154］。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのタンパク質合成は、手動の技術を使用し、または自動により、行われ得る。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を使用し、製造者により提供される指示に従い、達成され得る。ポリペプチドの様々な断片は、化学的方法を別々に使用し、および化学的方法を組み合わせて使用し、化学的に合成され得る。
二本鎖活性化形態および二量体のような、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性形態または活性化形態または活性化可能な形態の発現方法も、本明細書において提供される。本明細書において考察され、記載され、実施例１４～１６において例示される通り、改変ｕ－ＰＡポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸は、調製され得る。核酸は、例えば、ｕ－ＰＡシグナル配列、ＩｇＧカッパ鎖シグナル配列、およびＩＬ－２シグナル配列のような分泌シグナル、ｕ－ＰＡのＮ末端部分（全長ｕ－ＰＡを産生するため）、例えば、ｕ－ＰＡ活性化配列またはフューリン配列のような、活性化配列、ならびに血清半減期のようなｕ－ＰＡの特性を変更するためのアルブミンのような融合パートナー、ならびに／またはＨｉｓタグのような配列ならびに／または発現を増大させ、および／または単離を促進するためのＳＵＭＯが挙げられるが、これらに限定されない、他の配列をコードする核酸に結合された、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインをコードする。これらの核酸分子は、改変ｕ－ＰＡおよび／または融合タンパク質の産生のための、当業者に周知である、適当な宿主細胞において発現され得る。一般に、核酸は、シグナル配列または分泌もしくは精製のため遺伝子座へのトラフィッキングのための他のトラフィッキング配列をコードする。活性化配列をコードする核酸を含ませることを使用し、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性化形態を産生することができる。
２．変異体または改変核酸およびコードポリペプチドの生成
本明細書において提供される改変は、当業者にとって慣習的であるような、標準的組換えＤＮＡ技術により成され得る。標的タンパク質において任意の１つまたは複数のアミノ酸の変異をもたらすための当該技術分野において公知の任意の方法が、利用され得る。方法は、コード核酸分子の標準的部位特異的変異誘発（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅのようなキットを使用する）または固相ポリペプチド合成方法によるものを含む。
３．ベクターおよび細胞
本明細書において記載される任意の改変ｕ－ＰＡポリペプチドのような、所望のタンパク質の１つまたは複数の組換え発現のため、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは部分を含有する核酸は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必須のエレメントを含有するベクターに挿入され得る。必須の転写および翻訳シグナルはまた、酵素遺伝子、および／またはそれらのフランキング領域のための天然のプロモーターにより提供され得る。
酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供される。ベクターを含有する細胞も提供される。細胞は、真核生物および原核生物の細胞を含み、ベクターは、そこでの使用に幾分適当である。一般に、細胞は、コードされるタンパク質の糖改変に影響する能力がある細胞である。
ベクターを含有する原核生物および真核生物の細胞が、提供される。このような細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞を含む。細胞を使用して、上記の細胞を、コード化されるタンパク質が、細胞により発現される条件下で成長させること、および発現されたタンパク質を回収することにより、そのタンパク質を産生する。ここでの目的のため、例えば、酵素は、培地に分泌され得る。
宿主細胞株は、挿入された配列の発現をモジュレートするその能力または所望の様式で発現されたタンパク質を処理するその能力から選択され得る。ポリペプチドのこのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、糖改変、リン酸化、脂質改変およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後処理は、ポリペプチドのフォールディングおよび／または機能に影響し得る。非限定的に、ＣＨＯ（ＤＧ４４、ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－Ｋ１）、ＨｅＬａ、ＭＣＤＫ、２９３およびＷＩ３８のような、異なる宿主細胞は、このような翻訳後活性に特定の細胞機構および特徴機序を有し、正しい改変および導入されたタンパク質の処理を確実にするよう選択され得る。一般に、細胞の選択は、Ｎ－結合糖改変を発現したポリペプチドに導入する能力があるものである。故に、ベクターを含有する真核生物の細胞が提供される。真核生物の細胞の例は、哺乳類のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素を欠損したＣＨＯ細胞（例えば、ＤＧ４４細胞）を使用して、本明細書において提供されるポリペプチドが産生される。
天然または異種シグナル配列に結合した、改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、ならびにその複数のコピーを含有するベクターが、提供される。ベクターは、細胞における酵素タンパク質の発現のため選択され得るか、または酵素タンパク質は、分泌されたタンパク質として発現されるように、選択され得る。
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有し、プロテアーゼドメインの全てもしくは部分を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、またはその複数のコピーを含有するベクターが提供される。プロテアーゼドメインおよび全長プロテアーゼタンパク質を最大で含むプロテアーゼタンパク質の追加の部分をコードするヌクレオチドの配列、ならびにその複数のコピーを含有するベクターも提供される。ベクターは、細胞における足場または改変プロテアーゼタンパク質もしくはそのプロテアーゼドメインの発現のため、またはプロテアーゼタンパク質が、分泌されたタンパク質として発現されるように、選択され得る。プロテアーゼドメインが、発現されるとき、核酸は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α－接合因子シグナル配列もしくはその部分、または天然シグナル配列のような、分泌シグナルをコードする核酸に結合される。
様々な宿主－ベクターシステムを使用して、タンパク質コード配列を発現することができる。これらとしては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス）を感染させた哺乳類細胞システム；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞システム；酵母ベクターを含有する酵母のような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの強さおよび特異性が変動する。使用される宿主－ベクターシステムに依存し、多数の適当な転写および翻訳エレメントのいずれか１つが使用され得る。
ＤＮＡ断片のベクターへの挿入のための、当業者に公知である任意の方法を使用して、適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）組換え（遺伝子組換え）を含み得る。タンパク質をコードする核酸配列、またはそのドメイン、誘導体、断片もしくは相同体の発現は、遺伝子またはその断片が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように、第２の核酸配列により調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当該技術分野において公知の任意のプロモーター／エンハンサーにより制御され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、所望のタンパク質についての遺伝子にとって天然のものではない。使用され得るプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター［Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)］、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含有されるプロモーター［Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)］、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター［Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)］、メタロチオネイン遺伝子の調節性配列［Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)］；β－ラクタマーゼプロモーターまたはｔａｃプロモーター［DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)もしくはScientific American 242:79-94 (1980)における「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」も参照のこと］のような原核生物発現ベクター［Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543］；ノパリンシンテターゼプロモーター［Herrara-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)］またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター［Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)］、および光合成酵素リブロースビスホスフェイトカルボキシラーゼのプロモーター［Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)］を含有する植物発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターのような酵母および他の真菌由来のプロモーターエレメント、ならびにおよび組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用される、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域［Swift et al., Cell 38:639-646 (1984);Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986);MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)］；膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域［Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)］、リンパ球系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域［Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984);Adams et al., Nature 318:533-538 (1985);Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)］、精巣、乳房、リンパ球系およびマスト細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域［Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)］、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域［Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)］、肝臓において活性であるアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域［Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985);Hammer et al., Science 235:53-58 (1987)］、肝臓において活性であるアルファ－１抗トリプシン遺伝子制御領域［Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)］、骨髄細胞において活性であるベータグロビン遺伝子制御領域［Magram et al., Nature 315:338-340 (1985);Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)］、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域［Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)］、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域［Shani, Nature 314:283-286 (1985)］、ならびに視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞において活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域［Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)］が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、所望のタンパク質、またはそのドメイン、断片、誘導体もしくは相同体をコードする核酸に作動可能に連結したプロモーター、１つまたは複数の複製起源、および必要に応じて、１つまたは複数の選択可能なマーカー（例えば、抗菌抵抗性遺伝子）を含有するベクターが使用される。発現システムに依存し、特異的な開始シグナルはまた、ｕ－ＰＡ配列の効率的な翻訳に要求される。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。開始コドンおよびｕ－ＰＡまたはその触媒活性断片の上流配列が、適当な発現ベクターに挿入される場合では、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。コード配列、またはその部分が、挿入される場合では、ＡＴＧ開始コドンを含む外来転写制御シグナルが、提供されなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の転写を確実にするために、正しい読み枠になければならない。外来転写エレメントおよび開始コドンは、様々な起源、天然および合成のものであり得る。発現の効率は、使用中の細胞システムに適当なエンハンサーの組み入れにより、増強され得る［Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62;Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol、153:516-544］。
大腸菌細胞の形質転換のための代表的なプラスミドベクターは、例えば、ｐＱＥ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能；システムを記載している、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）により公開された文献も参照のこと）を含む。ｐＱＥベクターは、ファージＴ５プロモーター（大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）および大腸菌における組換えタンパク質の厳密に調節される高いレベルの発現をもたらすための二重のｌａｃオペレーター抑制モジュール、効率的翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳ ＩＩ）、６×Ｈｉｓタグコード配列、ｔ０およびＴ１転写終結コドン、ＣｏｌＥ１複製起源、ならびにアンピシリン抵抗性を付与するためのベータ－ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ－またはＣ－末端のいずれかでの６×Ｈｉｓタグの置換を可能にする。このようなプラスミドは、全３つの読み枠のための複数のクローニング部位をもたらし、Ｎ－末端で６×Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質の発現をもたらす、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０、およびｐＱＥ３１を含む。大腸菌細胞の形質転換の他の代表的なプラスミドベクターは、例えば、ｐＥＴ発現ベクター（米国特許第４，９５２，４９６号を参照のこと；Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能；システムを記載する、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）により公開された文献も参照のこと）を含む。このようなプラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７転写終結コドン、誘導可能な大腸菌ｌａｃオペレーター、およびｌａｃ抑制遺伝子を含有する、ｐＥＴ １１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７転写終結コドン、および大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有する、ｐＥＴ １２ａ－ｃ；ならびにＨｉｓカラムでの精製において使用するためのＨｉｓ－タグ（商標）リーダー配列およびカラムでの精製後に切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７－ｌａｃプロモーター領域およびＴ７転写終結コドンを含有する、ｐＥＴ １５ｂならびにｐＥＴ１９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。
典型的には、ベクターは、インビボまたはインビトロでの改変ｕ－ＰＡポリペプチドの発現のため使用される、プラスミド、ウイルス、または当該技術分野において公知の他のものであり得る。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳類細胞において発現される。
アデノウイルス、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスベクターのような、ウイルスベクターが利用され得る。一部の例では、ベクターは、欠損もしくは弱毒レトロウイルスまたは他のウイルスベクターである（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る［Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)を参照のこと］。これらのレトロウイルスベクターを改変して、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必須ではないレトロウイルス配列が欠損されている。一部の例では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を有するウイルスは、それらの複製を促進し、標的組織内で広がることができる。ウイルスはまた、ウイルスが、組織特異的プロモーター下で選択的に複製する、溶解性ウイルスまたは非溶解性ウイルスであり得る。ウイルスが複製するので、ｕ－ＰＡポリペプチドのウイルス遺伝子との共発現は、インビボでのウイルスの拡大を促進する。
４．発現
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、インビボおよびインビトロの方法を含む当業者に公知の任意の方法により産生することができる。所望のタンパク質は、例えば、投与および処置に必要とされるような、要求される量および形態のタンパク質を産生するのに適当な任意の生物において発現され得る。発現宿主は、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む哺乳類細胞のような原核生物ならびに真核生物の生物を含む。発現宿主は、それらのタンパク質産生レベルならびに発現されたタンパク質に存在する翻訳後改変の種類が異なり得る。発現宿主の選択は、調節性および安全性の考慮、産生コストならびに要件ならびに精製方法のような、これらおよび他の要因に基づきなされ得る。
多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に公知であり、タンパク質の発現のため使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現システムの選択により影響される。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターならびに必要に応じて、エンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換のため使用される発現ベクターは、典型的には、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。一部の場合では、複製起源を使用して、ベクターのコピー数を増すことができる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、タンパク質融合物として利用されるか、または発現され得る。例えば、酵素融合物を生成して、酵素に追加の機能性を付加することができる。酵素融合タンパク質の例としては、シグナル配列、局在化のためのようなタグ、例えば、ｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグ、または精製のためのタグ、例えば、ＧＳＴ融合物、ならびにタンパク質分泌および／もしくは膜結合を指示するための配列の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号１～６、８～４４および５２～７５のいずれかに記載されるプロテアーゼドメインまたは配列番号１～６、８～４４および５２～７５のいずれかに記載される配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする核酸分子の発現により生成されるものである。
組換えタンパク質の長期間の高収率の産生のため、安定な発現が所望される。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを安定的に発現する細胞株は、ウイルス複製起源または内在性発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用し、形質転換され得る。ベクターの導入後、細胞は、濃縮された培地において１～２日間成長させ、その後、それは、選択培地に切り替えられ得る。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する抵抗性を付与し、その存在により、導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長および回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞である抵抗性の細胞は、細胞タイプに適当な組織培養技術を使用し、増殖され得る。
任意の数の選択システムを使用して、形質転換された細胞株を回収することができる。これらとしては、それぞれ、ＴＫ細胞またはＡＰＲＴ細胞において利用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ［Wigler et al., (1977) Cell 11:223-232］およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ［Lowy I et al. (1980) Cell、22:817-23］遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗薬、抗菌または除草剤抵抗性は、選択の基準として使用することができる。例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与する、ＤＨＦＲ［Wigler M et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci、77:3567-70］；アミノグリコシドネオマイシンおよびＧ－４１８に対する抵抗性を付与する、ｎｐｔ［Colbere-Garapin F et al. (1981) J. Mol. Biol.、150:1-14］；およびそれぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する抵抗性を付与する、ａｌｓまたはｐａｔを使用することができる。追加の選択可能な遺伝子、例えば、細胞が、トリプトファン（ｔｙｐｔｏｐｈａｎ）の代わりにインドールを利用することを可能にする、ｔｒｐＢ、または細胞が、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする、ｈｉｓＤ［Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci、85:8047-8051］が記載されている。非限定的に、アントシアニン、ベータグルクロニダーゼおよびその基質、ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのような、目に見えるマーカーをまた使用して、形質転換体を同定し、特定のベクターシステムに寄与したトランジェントまたは安定なタンパク質発現の量を定量することもできる［Rhodes CA et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131］。
ｕ－ＰＡポリペプチドの存在および発現は、モニターすることができる。例えば、機能的ポリペプチドの検出は、適当な条件下でのヒアルロニダーゼ酵素活性について条件培地を試験することにより、決定することができる。発現されたタンパク質の溶解性および活性を評価するための代表的なアッセイが、本明細書において提供される。
ａ．原核生物の細胞
原核生物、特に、大腸菌は、多量のタンパク質を生成するためのシステムを提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知である単純かつ迅速な技術である。大腸菌のための発現ベクターは、誘導可能なプロモーターを含有し得、このようなプロモーターは、高いレベルのタンパク質発現を誘導し、宿主細胞に対していくらかの毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用である。誘導可能なプロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターならびに温度調節されるλＰＬプロモーターが挙げられる。
本明細書において提供されるいずれかのような、タンパク質は、大腸菌の細胞質環境において発現することができる。細胞質は、還元性の状況であり、一部の分子にとって、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオスレオトールおよびβ－メルカプトエタノールのような還元剤ならびにグアニジン－ＨＣｌおよび尿素のような変性剤を使用して、タンパク質を再溶解することができる。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロニン様およびジスルフィド異性化酵素をもたらす細菌の細胞膜周辺腔におけるタンパク質の発現であり、可溶性タンパク質の産生を導き得る。典型的には、リーダー配列は、タンパク質を周辺質に指示する発現されるべきタンパク質に融合される。次に、リーダーは、周辺質内部のシグナルペプチダーゼにより除去される。周辺質標的化リーダー配列の例として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子からもたらされるリーダーが挙げられる。一部の場合では、周辺質発現により、発現されたタンパク質の培養培地への漏出が可能になる。タンパク質の分泌により、培養上清からの迅速かつ単純な精製が可能になる。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解により周辺質から得ることができる。細胞質発現と同様に、一部の場合では、タンパク質は、不溶性および変性剤になり得、還元剤を使用して、可溶化およびリフォールディングを促進することができる。導入および成長の温度はまた、発現レベルおよび溶解性に影響し得、典型的には、温度２５℃～３７℃が使用される。典型的には、細菌は、アグリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が、機能のため糖改変を要求するなら、糖改変は、宿主細胞からの精製後、インビトロで加えることができる。
ｂ．酵母細胞
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ、ロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の様な酵母が、タンパク質の産生のため使用され得る周知の酵母発現宿主であり、次の様な本明細書において記載されるいずれかである。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いて、または相同組換えによる安定な染色体組み込みにより、形質転換することができる。典型的には、誘導可能なプロモーターを使用して、遺伝子発現を調節する。このようなプロモーターの例としては、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５およびメタロチオネインプロモーター、例えば、ＣＵＰ１、ＡＯＸ１もしくは他のピキアまたは他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、大抵、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のためのＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３の様な選択可能なマーカーを含む。酵母において発現されるタンパク質は、大抵可溶性である。Ｂｉｐおよびタンパク質ジスルフィド異性化酵素のようなシャペロニンとの共発現は、発現レベルおよび溶解性を改善することができる。加えて、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエ由来の酵母接合型アルファ因子分泌シグナルのような分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼのような酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用し、分泌について指示され得る。Ｋｅｘ－２プロテアーゼ用のようなプロテアーゼ切断部位を操作して、発現されるポリペプチドから融合された配列を、それらが分泌経路を出るように、除去することができる。酵母はまた、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフにおいて糖改変する能力がある。
ｃ．昆虫および昆虫細胞
昆虫細胞、特に、バキュロウイルス発現を用いる昆虫細胞は、ｕ－ＰＡポリペプチドのようなポリペプチドの発現に有用である。昆虫細胞は、高いレベルのタンパク質を発現し、より高度な真核生物により使用される大部分の翻訳後改変をする能力がある。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核生物発現の調節性懸念を低減する限定的な宿主範囲を有する。典型的な発現ベクターは、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターのような高レベル発現のためのプロモーターを使用する。一般に使用されるバキュロウイルスシステムとしては、キンウワバ科核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のようなバキュロウイルス、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、プセウダレチア・ウニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびダナオス・プレキシプス（Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）からもたらされるＳｆ９のような昆虫細胞株が挙げられる。高いレベルの発現のため、発現されるべき分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流で融合される。哺乳類分泌シグナルは、昆虫細胞において正確に処理され、それを使用して、発現されたタンパク質を培養培地に分泌させることができる。細胞株プセウダレチア・ウニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびダナオス・プレキシプス（ＤｐＮ１）は、哺乳類細胞システムと類似した糖改変パターンを有するタンパク質を産生する。代表的な昆虫細胞は、「哺乳類化」バキュロウイルス発現ベクターを有するものおよび酵素ＦＴ３を欠くものを含む、免疫原性を低減するよう変更されたものである。
昆虫細胞における代替の発現システムは、安定的に形質転換された細胞の使用である。シュナイダー２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））のような細胞株が、発現のため使用することができる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターを使用して、カルシウムまたは銅での重金属導入の存在下で高レベルの発現を誘導することができる。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシンおよびハイグロマイシンのような選択可能なマーカーの使用により維持される。
ｄ．哺乳類発現
哺乳類発現システムを使用して、Ｕ－ＰＡポリペプチドを含むタンパク質を発現させることができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスのようなウイルス感染症により、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランのような直接的ＤＮＡ導入により、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような物理的手段により、哺乳類細胞に導入することができる。哺乳類細胞のための発現ベクターとして、典型的には、ｍＲＮＡ ｃａｐ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザック共通配列）およびポリアデニル化エレメントが挙げられる。ＩＲＥＳエレメントをまた付加して、選択可能なマーカーのような別の遺伝子とのバイシストロニック発現を許可することができる。このようなベクターとしては、大抵、高レベルの発現のための転写プロモーター－エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター－エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末端反復配列が挙げられる。これらのプロモーター－エンハンサーは、多くの細胞タイプにおいて活性である。組織および細胞タイププロモーターならびにエンハンサー領域はまた、発現のため使用することができる。代表的なプロモーター／エンハンサー領域としては、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、哺乳類乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御のような遺伝子由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。選択可能なマーカーを使用して、発現コンストラクトを有する細胞を選択し、維持することができる。選択可能なマーカー遺伝子の例としては、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、発現を、メトトレキサートの存在下で行い、ＤＨＦＲ遺伝子を発現するそれらの細胞のみを選択することができる。ＴＣＲ－ζおよびＦｃεＲＩ－γのような細胞表面シグナル伝達分子との融合は、細胞表面上での活性化状態のタンパク質発現を指示することができる。
多くの細胞株は、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む、哺乳類発現のため利用可能である。代表的な細胞株としては、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）ならびに他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８、およびＨＫＢ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養培地からの分泌されたタンパク質の精製を促進する、血清を含まない培地に合わせた、細胞株もまた入手可能である。例としては、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号１１６１９－０１２）および血清を含まないＥＢＮＡ－１細胞株［Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42］が挙げられる。最大の発現に最適化された特定の培地における成長に合わせた細胞株もまた、利用可能である。例えば、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞は、化学的に定義された動物産物を含まない培地中での懸濁培養における成長に合わせられる。
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞および植物を使用して、本明細書において記載されるいずれかのようなタンパク質を発現させることができる。発現コンストラクトは、典型的には、微粒子銃のような直接的ＤＮＡ導入およびプロトプラストへのＰＥＧにより仲介される導入を使用し、ならびにアグロバクテリウムにより仲介される形質転換で、植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントならびに翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、アラビドプシスおよびタバコのような双子葉宿主、ならびにとうもろこしおよび米のような、単子葉宿主間で通常分けられる。発現のため使用される植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼ（ｓｙｎｔａｓｅ）プロモーター、リボースビスホスフェイトカルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼのような選択可能なマーカーを大抵使用して、形質転換された細胞の選択および維持を促進する。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集物（カルス組織）として培養で維持されるか、または植物全体に再生され得る。トランスジェニック植物細胞はまた、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するよう操作された藻類を含むことができる。植物は、哺乳類細胞と異なる糖改変パターンを有するので、これは、これらの宿主において産生されるタンパク質の選択に影響し得る。
５．精製
改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からコードされるタンパク質の発現および回収に適当な条件下で培養することができる。組換え細胞により産生されるタンパク質は、一般的に分泌されるが、使用される配列および／またはベクターに依存して、細胞内に含有されてもよい。当業者に理解される通り、原核生物または真核生物の細胞膜を通じたｕ－ＰＡの直接分泌を促進するシグナル配列を有する、ｕ－ＰＡをコードする核酸を含有する発現ベクターを設計することができる。
したがって、宿主細胞からのポリペプチドの精製方法は、選択される宿主細胞および発現システムに依存する。分泌される分子のため、タンパク質は、一般に、細胞を除去した後、培養培地から精製される。細胞内発現のため、細胞は溶解され、タンパク質は、抽出物から精製され得る。トランスジェニック植物および動物のようなトランスジェニック生物が、発現のため使用されるとき、組織または器官を出発材料として使用して、溶解された細胞抽出物を作製することができる。加えて、トランスジェニック動物の産生は、回収することができる、牛乳または卵におけるポリペプチドの産生を含み得、必要に応じて、タンパク質は、抽出され、当該技術分野において標準的な方法を使用し、さらに精製され得る。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドのような、タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿ならびに陰イオン交換のようなイオン交換クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において公知の標準的タンパク質精製技術を使用し、精製することができる。親和性精製技術をまた利用して、調製の効率および純度を改善することができる。例えば、ｕ－ＰＡタンパク質に結合する抗体、受容体および他の分子は、親和性精製において使用することができる。
発現コンストラクトをまた操作して、低分子ユビキチン様改変因子（ＳＵＭＯ）タグ、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６のような親和性タグをタンパク質に付加し、それぞれ、ＳＵＭＯまたはｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂で親和性精製することができる。このようなタグは、可溶性タンパク質の精製を促進することができる、本明細書において他で記載される、ｕ－ＰＡをコードするヌクレオチド配列に結合することができる。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、タンパク質精製を促進するため加えられる１つまたは複数の追加のポリペプチドドメインを含む組換えタンパク質として発現され得る。このような精製を促進するドメインとしては、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン－トリプトファンモジュールのような金属をキレートするペプチド、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質ＡドメインおよびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システムにおいて利用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈ．）が挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインと発現されたｕ－ＰＡポリペプチドの間での第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のような切断可能なリンカー配列の包含は、精製を促進するのに有用である。１つのこのような発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位においてｕ－ＰＡポリペプチドを含有する融合タンパク質の発現をもたらす。低分子ユビキチン様改変因子（ＳＵＭＯ）タグは、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー）上での精製を促進し、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からポリペプチドを精製する手段をもたらす。
純度は、ゲル電気泳動、直交性ＨＰＬＣ方法、染色および分光光度技術を含む、当該技術分野において公知の任意の方法により評価することができる。発現され、精製されたタンパク質は、当業者に公知の任意のアッセイまたは方法、例えば、セクション３において記載されたものを使用し、解析することができる。これらは、ゲル電気泳動、イムノアッセイおよびｕ－ＰＡ活性のアッセイによる解析が挙げられるが、これらに限定されない、タンパク質の物理的および／または機能的特性に基づくアッセイを含む。
６．追加の改変
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを改変して、薬物動態および薬理学的特性を改善するか、または変更することができる。特に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを、ＰＥＧ部分またはデキストランまたはシアリル酸付加（ｓｉａｌｉａｔｉｏｎ）のようなポリマーにコンジュゲートさせて、免疫原性（ｉｍｍｕｎｇｅｎｉｃｉａｔｙ）を低減し、ならびに／または血清および硝子体液を含む他の体液における半減期を増大させることができる。
ａ．ＰＥＧ化
主に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、典型的には、非免疫原性である生物適合性、無毒性、水溶性ポリマーであるので、生体材料、バイオテクノロジーおよび薬において使用される（Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997）。薬物デリバリーの範囲において、ＰＥＧ誘導体を、タンパク質への共有結合（すなわち、「ＰＥＧ化」）において広く使用して、免疫原性、タンパク質分解および血清半減期を増大するための腎臓クリアランスを低減し、溶解性を増強している（Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995）。同様に、ＰＥＧを、低分子量の相対的疎水性薬物に結合させて、溶解性を増強し、毒性を低減し、生物分布を変更させている。典型的には、ＰＥＧ化された薬物は、溶液として注射される。
生分解性可溶性薬物担体の設計において使用される同じ化学の大部分はまた、生分解性ゲルの設計において使用され得るので、関連する適用は、薬物デリバリーにおける使用のための架橋結合した生分解性ＰＥＧネットワークまたは製剤の合成である（Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87、1993）。高分子間複合体は、２つの相補性ポリマーの溶液を混合することにより、形成することができることも知られている。このような複合体は、一般に、含まれるポリマー間の静電気的相互作用（ポリアニオン－ポリカチオン）および／もしくは水素結合（ポリ酸－ポリ塩基）により、ならびに／または周囲の水中のポリマー間での疎水性相互作用により、安定化される（Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790、1996）。例えば、正しい条件下でのポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）とポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の混合溶液は、主に水素結に基づき、複合体の形成をもたらす。生理的条件でのこれらの複合体の解離は、遊離薬物（すなわち、非ＰＥＧ化）のデリバリーのため使用されている。相補性ポリマーの複合体は、ホモポリマーおよびコポリマーから形成される。
ＰＥＧ化のための多数の試薬は、ＰＥＧ部分（ＰＥＧ化）治療タンパク質として、知られている。このような試薬として、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファ－メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３－ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二機能性ＰＥＧ－スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二機能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二機能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ－ニトロフェニル－カルボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ－ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド（ｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）、分岐ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリジオン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーレス」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルソピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルソピリジルジスルヒド、Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、Ｂｏｃ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ－ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ－ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ－ＮＨＳ、およびビオチンＰＥＧ－ＮＨＳとのポリペプチドの反応が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995;Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997；米国特許第５，６７２，６６２号；米国特許第５，９３２，４６２号；米国特許第６，４９５，６５９号；米国特許第６，７３７，５０５号；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第４，１７９，３３７号；米国特許第５，１２２，６１４号；米国特許第５，３２４，８４４号；米国特許第５，４４６，０９０号；米国特許第５，６１２，４６０号；米国特許第５，６４３，５７５号；米国特許第５，７６６，５８１号；米国特許第５，７９５，５６９号；米国特許第５，８０８，０９６号；米国特許第５，９００，４６１号；米国特許第５，９１９，４５５号；米国特許第５，９８５，２６３号；米国特許第５，９９０，２３７号；米国特許第６，１１３，９０６号；米国特許第６，２１４，９６６号；米国特許第６，２５８，３５１号；米国特許第６，３４０，７４２号；米国特許第６，４１３，５０７号；米国特許第６，４２０，３３９号；米国特許第６，４３７，０２５号；米国特許第６，４４８，３６９号；米国特許第６，４６１，８０２号；米国特許第６，８２８，４０１号；米国特許第６，８５８，７３６号；米国特許公開第２００１／００２１７６３号；米国特許公開第２００１／００４４５２６号；米国特許公開第２００１／００４６４８１号；米国特許公開第２００２／００５２４３０号；米国特許公開第２００２／００７２５７３号；米国特許公開第２００２／０１５６０４７号；米国特許公開第２００３／０１１４６４７号；米国特許公開第２００３／０１４３５９６号；米国特許公開第２００３／０１５８３３３号；米国特許公開第２００３／０２２０４４７号；米国特許公開第２００４／００１３６３７号；米国特許公開第２００４／０２３５７３４号；国際公開第０５００３６０号；米国特許公開第２００５／０１１４０３７号；米国特許公開第２００５／０１７１３２８号；米国特許公開第２００５／０２０９４１６号；欧州特許第０１０６４９５１号；欧州特許第０８２２１９９号；国際公開第００１７６６４０号；国際公開第０００２０１７号；国際公開第０２４９６７３号；国際公開第９４２８０２４号；および国際公開第０１８７９２５号を参照のこと）。
一例では、ポリエチレングリコールは、約３ｋＤ～約５０ｋＤ、典型的には、約５ｋＤ～約３０ｋＤの範囲にある分子量を有する。ＰＥＧの薬物への共有結合（「ＰＥＧ化」として知られる）は、公知の化学合成技術によりなされ得る。例えば、タンパク質のＰＥＧ化は、ＮＨＳ活性化ＰＥＧをタンパク質と適当な反応条件下で反応させることにより、なされ得る。
ＰＥＧ化についての多数の反応が、記載されている一方、最も一般的に適用可能である物が、方向性を付与し、マイルドな反応条件を使用し、毒性の触媒または副産物を除去するための広範な下流処理を必要としない。例えば、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、１つの反応性の末端ヒドロキシルのみを有し、したがって、その使用は、得られたＰＥＧ－タンパク質産物混合物の不均一性の一部を制限する。末端メトキシ基と反対のポリマーの端でのヒドロキシル基の活性化は、一般に、求核性攻撃をより受けやすい誘導体化ＰＥＧを作製することを目的に、効率的タンパク質ＰＥＧ化をなすのに必要である。攻撃求核試薬は、通常、リジル残基のイプシロン－アミノ基であるが、局所条件が好ましいなら、他のアミンも、反応することができる（例えば、Ｎ末端のアルファ－アミンまたはヒスチジンのアミン環）。さらなる指示された結合は、単一のリジンまたはシステインを含有するタンパク質において可能である。後者の残基は、チオ特異的改変のためＰＥＧ－マレイミドにより標的にされ得る。あるいは、ＰＥＧヒドラジドは、過ヨウ素酸酸化ヒアルロナン分解酵素と反応し、ＮａＣＮＢＨ３の存在下で低減され得る。より具体的には、ＰＥＧ化ＣＭＰ糖は、適当なグリコシル－トランスフェラーゼの存在下でヒアルロナン分解酵素と反応し得る。一技術は、多数のポリマー分子が問題のポリペプチドに結合する、「ＰＥＧ化」技術である。この技術を使用するとき、免疫系は、抗体の形成に関与するポリペプチドの表面上のエピトープの認識が困難であり、これにより、免疫応答が低減される。ヒトの身体に特定の生理的作用（すなわち、医薬品）を与えるための循環システムに直接導入されるポリペプチドについて、典型的な可能性のある免疫応答は、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ応答であり、一方、呼吸器系（すなわち、工業的ポリペプチド）を通じて吸入されるポリペプチドは、可能性として、ＩｇＥ応答（すなわち、アレルギー応答）を引き起こし得る。低減した免疫応答を説明している理論の１つは、ポリマー分子が、抗体形成を導く免疫応答に関与するポリペプチドの表面上でのエピトープを遮蔽するということである。別の理論または少なくとも部分的な要因は、コンジュゲートが重いほど、得られる免疫応答は低減するということである。
典型的には、本明細書において提供されるＰＥＧ化改変ｕ－ＰＡポリペプチドを作製するために、ＰＥＧ部分は、共有結合を介してポリペプチドにコンジュゲートされる。ＰＥＧ化のための改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ１２２Ｓ置換なしで調製することができ、代わりに、Ｃ１２２は、ＰＥＧ部分へのコンジュゲートのため、および／または二本鎖活性化形態もしくは二量体のため、所望のジスルフィド結合を形成するための部位として働くことができる。
ＰＥＧ化のための技術としては、特殊化リンカーおよび結合化学（例えば、Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002を参照のこと）、単一のコンジュゲーション部位への複数のＰＥＧ部分の結合（例えば、分岐ＰＥＧの使用を介した；例えば、Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002）、部位得的ＰＥＧ化および／またはモノ－ＰＥＧ化（例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999を参照のこと）、ならびに部位指定酵素ＰＥＧ化（例えば、Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504、2002を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において記載される方法および技術は、単一のタンパク質分子に結合した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１０より多いＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を産生することができる（例えば、米国特許公開第２００６／０１０４９６８号を参照のこと）。
ｂ．融合タンパク質および他のコンジュゲート
本明細書において提供されるｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡポリペプチドのコンジュゲートが、本明細書において提供される。代表的なこのようなコンジュゲートは、実施例１４～１６において例示される融合タンパク質である。本明細書において記載される通り、含まれる活性化ポリペプチドの切断により活性化されるとき、コンジュゲートの一部は、二本鎖活性化ｕ－ＰＡポリペプチドを形成し、Ｆｃドメインを含有するもののような他のものは、Ｆｃドメインの結合を介して二本鎖を形成することができる。他は、発現および単離／精製を促進するＳＵＭＯおよびＨＩＳ－ＳＵＭＯのような配列を含有する。実施例１４および１５、ならびに図１～４はまた、得られたコンジュゲートを記載し、描写する。医薬品としての使用のため、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、一般に、二本鎖活性化形態のような活性化形態で提供される。以下の考察は、シグナル配列を含み得る融合ポリペプチドおよび生成される産物で出現しない他の調節性配列を記載することは理解される。特に、融合ポリペプチドは、活性化配列を含むことができ、これにより、切断の際、得られたポリペプチドは、二本鎖活性化ポリペプチドである。これは、一般に、対象に投与される医薬製品である、ポリペプチドの活性化形態である。
ｉ．代表的な融合タンパク質および他のタンパク質コンジュゲート
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、他のポリペプチドおよびその部分に、ならびに増大した血清半減期、および／もしくは低減した免疫原性、ならびに／または他の特性のような、所望の特性を付与するための部分に融合することができる。これらは、例えば、アルブミンへの融合物、抗体およびその抗原結合断片のような、標的化部分への融合物、免疫グロブリンへの融合物、Ｆｃ融合物、糖改変パターン、ファルスニル化および他のこのような改変の改変を含む［治療タンパク質の薬物動態特性を改善するための様々な融合タンパク質の概説については、Strohl (2015) BioDrugs 29:215-239を参照のこと］。治療剤の薬理学的特性を変更するための任意のこのような様式は、本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドに適用することができる。一般に、改変が、ポリペプチドまたはその部分である場合、改変ｕ－ＰＡは、融合タンパク質として産生される。ペグ化のような非ポリペプチド改変のため、改変は、単離されたタンパク質に影響する。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、翻訳後（ｐｏｄｔ）または精製後改変のための部位をもたらすために、残基１２２（キモトリプシン番号による）においてＣｙｓを有するものを含む。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プロテアーゼドメイン、または成熟ポリペプチドもしくは活性化二本鎖ポリペプチドのような、全長およびその触媒活性部分であるものを含む。
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび１つまたは複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質もまた、提供される。適当な経路による投与のため製剤化されたこのような融合タンパク質を含有する医薬組成物が、提供される。融合タンパク質は、任意の順で、改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび抗体またはその断片のような別のポリペプチド、成長因子、受容体、リガンドおよびプロテアーゼの精製を促進する目的の他のこのような剤を結合させること、ｕ－ＰＡポリペプチドを標的化細胞または組織に指示することにより改変ｕ－ＰＡポリペプチドの薬力学的特性を変更すること、ならびに／またはｕ－ＰＡポリペプチドの発現もしくは分泌を増大させることにより、形成される。ｕ－ＰＡポリペプチド融合タンパク質内で、ｕ－ＰＡポリペプチドは、ｕ－ＰＡポリペプチドの全てもしくはその触媒活性部分、またはｕ－ＰＡポリペプチドの触媒活性部分および全長ｕ－ＰＡでないｕ－ＰＡのさらなる部分であり得る。本明細書において提供される融合タンパク質は、補体タンパク質Ｃ３の特異性および／または選択性の実質的に全てを保持する。一般に、ｕ－ＰＡ融合ポリペプチドは、非融合ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の基質特異性を含む、非融合ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の基質特異性および／または選択性を保持する。
ｉｉ．コンストラクト生成
ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、標準的組換え技術により産生することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、例えば、ライゲーションのための平滑末端またはねじれ末端、適当な末端をもたらすための制限酵素設計、非所望な結合を回避するための適当なアルカリホスファターゼ処理としての付着末端の充填、および酵素ライゲーションを利用することにより、従来の技術に従い枠内で一緒にライゲーションすることができる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、続いて、アニーリングし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る２つの連続する遺伝子断片間で相補性オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して行うことができる［例えば、Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照のこと］。融合部分（例えば、ｈｉｓタグ、ＳＵＭＯポリペプチド、またはＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。ｕ－ＰＡコード核酸は、融合部分が、ｕ－ＰＡポリペプチドに枠内で結合するように、このような発現ベクターにクローニングされ得る。
代表的な発現ベクターは、例えば、ｐＣＭＶのような任意の哺乳類発現ベクターを含む。細菌発現のため、このようなベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびにＭＢＰ、ＧＳＴおよびＬａｃＺのような融合ベクターを含む。他の真核生物ベクター、例えば、真核生物ウイルス由来の調節性エレメントを含有するいずれかは、真核生物発現ベクターとして使用することができる。これらは、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルスからもたらされたベクターを含む。代表的な真核生物ベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴ０１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＣＥ、およびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、多面体プロモーター、または真核生物における発現に有効性を示された他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする他のベクターを含む。
ｉｉｉ．シグナル配列
ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、プロテアーゼの輸送を指示するためのシグナルペプチド（ＳＰまたはシグナル配列または局在化シグナルまたはリーダーペプチド）を含有することができる。シグナルペプチドは、細胞内、またはタンパク質が分泌されるべきであるなら、細胞外のそれらの特定の目的地に小胞体膜を超えた転位置のためタンパク質を標的にする新生タンパク質のＮ－末端で見られる配列モチーフである。したがって、ＳＰ選択およびＳＰの改変は、タンパク質標的化に影響する［Zhang et al. (2005) J Gene Med 7:354-365］。最適化ＳＰは、より効率的活性のため開発された。ＳＰ有効性を推定し、ＳＰ共通配列を定義するための計算的モデルおよびアルゴリズムが、開発されている［Burdukiewicz et al. (2018) Int J Mol Sci 19(12): 3709;Peason et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448］。
様々なタンパク質は、受容体（核、４回膜貫通、Ｇタンパク質共役およびチロシンキナーゼ）、サイトカイン（ケモカイン）、ホルモン（成長因子および分化因子）、ニューロペプチドおよび血管調節因子、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヌクレオチドシクラーゼ、マトリックス分子（接着、カドヘリン、細胞外マトリックス分子、インテグリン、およびセレクチン）、Ｇタンパク質、イオンチャネル（カルシウム、クロリド、カリウム、およびナトリウム）、プロテアーゼ、輸送体／ポンプ（アミノ酸、タンパク質、糖、金属およびビタミン；カルシウム、ホスフェート、カリウム、およびナトリウム）ならびに調節性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない、ＳＰを有することが知られている。一部の例では、オリジナルのシグナルペプチドは、産生のため選択される所望の宿主細胞におけるタンパク質の分泌のため最適化される。本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのような、ｕ－ＰＡポリペプチドは、ｕ－ＰＡ標的化のため非ｕＰＡシグナルペプチドに直接または間接的に融合することができる。
シグナルペプチドは、抗体の重鎖および抗体の軽鎖のシグナルペプチドのような抗体のシグナルペプチドであってもよい。抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含み得るが、これらに限定されない。したがって、重鎖は、ガンマ、ミュー、デルタ、アルファおよびイプシロン重鎖を含んでもよく、軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖を含んでもよい。本明細書において記載されるｕ－ＰＡ融合タンパク質は、配列番号９９９に記載されるシグナル配列のような、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列のような抗体シグナルペプチドを用いて、調製することができる。
他の代表的なシグナルペプチドは、研究およびタンパク質産生のため広範に使用される、ヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）からもたらされたものである［Bamford et al. (1998) J Immunol 160:4418;Komada et al. (1999) Biol Pharm Bull 22:846］。融合したタンパク質の分泌を最大３．５倍増大させる、増大した塩基性および疎水性を有する改変ＩＬ－２ ＳＰが開発されている［Zhang et al. (2005) J. Gene Med. 7:354］。本明細書におけるｕ－ＰＡ融合タンパク質は、例えば、配列番号１０００に記載されるシグナル配列のような、ヒトＩＬ２シグナルペプチド（ｈＩＬ２ＳＰ）のような、例えば、ＩＬ－２シグナルペプチドを用いて、調製することができる。
本明細書において記載される代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、プロテアーゼの輸送を指示するためのシグナルペプチドを含有することができる。例えば、配列番号１００４、１００５、１０１０、１０１１、１０１４～１０１８、１０３６および１０４０として記載されるｕ－ＰＡ融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）を含有する。別の例では、配列番号１００６～１００９、１０１２、１０１３、１０３４および１０３５として記載されるｕ－ＰＡ融合ポリペプチドは、ヒトＩＬ２シグナルペプチド（ｈＩＬ２ＳＰ）配列（配列番号１０００）を含有する。
ｉｉｉ．代表的な融合タンパク質およびペプチドリンカー
改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび別のポリペプチドの結合は、直接、またはリンカーを介して間接的に影響され得る。一例では、結合は、例えば、ヘテロ二機能性剤またはチオール剤もしくはチオール結合剤あるいは他のこのような結合を介した化学結合によるものであり得る。ｕ－ＰＡポリペプチドの別のポリペプチドへの融合は、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのような、改変ｕ－ＰＡポリペプチドのＮ－またはＣ－末端へのものであり得る。本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチドを有する融合タンパク質において使用され得るポリペプチドの非限定的な例としては、例えば、免疫グロブリンＧ由来のＦｃドメイン、血清アルブミン（すなわち、ヒト血清アルブミン））、コラーゲンＩＩｍに結合するｓｃＦｖ（Ｃ２ｓｃＦｖ）、ヒアルロン酸結合ドメイン（ＨＡＢＤ）、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）ポリペプチド、ｈｉｓタグ（すなわち、ＨＨＨＨＨＨ）、低分子ユビキチン様改変因子（ＳＵＭＯ）タグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５、ならびに／または異種シグナル配列（例えば、トロンビンもしくはマウスＩｇカッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域（ＩｇＧκ）もしくはヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ２）由来）が挙げられる。融合タンパク質は、細胞によるタンパク質の取り込みを目的とする大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のような、追加の成分を含有することができる（国際ＰＣＴ特許出願公開第０１／３２７１１号を参照のこと）。
ペプチドリンカーは、ｕ－ＰＡ融合タンパク質において含まれ得る。一例では、ペプチドリンカーは、第１のポリペプチドのＣ末端および第２のポリペプチドのＮ末端に融合することができる。少なくとも１つ、必要に応じて、２、３、４つまたはそれ以上のポリペプチドが、それらのそれぞれの末端においてペプチドリンカーを介して互いに結合されるように、この構造は、複数回繰り返すことができる。例えば、融合タンパク質は、配列Ｘ－Ｙ－Ｚ（式中、Ｘは、野生型または改変ｕ－ＰＡ触媒ドメインであり、Ｙは、ペプチドリンカーであり、Ｚは、融合パートナー（例えば、ＨＳＡ、Ｆｃ、ＨＡＢＤ、もしくはＣ２ ｓｃＦｖ）の全てまたは部分である）を含むことができる。場合によっては、Ｘは、ｕ－ＰＡのＮ－末端、およびｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインを含む改変ｕ－ＰＡの全てである。他の場合では、Ｘは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのすぐ上流の１２個のアミノ酸、およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含む改変ｕ－ＰＡの部分である。別の例では、ポリペプチドは、得られたポリペプチドの発現および／または単離を促進する、ＳＵＭＯまたはＨＩＳ－ＳＵＭＯのような、ポリペプチドのような、配列Ａ－Ｘ－Ｙ－Ｚ（式中、「Ａ」は、別の融合パートナーである）を含むことができる。
ペプチドリンカーは、一般に、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびその組合せ、またはＡｌａおよびプロリンを含む。リンカーは、一般に、２～最大２０または２５個の残基を含有する。ペプチドリンカーの例としては、__Gly-Gly__、GSG、AGS（配列番号１００３）、GGGGS（配列番号１００１）、GGSSGG（配列番号１００２）、SSSSG（配列番号１０２４）、GKSSGSGSESKS（配列番号１０２５）、GGSTSGSGKSSEGKG（配列番号１０２６）、GSTSGSGKSSSEGSGSTKG（配列番号１０２７）、GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号１０２８）、EGKSSGSGSESKEF（配列番号１０２９）、またはAlaAlaProAlaまたは（AlaAlaProAla）n（配列番号１０３０）、（式中、ｎは、１、２、３、４、５または６のような、１～６である）が挙げられるが、これらに限定されない。
結合部分は、例えば、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883、Whitlow et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995、およびNewton et al., (1996) Biochemistry 35:545-553において記載される。他の適当なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号または第４，９３５，２３３号に記載されるもののいずれかを含む。所望のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、任意の適当な従来技術を使用し、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含むｕ－ＰＡの全てまたは部分をコードするポリヌクレオチドと同じ読み枠間および内に挿入され得る。一例では、融合タンパク質は、ｕ－ＰＡポリペプチド、例えば、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン、およびペプチドリンカーにより分けられる、ＨＳＡ、Ｆｃ、ＨＡＢＤ、またはＣ２ ｓｃＦｖのような、融合パートナーを含有する。
代表的なｕ－ＰＡ融合ポリペプチドは、ＨＳＡまたはＦｃのような、Ｃ末端の融合パートナーにｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを結合するｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＣ－末端においてリンカーを含む。ｕ－ＰＡ－リンカー－Ｆｃおよびｕ－ＰＡ－リンカー－ＨＳＡ分子は、必要に応じて、エピトープタグならびに／または発現および分泌のためのシグナルを含有することができる。代表的なｕ－ＰＡ－リンカー－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０１８に記載され、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ＨＩＳ－ＳＵＭＯ（配列番号９９０）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、リンカー（配列番号１００２）、およびヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃ断片（配列番号９９２）を含有する。
他の例では、代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、配列番号１０１５～１０１７として記載される融合タンパク質のような、ｕ－ＰＡ－リンカー－ＨＳＡ融合ポリペプチドである。例えば、配列番号１０１５に記載される融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ｕ－ＰＡのＮ末端ドメイン（配列番号１０４２）、野生型ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）、リンカー（配列番号１００２）、およびＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。別の例では、配列番号１０１６に記載される融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ｕ－ＰＡ活性化配列におけるフューリン活性化部位（配列番号９９６）、ｕ－ＰＡプロテアーゼ ドメイン（配列番号２１）、リンカー（配列番号１００２）、およびＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。別の例では、配列番号１０１７に記載される融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ＨＩＳ－ＳＵＭＯ（配列番号９９０）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、リンカー（配列番号１００２）、およびＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。
他の例では、リンカーは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＮ－末端にあり、Ｎ末端の融合パートナーにプロテアーゼドメインを結合させる。例えば、融合タンパク質は、ｕ－ＰＡに結合したＮ末端のＦｃを含有してもよい。代表的なＦＣ－リンカー－ｕ－ＰＡ融合ポリペプチドは、配列番号１００４に記載され、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃ断片（配列番号９９２）、リンカー（配列番号１００３）、野生型ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７）、およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）を含有する。
ｉｖ．融合パートナー
Ｆｃへの融合物、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への融合物、コラーゲンＩＩに結合するｓｃＦｖ（Ｃ２ｓｃＦｖ）のような、１本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体への融合物、ＨＡＢＤへの融合物、および他のポリペプチドへの融合物を含有する融合タンパク質のような、融合タンパク質は、ペプチドまたは生物学的薬物の薬理動態を改善するための公知の改変である。また、このうち、直鎖または分岐鎖モノメトキシポリ－エチレングリコール（ＰＥＧ）のいずれかへのコンジュゲーションであり、これらは、分子量および流体力学半径の増大、ならびに腎臓による糸球体濾過率の減少をもたらす。薬物動態パラメータを改善するための別のアプローチは、低減したクリアランスおよび半減期の延長をもたらす、糖改変パターンの改変を含む。
代表的なｕ－ＰＡ融合ポリペプチドは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインへのＮ末端の、またはｕ－ＰＡプロテアーゼドメインへのＣ末端の融合パートナー（すなわち、ＨＳＡ、ＨＡＢＤ、Ｃ２ ｓｃＦｖもしくはＦｃ）への置換を含む。融合パートナーが、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＮ末端である、代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、配列番号１００４に記載される。融合パートナーが、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＣ末端である代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、配列番号１００６～１０１８に記載される。
（ａ）Ｆｃドメイン
ｕ－ＰＡ融合タンパク質のいくつかの例としては、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖、最も一般的には、重鎖の定常ドメインを含む。ヒトＩｇＧサブタイプについての重鎖定常領域の代表的な配列は、配列番号４５（ＩｇＧ１）、配列番号１０２０（ＩｇＧ２）、配列番号１０２１（ＩｇＧ３）、および配列番号１０２２（ＩｇＧ４）に記載される。例えば、配列番号４５に記載される代表的な重鎖定常領域について、ＣＨ１ドメインは、アミノ酸１～９８に対応し、ヒンジ領域は、アミノ酸９９～１１０に対応し、ＣＨ２ドメインは、アミノ酸１１１～２２３に対応し、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２２４～３３０に対応する。
一例では、ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンのような、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含むことができる。典型的には、このような融合物は、少なくとも機能的に活性なヒンジ、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。例えば、ＩｇＧ１の全長Ｆｃ配列は、配列番号４５に記載される配列のアミノ酸１０５～３３０を含む。ｈＩｇＧ１についての代表的なＦｃ配列は、配列番号９９２および１０２３に記載され、配列番号４５のアミノ酸１００～１１０に対応するヒンジ配列のほぼ全て、および配列番号４５に記載されるＣＨ２およびＣＨ３ドメインについての完全な配列を含有する。別の代表的なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願公開第９３／１０１５１号に記載され、Ｎ末端のヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体（配列番号５０）のＦｃ領域の天然のＣ－末端まで伸長する１本鎖ポリペプチドである。結合がなされる正確な部位は、重要ではなく、特定の部位が周知であり、ｕ－ＰＡポリペプチドの生物学的活性、または安定性を最適化するために選択することができる。例えば、他の代表的なＦｃポリペプチド配列は、配列番号４５に記載される配列のアミノ酸Ｃ１０９またはＰ１１３にて始まる（例えば、米国特許公開第２００６／００２４２９８号を参照のこと）。
ｈＩｇＧ１ Ｆｃに加えて、他のＦｃ領域はまた、本明細書において提供されるｕ－ＰＡ融合タンパク質において含まれ得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用により仲介されるエフェクタ機能が最小にされるべきである場合、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃのような、補体またはエフェクタ細胞を不十分に動員するＩｇＧアイソタイプとの融合物が、企図される。加えて、Ｆｃ融合物は、抗体のＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ならびにＩｇＭクラスが挙げられるが、これらに限定されない、抗体クラスのいずれかに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる免疫グロブリン配列を含有することができる。さらに、リンカーを使用して、別のポリペプチドにＦｃを共有結合させて、Ｆｃキメラを生成することができる。
改変Ｆｃドメインもまた、ｕ－ＰＡ融合ポリペプチドとのキメラにおける使用のため、本明細書において企図される。一部の例では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲへの変更された結合を示し、ゆえに、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクタ機能より変更した（すなわち、より高いまたは低い）エフェクタ機能をもたらさなければならないように、それは、改変される。したがって、改変Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対して増大した、または低い親和性または親和性を有さないものが挙げられるが、これらに限定されない、変更された親和性を有し得る。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的には、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４より、受容体に実質的に良好に結合する。異なるＦｃγＲは、異なるエフェクタ機能を仲介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することにより特徴付けられる、免疫複合体により引き金を引かれる活性化の正の調節因子である。しかしながら、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、それゆえ、阻害性である。場合によっては、本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチドＦｃ融合タンパク質を改変して、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を増強させることができる。さらに、Ｆｃを改変して、ＦｃＲｎへのその結合を変更することができ、これにより、ｕ－ＰＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドの薬理動態を改善することができる。したがって、受容体に対するＦｃ領域の親和性を変更することは、Ｆｃドメインが関連する、エフェクタ機能および／または薬物動態特性をモジュレートすることができる。改変Ｆｃドメインは、当業者に公知であり、文献において記載され、例えば、代表的な改変について、米国特許第５，４５７，０３５号；米国特許公開第２００６／００２４２９８号；および国際特許出願公開第２００５／０６３８１６号を参照のこと。
一部の例では、ｕ－ＰＡポリペプチド多量体が形成される。典型的には、ポリペプチド多量体は、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのような、同じまたは異なるｕ－ＰＡポリペプチドの２つを、Ｆｃポリペプチドに直接または間接的に結合させることにより生成される、２つのキメラタンパク質の二量体である。一部の例では、ｕ－ＰＡ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合物が、適当な発現ベクターに挿入される。得られたｕ－ＰＡ－Ｆｃ融合タンパク質は、組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞において発現され、非常に抗体分子様に構築されることを可能にし、ここで、鎖間ジスルフィド結合が、Ｆｃ部分の間で形成して、二価のｕ－ＰＡポリペプチドを生じる。
Ｆｃ領域を含有するｕ－ＰＡ融合ポリペプチドをまた操作して、金属キレート剤または他のエピトープを有するタグを含むことができる。タグされたドメインは、金属キレートクロマトグラフィーによる、および／またはウエスタンブロット、免疫沈殿、もしくはバイオアッセイにおける活性枯渇／遮断の検出を可能にするための抗体による迅速な精製のため使用することができる。
代表的なｕ－ＰＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインとＦｃの融合物を含む。代表的なｕ－ＰＡ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１００４、１００６、１０１０、１０１１、１０１２および１０１８に記載される。ｕ－ＰＡ－Ｆｃ分子は、必要に応じて、エピトープタグまたは発現および分泌のためのシグナルを含有することができる。例えば、配列番号１００４、１０１０、および１０１１として記載される代表的なｕ－ＰＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＦｃのＮ末端（配列番号１００４）またはＣ末端（配列番号１０１０および１０１１）のいずれかに、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃ断片（配列番号９９２）およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１または９８７）を含有する。別の例では、配列番号１００６および１０１２として記載される代表的なｕ－ＰＡ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＮ末端に、ヒトＩＬ２シグナルペプチド（ｈＩＬ２ＳＰ）配列（配列番号１０００）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号５または２１）、およびヒトＩｇＧ１重鎖（配列番号９９２）のＦｃ断片を含有する。
（ｂ）血清アルブミン
ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、半減期、安定性、生物学的利用率、分布を増大させるために、および／またはｕ－ＰＡの薬理動態を改善するために、融合パートナーとしてアルブミンを用いて生成することができる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合した多数の製品が、がん治療としておよび２型糖尿病の処置のための使用を含む、治療としての使用が承認されている［AlQahtani et al. (2019) Biomed and Pharmacotherapy 113:108750;Roscoe et al., (2018) Mol. Pharmaceutics 151:15046-5047;Strohl、W.R. (2015) BioDrugs 4:215-239］。一部の例では、シグナル配列および活性化配列を欠く、成熟ＨＳＡタンパク質は、目的のタンパク質に融合される。ｕ－ＰＡ融合タンパク質の一部の例では、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミンは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのようなｕ－ＰＡにコンジュゲートされる。代表的なＨＳＡは、配列番号９９１に記載される。
ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインおよびＨＡＳの融合物を含む。代表的なｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質は、配列番号１００７および１０１３～１０１７に記載される。ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ分子は、必要に応じて、エピトープタグならびに／または発現および分泌のためのシグナルを含有することができる。例えば、配列番号１０１４～１０１７として記載される代表的なｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７または２１）、およびＣ末端のＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。別の例では、配列番号１０１３として記載される代表的なｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドは、ヒトＩＬ２シグナルペプチド（ｈＩＬ２ＳＰ）配列（配列番号１０００）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号５）、およびＣ末端のＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。
（ｃ）コラーゲンＩＩに結合するｃＦｖ（Ｃ２ｓｃＦｖ）
コラーゲンＩＩに結合するｓｃＦｖ（Ｃ２ｓｃＦｖ）のような、１本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体の形態の組換え抗体断片は、ｕ－ＰＡとの融合パートナーとして使用することができる。ファージディスプレイから産生されるｓｃＦｖ抗体は、マーカー、または活性もしくは治療タンパク質に融合することができる［Ahmad et al. (2012) Clin Dev Immunol 2012:980250］。ｓｃＦｖｓの融合物を使用して、コンジュゲートしたタンパク質の収量および活性を増大させることができる［Martin et al., (2006) BMC Biotech 6:46］。
１本鎖断片可変抗体は、ペプチドリンカーまたはジスルフィド結合により結合される重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖可変領域を含む［Glockshuber et al. (1990) Biochemistry 29(6):1362-1367］。ペプチドリンカーは、ポリペプチド鎖のフォールディングにおいて重要な役割を果たす。一般的に利用されるリンカーは、可動性のためのＧｌｙおよびＳｅｒ残基または溶解性を増強するためのＧｌｕおよびＬｙｓを含む［Whitlow et al. (1993) Protein Engineering 6(8):989-995］。
ｓｃＦｖｓは、抗原提示細胞への特異的なデリバリーのため、タンパク質に融合することができる［Ahmad et al. (2012) Clin Dev Immunol 2012:980250］。例えば、研究試薬として、およびヒトコラーゲンＩＩを発現する部位への治療分子のデリバリー剤として使用するためのような、コラーゲンＩＩを標的化するためのｓｃＦｖを生成することができる。例えば、ｓｃＦｖは、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む、ヒトコラーゲンＩＩに結合する単離されたモノクローナル抗体またはその断片であり、Ｃ２ｓｃＦｖは、配列番号９９３に示される配列を有するアミノ酸配列を含む。
代表的なｕ－ＰＡ－Ｃ２ｓｃＦｖ融合ポリペプチドは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインおよびＣ２ｓｃＦｖの融合物を含む。代表的なｕ－ＰＡ－Ｃ２ｓｃＦｖ融合タンパク質は、配列番号１００８に記載される。ｕ－ＰＡ－Ｃ２ｓｃＦｖ分子は、必要に応じて、エピトープタグまたは発現および分泌のためのシグナルを含有することができる。例えば、配列番号１００８として記載される代表的なｕ－ＰＡ－Ｃ２ｓｃＦｖ融合ポリペプチドは、ヒトＩＬ２シグナルペプチド（ｈＩＬ２ＳＰ）配列（配列番号１０００）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、およびＣ末端のＣ２ｓｃＦｖ（配列番号９９３）を含有する。
（ｄ）ヒアルロン酸結合ドメイン（ＨＡＢＤ）
一部の例では、ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、配列番号９９４（ヒトＴＳＧ－６のアミノ酸３２～１３４に対応する；ＮＣＢＩ番号ＮＰ＿００９０４６．２）として記載されるＴＳＧ－６のような、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６）のような、ＨＡＢＤ融合パートナーを含有する。ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ｕ－ＰＡの半減期、安定性、生物学的利用率、分布を増大させる、および／またはｕ－ＰＡの薬理動態を改善するために、融合パートナーとして、ＴＳＧ－６のようなＨＡＢＤを用いて生成することができる。
腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６、腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質６、ＴＮＦＡＩＰ６；ＮＣＢＩ番号ＮＰ＿００９０４６．２）は、単一のＮ末端の結合モジュールおよびＣ末端のＣＵＢドメインを含む、約３５ｋＤａの分泌された糖タンパク質である。ＴＳＧ－６の発現は、サイトカインおよび成長因子を含む炎症性メディエータにより、多くの細胞タイプにおいて誘導される。およそアミノ酸３５～１３２を含有することが報告されている、その結合分子を介して、ＴＳＧ－６は、多形核白血球遊走の可能性のある阻害剤である。ＴＳＧ－６は、セリンプロテアーゼ阻害剤インター－アルファ－阻害剤（ＩαＩ）と安定な複合体を形成し、ＩαＩの抗プラスミン活性を増強する。ＴＳＧ－６はまた、ＨＡ－リッチな細胞周囲のコートおよび細胞外マトリックスの形成およびリモデリングに重要である。
代表的なｕ－ＰＡ－ＨＡＢＤ融合ポリペプチドは、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインおよびＨＡＢＤの融合物を含む。代表的なｕ－ＰＡ－ＨＡＢＤ融合タンパク質は、配列番号１００９に記載される。ｕ－ＰＡ－ＨＡＢＤ分子は、必要に応じて、エピトープタグまたは発現および分泌のためのシグナルを含有する。例えば、配列番号１００９として記載される代表的なｕ－ＰＡ－ＨＡＢＤ融合ポリペプチドは、ヒトＩＬ２シグナルペプチド（ｈＩＬ２ＳＰ）配列（配列番号１０００）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、およびＣ末端のＨＡＢＤ（配列番号９９４）を含有する。
ｖ．活性化部位
代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ｕ－ＰＡ活性化のための部位を含有する。例えば、ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、自己活性化のための野生型ｕ－ＰＡ配列を含み、タンパク質発現中の活性化のためのフューリン配列を含有するか、または分泌シグナル切断後、活性化され、全ての、活性化ｕ－ＰＡプロテアーゼを生成する。
（ａ）フューリン
フューリンタンパク質は、分泌経路内での単一、対形成した、または複数の基本的な共通部位において不活性な前駆タンパク質のタンパク質内分解性成熟処理に関係づけられている［Nakayama(1997) Biochem.J. 327:625-635;Seidah and Chretien, Current Opinions in Biotechnology (1997) 8:602-607］。新たに合成された前駆タンパク質の小胞体からゴルジ体領域への移行の際、プロペプチドは、フューリン切断モチーフにおける２つの工程の処理現象において自動触媒的に除去される［Leduc et al. (1992) J.Biol.Chem 267:14304-14308;Anderson et al. (1997) EMBO 1508-1518］。フューリンは、切断のためＲ－Ｘ－Ｘ－Ｒ部位を要求し、最適な処理は、Ｒ－Ｘ－Ｋ／Ｒ－Ｒモチーフにおいて生じる［Molloy et al. (1992) J. Biol Chem 267:16396-16402］。フューリンＲＲＫＲ切断部位を含有する代表的なｕ－ＰＡ活性化配列は、配列番号９９５および９９６に記載される。
ｕ－ＰＡタンパク質が、発現中に活性化されるように、ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＮ末端にフューリン活性化部位を含んでもよい。ｕ－ＰＡ活性化配列におけるフューリン活性化部位の包含によるような、発現中のｕ－ＰＡ活性化は、下流の処理中に活性化工程の用件を取り除くことを意図する。
フューリン活性化部位およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含むｕ－ＰＡ融合ポリペプチドが、生成された。代表的なフューリン－ｕ－ＰＡタンパク質は、配列番号１０１０、１０１４および１０１６に記載される。フューリン活性化ｕ－ＰＡ分子は、必要に応じて、融合パートナー、ならびに／または発現および分泌のためのシグナルを含有する。例えば、配列番号１０１４および１０１６として記載される代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ｕ－ＰＡ活性化配列におけるフューリン活性化部位（配列番号９９５または９９６）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１または９８７）、およびＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。配列番号１０１４として記載されるｕ－ＰＡ融合タンパク質は、配列番号９８７に記載されるｕ－ＰＡプロテアーゼドメインと共に、フューリン－ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＮ末端にｕ－ＰＡのＮ－末端（配列番号１または配列番号１０４２のアミノ酸２１～１７８として記載される）をさらに含有する。別の例では、配列番号１０１０として記載されるｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ｕ－ＰＡ活性化配列におけるフューリン活性化部位（配列番号９９５）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、およびＦｃ（配列番号９９２）を含有する。
（ｂ）ｕ－Ｐａ
ｕ－ＰＡ酵素前駆体活性化は、ｕ－ＰＡ触媒ドメインのＮ末端の単一のペプチド結合の切断により生じ、これが、タンパク質における立体構造変化を開始する。本明細書において生成されるｕ－ＰＡコンストラクトは、１２個のアミノ酸ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７）またはその改変形態（配列番号９９８）を含有することができるか、またはｕ－ＰＡが、配列番号３に記載されるポリペプチドのような全長成熟ポリペプチドを含むように、活性化配列を含むｕ－ＰＡ Ｎ－末端の伸長した部分を含有することができる。他の場合では、ｕ－ＰＡは、配列番号１または配列番号１０４２のアミノ酸２１～１７８として記載されるｕ－ＰＡのＮ末端の領域のようなＮ－末端、および１２個のアミノ酸ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７）または改変形態のｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９８）を含む。
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する融合タンパク質が、調製されている。野生型または改変ｕ－ＰＡ活性化部位およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含むｕ－ＰＡ融合ポリペプチドが、生成される。活性化のための野生型ｕ－ＰＡ活性化配列を含有する代表的なｕ－ＰＡタンパク質は、配列番号１００４、１００５、１０１１、および１０１５に記載される。融合ペプチドは、必要に応じて、融合パートナー、ならびに／または発現および／もしくは分泌のためのシグナルを含有することができる。例えば、配列番号１００４として記載される代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、Ｆｃ（配列番号９９２）、ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９５）、およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）を含有する。さらなる例では、配列番号１００５として記載されるｕ－ＰＡ融合タンパク質は、全長成熟ｕ－ＰＡ配列（配列番号９８７に記載される改変プロテアーゼドメインを有する配列番号３）およびＮ末端のヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）を含有する。さらなる例では、配列番号１０１１として記載されるｕ－ＰＡ融合タンパク質は、Ｎ末端のヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、全長成熟ｕ－ＰＡ配列（配列番号９８７に記載される改変プロテアーゼドメインを有する配列番号３）、およびＦｃ（配列番号９９２）を含有する。別の例では、配列番号１０１５として記載されるｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、ｕ－ＰＡ活性化配列を含むｕ－ＰＡのＮ－末端（配列番号１のアミノ酸２１～１７８として記載される）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）、およびＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。配列番号１００６、１００７、１００９および１０１０のもののような、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、発現の際、ｕ－ＰＡプロテアーゼ活性を示した。Ｃ－末端（例えば、配列番号１０１０に記載される）においてＩｇ ＦＣ融合とｕ－ＰＡのＮ末端にフューリン活性化配列を有する改変ｕ－ＰＡが、最大の活性を示した。
ｖｉ．精製タグ
代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ｕ－ＰＡまたはｕ－ＰＡ融合タンパク質の精製のためのタグを含有する。ｕ－ＰＡ融合タンパク質の精製のための代表的なタグは、上の、セクションＦに記載される。代表的なｕ－ＰＡ融合タンパク質は、精製のためのＳＵＭＯまたはＨｉｓ配列を含むことができる。
（ａ）Ｈｉｓタグ
ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、配列番号９８９に記載される６×ＨｉｓのようなＨｉｓタグ、およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含んでもよい。
Ｈｉｓ精製タグおよびｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含むｕ－ＰＡ融合ポリペプチドが、生成される。代表的なＨＩＳ－ｕ－ＰＡ融合タンパク質が、配列番号１０１７および１０１８に記載される。Ｈｉｓタグされたｕ－ＰＡ分子は、必要に応じて、融合パートナー、ならびに／または発現および分泌のためのシグナルを含有することができる。例えば、配列番号１０１７として記載される代表的なＨｉｓ－ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、６×Ｈｉｓ（配列番号９８９）、ＳＵＭＯ（配列番号１０３１）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、およびＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。別の例では、配列番号１０１８として記載される代表的なＨｉｓタグされたｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、６×Ｈｉｓ（配列番号９８９）、ＳＵＭＯ（配列番号１０３１）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、およびＦｃ（配列番号９９２）を含有する。
（ｂ）ＳＵＭＯ
ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、Ｈｉｓタグを含むことができ、および／または封入体における蓄積のためのＳＵＭＯ配列が、含まれ得る。例えば、配列番号９９０に記載されるＨＩＳ－ＳＵＭＯ配列、およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメインは、全長の改変ｕ－ＰＡポリペプチドに、またはプロテアーゼドメインのような、その触媒的に活性なタンパク質、または改変ｕ－ＰＡポリペプチドの大きな部分に結合することができる。Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグおよびｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを含むｕ－ＰＡ融合ポリペプチドが、生成された。代表的なＨＩＳ－ＳＵＭＯ－ｕ－ＰＡタンパク質は、配列番号１０１７および１０１８に記載される。ＨＩＳ－ＳＵＭＯタグされたｕ－ＰＡ分子は、必要に応じて、融合パートナー、ならびに／または発現および分泌のためのシグナルを含有することができる。例えば、配列番号１０１７として記載されるＨｉｓ－ＳＵＭＯ－ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、６×Ｈｉｓ（配列番号９８９）、ＳＵＭＯ（配列番号１０３１）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、およびＨＳＡ（配列番号９９１）を含有する。別の例では、配列番号１０１８として記載される代表的なＨｉｓ－ＳＵＭＯ－ｕ－ＰＡ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）リーダーシグナルペプチド配列（配列番号９９９）、６×Ｈｉｓ（配列番号９８９）、ＳＵＭＯ（配列番号１０３１）、ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、およびＦｃ（配列番号９９２）を含有する。
７．核酸分子
ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子は、任意のコードされるｕ－ＰＡポリペプチド、またはその触媒的に活性な部分の対立遺伝子バリアントまたはスプライスバリアントを含む。一実施形態では、本明細書において提供される核酸分子は、任意のｕ－ＰＡポリペプチドコード核酸またはその触媒的に活性な部分に対して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、核酸分子は、本明細書において提供されるもののような、ｕ－ＰＡポリペプチドまたはその触媒的に活性な部分のいずれかの縮重コドン配列を有するものを含むことができる。
哺乳類細胞における発現のための誘導可能なプロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結した、核酸分子、または核酸分子の触媒的に活性な部分を含有する融合タンパク質もまた提供される。このようなプロモーターとしては、ＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーター；ＨＰＶ Ｅ７腫瘍性タンパク質に応答性である、Ｅ２遺伝子プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；ＰＶ Ｅ２タンパク質に応答性である、ＰＢＶ ｐ８９プロモーターのようなＰＶプロモーター；およびＨＩＶまたはＰＶまたは腫瘍遺伝子により活性化される他のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において提供されるｕ－ＰＡプロテアーゼはまた、遺伝子導入ベクターにおいて細胞にデリバリーすることができる。導入ベクターはまた、プロテアーゼが投与される、関節リウマチまたは心血管疾患またはＡＭＤまたはＤＧＦのような、疾患または障害の処置のための追加の他の治療剤をコードすることができる。プロテアーゼをコードする導入ベクターは、核酸を対象に投与することにより、全身で使用することができる。例えば、導入ベクターは、アデノウイルスベクターのようなウイルスベクターであり得る。プロテアーゼをコードするベクターはまた、療法のための部位において、幹細胞を移植するか、または生着させることによるような、対象に投与される幹細胞およびこのような幹細胞に取り込まれ得る。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を操作して、プロテアーゼおよび、療法のための移植部位において生着させたそのようなＭＳＣを発現させることができる。
Ｇ．組成物、製剤および投与
改変ｕ－ＰＡポリペプチド、改変ｕ－ＰＡ融合タンパク質またはコード核酸分子を含有する医薬組成物は、選択された量のポリペプチドを１つまたは複数の生理的に許容される担体または賦形剤と混合することにより、従来の様式で製剤化することができる。大抵の実施形態では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質は、投与のための組成物において活性化形態である。したがって、例えば、ポリペプチドは、二本鎖活性化形態であるか、または融合タンパク質が、多量体化ドメインを含有する場合、タンパク質は、二量体のような多量体であり得る。
担体または賦形剤の選択は、投与の専門家の技量の範囲内であり、多数のパラメータに依存し得る。これらは、例えば、投与様式（すなわち、全身、経口、経鼻、肺、局所、局所的または任意の他の様式）および処置される障害を含む。本明細書において提供される医薬組成物は、１回投薬量（直接）投与のため、または希釈もしくは他の改変のため製剤化することができる。製剤中の化合物の濃度は、投与の際に、意図される処置に有効である量のデリバリーに有効である。典型的には、組成物は、１回投薬量投与のため製剤化される。組成物を製剤化するために、化合物またはその混合物の重量分率は、処置される状態が、軽減されるか、または寛解されるように、有効な濃度で選択された媒体において溶解されるか、懸濁されるか、分散されるか、またはそうでなければ、混合される。本明細書において提供される化合物の投与に適当な医薬担体または媒体は、特定の投与の様式に適当であることが、当業者に知られている、任意のこのような担体を含む。
１．改変ｕ－ＰＡポリペプチドの投与
このセクションの目的のため、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、改変プロテアーゼドメインのような改変を含有し、融合タンパク質のようなコンジュゲートを含むｕ－ＰＡポリペプチドを指す。ポリペプチドは、組成物における唯一の医薬上の有効成分として製剤化され得るか、または他の有効成分と組み合わせられ得る。ポリペプチドは、抗体のような標的化剤へのコンジュゲーションによるような、デリバリーのため標的化することができる。組織－標的化リポソームを含む、リポソーム懸濁液はまた、医薬上許容される担体として適当であり得る。これらは、当業者に高知の方法に従い、調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される通り、調製することができる。リポソームデリバリーはまた、フィブロネクチンを用いて改変コラーゲンゲルおよびリポソームのような医薬マトリックスを含む、遅延型放出製剤を含み得る［例えば、Weiner et al. (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5を参照のこと］。
活性な化合物は、処置される対象に対する非所望な副作用の不存在下で治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で医薬上許容される担体において含まれる。治療上有効な濃度は、本明細書において提供されるアッセイのような、公知のインビトロおよびインビボシステムにおいて化合物を試験することにより、経験的に決定することができる。
本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチド（すなわち、活性な化合物）は、体液または他の組織試料のような混合物を、本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれかを含む、本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチドと接触させることにより、インビトロ、生体外で、またはインビボで投与することができる。例えば、化合物を生体外で投与するとき、対象由来の硝子体のような体液または組織試料は、例えば、バイパス装置におけるトゥルーまたはフィルターのような、チューブまたはフィルター上でコーティングされるｕ－ＰＡポリペプチドと接触され得る。インビボで投与されるとき、活性な化合物は、液体、半液体または固体形態で、任意の適当な経路、例えば、経口、経鼻、肺、非経口、静脈内、皮内、硝子体内、網膜内、網膜下、眼周囲、皮下、または局所投与することができ、それぞれの投与経路に適当な様式で製剤化される。投薬量の決定は、医師の技量の範囲内であり、特定の障害の機能、投与の経路および対象であり得る。代表的な投薬量は、例えば、０．１～１ｍｇである。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび生理的に許容される塩および溶媒和物は、吸入による投与（口もしくは鼻のいずれかを通じて）、経口、経皮、肺、非経口または直腸投与のため製剤化することができる。吸入による投与のため、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、加圧パックからエアロゾルスプレー提示の形態、または適当な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適当なガスを使用した噴霧器においてもたらすことができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量した量をもたらすためのバルブを備えることによって決定することができる。治療化合物および適当なラクトースまたはデンプンなどの粉末基剤の粉末混合物を含有する、吸入器または注入器における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
肺への肺投与のため、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、適当な高圧ガスを使用した噴霧器、ターボ噴霧器、またはマイクロプロセッサー制御性計量用量の経口吸入器からエアロゾルスプレー提示の形態でデリバリーすることができる。一般に、エアロゾルの粒子サイズは、小さく、例えば、０．５～５ミクロンの範囲内である。肺投与のため製剤化された医薬組成物の場合、界面活性剤は、典型的には使用されない。肺薬物デリバリーは、有望な非侵襲性の全身投与方法である。肺は、主に、吸収のための広い表面積、薄い肺胞上皮、広範な血管新生、肝臓の初回通過代謝の欠如、および相対的に低い代謝活性のため、魅力的な薬物デリバリー経路を表す。
経口投与のため、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の方法により調製される、例えば、錠剤、ピル、液体懸濁剤、またはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体調製剤は、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとることができ、またはそれらは、使用前に水または他の適当な媒体と構成するための乾燥製品として提示することができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは食用硬化脂質）；乳化剤（例えば、レシチンもしくはアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールもしくは分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートもしくはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて従来の方法により調製することができる。調製剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、香料、着色剤および甘味剤を含有することができる。
経口投与用の調製物は、有効な化合物の制御放出のため、製剤化することができる。バッカル投与のため、組成物は、従来の方法で製剤化した錠剤またはトローチ剤の形態をとることができる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、デポー調製物として製剤化することができる。このような長期作用製剤は、埋入（例えば、皮下もしくは筋肉内）により、または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、治療化合物は、適当なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油における乳液として）またはイオン交換樹脂を用いて、または難可溶性誘導体、例えば、難可溶性塩として製剤化することができる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、非経口投与のため、注射（例えば、ボーラス注射または持続注入）により製剤化することができる。注射用製剤は、添加保存剤を用いて単位投薬形態において（例えば、アンプルにおいて、または複数用量の容器において）提示することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳液のような形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、使用前に、適当な媒体、例えば、無菌のパイロジェンフリー水と構成するための粉末の凍結乾燥させた形態であることができる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、眼または目へのデリバリーのため製剤化することができる。眼への薬物デリバリーは、例えば、局所、経口もしくは全身であってもよく、および／または注射されてもよい。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチド（複数可）または改変ｕ－ＰＡポリペプチド（複数可）を含有する医薬組成物は、点眼剤の形態などにおいて、局所投与されてもよい。別の例では、改変ｕ－ＰＡポリペプチド（複数可）または改変ｕ－ＰＡポリペプチド（複数可）を含有する医薬組成物は、眼周囲および／または硝子体内または網膜内もしくは網膜下投与により、例えば、眼周囲、または網膜内、または硝子体内注射（複数可）により投与することができる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは改変ｕ－ＰＡ ポリペプチドもしくは改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を含有する医薬組成物は、ＤＧＦの処置の目の全身投与ように製剤化することができる。別の例では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは改変ｕ－ＰＡポリペプチドもしくは改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を含有する医薬組成物は、腎臓または組織に、あるいは移植した腎臓の隣接または周囲の臓器に直接注入されるか、または注射される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する医薬組成物は、同種移植片移植時より前もしくは継続的な様式で継続する投与を用いた移植の時に投与することができるか、および／または現象における拒絶エピソード中に投与することができ、結局、このようなエピソード用量が生じる。
医薬組成物は、例えば、目における皮膚（経皮）および粘膜への局所的適用などの局所または局所的適用のため、ゲル剤、クリーム剤、およびローション剤の形態で、ならびに目への適用のため、または大槽内もしくは脊髄内適用のため製剤化することができる。このような液剤、特に、眼への使用を意図されるものは、適当な塩を用いたｐＨ約５～７の０．０１％～１０％等張溶液として製剤化することができる。化合物は、吸入によるなどの、局所的適用のためエアロゾルとして製剤化することができる（炎症疾患、特に、喘息の処置に有用なステロイドのデリバリーのためのエアロゾルを記載する、例えば、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号および第４，３６４，９２３号を参照のこと）。
薬物組成物における有効な化合物の濃度は、有効な化合物の吸収、不活性化および排泄速度、投薬スケジュール、および投与される量ならびに当業者に公知である他の要因に依存する。本明細書においてさらに記載されるとおり、投薬量は、改変されていないおよび／または野生型ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの特性および添加剤（例えば、１つまたは複数の補体タンパク質の切断）の比較を使用して、経験的に決定することができる。
組成物は、所望されるなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有することができる、パッケージにおいて、キットまたはディスペンサー装置において提示され得る。一部の例では、組成物は、例えば、バイパス装置における例えば、チューブまたはフィルターなどの装置にコーティングすることができる。パッケージは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックフォイルを含有する。パックまたはディスペンサー装置には、投与についての指示書を添えることができる。活性な剤を含有する組成物は、パッケージング材、本明細書において提供される剤、および剤が提供される障害を示す標識を含有する、製造元の規約としてパッケージすることができる。
ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする、発現ベクターを含む、核酸分子を含有する組成物もまた提供される。一部の実施形態では、ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸分子およびそれをコードする発現ベクターの組成物は、遺伝子療法に適当である。タンパク質をデリバリーするよりむしろ、核酸は、全身もしくは他の経路などにより、インビボで投与することができるか、またはリンパ球を含む細胞の除去、それへの核酸の導入、および宿主または適合レシピエントへの宿主の再導入などにより、生体外で投与することができる。
２．改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子療法）
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、核酸分子の発現により、細胞および組織にデリバリーすることができる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、生体外での技術および直接インビボ発現を含む、改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸分子として投与することができる。核酸は、当業者に公知の任意の方法により、細胞および組織にデリバリーすることができる。単離された核酸は、さらなる操作のためベクターに取り込まれ得る。コード核酸分子の発現によるｕ－ＰＡポリペプチドの投与方法は、組換えベクターの投与を含む。ベクターは、複製起源の包含によるなどの、エピソームのままであるよう設計され得るか、または細胞における染色体に統合されるよう設計され得る。
ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、ベクターを使用した生体外での遺伝子発現療法において使用することができる。適当な遺伝子療法ベクターおよびデリバリー方法は、当業者に公知である。例えば、細胞は、調節性配列に作動可能に連結されるか、またはそれが、ゲノム位置における調節性配列に作動可能に連結される位置にあるように、ｕ－ＰＡポリペプチドコード核酸をゲノム一に統合することなどにより、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを発現するよう操作することができる。次いで、このような細胞は、処置を必要とする患者などの対象に局所または全身投与することができる。インビボおよび生体外での遺伝子療法のための代表的なベクターは、ウイルスベクター、および例えば、リポソームまたは人工染色体などの非ウイルスベクターを含む。
例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ＥＢＶ、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および遺伝子療法用に設計される他のものを含むウイルスベクターを利用することができる。ベクターは、エピソームまたは処置される対象の染色体に統合させることができるもののままであるものであり得る。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ＡＡＶなどのウイルスベクターにおいてコードされ、処置を必要とする対象に投与され得る。
遺伝子療法に適当なウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、および上で示した他のものを含む。例えば、アデノウイルス発現テクノロジーは、当該技術分野において周知であり、アデノウイルス産生および投与方法もまた、周知である。アデノウイルス血清型は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能である。アデノウイルスは、生体外で使用することができ、例えば、細胞は、処置を必要とする患者から単離され、改変ｕ－ＰＡポリペプチド発現アデノウイルスベクターを用いて形質導入される。適当な培養期間の後、形質導入された細胞は、対象に、局所および／または全身投与される。あるいは、ｕ－ＰＡポリペプチド発現アデノウイルス粒子は、単離され、対象の疾患または状態を予防する、処置するまたは寛解させるのに治療有効量のデリバリーのための薬学的に許容される担体において製剤化される。一実施形態では、処置されるべき疾患は、補体活性化により引き起こされる。典型的には、アデノウイルス粒子は、対象の体重１キログラム当たり１個の粒子～１０１４個の粒子の用量範囲、一般的には、対象の体重１キログラム当たり１０６個の粒子または１０８個の粒子～１０１２個の粒子の用量範囲でデリバリーされる。
核酸分子は、人口染色体および他の非ウイルスベクターに導入することができる。ＡＣＥＳ［Lindenbaum et al. Nucleic Acids Res. (2004) 32(21):e172を参照のこと］などの人口染色体は、ｕ－ＰＡポリペプチドをコードし、発現するように操作することができる。簡単に言うと、哺乳類人口染色体（ＭＡＣ）は、自己複製の非統合形態で細胞に遺伝子情報の巨大なペイロードを導入するための手段を提供する。ＭＡＣの中でも珍しいことに、哺乳類付随体ＤＮＡベースの人口染色体発現系（ＡＣＥＳ）は、異なる種の細胞株において新規で再生可能に生成され、宿主細胞の染色体から容易に精製され得る。次いで、精製された哺乳類ＡＣＥは、それらが、ＡＣＥ系を使用した選択プレッシャーの不存在下で長期間安定して維持される、様々なレシピエント細胞株に再導入され得る。このアプローチを使用し、１つまたは２つの遺伝子標的の特異的な積載が、ＬＭＴＫ（－）およびＣＨＯ細胞において達成される。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を導入する別の方法は、ＹＡＣクローンにおける特定の領域を標的化するためのアデノウイルス配列、目的の遺伝子の発現カセットならびに陽性および陰性選択可能なマーカーを含有する酵母人口染色体（ＹＡＣ）およびプラスミドにクローニングされた完全なアデノウイルスゲノム［Ad2;Ketner et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6186-6190］で出発する、酵母における２工程の遺伝子置換技術である。ＹＡＣは、より巨大な遺伝子の取り込みを可能にするので、特に目的である。このアプローチは、哺乳類細胞または動物全体への遺伝子導入のため記載された改変ｕ－ＰＡポリペプチドのいずれかをコードする核酸を生じるアデノウイルスベースのベクターの構築のため使用することができる。
核酸は、リポソームなどの媒体に被覆され得るか、または細菌細胞、特に、弱毒細菌などの細胞に導入され得るか、もしくはウイルスベクターに導入され得る。例えば、リポソームが利用されるとき、エンドサイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞タイプに向性のカプシドタンパク質またはその断片、循環において内部移行を経験するタンパク質についての抗体、および細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を増強するタンパク質を標的にするため、および／または取り込みを促進するために使用することができる。
一部の実施形態では、細胞表面膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体のリガンドなどの、細胞を標的にする剤を核酸供給源にもたらすことが望ましい。本明細書において提供されるポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、任意の適当な方法により作製することができる。上で記載された核酸分子を含有する核酸ベクターが、さらに提供される。上で記載される核酸分子を含有する核酸ベクターおよびこれらのベクターを含有する細胞が、さらに提供される。
生体外およびインビボでの方法のため、ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸分子は、適当なドナー由来の細胞または処置されるべき対象に導入される。核酸が、療法目的のため導入され得る細胞は、例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、および他のその供給源から得られる幹細胞などの、造血幹細胞もしくは前駆細胞を含む、様々な幹細胞または前駆細胞を含むが、これらに限定されない、処置されるべき疾患または状態に適当な、任意の所望の入手可能な細胞タイプを含む。
生体外での処置のため、処置されるべき対象とで適合するドナー由来の細胞または処置されるべき対象由来の細胞は、除去され、核酸は、これらの単離された細胞に導入され、改変細胞は、対象に投与される。処置は、例えば、患者に移植される、多孔性膜内に被覆されるような、直接投与を含む（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照のこと）。インビトロでの哺乳類細胞への核酸の導入に適当な技術は、リポソームおよび陽イオン脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ－Ｃｈｏｌ） エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ－デキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿法の使用を含む。ＤＮＡデリバリー方法を使用して、インビボでｕ－ＰＡポリペプチドを発現させることができる。このような方法としては、エレクトロポレーション、超音波およびリン酸カルシウムデリバリーの使用などの局所ならびに全身デリバリーを含む、核酸のリポソームデリバリーおよびネイキッドＤＮＡデリバリーが挙げられる。他の技術としては、マイクロインジェクション、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小核体媒介性遺伝子導入およびスフェロプラスト融合が挙げられる。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドのインビボでの発現は、追加の分子の発現と結び付けることができる。例えば、ｕ－ＰＡポリペプチドの発現は、操作されたウイルスなどにおける細胞傷害産物の発現と結び付けられるか、または細胞傷害性ウイルスにおいて発現させることができる。このようなウイルスは、治療効果のための標的である特定の細胞タイプに標的化することができる。発現されたｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、ウイルスの細胞毒性を増強することができる。
ｕ－ＰＡポリペプチドのインビボ発現は、核酸分子をコードするｕ－ＰＡポリペプチドを、細胞特異的または組織特異的なプロモーターなどの特定の調節配列に作動可能に連結させることを含み得る。ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、標的細胞タイプおよび／または組織において特異的に感染し、および／または複製するベクターから発現させることができる。誘導可能なプロモーターを使用して、ｕ－ＰＡポリペプチド発現を選択的に調節することができる。
ネイキッド核酸として、またはベクターにおける核酸分子、人工染色体、リポソームならびに他の媒体は、全身投与、局所的、局所および他の投与経路により対象に投与することができる。全身およびインビボのとき、核酸分子または核酸分子を含有する媒体は、細胞に標的化することができる。
投与はまた、典型的には、細胞または組織を標的化するベクターまたは細胞の投与などにより、直接的であり得る。例えば、腫瘍細胞および増殖細胞は、ｕ－ＰＡポリペプチドのインビボ発現のための標的化細胞であり得る。ｕ－ＰＡポリペプチドのインビボ発現のため使用される細胞はまた、患者にとって自己の細胞を含む。このような細胞は、患者から除去され、ｕ－ＰＡポリペプチドの発現のための核酸が、導入され、次いで、注射または生着などにより、患者に投与され得る。
ＡＭＤおよび他の眼性疾患の処置のための投与
提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸は、それらの病因学における補体活性化に関与する疾患または状態の処置のため投与することができ、その阻害は、疾患もしくは状態の症状を寛解させるか、またはそうでなければ、疾患もしくは状態を処置することができる。本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸のデリバリーのため設計されたウイルスベクターなどのベクターなどの核酸は、疾患または状態に依存して、任意の適当な経路または異なる経路の組合せにより、対象に投与され得る。核酸デリバリーは、目（例えば、眼へのデリバリー、網膜下注射、硝子体内（ＩＶＴ）注射、網膜内注射、もしくは局所的（例えば、点眼）デリバリーを介した）への直接デリバリー、または全身経路、例えば、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経腸投与経路を介したデリバリーを介してもたらされ得る。
当業者は、対象および投与のためのウイルスと適合性であり、ウイルスが、標的細胞タイプまたは組織、例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／または視細胞などの目に恐らく達するようにさせる、任意の投与形式を選択することができる。投与経路は、疾患の性質、標的細胞または組織の特性（例えば、細胞タイプ）、および投与されるべき特定のウイルスを含む、様々な要因のいずれかに従い、当業者により選択され得る。投与は、目、例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および／もしくは視細胞または網膜下空間などの、目的の細胞または組織が標的化される場所を選択することができる。
ウイルス発現ベクターなどの、改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸は、例えば、ＡＭＤなどの眼性疾患などの疾患により特徴付けられる標的細胞にデリバリーすることができる。例えば、ウイルスを含有する組成物は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、視細胞または他の眼性細胞（例えば、網膜神経節細胞）への網膜下注射などの網膜下注射によりデリバリーすることができる。一部の例では、本明細書において記載される核酸を含有する任意のウイルスなどのウイルスの網膜下投与は、医師が硝子体切除術（すなわち、針穴を、網膜（レチノミー）において作製し、本明細書において記載される任意のウイルスなどのウイルスを含有する液体などの液体が、注射される）を行う必要がある。網膜下注射は、経角膜経路を介して、瞳孔を通じ、次いで、水晶体、硝子体および網膜を通過して、もたらされ得る。他の例では、網膜下注射は、強膜を通じて、針または任意の他の投与装置を通過し、毛様体扁平部または角膜縁範囲、中部または後部硝子体だが、網膜の逆側、網膜下空間に入ることにより、行うことができる。他の例では、網膜下注射は、針または任意の他の投与装置を、強膜、ならびに脈絡膜およびブルッフ膜を通すこと、網膜を避けて、ＲＰＥへのデリバリーを達成することにより、行うことができる。網膜下投与の他の適当な経路は、当業者または医師もしくは外科医により決定され得る。一部の例では、濾過胞形成は、良好な投与をシグナル伝達する。
他の例では、目における発現のための改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を含有する組成物は、硝子体細胞および網膜内側の細胞を標的化するための投与などの、眼細胞への硝子体内注射によりデリバリーすることができる。一部の例では、硝子体内注射は、針または任意の他の投与装置を、毛様体扁平部を通過させ、中部または後部硝子体だが、網膜の逆側に通過させることにより、行われる。硝子体内注射後、ウイルスを含有する組成物は、神経節細胞に感染するようデリバリーすることができる。他の例では、硝子体内注射によりデリバリーされるウイルスを含有する組成物は、内側の核層細胞を標的にする。デリバリーの有効性は、ウイルスタイターおよび血清型に依存する。一部の例では、処置は、目の裏側に投与される薬剤の濃度を増大させるために、硝子体内に移植可能な装置（すなわち、生体分解可能および非生体分解可能な硝子体内に移植可能な装置）と組み合わせた直接的な硝子体内注射を含む［Hwang et al. (2012) J Korean Med Sci 27:1580-85］。
他の例では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸を含有する組成物は、眼細胞を標的化するための眼瞼静脈を介して注射される。他の例では、ウイルスは、例えば、網膜移植片としてなどの、目への移植のため生体外で適用される（例えば、切除されたＲＰＥ脈絡膜または胎児網膜細胞または網膜細胞に適用される）。他の例では、医師などの当業者は、本明細書において記載される核酸を含有する任意のウイルスの投与のための適当な経路を選択することができる。所望されるなら、投与経路は組み合わせることができる。
一例では、ウイルスは、標的細胞、例えば、疾患細胞が、存在する部位、すなわち、目または網膜内に局所投与される。局所投与は、大抵、目の前部の目疾患において使用される［Patel et al. World J Pharmacol (2013) 2:47-64］。
一例では、硝子体内にデリバリーされるべきウイルスは、細い針（２７～３０Ｇ）を用いて、硝子体内部の毛様体扁平部を通じて投与することができる。当業者は、針の軸を、目の中にどれだけ挿入するか（例えば、挿入の深さ）、投与速度（例えば、プランジャーに適用する圧力）、傾斜の向きの角度、および軸と毛様体扁平部の間の角度を決定する。
Ｈ．治療上の使用および処置方法
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ３を標的にし、補体媒介性疾患および障害のモジュレーションを可能にする。本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドなどの治療プロテアーゼは、伝統的な治療アプローチより多くの効果的な利点を有する。そのうち主なものは、疾患標的を触媒様式で不活性化する能力である（すなわち、多くの化学量論の１つ）。したがって、プロテアーゼは、有意に標的濃度未満である濃度で有効な調節を維持することができる。追加の区別する利点は、（１）不可逆的不活性化；（２）低い投与；（３）投与頻度の減少（４）小分子サイズ；（５）翻訳後改変を標的にする能力；（６）高い標的濃度を中和する能力；および（７）活性部位から離れて標的化する能力を含む。治療として、プロテアーゼは、以下の特徴：（１）分子標的（細胞外）へのアクセス、および（２）疾患状態に重要な標的についての十分にストリンジェントな特異性の保有を依然として示さなければならない。本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体媒介性疾患および障害の処置において使用することができる。
当業者は、疾患プロセスにおける補体系の役割を理解し、様々なこのような疾患を知っている。代表的な疾患の簡単な考察およびそれらの病因学および病理における補体タンパク質Ｃ３の役割が提供される。本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび核酸分子は、補体経路の活性化が関係付けられる任意の状態、特に、敗血症性ショックなどの急性炎症状態、および関節リウマチ（ＲＡ）などの慢性炎症状態を含む炎症状態の処置のため使用することができる。急性および炎症状態は、例えば、自己免疫疾患または免疫－複合体媒介性炎症により引き起こされる組織損傷などの免疫媒介性疾患として出現し得る。補体媒介性炎症状態はまた、炎症性成分を有する神経変性または心血管疾患として出現し得る。このセクションは、本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのための代表的な投与使用および投与方法を提供する。ここで記載される療法は代表的であり、本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドの適用であり、それを制限しない。このような方法としては、記載され、以下に挙げられる生理的および医学的状態の処置方法が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法としては、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、腎遅延移植片機能（ＤＧＦ）、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、エリテマトーデス、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、呼吸促迫症候群、免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織損傷、多臓器不全、アルツハイマー病（ＡＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）などの現象もしくは処置により引き起こされる虚血再灌損傷、脳卒中、心肺バイパス術（ＣＰＢ）もしくは冠動脈バイパス術、血管形成術、または血液透析、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）ならびに／またはギラン・バレー症候群の処置方法が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを用いた疾患および状態の処置は、皮下注射、経口、硝子体内、網膜内、網膜下、眼周囲および経皮投与を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される適当な製剤を使用して、任意の適当な投与経路によりもたらすことができる。必要なら、特定の投薬量および持続時間および処置プロトコールは、経験的に決定するか、または推定することができる。例えば、野生型ｕ－ＰＡポリペプチドの代表的な用量を出発点として使用して、適当な投薬量を決定することができる。野生型ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、より特異性および／または選択性を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、低減した投薬量および頻度で有効であり得る。投薬レベルは、個体の体重、一般的な健康、年齢、利用される特定の化合物の活性、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、疾患の重症度および経過、ならびに疾患に対する患者の素因ならびに処置医の判断などの、様々な要因に基づき、決定することができる。単回投与形態を生じるよう担体材料と組み合わせられ得る有効成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に依存して、変動する。
患者の状態の改善の際、維持用量の化合物または組成物が、必要に応じて投与することができ、投薬量、投薬形態、もしくは投与頻度、またはその組合せは、改変することができる。一部の場合では、対象は、疾患症状の任意の再初の際に、長期基盤に断続的な処置を必要とし得る。
１．補体活性化により介在される疾患
補体カスケードは、貪食および炎症を促進することにより、細菌およびウイルス侵入に対する保護を引き起こす、二重の囲いのスオードである。逆に、補体が正常に機能するときでさえ、それは、局所炎症および組織への損傷を促進することにより、疾患の発症に関与し得る。したがって、病理学的効果は、補体の保護役割に関与する同じメディエータにより介在される。例えば、アナフィラキシー性および走化性ペプチドＣ５ａは、好中球を動員し、活性化することにより、炎症をもたらし、Ｃ３ａは、他の貪食細胞の病理学的活性化を引き起こし得、複合体を攻撃する膜が、細胞を殺傷するか、または損傷し得る。一例では、例えば、多くの自己免疫疾患において、補体は、宿主組織に対する抗体などにより、不適当な状況下で活性化されるので、それは、組織損傷を生じる。他の状況では、補体は、敗血症などにより、通常活性化され得るが、呼吸促迫症候群などにおいて、疾患の進行に依然として関与する。病理学的に、補体は、それが十分に制御されない場合、血管への実質的な損傷（血管炎）、腎基底膜ならびに付着した内皮および上皮細胞への実質的な損傷（腎炎）、関節滑膜への実質的な損傷（関節炎）、ならびに赤血球への実質的な損傷（溶血）を引き起こし得る。
補体は、関節リウマチ［例えば、Wang et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8955-8959; Moxley et al. (1987) Arthritis & Rheumatism 30:1097-1104を参照のこと］、エリテマトーデス［Wang et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:8563-8568;およびBuyon et al. (1992) Arthritis Rheum. 35:1028-1037］および急性糸球体腎炎［Couser et al. (1995) J Am Soc Nephrol. 5:1888-1894］などの自己免疫疾患を含む、多数の障害の免疫病理学において役割を果たす。補体系の活性化に関与する他の病理は、敗血症［例えば、Stove et al. (1996) Clin Diag Lab Immunol 3:175-183; Hack et al. (1989) Am. J. Med. 86:20-26を参照のこと］、呼吸促迫症候群［例えば、Zilow et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:151-157;およびStevens et al. (1986) J. Clin. Invest. 77:1812-1816を参照のこと］、多臓器不全［例えば、Hecke et al. (1997) Shock 7:74;およびHeideman et al. (1984) J. Trauma 24:1038-1043を参照のこと］、脳卒中または心筋梗塞［Austen WG et al. (2003) Int J Immunopathol Pharm 16(1):1-8］などの心血管疾患における現象などの虚血再灌流障害、加齢黄斑変性［Bradley et al. Eye 25: 683-693 (2011); Gemenetzi et al. Eye 30: 1-14 (2016)］および腎遅延移植片機能［Danobeitia et al. [abstract]. Am J Transplant. 2013; 13(suppl 5);Yu et al. (2016) Am J Transplant 16(9):2589-2597;Castallano et al. (2010) Am J Pathol 176(4):1648-1659］を含む。補体媒介性疾患のいつくかの代表的な例は、以下に記載される。
ａ．関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）は、慢性の炎症性の病気である。これは、あたかもそれらが侵入性の病原体であるかのように、免疫系が、正常組織成分を攻撃する、自己免疫疾患である。関節リウマチに関連する炎症は、主に、関節の裏層を攻撃する。血管、心臓、および肺を裏打ちする膜はまた、炎症し得る。ＲＡは、炎症滑膜、および確立した疾患のリンパ球系濾胞および胚中心に存在する活性化Ｂ細胞および血漿細胞により、特徴付けられる。これは、高いレベルの局所免疫グロブリン産生および滑膜における補体カスケードのイニシエーターとして働き得る、関節軟骨と関連して、ＩｇＧおよびＩｇＭリウマチ因子を含み得る免疫複合体の蓄積をもたらす。Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、およびＣ５ｂ－９などの補体成分のレベルの上昇は、炎症したリュウマチの関節内で見られる。これらの補体成分は、例えば、血管透過性、白血球走化性、ならびに複数の細胞タイプの活性化および溶解における変化などの様々な炎症促進活性を誘導することにより、ＲＡと関連する炎症を悪化させ得る。
ｂ．敗血症
敗血症は、全身の炎症応答を導く、細菌の感染症などの重篤な感染症により引き起こされる疾患である。細菌細胞の壁成分であるリポ多糖類は、大抵、敗血症と関連するが、他の細菌、ウイルス、および真菌感染症は、敗血症症状を刺激し得る。敗血症性ショックは、大抵、例えば、免疫応答の炎症促進結果が、宿主組織に対して損傷するように、身体の天然の免疫系が、侵入微生物に対して防御することができない場合、生じる。早期の敗血症は、血管透過性を増大し、好中球からのスーパーオキシド産生を刺激し、ヒスタミン放出を刺激するよう作用するＣ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａなどの、補体アナフィラトキシンの産生の増大をもたらす、過剰な補体活性化により特徴付けられる。Ｃ５ａの作用は、細菌感染症に対する増殖性免疫応答に寄与し得るが、これは、調節されないままなら、Ｃ５ａはまた、重篤に損傷し得る。炎症の大腸菌誘導性モデルにおいて、Ｃ５ａの遮断は、好中球媒介性組織損傷を導き得るＣ５ａ媒介性好中球活性化を制限することにより、敗血症動物の結果を改善した。
細菌感染症に対する自然免疫応答の継続的機能損傷は、大抵、生命を脅かし得る、慢性の敗血症または敗血症性ショックを導く。後期の敗血症において、これは、継続した疾患に関与する、早期に生じる、過剰活性と反対の好中球の「休止状態の」活性である。後期では、走化性、呼吸性バースト活性、および細菌の殺傷能力を含む、好中球の主要な機能は、低減する。補体、特に、Ｃ５ａはまた、より後期の敗血症において役割を果たす。敗血症中のＣ５ａの過剰な産生は、好中球上のそれ自体の受容体Ｃ５ａＲのＣ５ａ誘導性下方調節に結び付けられるプロセスである、血液好中球の「脱活性化」に関連する［Guo et al. (2003) FASEB J 13:1889］。好中球上のＣ５ａＲのレベルの低減は、血液の好中球のＣ５ａに結合する能力の減少、走化性応答の損傷、スーパーオキシド産生の喪失、および細菌活性の障害と相関する。しかしながら、Ｃ５ａＲレベルは、敗血症のより後期で「回復」し始めることができ、有益な疾患結果の例と相関し得る。
ｃ．多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）およびその動物モデル実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄性疾患である。ＭＳにおいて、神経組織の炎症は、脳および脊髄における神経繊維の一種の保護的遮蔽として働く脂肪性材料であるミエリンの喪失を引き起こす。この脱髄は、ＭＳの様々な症状を生じる、脳への電気的衝撃および脳からの電気的衝撃を行う神経の能力を崩壊させる、神経細胞を覆いながら、複数の範囲の瘢痕組織（硬化症）をそのままにする。ＭＳは、活性化リンパ球、マクロファージ／ミクログリアおよび補体系により仲介される。補体活性化は、その二重の役割：脱髄を促進する活性化末端複合体Ｃ５ｂ－９の能力およびアポトーシスからオリゴデンドロサイト（ＯＬＧ）を保護する半溶解性Ｃ５ｂ－９の能力を通じて、これらの疾患の病因に関与し得る。
ｄ．アルツハイマー疾患
アルツハイマー疾患（ＡＤ）は、脳内の濃縮体（微小管に通常結合する、タンパク質タウの異常な対のらせんフィラメント）およびプラーク（主に、ベータ－アミロイドタンパク質を含む細胞外蓄積物）により特徴付けられる。ＡＤの正確な原因は、完全には明確ではないが、ＡＤの脳の影響を受けた領域における慢性神経炎症は、炎症促進性メディエータが、役割を果たし得ることを示唆する。ＡＤの脳内の濃縮体およびプラークは、例えば、Ｃ４ｄおよびＣ３ｄなどの活性化補体断片と共に蓄積する。同様に、ＡＤの脳における変性神経突起は、ＭＡＣについて免疫染色され得、これは、ＡＤにおけるこれらの神経突起の自己触媒性攻撃および随伴性神経突起喪失を示す。ＡＤにおける補体の活性化は、凝集したアミロイド－ベータタンパク質により誘導される抗体依存性機序により生じる。さらに、補体カスケードは、全てが、ＡＤにおいて上方調節される、ペントラキシン、Ｃ－反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびアミロイドＰ（ＡＰ）により活性化され得る［McGeer et al. (2002) Trends Mol Med 8:519］。補体メディエータの増大により印を付けられる、ＡＤにおける補体の活性化は、例えば、ＣＤ５９などの補体調節性タンパク質の代償性上方調節により、十分には制御されない。したがって、補体活性化の炎症促進性の結果は、ＡＤの進行を悪化させ、おそらく、神経突起の破壊に関与する。
ｅ．虚血性再灌流損傷
虚血性再灌流損傷は、虚血性イベントおよび続く、血流の回復後に持続する損傷であり、低酸素発作に対する炎症応答から生じる。虚血性再灌流損傷は、例えば、開胸心臓外科手術もしくは血管形成術後などの心臓外科手術手法中の急性、またはうっ血性心不全もしくは閉塞性心血管疾患を伴う慢性であり得る。虚血性再灌流損傷を引き起こし得る損傷の例は、心筋梗塞（ＭＩ）および脳卒中を含む。炎症応答の開始は、炎症刺激性である酸素フリーラジカルを生成し得る、再灌流および代謝物の随伴性蓄積と共に生じる、組織酸素レベルの増大によりおそらく引き起こされる。虚血性再灌流損傷は、心筋梗塞の重篤度、大脳の虚血現象、腸の虚血、および多くの態様の血管外科手術、心臓外科手術、外傷、および移植を含む、様々な現象に関連する。損傷は、自然免疫系の炎症現象、特に、非自己として新たに改変組織に対する応答における補体系の活性化により、顕在化する。そうであるから、虚血性再灌流損傷は、血管透過性の増大により引き起こされる組織浮腫および多形核白血球の流入により引き起こされる急性炎症性細胞浸潤物により、特徴付けられる。
補体系の活性化は、虚血性再灌流損傷の炎症現象において役割を果たす。虚血損傷は、これらの曝露されたエピトープが、改変され、新規抗原（改変自己抗原）として働き得るように、細胞膜、影響する脂質、炭水化物、または外部の表面のタンパク質の変化をもたらす。循環ＩｇＭは、新規抗原を認識し、結合して、損傷された細胞表面上で免疫複合体を形成する。形成された抗原－抗体複合体は、補体の古典的経路の古典的なアクチベーターであるが、全ての経路は、何らかの方法で、損傷の憎悪作用に関与するようである。虚血性再灌流損傷への補体の古典的経路の関与は、後肢および損傷の動物モデルにおける局所損傷からの等しい保護を示すＣ３またはＣ４のいずれかにおけるマウス遺伝子欠損により証明される［Austen et al. (2003) Int J Immunopath Pharm 16:1］。逆に、虚血損傷の腎臓モデルにおいて、Ｃ３－、Ｃ５－、およびＣ６－欠損マウスは保護されたが、Ｃ４－欠損マウスは保護されず、これは、代替の補体経路の重要性を示唆している［Guo et al. (2005) Ann Rev Immunol 23:821］。補体活性化の際誘導されるメディエータは、局所損傷の部位において細胞膜で指示される炎症応答を開始する。
虚血性再灌流損傷における補体の主要なエフェクタ機序は、例えば、Ｃ５ａなどの補体成分により炎症した組織への好中球の流入および活性化である。好中球の活性化は、アポトーシス、壊死、および喪失または臓器機能を最終的にもたらす、局所の損傷臓器における反応性酸素種の産生の増大およびリソソーム酵素の放出をもたらす。終わりのＭＡＣ、Ｃ５ｂ－９の生成はまた、虚血性再灌流損傷における局所組織損傷に関与する。
ｆ．眼の障害
正常の目において、補体系は、低レベルで継続的に活性化され、膜結合し、可溶性眼内補体調節性タンパク質は、この自発的な補体活性化を堅固に調節する。低レベル補体活性化は、自己組織への損傷および視力喪失を引き起こすことなく、病原体に対して保護する。補体系および補体調節性タンパク質は、自己免疫ぶどう膜炎における眼内炎症を制御し、角膜の炎症、加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症の発症において重要な役割を果たす。補体系は、糖尿病性網膜症［例えば、Ghosh et al. (2015) Endocr Rev 36:272-288を参照のこと］ならびに糖尿病性神経障害および糖尿病性心血管疾患の病態形成において重要な役割を果たす。自発的な補体活性化は、感染後の角膜組織に対する損傷を引き起こし得る。補体阻害は、様々な眼の疾患の処置における適切な治療標的である［例えば、Purushottam et al. (2007) Mol Immunol. 44:3901-3908を参照のこと］。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）
加齢黄斑変性は、中心視野の進行的な喪失により特徴付けられる、様々な疾患を記載する臨床用語である。ＡＭＤは、多くの先進国における加齢した個人における視力喪失の主要な原因である［Jager et al. (2008) N Engl J Med 358:2606-2617］。視力喪失は、非常に鋭敏な中心視野に特殊である、高密度の錐体視細胞を含む目の裏側での領域である錐体視細胞の進行性変性に起因して生じる。
ＡＭＤは、乾燥性（非新生血管性）ＡＭＤおよび／または湿潤性ＡＭＤとして顕在化し得る。乾燥性ＡＭＤは、ＡＭＤのより一般的（症例の８５～９０％）かつより軽度の形態であり、斑内および斑の下における小さい丸い白から黄色の病変（ドルーゼン）により特徴付けられる。進行した乾燥性ＡＭＤ、または地図状萎縮は、ＰＲＥ視細胞の喪失、斑の悪化および最終的な盲目のため、網膜の菲薄化を導く。稀であるが、湿潤性ＡＭＤに関連する視力喪失は、一般的に、湿潤性ＡＭＤより劇的である。湿潤性ＡＭＤは、異常な血管が、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）層の真下で生じる、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と呼ばれる、病的な血管の形成を含む。脈絡膜と網膜色素上皮（ＲＰＥ）の間の細胞外基質であるブルッフ膜における破砕を通じて下にある脈絡膜からの網膜のＣＮＶ侵入、またはそれらの破損は、ＡＭＤにおける視力喪失を引き起こし得る（例えば、網膜下出血および／または瘢痕のため）。
ＡＭＤの早期臨床特徴は、凝集したタンパク質（すなわち、アルブミン、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ））、補体経路の成分（例えば、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、およびビトロネクチン［Hageman et al. (2001) Prog. Retin. Eye. Res 29:95-112; Hageman et al. (2005) Proc. Nat. Acad. Sci. 102: 7227-7232; Mullins et al. (2000) FASEB H 14:835-846; Anderson et al. (2010) Pro. Retin. Eye Res. 29:95-112)］、免疫グロブリンならびに／またはアミロイド－β［Crabb et al. (2002) Proc Natl Acad Sci 99: 14682-14687; Johnson et al. (2002) 99: 11830-11835)］ならびにＲＰＥとブルッフ膜の間に局在化する脂質および細胞成分からなる細胞外脂質タンパク質性蓄積物である、ブルッフ膜の肥厚およびドルーゼンの出現を含む［Gass、J. D. (1972) Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 70: 409-36］。
ＡＭＤにおける炎症は、代替の補体経路の脱調節により介在される。補体成分Ｃ３およびＣ５は、ＡＭＤを有する患者におけるドルーゼンの主要構成成分である［Mullins et al. (2000) FASEB J 14、835-46; Johnson et al. (2000) Exp Eye Res 70、441-9; Anderson et al. (2002) Am J Ophthalmol 134、411-31;およびLeitner et al. (2001) Exp Eye Res 73、887-96］。ドルーゼン新生が、ＡＭＤの炎症特徴を導く、ＲＰＥ細胞を溶解するか、またはＲＰＥ細胞における生理的ホメオスタシスを妨害し得る、補体活性化およびＭＡＣの形成の引き金を引き得る慢性炎症プロセスに関与すると仮定される［Johnson et al. (2001) Exp Eye Res 73、887-896］。補体タンパク質（例えば、Ｃ３ｄ）はまた、ＡＭＤ患者の血液において検出され［Scholl et al. (2008) PLoS One 3: e2593］、これは、ＡＭＤ誘導性炎症が、全身性であり得ることを示している。乾燥性ＡＭＤの病態形成における補体における役割についての遺伝子の証拠があり［Klein et al. Science 308(5720):385-389 (2005); Yates et al. NEJM 357:553-561 (2007)］、コンプスタチン（ならびにコンプスタチン誘導体ＡＰＬ－１およびＡＰＬ－２）ならびにＰＯＴ－４（効力のある医薬）、Ｃ３の小ペプチド阻害剤は、ＡＭＤにおける地図状萎縮の進行を遅らせ得［Ricklin et al. (2008) Adv. Exp. Med. Biol. 632: 273-292］、Ｃ３（すなわち、Ｃ３阻害）は、ＡＭＤ処置の実行可能な標的であり得ることを示している。
ｇ．臓器移植および臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）
補体は、虚血性再灌流損傷の病態形成における役割を果たす。腎臓再灌流損傷の機序は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ－９の生成に依存し、それらの両方が、急性尿細管壊死およびアポトーシスに関与し、虚血後の急性腎不全および組織線維化を導く、腎臓尿細管に対する直接的な毒性を有する。順に、これらの終わりの経路成分の生成は、Ｃ３の腎臓内合成および補体活性化に必須である他の補体成分の利用可能性に依存する。ドナー臓器におけるＣ３の発現レベルは、冷却虚血時間に強く依存する［Elham et al. (2010) Curr Opin Organ Transplant. 15:486-491］。
固形臓器移植における拒絶は、開始の炎症応答および続く、適応同種免疫応答により影響され、それらの両方が、様々な補体成分により影響される。補体タンパク質は、虚血再灌流のプロセスにおける移植後の臓器損傷において、および適応免疫応答の活性化のモジュレートにおける有意な役割を果たす。補体の阻害または補体タンパク質分子の機能のモジュレートは、移植臓器損傷を低減し、臓器の寿命を増大させ得る［例えば、Elham et al. (2010) Curr Opin Organ Transplant. 15:486-491を参照のこと］。治療介入時、輸送および移植後のため標的化する補体成分は、臓器回収時の臓器損傷を低減し得る。このような臓器の代表は、腎臓である。本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを投与して、移植後の臓器損傷を軽減、および／または処置することができる。
腎遅延移植片機能などの臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）は、移植した臓器は、腎移植患者のサブセットにおいて生じる状態であり、移植した臓器は、移植直後に正常に機能しない。他の可能性のある移植としては、心臓、肺、血管組織、目、角膜、水晶体、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、膵島、軟骨、肝細胞、および造血細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎ＤＧＦは、腎同種移植片の急性壊死により特徴付けられ、移植後の短い透析の必要により、臨床上定義される。移植プロセス中の急性腎損傷は、ＤＧＦとして頻繁に顕在化する。ＤＧＦの根底にある病理は、ドナーの年齢および虚血の持続時間などのドナー由来の要因、ならびに再灌流損傷、免疫学的応答および免疫抑制剤を用いた処置などのレシピエントの要因由来の関与で複雑である。
補体カスケードの構成成分および補体活性化は、移植の拒絶およびの構成成分を導く虚血性再灌流損傷のメディエータとして重要な役割を果たす。動物実験は、虚血性再灌流損傷における補体の鍵となる役割を確立した。例えば、Ｃ５に対するヒト化モノクローナル抗体であるエクリズマブは、補体活性化を遮断し、ハイリスク腎臓移植患者のサブセットにおいて臓器移植後臓器機能障害を予防することが示された［例えば、Horizon Scanning Research and Intelligence Centre brief, 2016 September; Johnson et al. (2015) Curr Opin Organ Transplant 20(6):643-651; Yu et al. (2016) Am J Transplant 16(9):2589-2597を参照のこと］。顆粒Ｃ４ｄ蓄積は、ヒト腎臓同種移植片レシピエントにおけるＤＧＦに関連した［Kikic et al. (2014) Transpl Int 27(3):312-321］。Ｃ３産生の増大は、腎臓移植の拒絶に関連する［Pratt et al. (2002) Nat Med 8(6):582-587; Damman et al. (2011) Nephrol Dial Transplant 26(7):2345-2354］。故に、本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、移植の拒絶およびＤＧＦを予防するか、または寛解させるか、または除去するための治療として使用することができる。
２．治療上の使用
ａ．免疫媒介性炎症疾患
本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、炎症疾患を処置することができる。プロテアーゼを用いて処置することができる炎症疾患は、急性および慢性炎症疾患を含む。代表的な炎症疾患は、中枢神経系疾患（ＣＮＳ）、自己免疫疾患、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、および免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織損傷などにおける気道過敏状態を含む。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとして働き得る［Piddlesden et al. (1994) J Immunol 152:5477］。ＥＡＥは、ミエリンならびにミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）などのミエリン成分を用いた免疫により、多数の遺伝的に疑わしい種において誘導することができる。例えば、ＭＯＧ誘導性ＥＡＥは、病理組織学的三徴候の炎症、反応性神経膠症、および巨大な集密的脱ミエリン化プラークの形成である慢性、再発性臨床疾患経過を含む、ヒトＭＳの本質的な特色を再現する。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ＥＡＥ動物モデルにおいて評価することができる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、毎日の腹腔内注射などにより投与され、症状の経過および進行は、対照動物と比較して、モニターされる。疾患を悪化させ得る炎症補体成分のレベルはまた、溶血アッセイにおいて血清補体活性をアッセイすることにより、および例えば、Ｃ１、Ｃ３およびＣ９などの補体成分の蓄積についてアッセイすることにより、測定することができる。
補体活性化は、関節リウマチ（ＲＡ）などの疾患における炎症をモジュレートする［Wang et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8955］。改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、ＲＡを処置することができる。例えば、ｕ－ＰＡポリペプチドは、局所または全身注射することができる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、毎日または毎週投与することができる。ＰＥＧ化ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、免疫原性を低減することができる。一例では、ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）は、炎症性滑膜炎、パンヌス形成、ならびに軟骨および骨の侵食により特徴付けられるＲＡに組織学的に類似する、自己免疫炎症関節疾患のモデルであるマウスにおいて誘導することができる。ＣＩＡを誘導するために、フロイント完全アジュバントの存在下でのウシＩＩ型コラーゲン（Ｂ－ＣＩＩ）は、尾の根元に皮内注射され得る。２１日後、マウスは、同一のプロトコールを使用して、再免疫され得る。ｕ－ＰＡポリペプチドの効果を調べるために、Ｂ－ＣＩＩでの開始負荷の３週間後、ｕ－ＰＡポリペプチドまたは対照は、毎週２回、３週間、腹腔内投与され得る。マウスは、組織学的解析のため、開始免疫の７週間後に屠殺され得る。確立した疾患に対するｕ－ＰＡポリペプチドの治療効果を評価するために、ｕ－ＰＡポリペプチドは、１つまたは複数の肢における臨床的な関節炎の発症後、計１０日間、毎日投与され得る。最初に影響を受けた関節における腫脹の程度は、ノギスを使用して肢の太さを測定することによりモニターされ得る。両方のモデルにおいて、血清は、溶血アッセイならびに例えば、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ－９などの活性化の補体マーカーの測定のため、マウスから採取され得る。別の例では、霊長類モデルが、ＲＡ処置のため入手可能である。圧痛のあるおよび腫脹した関節の応答は、ｕ－ＰＡポリペプチドを用いて処置した対象およびｕ－ＰＡポリペプチド処置を評価するための対照においてモニターされ得る。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、免疫複合体（ＩＣ）媒介性急性炎症性組織損傷を処置することができる。ＩＣ媒介性損傷は、組織におけるＩＣ蓄積に対する局所的免疫応答により引き起こされる。結果として生じる炎症応答は、浮腫、好中球増加症、出血、および最後に組織壊死により特徴付けられる。ＩＣ媒介性組織損傷は、インビボでのアルサス（ＲＰＡ）反応において研究することができる。簡単に言うと、ＲＰＡ反応において、過剰な抗体（例えば、ウサギＩｇＧ抗ニワトリ卵アルブミンなど）が、例えば、対応する抗原（すなわち、ニワトリ卵アルブミン）を用いて既に静脈内注入されたラットまたはモルモットなどの動物の皮膚に注射される［Szalai et al. (2000) J Immunol 164:463］。ＲＰＡ反応の開始の直前に、ｕ－ＰＡポリペプチド、またはボーラス対照は、右大腿静脈を介した静脈内注射により、対応する抗原と同時に投与することができる。あるいは、ｕ－ＰＡポリペプチドは、抗原注射の直後および抗体の皮膚注射の直前に始まる、ＲＰＡ反応の最初の時間に、投与することができる。補体依存性ＩＣ媒介性組織損傷の生成に対するｕ－ＰＡポリペプチドの効果は、血清溶血活性を決定するために血液を集めること、および病変サイズの定量化のため感染した範囲の皮膚を回収することにより、ＲＰＡの開始の様々な時間に評価することができる。
本明細書において記載されるものなどの、治療ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、敗血症および致死的ショックをもたらし得る重篤な敗血症を処置することができる。補体媒介性致死的ショックのモデルを使用して、治療剤としてのｕ－ＰＡポリペプチドの効果を試験することができる。このような一例において、ラットは、微量のリポ多糖類（ＬＰＳ）を用いて刺激され、続いて、補体の膜阻害剤に対する（抗Ｃｒｒｙ） モノクローナル抗体が投与され得る［Mizuno et al. (2002) Int Arch Allergy Immunol 127:55-62］。ｕ－ＰＡポリペプチドまたは対照は、ＬＰＳ刺激前、ＬＰＳ刺激後、または抗Ｃｒｒｙ投与後などの、致死的ショックの開始経過中の任意の時間で投与することができ、致死的ショックからのラットの救出を評価することができる。
ｂ．神経変性疾患
補体活性化は、アルツハイマー疾患（ＡＤ）の進行を悪化させ、ＡＤ脳における神経突起の喪失に関与する。本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、ＡＤを処置することができる。ＡＤの神経病理学的および行動特色の一部を模倣するマウスモデルを使用して、ｕ－ＰＡポリペプチドの治療効果を評価することができる。トランスジェニックマウスモデルの例としては、活動的プロモーターの制御下でマウスに疾患を生じる変異を用いてヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）またはプレセニリン１（ＰＳ１）タンパク質を導入することが挙げられる。これらのマウスは、ベータ－アミロイドプラークおよび変性神経突起の増大を含む、ＡＤの特徴を発症する。ＡＰＰおよびＰＳ１変異タンパク質についての二重トランスジェニックマウスは、多数の繊維性ベータ－アミロイドプラークを発症し、プラークに関連する活性化グリアおよび補体因子を示す。ｕ－ＰＡポリペプチドは、毎日の腹腔内または静脈内注射などにより、投与することができ、症状の経過および進行は、対照動物と比較して、モニターされる。
ｃ．心血管疾患
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、心血管疾患を処置することができる。ｕ－ＰＡポリペプチドは、脳卒中、心筋梗塞、心肺バイパス術、冠動脈バイパス術、血管形成術、または血液透析から生じる虚血性再灌流損傷を含む、心血管疾患の処置において使用することができる。ｕ－ＰＡポリペプチドはまた、組織損傷に関与し得る心肺バイパス術に関連する炎症応答の処置において使用することができる。一般に、ｕ－ＰＡポリペプチドは、補体媒介性虚血性再灌流損傷を誘導する処置もしくは現象の前、随伴性に、または後に投与することができる。一例では、ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、血管形成術の冠動脈バイパス術などの、現象を誘導する補体媒介性虚血により、対象の処置前に、対象に投与することができる。
虚血性再灌流損傷の処置に対するｕ－ＰＡポリペプチドの効果は、損傷の動物モデルにおいて評価することができる。このような一モデルにおいて、心筋虚血は、３－０のシルク構造物を、始まりから５～８ｍｍの左前下行枝（ＬＡＤ）冠動脈周囲に置くこと、および血管が完全に閉塞されるように、結紮糸を縛ることにより、それらの前側の心膜において作製した切開を有していたウサギにおいて誘導される［Buerke et al. (2001) J Immunol 167:5375］。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドなどのｕ－ＰＡポリペプチド、または食塩水などの対照媒体は、冠動脈閉塞の５５分後（すなわち、再灌流の５分前）に、ボーラスとして増大する用量で静脈内付与され得る。５分後（すなわち、虚血の計６０分後）、ＬＡＤ結紮糸はほどかれ、虚血心筋は、３時間、再灌流され得る。再灌流期間の終わりに、ＬＡＤ周囲の結紮糸は縛られる。虚血損傷に対するｕ－ＰＡポリペプチドの効果は、心筋の壊死、血漿クレアチニンキナーゼレベル、ならびに例えば、ミエロペルオキシダーゼ活性およびスーパーオキシドラジカル放出などの好中球活性化のマーカーに対する効果を評価することにより、解析することができる。
６％ヒト血漿を含有するクレブス・ヘンゼライトバッファを用いた単離マウス心臓の再灌流の際に持続した補体媒介性心筋損傷の別のモデルにおいて、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを用いた処置を使用して、組織損傷を心臓に限定することができる。このような例において、心臓を灌流するために使用されるバッファは、変動する用量の改変ｕ－ＰＡポリペプチドが添加され得る。再灌流した心臓を、ヒトＣ３およびＣ５ｂ－９の蓄積、冠動脈灌流圧、拡張終期圧、および心拍数についてアッセイすることができる。
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、大抵、バイパスに従い、組織損傷に関与し得る炎症免疫応答を阻害するための心肺バイパス術（ＣＰＢ）または冠動脈バイパス術の前、または後に、治療として使用することができる。体外のバイパス回路における全血のインビトロでの再循環を使用して、血小板および白血球変化ならびにＣＰＢにより誘導される補体活性化を刺激することができる［Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564］。かかるモデルにおいて、変動する用量での、ｕ－ＰＡポリペプチドまたは対照バッファを、体外の回路に血液を添加する直前に、健常ドナー由来の血液およびブタヘパリンを既に含有する導入パックに加えることができる。血液試料を、再循環の５、１５、３０、４５、６０、７５、および９０分後に採取することができ、例えば、Ｃ５ａ、Ｃ３ａ、および／もしくはｓＣ５ｂ－９について測定するための溶血アッセイならびに／または補体活性化アッセイなどの、補体研究のためアッセイすることができる。体外の回路へ添加の前に採取した前処理血液試料を、対照として使用することができる。血液試料のフローサイトメトリーを行って、例えば、ＣＤ１１ｂおよびＰ－セレチンレベルなどの血中の循環白血球（すなわち、好中球）の集団上の接着分子のレベルを決定することができる。
ｄ．加齢黄斑変性（ＡＭＤ）
本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を処置することができる。プロテアーゼを用いて処置することができる加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、湿潤性ＡＭＤ、乾燥性ＡＭＤおよび地図状萎縮を含む。
ヒト障害の特徴の多くを模倣するＡＭＤの多数の動物モデルが、利用可能である［Pennesi et al. (2012) Mol. Aspects Med. 33(4):487-509)］。補体経路遺伝子における変異は、ＡＭＤに対する感受性を増大させるか、または減少することが示された［Edwards et al. (2005) Science 308(5720):421-424; Hageman et al. (2005) Proc. Nat. Acad. Sci 102(20): 7227-7232; Klein et al. (2005) Science 308(5720):385-389］。例えば、Ｃ３ｂと通常相互作用する、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）において、一塩基多型Ｙ４０２Ｈは、Ｂ因子とのＣ３ｂの結合を妨げ、これにより、Ｃ３形成の阻害を導く。Ｙ４０２Ｈは、人におけるＡＭＤのリスクの増大に関連し、変異は、ＡＭＤ患者の４３～５９％において既に同定されている［Haines et al. (2005) Science 308(5720): 419-421; Thakkinstian et al. (2006) Hum. Mol. Genet. 15(18): 2784-2790; Zareparsi et al. (2005) Am. J. Hum. Genet. 77(1): 149-153］。
一般に、ＣＦＨを作る能力を欠く、改変マウスは、網膜の異常、視覚の鋭敏さの減少および補体蓄積を含む、ＡＭＤの特徴を発症する［Coffey et al. (2007) Proc. Nat. Acad. Sci. 104:16651-16656］。補体タンパク質Ｂ因子における変異［Montes et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. 106(11): 4366-4371］、Ｃ２因子における変異［Gold et al. (2006) Nat. Genet. 38(4): 458-462］、およびＣ３因子における変異［Maller et al. (2007) Nat. Genet. 39(10): 1200-1201; Yates et al. (2007) New Engl. J. Med. 357(6): 553-561］は、様々な補体タンパク質の発現および／または活性に対するそれらの衝撃に基づき、ＡＭＤを発症するリスクの増大または減少に関連する［Reynolds et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50(12): 5818-5827］。
本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡプロテアーゼなどの、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼは、補体タンパク質Ｃ３の切断についてｕ－ＰＡプロテアーゼの基質特異性または選択性などの活性が変更される場合、治療として使用することができる。本明細書において提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを、例えば、月に２回、硝子体内もしくは網膜下、または網膜内注射により投与し、症状の経過および進行は、対照動物または対象と比較して、モニターされる。疾患を悪化させ得る補体成分のレベルはまた、溶血アッセイにおいて血清補体活性をアッセイすることにより、ならびに例えば、Ｃ１、Ｃ３およびＣ９などの補体成分の蓄積についてアッセイすることにより、測定することができる。
補体活性化は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）における疾患の進行において役割を果たす［例えば、Bradley et al. (2011) Eye 25:683-693; Gemenetzi et al. (2016) 30:1-14を参照のこと］。改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、ＡＭＤを処置することができる。例えば、ｕ－ＰＡポリペプチドまたは本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドなどのｕ－ＰＡポリペプチドを含有する医薬組成物は、硝子体内、または網膜内、または網膜下、または眼周囲に注射することができる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、月に２回などの、例えば、毎月以下の頻度などの、毎日または毎週以下の頻度で投与することができる。ＡＭＤのため、毎月投与する、目における長期間さらに「改変され」（例えば、融合タンパク質、ＰＥＧ化など）ない改変ｕＰＡポリペプチドは、可能性がある（月に２回の投与も企図される）。適当な「改変」後、３ヵ月毎（またはそれ未満の頻度）は可能であり得る。改変ｕ－ＰＡポリペプチドを、ＰＥＧ化などにより改変して、効力のある免疫原性を低減し、および／または血清半減期を増大させることができる。ＡＭＤのため、毎月投与するまたは月に２回投与する、目における長期間さらに改変（例えば、融合タンパク質、ＰＥＧ化）されない改変ｕＰＡポリペプチドを使用する。ＰＥＧ化などにより改変された場合、投与は、３ヵ月毎以上でもたらすことができる。
ｅ．臓器移植
臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）
本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、例えば、腎臓移植レシピエントにおける虚血性再灌流損傷の結果としてのＤＧＦなどを含む、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）を処置することができる。ｕ－ＰＡポリペプチドをまた、組織損傷に関与し得る臓器移植に関連する炎症応答の処置において使用することができる。一般に、ｕ－ＰＡポリペプチドを、補体媒介性虚血性再灌流損傷を誘導する処置または現象の前、随伴性に、または後に投与することができる。一例では、ｕ－ＰＡポリペプチドを、例えば、腎臓移植または腎臓同種移植片などの現象を含む、補体媒介性虚血損傷により、対象の処置前に対象に投与することができる。臓器移植後臓器機能障害、例えば、虚血性再灌流損傷の結果としての臓器移植後臓器機能障害の処置に対するｕ－ＰＡポリペプチドの効果を、ヒト腎臓同種移植片または移植において示した特徴を模倣する、損傷の動物モデルにおいて評価することができる。
尿細管上皮細胞損傷のバイオマーカーを含む、ＤＧＦを導く早期移植片機能障害の早期バイオマーカーの存在は、治療の必要性を示し得る。ＤＧＦのバイオマーカー（すなわち、血清クレアチニン）が同定されている［Malyszko et al. (2015) Nature Scientific Reports 5:11684; Wanga et al. (2015) PLoS One 10(9):e0136276］。ＤＧＦについてのバイオマーカーの早期検出および例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドと用いた治療処置などの治療介入は、臨床結果を改善し得る。
補体活性化は、臓器移植、例えば、腎臓移植後の臓器移植後臓器機能障害などの障害における疾患の進行をモジュレートする［Yu et al. (2016) Am J of Transplantation 16(9):2589-2597］。改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、ＤＧＦを処置することができる。例えば、ｕ－ＰＡポリペプチドは、全身デリバリーのため投与することができるか、または移植片もしくは周囲組織に直接注入することができる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、移植前、中または後に投与することができる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、月に２回などの毎月以下の頻度などの、毎日または毎週以下の頻度で投与することができる。場合によっては、単回全身用量の改変ｕ－ＰＡポリペプチドを投与する。数時間かけた改変ｕ－ＰＡポリペプチドの複数回の注入も考慮する。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、慢性的にデリバリーすることができ、必要に応じて、例えば、本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドなどの、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを、毎日のように、または別のスケジュールでデリバリーして、同種移植片レシピエントにおいて有効量を維持することができる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、レシピエントにおける同種移植片生存、特に、同種移植片の慢性的な生存を延長することができる。ＰＥＧ化ｕ－ＰＡポリペプチドを使用して、免疫原性を低減することができる。
３．併用療法
本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチドは、疾患および状態を処置するため他の既存の薬物および治療剤と併用して使用することができる。このような処置は、他の抗炎症薬および／または治療剤と併せて行うことができる。併用療法に有用な抗炎症薬および剤の例としては、アスピリンなどのサリチル酸塩を含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトロプロフェン、ナブメトン、ピロキシカム、ジクロフェナク、またはインドメタシンなどの古典的ＮＳＡＩＤ、およびセレコキシブ（登録商標Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）下で販売される）またはＲｏｔｅｃｏｘｉｎ（登録商標Ｖｉｏｘｘ（登録商標）の下で販売される）などのＣｏｘ－２選択性阻害剤が挙げられる。併用療法に有用な他の化合物は、メトトレキサートおよびレフルノミドなどの代謝拮抗薬、コルチゾン、デキサメタゾン、またはプレド二ゾンなどのコルチコステロイドまたは他のステロイド、アセトアミノフェンなどの鎮痛剤、メサラミンなどのアミノサリチル酸塩、ならびにアザチオプリン（登録商標Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）の下で販売される）、シクロホスファミド（登録商標Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）の下で販売される）、およびシクロスポリンＡなどの細胞傷害剤を含む。併用療法において使用することができる追加の剤は、生物学的応答改変剤を含む。生物学的応答改変剤は、エタネルセプト（登録商標Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）の下で販売される）、インフリキシマブ（登録商標Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）の下で販売される）、またはアダリムマド（登録商標Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）の下で販売される）などのＴＮＦ－アルファの阻害剤、およびアナキンラ（登録商標Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）の下で販売される）などのＩＬ－１の阻害剤を含む、炎症促進性サイトカイン阻害剤を含み得る。生物学的応答改変剤はまた、ＩＬ－１０などの抗炎症サイトカイン、抗ＣＤ２０抗体（登録商標Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）の下で販売される）などのＢ細胞標的化剤、Ｔ抗原標的化化合物、接着分子遮断剤、ケモカイン受容体アンタゴニスト、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、または核因子（ＮＦ）κＢ（ＮＦκＢ）に対する阻害剤などのキナーゼ阻害剤、およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体－ガンマ（ＰＰＡＲ－γ）リガンドを含み得る。併用療法において使用することができる追加の剤は、免疫抑制剤を含む。免疫抑制剤は、タクロリムスもしくはＦＫ－５０６；ミコフェノール酸；カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）；ＣｓＡ；シロリムスまたは免疫系を抑制することが知られている他の剤を含み得る。
本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチドはまた、例えば、補体媒介性虚血性再灌流損傷に関連する炎症状態に関与する、本明細書において記載されるものなどの、心血管疾患を処置するために投与する、および／または心血管疾患を処置するための手法中に投与する剤と併せて使用することができる。例えば、提供するｕ－ＰＡポリペプチドは、血液凝固薬と併せて投与することができる。代表的な抗血液凝固薬の例としては、ヘパリン、ワーファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩、ならびにアルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランなどの直接的トロンビン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチドはまた、ＤＧＦを処置するために投与する剤と併せて使用することができる。本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチは、例えば、免疫抑制性剤と併せて投与することができる。このような組合せは、レシピエントにおける同種移植片生存、特に、同種移植片の慢性的生存の延長に有用である。好ましい実施形態では、同種移植片のレシピエントへの慢性投与に適当であるように、組合せを製剤化し、調製し、例えば、適当な製剤を利用する。ある特定の実施形態では、同種移植片のレシピエントへの改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび免疫抑制薬の同時投与に適当であるように、組合せを製剤化し、調製する。ある特定の実施形態では、同種移植片のレシピエントへの改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよび免疫抑制薬の連続（いずれかの順で）投与に適当であるように、組合せを製剤化し、調製する。
本明細書において提供されるｕ－ＰＡポリペプチドはまた、黄斑変性症を処置するために投与する他の剤と合わせて使用することができる。例えば、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）の下で販売される）；ベバシズマブ（商品名 Ａｖａｓｔｉｎ（商標）の下で販売される）；ペガプタニブナトリウム（商品名 Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）の下で販売される）；アフリベルセプト（商品名 Ｅｙｌｅａ（商標）の下で販売される）；およびベルテポルフィン（商品名 Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（商標）の下で販売される）の任意の１つまたは複数と共に投与することができる。本明細書において提供されるＵ－ＰＡポリペプチドはまた、単独または治療ベルテポルフィンと併せた、移植可能なテレスコープ、レーザー処置もしくはレーザー光凝固術、外科手術、および／または光線力学的療法と併せて使用して、黄斑変性症を処置することができる。
他の補体阻害剤などの追加の剤を、本明細書において記載される改変ｕ－ＰＡポリペプチドとの併用療法における抗炎症薬として使用することができる。このような他の補体阻害剤の例としては、コブラ毒因子（ＣＶＦ）、ヘパリン、硫酸デキストラン、ポリビニル硫酸、ポリリジン、またはスラミンなどのポリアニオン分子、Ｋ－７６ＣＯＯＨ、ロスマリン酸、または漢方薬マオウの抽出物などの天然分子、ナファモスタットメシル酸塩（ａｆａｍａｓｔａｔ ｍｅｓｉｌａｔｅ）（ＦＵＴ－１７５）、Ｃ１ｓの合成阻害剤（Ｃ１ｓ－ＩＮＨ－２４８）、またはＣ１ｓおよびｆＤに対する阻害剤（ＢＣＸ－１４７０）などの合成分子、コンプスタチンなどのペプチド阻害剤、抗Ｃ５（Ｎ１９－８）、ヒト化抗Ｃ５（ｈ５Ｇ１．１）、抗Ｃ６、または抗Ｃ８抗体などの補体の抗体阻害剤、および可溶性ＣＲ１（ｓＣＲ１）、可溶性ＤＡＦ（ｓＤＡＦ）、可溶性ＭＣＰ（ｓＭＣＦ）、または可溶性ＣＤ５９（ｓＣＤ５９）などの膜補体調節因子の可溶性形態が挙げられる［Morgan et al. (2003) Mol Immunol. 40:159］。
本明細書において記載されるｕ－ＰＡポリペプチドを含有する医薬組成物を使用して、補体活性化が介在する任意の１つまたは複数の炎症疾患または状態を処置することができる。炎症疾患または状態を処置するための、ｕ－ＰＡポリペプチドの組合せ、および別の処置または化合物も提供される。ｕ－ＰＡポリペプチドおよび抗炎症剤は、一緒、または連続した、または断続的な投与のため別々の組成物としてパッケージすることができる。あるいは、それらは、投与用の単一組成物として、または単一組成物としての投与用の２つの組成物として提供することができる。組合せは、必要に応じて、追加の試薬、使用についての指示書、バイアルおよび他の容器、シリンジならびに改変ｕ－ＰＡポリペプチドの使用のための他のアイテムと共に、キットとしてパッケージすることができる。
Ｉ．実施例
下記の実施例は、単なる説明の目的で含まれるものであり、本発明の範囲を限定するとは意図されない。
改変ｕ－ＰＡポリペプチドのクローニングおよび発現、ならびにＱＨＡＲ／ＡＳ部位でＣ３を切断する改変ｕ－ＰＡポリペプチドに関するスクリーニング
Ａ．ｕ－ＰＡのクローニング
ヒトｕ－ＰＡポリペプチド（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７４９；配列番号１に示される）のキモトリプシンナンバリングによるＣ１２２Ｓ突然変異を有するアミノ酸１７９～４３１をコードする核酸（配列番号５に示される）を、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タグに対してＣ末端でｐＥ－ＳＵＭＯ－ＡＭＰ発現ベクターにクローニングした。コンストラクトには、シグナルペプチド（アミノ酸１～２０）およびプロテアーゼドメイン（アミノ酸１７９～４３１）が含まれた。
Ｂ．改変ｕ－ＰＡポリペプチドの生成
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、プライマーとして機能を果たして、設計した突然変異を、新たに合成したＤＮＡに取り込ませる、特異的に設計したオリゴヌクレオチドを用いて、製造業者の使用説明書に従って、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって生成された。鋳型としての野生型ｕ－ＰＡ ＤＮＡおよび所望の突然変異を含有するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを含有するＰＣＲ反応を設定した。ＰＣＲ後、反応産物をそれぞれ、ＤｐｎＩで消化して、ＤＮＡのｄａｍメチル化親鎖を除去した。続いて、ＤＮＡを、大腸菌ＸＬ－１ Ｂｌｕｅ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換して、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンを含有する選択的寒天上に蒔いた。プラスミドＤＮＡを、選択したクローンから単離して、配列決定して、ｕ－ＡＰコードＤＮＡ内の選択した位置での意図される突然変異の取込みおよび任意のさらなる望ましくない突然変異が存在しないことを検証した。
Ｃ．ｕ－ＰＡポリペプチドの調製
１．形質転換
野生型および変異体ｕ－ＰＡポリペプチドそれぞれをコードするＤＮＡを、上記セクションＡで詳述されるように、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タグおよびプロドメインに対してＣ末端でｐＥ－ＳＵＭＯ－ＡＭＰ発現ベクターにクローニングして、得られたコンストラクトを、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２３０１３２）に形質転換した。化学的にコンピテントなＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞およそ５０μＬを、適切なプラスミドＤＮＡ（通常、総ＤＮＡ １ｐｇ～５０ｎｇを含有する）０．５μＬで形質転換した。細胞およびＤＮＡを、氷上で３０分間インキュベートして、続いて、細胞を４２℃で４５秒間、熱ショックを与えて、氷上で２分間、さらにインキュベートした。室温のＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号１００２１９－８６６）４５０μＬを混合物に添加して、細胞を、ＴＢ培地中で１時間、３７℃にて２４０ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。この形質転換混合物２０μＬを、Ｔｅｋｎｏｖａの２ｘＹＴ培地＋１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンプレート（Ｃａｔ＃：Ｙ４４２０）上に広げて、３７℃で一晩インキュベートした。
２．ｕ－ＰＡポリペプチドの発現
所望のｕ－ＰＡポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する細胞（通常、上記の形質転換プロセスからの単一の「確認された」コロニーから得られる）を、カルベニシリン５０μＬ、２０％ラクトース溶液０．３ｍＬ、リン酸緩衝剤５ｍＬ、およびベースＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ０３５０）４５ｍｌを組み合わせることによって調製された培地およそ５０ｍＬ中で成長させた。細胞および成長培地を、Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｓｈａｋｅｒにおいて、３７℃にて４００ｒｐｍで回転させた。成長の１８～２２時間後、Ｆｉｂｅｒｌｉｔｅ Ｆ１３－１４ｘ５０ｃｓ遠心分離ローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ６ Ｐｌｕｓ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）において、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ遠心チューブ中で、４℃で１０分間、７，０００ｒｐｍでの遠心分離によって、細菌をペレット化した。遠心分離後、上清をデカンテーションした。
培養体５０ｍＬからの細胞ペレットを、細胞溶解緩衝剤Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）１０ｍｌ中に再懸濁させた。細胞ペレットは、３７℃で１時間、２４０ｒｐｍで振盪することによって、緩衝剤Ａ中に再懸濁させた。得られた混合物を、７，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離に付して、上清をデカンテーションした。得られたペレットを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）２０μＬを含有するＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）抽出試薬（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＮＣ９５９１４７４）１０ｍｌ中に再懸濁させた。３７℃で１時間、２４０ｒｐｍでボルテックスおよび振盪することによって、細胞を再懸濁させた。振盪後、残存する不溶性材料を、４℃で１５分間、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレット化して、上清をデカンテーションした。得られたペレットを、Ｐｏｗｅｒ Ｇｅｎ ５００ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４－２６１－０４Ｐ）を使用して、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００］１０ｍｌ中で均質化させることによって再懸濁させた。懸濁させたｕ－ＰＡポリペプチド封入体（ＩＢ）を含有するこの混合物を、４℃で１５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離して、上清を廃棄した。新たなペレットを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０））１０ｍＬ中に再懸濁させて、ペレットが良好に分散されるまで、繰り返し均質化した。得られた混合物を再び、４℃で１５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離して、上清をデカンテーションして、ペレットを１０～１５分間、風乾させた。ｕ－ＰＡポリペプチド封入体（ＩＢ）のこのペレットは、－２０℃で保管され得るか、または以下に記載されるアンフォールディングおよびリフォールディングに即座に使用され得る。
３．ｕＰＡのアンフォールディング
不溶性ＳＵＭＯ－ｕ－ＰＡポリペプチド融合タンパク質封入体を、アンフォールディング緩衝剤［６Ｍ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号：Ｇ０３８０）］５ｍＬ中で溶解および変性させた。新鮮に調製したＤＴＴを、リフォールディング手順の当日に最終濃度１０ｍＭになるように添加した。このＩＢ溶液を、３７℃で少なくとも１時間（通常、２時間）、または封入体が完全に溶解するまで、２４０ｒｐｍで撹拌した。完全に溶解したＩＢ溶液は透明であるが、茶色がかった色合いを示し得る。
４．ｕ－ＰＡのリフォールディング
上記のアンフォールディングされたｕ－ＰＡポリヌクレオチドの５ｍｌ溶液を、２．５ｍｌの２つのアリコートに分割して、各アリコートを、リフォールディング緩衝剤［１．５Ｍアルギニン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＧＳＨ（Ｌ－グルタチオン還元型、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および４．０ｍＭ ＧＳＳＧ（Ｌ－グルタチオン酸化型、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）］２００ｍｌに添加する。リフォールディング緩衝剤中にｕ－ＰＡポリペプチドを含有するこの溶液を、室温で２４時間、１５０ｒｐｍにて振盪機上でインキュベートして、フォールディングを起こさせた。
得られたタンパク質溶液を、長さがおよそ３５ｃｍの１２，０００～１４，０００ダルトン分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）再生セルロース透析チューブ（ＶＷＲ）に移して、２５ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．１中で透析した。試料は、少なくとも一晩、より典型的には、数日間、透析した。ほんの１日間透析した試料は、室温でインキュベートして、１日より多く透析した試料は、４℃でインキュベートした。総試料容量に対する、総透析緩衝剤容量の最適比は、少なくとも１００であった。より低い比は通常、より低い収率の適正にフォールディングされたｕ－ＰＡポリペプチドをもたらした。透析後、プロテアーゼ試料は、透析チューブから除去されて、５００ｍＬの０．２２μｍのフラスコ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過された。
４．酵素前駆体のカラム精製
次に、タンパク質溶液を、スルホプロピルセファロースファストフロー（ＳＰＦＦ）系を使用して精製した。ＳＰＦＦ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗスラリー（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）６ｍＬ（樹脂およそ３ｍＬとともに）を、各Ｅｃｏｎｏカラム（ＢｉｏＲａｄ）に添加することによって、カラムを準備して、保管溶液を、樹脂から排出させた。続いて、２５ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．１、１Ｍ ＮａＣｌ １０ｍＬを、樹脂を含有するカラムに添加して、溶液を流した。次に、２５ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．１ １０ｍＬを、樹脂を含有するカラムに添加して、溶液を通した。樹脂カラムの底にキャップをして、２５ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．１緩衝剤 １０ｍＬを添加して保管して、樹脂を平衡化させた。
リフォールディングおよび透析したｕ－ＰＡポリペプチド試料溶液を、平衡化したＳＰＦＦカラムに適用させた後、２５ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６．１、５０ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍｌを適用させた。次に、活性化されていないｕ－ＰＡポリペプチド酵素前駆体を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ ４ｍｌで溶出させて、それを、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに収集した。続いて、試料を、総容量１２ｍｌになるように、２５ｍＬ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で希釈した。
５．ｕ－ＰＡ酵素前駆体の活性化
精製されたｕ－ＰＡポリペプチド酵素前駆体を含有する試料１２ｍｌを、活性化緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２０ｍＭベンズアミジン）１２ｍｌの添加によって希釈した。次に、ｕ－ＰＡポリペプチド酵素前駆体を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳＵＭＯプロテアーゼユビキチン様特異的プロテアーゼ－１（ＵＬＰ－１）を用いて、対応する活性なｕ－ＰＡプロテアーゼに変換させた。ｕ－ＰＡポリペプチド酵素前駆体の「活性化」は、ＵＬＰ－１ １２０μｇを、精製された酵素前駆体に添加することと、溶液を手短に回旋することと、試料を室温で一晩インキュベートすることとによって遂行された。
６．活性化されたｕ－ＰＡポリペプチドの精製
活性なｕ－ＰＡポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィを使用して精製された。クロマトグラフィの前に、試料を、５０ｍｌのフィルターユニットを用いて濾過した。Ｖｉｖａｐｕｒｅ Ｑスピンカラムは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ ５ｍｌおよび２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ １０ｍｌで予め調整した後、Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ ＲＴ遠心機において５００ｇで５分間、遠心分離した。
活性化されたｕ－ＰＡポリペプチドを含有する試料をそれぞれ、１９ｍＬのバッチで、個々のＱ－スピンカラム上に負荷して、それぞれの実行に関して、５００ｇで５分間、遠心分離した。ＳＵＭＯタグおよび酵素前駆体を有さない活性化されたｕ－ＰＡを含有するフロースルーを収集した。２５ｍＭクエン酸、ｐＨ＝５．０ １２ｍｌおよび１Ｍクエン酸 ６０μｌを添加することによって、得られたｕ－ＰＡ試料のｐＨを調整した。次に、得られたタンパク質溶液を、予め調整したＶｉｖａｐｕｒｅ Ｓスピンカラム上に負荷した。このカラムを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ ５ｍｌおよび２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ １０ｍＬで予め調整した後、５００ｇで５分間、カラムを遠心分離した。試料を、１９ｍｌのバッチでＳ－カラム（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷して、カラムを５００ｇで５分間、遠心分離した。このプロセスからのフロースルーを廃棄した。続いて、２５ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ５．０、２０ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍｌで、カラムを「洗浄」する。カラムを洗浄した後、収集チューブを、希釈緩衝剤５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０ ７ｍｌを含有する新たなチューブと交換する。次に、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、２５０ｍＭ ＮａＣｌ ７ｍｌを用いて、ｕ－ＰＡポリペプチドをカラムから溶出させる。続いて、ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する溶出物（ｅｌｕｔｅ）を濃縮して、６０μＭ以上の最終濃度（２．６以上のＡ２８０）を達成するように、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを使用して、クエン酸緩衝食塩水（ＣＢＳ；２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）に「緩衝剤交換」する。溶液の光学密度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐデバイスを使用して測定した。調製物の品質は、最初にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰを含有する１Ｘ試料緩衝剤中のｕ－ＰＡポリペプチド試料２μｇを、１２ウェル４～１２％ＰＡＧＥ ＮｏｖｅｘＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルの各「レーン」上に載せ、１ＸＭＥＳランニング緩衝剤中で、２００Ｖで４０分間流した。クマシーブルーを用いてゲル染色することによって、タンパク質を「可視化」した後、脱染した。およそ２５ｋＤａで移動する単一バンドを含有する画分を、液体窒素中で急速冷凍して、使用するまで－８０℃で保管した。個々のｕ－ＰＡポリペプチド試料の品質は、活性アッセイおよび質量分析によってさらに評価した。
Ｄ．Ｃ３を切断して、それを不活性化させる改変ｕ－ＰＡポリペプチドの選択および同定
改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、例えば、米国特許第８，２１１，４２８号（米国特許出願公開第２０１４－０２４２０６２－Ａ１号も参照されたい）に記載されるように、改変セルピン（ＰＡＩ－１）に対して改変ｕ－ＰＡポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。セルピンと、プロテアーゼとの間に共有結合性アシル酵素中間体を形成することが可能な阻害性セルピン、またはその断片を、スクリーニングに使用する。一般的に、使用されるセルピンは、インビボで通常、プロテアーゼを標的とするものである。アッセイにおいて、標的配列（即ち、Ｃ３における活性部位）を含むように反応性部位ループ（ＲＳＬ）の置換によって改変されたセルピンは、標的部位を切断して、安定な複合体を形成する改変プロテアーゼを捕捉する。次に、捕捉された改変プロテアーゼを単離／同定する。ｕ－ＰＡに関して、その阻害剤であるＰＡＩ－１、ＰＡＩ－２、ＰＡＩ－３、特にＰＡＩ－１は、同族セルピンである。以下に示した残基を、ヒトＣ３の活性部位であるＱＨＡＲＡＳＨＬＧ（Ｃ３の残基７３７～７４５、配列番号４７）で置換することによって、セルピンＰＡＩ－１を改変した。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは全て、Ｃ３の活性部位内で切断するように選択された。特に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは全て、ＲとＡとの間で切断する。
Ｑ Ｈ Ａ Ｒ ↓ Ａ Ｓ Ｈ Ｌ
挿入された配列ＱＨＡＲＡＳＨＬＧ（Ｃ３における不活性化切断部位に対応する（配列番号４７の残基７３７～７４５））を有するＡＴＩＩＩ「ベイト」（以下）：
Figure 2022516725000021
上記改変ＰＡＩ－１における突然変異は、以下の通りである：
Figure 2022516725000022

以下の実施例２における表１４は、突然変異について示しており、突然変異を含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドの例示的なプロテアーゼドメインに関する配列番号を提供する。ナンバリングは、キモトリプシンナンバリングである。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、示した突然変異で、Ｃ３を不活性化するように生成および選択された。配列番号はプロテアーゼドメインについて言及する一方で、突然変異は、前駆、完全長および成熟の改変ｕ－ＰＡポリペプチドにおいて含まれ得ることが理解されよう。Ｃ１２２Ｓ置換、またはＳに関する他の保存された置換は、凝集を低減するように含まれ、有利であるが、それは任意である。遺伝子療法に関する、またはペグ化に関する使用のための改変ｕ－ＰＡに関して、Ｃ１２２Ｓ置換は、改変ｕ－ＰＡにおいて、またはコード核酸において含まれない。Ｃ１２２は、ペグ化部分または他の改変のコンジュゲート用の部位として機能を果たし得る。インビボで発現される場合、凝集は一般的に重要ではない。また、それに対して、活性形態は、ジスルフィド結合によって連結されている二本鎖形態であり、一般的には、残基１２２における遊離Ｃｙｓは、それがジスルフィド結合を形成するのに利用可能であるように、Ｓｅｒには改変されない。
補体タンパク質Ｃ３のインビトロ切断
Ｃ３の不活性化切断に関する、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、基質補体タンパク質ヒトＣ３と、様々な濃度の各改変プロテアーゼとの３７℃で１時間のインキュベーション後に残存する無傷のヒトＣ３の量を測定することによって決定された。このアッセイによれば、シグナルは、無傷のヒトＣ３の存在下で生成されて、Ｃ３が切断されると失われる。
２μＭ血漿精製ヒトＣ３（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する緩衝剤中で、改変ｕ－ＰＡポリペプチド（０～２５０ｎＭ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、最終濃度１０μＭになるようにＥＧＲ－ＣＭＫ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＧＲＣＫ－０１）の添加によってクエンチされ、ｈＣ３／改変ｕ－ＰＡポリペプチド混合物を、周囲温度で３０分間静置させた。
未消化のヒトＣ３の残留レベルは、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ Ｓｃｒｅｅｎ（商標ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）で販売されている；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して定量化した。１００μｇ／ｍＬのα－マウスＩｇＧでコーティングされたアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃６７６０６０６）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０および０．２％ ＢＳＡ中で５ｎＭマウスα－ｈＣ３ａ ｍＡｂ（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ１１８７２－５０）とともにインキュベートして、アクセプタービーズ混合物を形成した。アクセプタービーズ混合物を光から遮蔽して、回転振盪機に３０～６０分間配置した。ｈＣ３／改変ｕ－ＰＡポリペプチド反応混合物（上記で調製）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．２％ ＢＳＡに１６００倍に希釈して、アリコート４μＬを、３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃６００７２９９）の二重反復ウェルに配置した。α－ｈＣ３ ｍＡｂ／アクセプタービーズ混合物８μＬを、２５ｎＭビオチン化ヤギα－ｈＣ３ ｐＡｂ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ａ２１３からのビオチン化されていない（ｕｎｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）バージョンから、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃２１３２７のＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎキットを使用して調製）８μＬとともにインキュベートした。次に、プレートを光から遮蔽して、周囲温度で３０分間インキュベートした。この後、１００μｇ／ｍＬ ストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃６７６０６０６）４μＬを、各ウェルに添加して、６０分間インキュベートして、光から遮蔽した。続いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、アルファスクリーンシグナル（励起＝６８０ｎｍ、発光＝５７０ｎｍ）を測定した。このシグナル（残存するｈＣ３の濃度［ｈＣ３］に対応する）を、Ａｌｔｅｒａｓｅ（登録商標）濃度（［Ａｌｔｅｒａｓｅ］）の関数としてプロットし、データを、以下の４つのパラメータ方程式にフィッティングさせて、アッセイにおける５０％に至る利用可能なｈＣ３を切断するのに必要とされる改変ｕ－ＰＡポリペプチドの濃度（Ａｌｔｅｒａｓｅ（登録商標）濃度）（ＥＣ５０）、Ｈｉｌｌ勾配（Ｈｉｌｌ）ならびに最大値（Ｍａｘ）および最小値（Ｍｉｎ）シグナルを決定した。
Figure 2022516725000023
プロテアーゼの９個の異なるロットを使用して、突然変異Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ（配列番号２１を参照されたい）を含有するｕ－ＰＡ変異体によるｈＣ３の切断を、総計１３回、独立して測定した。この改変ｕ－ＰＡポリペプチドに対する平均ＥＣ５０値は、１９ｎＭであると決定され（ｎ＝１３、ＳＤ＝２．２）、結果が以下の表１４に報告される実験では、平均ＥＣ５０は、２４．５ｎＭであった。
突然変異を伴うプロテアーゼドメインを含む約６００個の改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、表１４に示される。結果は、以下の表１４に示されている。検査した改変ｕ－ＰＡポリペプチドの大部分は、その多くが、１００ｎＭ未満のＥＤ５０で、Ｃ１２２Ｓ置換を含有する野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインよりも、有意により効率的にヒト補体タンパク質Ｃ３を切断した（即ち、より低いＥＤ５０）。ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼドメインの発現時の凝集を防ぐために、Ｃ１２２Ｓ置換を含む。幾つかの実施形態では、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、二本鎖活性化ポリペプチドを形成するように活性化されている完全長である。こうした実施形態に関して、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインは、Ｃ１２２Ｓ置換（成熟ナンバリングによる２７９）を含まず、システインは、ジスルフィド結合を形成する（成熟ナンバリングによる１４８Ｃと２７９Ｃとの間、配列番号３を参照されたい）。
検査したｕ－ＰＡ変異体の中には、野生型ｕ－ＰＡよりも強力でないもの、特にｈＣ３の切断が１時間のアッセイ中に観察されなかった（即ち、以下の表１４でＮＡとして示される）変異体が存在する。他の低活性変異体は、アッセイ中にｈＣ３の２５％未満を切断し、したがって、ＥＤ５０を割り当てられなかった。これらの結果に基づいて、当業者は、Ｃ３に対する切断活性を増大させる突然変異を選択することができる。
表14
Figure 2022516725000024

Figure 2022516725000025

Figure 2022516725000026

Figure 2022516725000027

Figure 2022516725000028

Figure 2022516725000029


Figure 2022516725000030


Figure 2022516725000031


Figure 2022516725000032


Figure 2022516725000033


Figure 2022516725000034

Figure 2022516725000035


Figure 2022516725000036


Figure 2022516725000037


Figure 2022516725000038


Figure 2022516725000039


Figure 2022516725000040


Figure 2022516725000041


Figure 2022516725000042


Figure 2022516725000043


Figure 2022516725000044


Figure 2022516725000045


Figure 2022516725000046


Figure 2022516725000047


Figure 2022516725000048


Figure 2022516725000049


Figure 2022516725000050


Figure 2022516725000051


Figure 2022516725000052


Figure 2022516725000053


Figure 2022516725000054


Figure 2022516725000055


Figure 2022516725000056


Figure 2022516725000057


Figure 2022516725000058


Figure 2022516725000059


Figure 2022516725000060


Figure 2022516725000061


Figure 2022516725000062


Figure 2022516725000063


Figure 2022516725000064


Figure 2022516725000065


Figure 2022516725000066


Figure 2022516725000067

Figure 2022516725000068


Figure 2022516725000069

Figure 2022516725000070


Figure 2022516725000071


Figure 2022516725000072


Figure 2022516725000073


Figure 2022516725000074



*置換を含有する例示的なプロテアーゼドメインの配列番号
カニクイザル血漿におけるｕ－ＰＡ変異体の抗Ｃ３活性
幾つかの改変ｕ－ＰＡポリペプチドのエクスビボ抗Ｃ３活性を、購入したカニクイザル血漿（ＢｉｏＣｈｅｍｅｄ）において測定した。Ｃ３を切断することに関する改変ｕ－ＰＡポリペプチドのメジアン有効用量（ＥＤ５０）を、ＥＬＩＳＡを使用して算出した。簡潔に述べると、例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチドを、１０００ｎＭから３９．０ｎＭまで１：１．５倍段階希釈した（９点希釈）。１Ｘ ＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水Ｔｗｅｅｎ－２０）中の１％ＢＳＡにおいて、ｈＣ３標準物質を、４５０から３９まで１：１．５倍段階希釈した（７点希釈）。１Ｘ ＰＢＳＴに関するレシピは、下記を含む：
１．蒸留Ｈ２Ｏ ８００ｍｌ中に以下を溶解する
・ＮａＣｌ ８ｇ
・ＫＣｌ ０．２ｇ
・Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ
・ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ
・ｔｗｅｅｎ－２０ ２ｍｌ
２．ｐＨを７．２に調整する
３．さらなる蒸留Ｈ２Ｏを用いて容量を１Ｌに調整する
４．オートクレーブにかけることによって滅菌する。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、およびＣ３の希釈物を含有する緩衝剤中で、８０％カニクイザル硝子体血漿（ＢｉｏＣｈｅｍｅｄから入手）を、最終濃度０．１μＭで改変ｕ－ＰＡポリペプチドとともに、３７℃で１０分間インキュベートした。８０％血漿消化物を、Ｂｉｏｍｅｋ液体ハンドリングシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、１Ｘ ＰＢＳＴ中の１％ ＢＳＡにおいて、１：１５，６２５で希釈した。２．０μｇ／ｍＬの精製Ａ２１３抗体（抗Ｃ４；Ｑｕｉｄｅｌ特産品）でコーティングされた平底ＥＩＡプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を、５０μＬ／ウェルの試料または標準とともにインキュベートして、１ｘ ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡにおける抗ｈＣ３ａ抗体（ａｂ１１８７７２；Ａｂｃａｍ）で検出した。１ｘ ＰＢＳＴ中の１％ ＢＳＡにおいて、１：３０，０００希釈で、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；カタログ番号：１１５－０３５－００３）で、ウェルをさらにコーティングして、検出用のＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ ＥＣＬ（化学発光）ＨＲＰ基質で展開させた。
ＥＤ５０は、Ｃ３の５０％損失をもたらすプロテアーゼの濃度として定義される。結果により、配列番号８～１４および配列番号１６～２０に示される配列を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドの存在下で、Ｃ３の増大した損失（即ち、切断）が示される。配列番号８に示される配列を有するｕ－ＰＡポリペプチドプロテアーゼドメインは、他のものよりも数倍高いＥＤ５０で切断した。結果を以下の表１５に示す。
Figure 2022516725000075

*置換を含有する例示的なプロテアーゼドメインの配列番号
カニクイザル硝子体液中での改変ｕ－ＰＡポリペプチドの抗Ｃ３活性
改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、基質補体タンパク質ヒトＣ３の切断によって評価した。２μＭ精製ヒトＣ３（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）を、購入したサル硝子体液（ＢｉｏＣｈｅｍｅｄ）中で改変ｕ－ＰＡポリペプチド（０～２５０ｎＭ）とともに、３７℃で１時間インキュベートした。次に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、最終濃度１０μＭになるようにウロキナーゼ阻害剤Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇクロルメチルケトン（ＥＧＲ－ＣＭＫ；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＧＲＣＫ－０１）を添加することによってクエンチされ、ｈＣ３／改変ｕ－ＰＡポリペプチド混合物を周囲温度で３０分間、静置した。
未消化のヒトＣ３の残留レベルは、ＥＬＩＳＡを使用して定量化した。置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ、Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ、およびＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ、およびＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓを含有するものを含む、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは全て、配列番号５に示されるＣ１２２Ｓ置換を含有する参照ｕ－ＰＡポリペプチドよりも高いターンオーバー数（１時間当たり）で補体タンパク質Ｃ３を切断した。結果を以下の表１６に示す。
Figure 2022516725000076

*置換を含有する例示的なプロテアーゼドメインの配列番号
カニクイザル硝子体液中での改変ｕ－ＰＡポリペプチドのエクスビボ安定性
改変ｕ－ＰＡポリペプチドのエクスビボ安定性を、購入したカニクイザル硝子体液またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）対照中で評価した。硝子体液中で安定性を示す改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ＡＭＤの処置に使用することができる。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０またはＰＢＳ対照を含有する緩衝剤中の８０％カニクイザル硝子体液（ＢｉｏＣｈｅｍｅｄから入手；カタログ番号ＢＣ７６１５－Ｖ１、ＢＣ６０８１５－Ｖ１、ＢＣ３３１１５－Ｖ６）を、最終濃度０．１μＭで改変ｕ－ＰＡポリペプチドとともにインキュベートした。これらの混合物を、３７℃で７日間インキュベートして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０中の１００μＭ 蛍光発生的基質ＡＧＲ－ＡＣＣ（７－アミノ－４－カルバモイルメチル－クマリン）を用いて、残留プロテアーゼ活性をアッセイした（アッセイの結果は、励起波長＝３８０ｎｍおよび発光波長＝４６０ｎｍで評価した）。結果により、配列番号２１～３３に示される配列を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、カニクイザル血漿およびＰＢＳ中で、同等の活性を示すことが示される。結果を以下の表１７に示す。
Figure 2022516725000077

*置換を含有する例示的なプロテアーゼドメインの配列番号
以下の表１８における抗Ｃ３ ｕ－ＰＡ変異体のエクスビボ安定性を、購入したカニクイザル硝子体液中で、７日間および２８日間の両方のインキュベーション後に評価した。結果により、変異体の幾つかは、２８日のインキュベーション後でさえ、著しい活性を維持することが示される。結果を以下の表１８に示す。
Figure 2022516725000078

*置換を含有するプロテアーゼドメインの配列番号
ヒト血漿におけるエクスビボ薬力学的アッセイ
改変ｕ－ＰＡポリペプチド（プロテアーゼドメイン）を、８０％ヒト血漿とともにインキュベートした後、赤血球を添加して、補体活性の溶血性アッセイにおいて補体タンパク質Ｃ３の切断を評価した。ヒト血漿の存在下で機能的アッセイを実施することは、薬学的に適切な状況で、抗Ｃ３プロテアーゼの活性を検査し、例えば、それらが、ヒトの血中に存在するセルピンまたは他のプロテアーゼ阻害剤による不活性化に対して感受性が高いかどうかを検討する。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、一般的に、ヒト血漿の存在下では阻害されなかった。これは、ＤＧＦ等の疾患および障害および状態の処置にとって重要であり、ここで、例えば静脈内投与されると、投与された改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ヒト血漿に曝露される。それは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、血漿に曝露されない場合、硝子体内または網膜内または網膜下注射によるＡＭＤの処置等の用途にとって、あまり重要ではないか、または重要ではない。
補体活性の５０％阻害が達成されるプロテアーゼの濃度であるＥＤ５０値を測定した。野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号５、Ｃ１２２Ｓを有する）、および様々な例示的な改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを、３μＭから０．１１μＭまで段階希釈して（９点段階希釈１：２）、ＥＤ５０を測定した。希釈したプロテアーゼ溶液４μＬおよびヒト血漿（抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを有する；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）１６μＬを組み合わせることによって、野生型ｕ－ＰＡ（配列番号５）プロテアーゼドメインおよび改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを、０．２ｍＬチューブにおいて、最終濃度の８０％血漿とともにプレインキュベートした。これが、プロテアーゼのさらなる希釈をもたらし、ＥＣ５０プロトコールに関して、最終濃度０．６μＭ～０．００２２μＭプロテアーゼを生じた。プロテアーゼなしの対照（血漿１８μＬおよびＰＢＳＴ ２μＬ）およびバックグラウンド対照（ＰＢＳＴのみ ２０μＬ）もまた、アッセイに含まれた。反応を３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ ７０μＬの添加により、反応混合物を、２０％血漿にまでさらに希釈した。
３．０ｍｌアリコートをペレット化することと、緩衝剤２．７ｍＬを除去することと、残りの０．３ｍｌの緩衝剤中に細胞ペレットを再懸濁させることによって、感作ヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｄｅｘ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を濃縮した。濃縮した感作赤血球を、ウェル１つ当たり１２μＬの容量でポリプロピレン９６ウェルプレートに添加した。６μＬまたは６０μＬのプレインキュベートしたプロテアーゼ／血漿混合物を赤血球に添加して、最終容量１２０μＬ（最終容量になるようにＰＢＳＴを添加）において、それぞれ、最終濃度の１％血漿または１０％血漿を付与した。溶液を、振盪しながら、室温で４５分間インキュベートした。細胞を２０００ｒｐｍで５分間、遠心沈降させて、破壊されてない細胞をペレット化して、上清１００μＬを取り出して、透明な９６ウェルマイクロタイタープレートに配置させた。
溶解させた赤血球からのヘモグロビンの放出を、４１５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を読み取ることによってモニタリングした。ウェル全てからバックグラウンド対照を差し引くこと、続いて実験試料を、プロテアーゼなしの対照（陽性対照）で除算することによって、溶血の割合を算出し、ここで、陽性対照の溶血の割合を１に設定した。プロテアーゼによる溶血のＥＤ５０（ｎＭ）を、４パラメータロジスティック曲線フィット（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）で溶血の割合対プロテアーゼ濃度をプロットすることによって測定した。
結果を以下の表１９に示し、表１９は、配列番号５に示されるＣ１２２Ｓ突然変異を有する野生型ｕ－ｐＡおよび改変ｕ－ＰＡポリペプチドによる８０％ヒト血漿における溶血に関するＥＤ５０（ｎＭ）について示している。表１９に示されるように、８０％ヒト血漿における野生型ｕ－ＰＡに関するＥＤ５０は、６μＭを上回る一方で、例示的な改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインポリペプチドは、より低いＥＤ５０（例えば、１７３ｎＭ～１．０２８μＭの間）によって示されるように、補体を阻害する、有意に増大した能力を有する。
Figure 2022516725000079

*置換を含有する例示的なプロテアーゼドメインの配列番号
間接的発色性アッセイを使用したプラスミノゲン活性化の動態解析
間接的発色性アッセイを実施して、精製されたタンパク質調製物として産生された野生型および改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性を決定した［Madison et al. (1989) Nature, 339: 721-724；Madison et al. (1990) J Biol. Chem., 265: 21423-21426を参照されたい］。このアッセイでは、ｕ－ＰＡプラスミノゲンの作用によって生成されるプラスミンの作用によって、遊離ｐ－ニトロアニリンが、発色性基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＰＬ（Ｈ－Ｄ－ノルロイシルヘキサヒドロチロシル－リシン－ｐ－ニトロアニリド二酢酸塩、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）から放出される。遊離Ｐ－ニトロアニリンの放出を、ＯＤ４０５ｎｍで分光光度的に測定した。
アッセイに関して、検査されるべきｕ－ＰＡ酵素０．２５～１ｎｇを含有する反応混合物１００μＬ、０．６２ｍＭ Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＰＬ、および０．２μＭ Ｌｙｓ－プラスミノゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有する緩衝剤中で組み合わせた。反応を、９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）において３７℃でインキュベートして、４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ４０５）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｔｈｅｒｍｏｍａｘにおいて３０秒毎に１時間読み取った。速度定数ｋｃａｔ、Ｋｍ、およびｋｃａｔ／Ｋｍ（特異性定数）を算出した［例えば、Madison, E. L (1989) Nature 339: 721-724を参照されたい］。
結果を以下の表２０に示す。結果により、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、基質プラスミノゲンに対して著しく低下した酵素活性を有することが示される。本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは全て、プラスミノゲンに対して低減した活性および特異性を有し、全てが、Ｃ３に対して、また非改変ｕ－ＰＡと比較して、補体活性化を阻害することに対して、何倍もの増大を有する。
Figure 2022516725000080

*置換を含有する例示的なプロテアーゼドメインの配列番号
インビボでのカニクイザル硝子体液中での抗Ｃ３ ｕ－ＰＡ変異体の抗Ｃ３活性および安定性
置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒを含有するプロテアーゼドメインである配列番号２１に示される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのインビボ活性および安定性を評価した。硝子体液中での安定性およびＣ３を切断する能力は、ＡＭＤの処置に関する候補物を示すパラメータである。
１２匹のナイーブカニクイザルを、単一処置群に割り当てた。研究動物に、片眼において単回用量１２５μｇの改変ｕ－ＰＡポリペプチドを硝子体内に投与した。配列が配列番号２１に示され、およそ２５ｋＤａの分子量を有する単離プロテアーゼドメインを投与した。右眼に、検査物品を付与し、左眼に媒体対照を注射した。以下の時点それぞれで、４匹の動物を屠殺した：投薬の２４時間後、２日目および６日目。硝子体液試料を、右眼および左眼から収集して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは媒体対照による処置後の改変ｕ－ＰＡポリペプチド安定性およびＣ３のレベルに関して分析し、Ｃ３および改変ｕ－ＰＡポリペプチド濃度を、上記で詳述するようにＥＬＩＳＡによって決定した。
投薬の２４時間後、２日目および６日目に得られた硝子体液試料中に存在する改変ｕ－ＰＡポリペプチドの濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。次に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、最終濃度１０μＭになるようにＥＧＲ－ＣＭＫ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＧＲＣＫ－０１）を添加することによってクエンチされ、ｈＣ３／改変ｕ－ＰＡポリペプチド混合物を周囲温度で３０分間、静置した。
配列番号２１の改変ｕ－ＰＡポリペプチドの半減期は、およそ２日であると決定され、それは、ヒトの系ではおよそ５日に相当するはずである［Deng et al. MAbs 3(1): 61-66 (2011)］。改変ｕ－ＰＡポリペプチド（配列番号２１の）のインビボ回収率（即ち、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの用量で除算した改変ｕ－ＰＡポリペプチドのピークレベル）を、ＥＬＩＳＡによって、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの観察された最大レベルから算出した。インビボ回収率１００％に関する予測される理論値は、２．５μＭであった。置換：Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒを含有する改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）の測定されたインビボ回収率は、予測値のおよそ８０％、またはおよそ２．０μＭであると算出された。
硝子体液中でのＣ３レベルは、実施例３で詳述されるように、ＥＬＩＳＡによって評価した。媒体を注射した陰性対照の眼におけるＣ３レベルは、０．４ｎＭ～５０ｎＭの範囲であった（媒体を注射した眼由来の２つの試料は、硝子体の血液混入に起因するようにして、他の１０個と有意に異なった）。ｕ－ＰＡ投与前のＣ３のベースラインレベルは、およそ２．２ｎＭであった。Ｃ３は、１日後および７日後に、変異体で処置した眼において検出不可能であった。２８日後、配列番号２１に示される配列を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドで処置した眼におけるＣ３濃度は、およそ２．２ｎＭであり、それは、処置前のレベルと同等である。したがって、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ＡＭＤの処置に関する候補物である。
ｕ－ＰＡにおける例示的な突然変異および切断部位の確認
完全長、前駆体およびプロテアーゼドメインならびにそれらの触媒的に活性な部分を含む、ｕ－ＰＡポリペプチドにおける例示的な位置および突然変異を、表２２（以下）に示す。
Figure 2022516725000081

置換は、プロテアーゼドメイン（配列番号２または５）、完全長（配列番号１または４）および成熟形態（配列番号３または６）を含むｕ－ＰＡの任意の形態で存在する。最大１５～１８個程度またはそれよりも多い置換を含む、本明細書で例示されるものを含む置換を組み合わせることができる。
データにより、これらの突然変異を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ヒトおよびカニクイザル等の複数の種において、Ｃ３を切断して、不活性化させることが示される。ヒトＣ３の切断は、残基７４０と７４１との間に存在する場合があり（配列番号４７）、この切断が、Ｃ３を不活性化させる：
Ｑ Ｈ Ａ Ｒ ↓ Ａ Ｓ Ｈ Ｌ ７３７～７４４
Ｐ４ Ｐ３ Ｐ１↓Ｐ１’ Ｐ４’。
上記で実証されたように、また本開示全体にわたって、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、Ｃ３を切断して、不活性化させる。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、この領域での切断に関して選択され、そのことは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを検査することによって確認された。例えば、Ｃ３を、置換：Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒを含有する改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）または置換Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓを有する改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号４０）のいずれかとともに、酵素対基質比１：１０または１：５０で、総計１時間インキュベートした。試料を、０分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分でこれらの反応物から除去して、ＴＦＡの添加によって、各試料において、切断反応を即座に終結させて、ドライアイスで急速凍結させた。これらの試料のさらなる分析に先立って、システイン側鎖を還元して、アルキル化して、リシン側鎖のε－アミノ基を、Ｏ－メチルイソ尿素による処置によってブロックして、続いて、ペプチドアミノ末端を、ＮＨＳ－ＳＳ－ビオチンで標識した。得られたビオチン化Ｃ３ペプチドを捕捉して、トリプシンおよびＧｌｕＣプロテアーゼでさらに消化した。この第２のプロテアーゼ消化後、ペプチド産物を、再度、アフィニティ捕捉した。次に、ビオチンを、捕捉されたペプチドから還元によって除去して、ペプチド混合物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。０分後の各時点で、ＭＷ８２８９の断片を観察して、Ｃ３におけるＱＨＡＲにおけるアルギニンでの切断が示された。さらなるＣ３切断部位は、これらの反応では観察されなかった。したがって、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、ＱＨＡＲで切断する：
Ｑ Ｈ Ａ Ｒ ↓ Ａ Ｓ Ｈ Ｌ ７３７～７４４
Ｐ４ Ｐ３ Ｐ２ Ｐ１↓Ｐ１’ Ｐ４’。
カニクイザル硝子体液中でのｕ－ＰＡ毒性
改変ｕ－ＰＡポリペプチドの安全性および忍容性を、カニクイザルにおいてインビボで評価した。３匹のナイーブカニクイザルを、３つの処置群それぞれに割り当てた。研究動物に、眼１つにつき改変ｕ－ＰＡポリペプチド１２．５μｇ、３７．５μｇまたは１２５μｇのいずれかを硝子体内で投与した。右眼には、検査ポリペプチドを付与して、左眼には媒体対照を注射した。動物を臨床的に観察し（即ち、摂食量）、眼科の検査を行った。眼科の検査には、投薬前（Ｔ＝０）ならびに投薬の２日後、８日後および１５日後の細隙灯生体顕微鏡検査および倒像検眼鏡観察、続くカラー眼底写真または光干渉断層法（ＯＣＴ）が含まれた。観察は全て、最大４週間、または消散するまで継続した。
無毒性量（ＮＯＡＥＬ）を、全ての動物に関して評価した。配列番号４２に示される配列を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドを投与した動物に関するＮＯＡＥＬは、３７．５μｇ以上であった。配列番号２１に示される配列を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドを投与した動物に関して、有害な影響は認められず、したがって、配列番号２１に示される配列を有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドを投与した動物に関するＮＯＡＥＬは、１２５μｇ以上であった（ヒトにおける眼１つにつき３７５μｇ以上に同等である）。
野生型ｕ－ＰＡ、野生型ｕ－ＰＡ（配列番号５）プロテアーゼドメインのＣ１２２Ｓ変異体および例示的なｕ－ＰＡ変異体プロテアーゼドメインにおいて、候補免疫原性ホットスポットを同定するために計算を実施して、例示的な変異体における突然変異が、いかなる免疫原性ホットスポットも導入しないことが確認された。また、目的の変異体に関するホットスポットのプロファイル全体を、比較タンパク質のパネルと比較するために、計算を実施した。
方法の概要
外来タンパク質に対するＴ細胞応答における重要なステップは、抗原提示細胞において発現されるＨＬＡ複合体の宿主のいずれかへの、構成ペプチド（外来タンパク質の切断に由来する）の結合および提示である。公知のＨＬＡに結合すると予測される、タンパク質に由来されるペプチドの同定は、Ｔ細胞応答を誘発するための配列における考えられるホットスポットの指標として使用され得る。公知の免疫原性特性を有するタンパク質の変異体を考慮すると、予測されるＨＬＡバインダーのプロファイルを比較することは、変化が任意の新たな免疫原性ホットスポットを導入したかどうかを同定するのに役立ち得る。
公的に利用可能なデータベースを使用して、プロファイルを作成することができる。例えば、デンマーク工科大学の公的に利用可能な結合予測サービス（ＮｅｔＭＨＣＩＩ ２．２サーバー）を使用して、ＨＬＡへの結合を予測した。ＮｅｔＭＨＣＩＩ ２．３サーバーは、人工ニューロンネットワークを使用して、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰおよびマウスＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子へのペプチドの結合を予測する。予測は、２５個のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子、２０個のＨＬＡ－ＤＱ、９個のＨＬＡ－ＤＰ、および７個のマウスＨ２クラスＩＩ対立遺伝子に関して得ることができる。予測値は、１，０００，０００個のランダム天然ペプチド組に対して、ｎＭ ＩＣ５０値で、また％ランクとして付与される。強力な結合ペプチドおよび弱い結合ペプチドをアウトプットで示す。
サービスを使用して、ペプチドの一次配列に基づく１４個のＨＬＡ－ＤＲ変異体（以下の表Ｂを参照されたい）のパネルに対する、例示的な変異体（配列番号４０、および配列番号２１）、野生型プロテアーゼドメイン（配列番号２）、およびＣ１２２Ｓを有する野生型プロテアーゼドメイン（配列番号５）における１５個の連続するアミノ酸の全ての考えられるペプチドの結合親和性を予測した。各ペプチド／ＨＬＡ対に関して、ＮｅｔＭＨＣＩＩサーバーは、予測された結合親和性、ならびに強固な結合体（５００以下のＫｄ）、弱い結合体（５０ｎＭ以下のＫｄ）、または結合体なし（５００ｎＭを超えるＫｄ）としての分類を提供する。Ｎアミノ酸を含有するタンパク質配列に関して、これは、総計Ｔ＝（Ｎ－１４）×１４個の考えられるペプチド－ＨＬＡ結合対を生じる。
ＮｅｔＭＨＣＩＩサーバーからの結合予測を使用して、結果を使用して、候補結合対の数が同定された領域に基づいて、これらのタンパク質配列における考えられるホットスポットを同定した。これらの変化を、対応するタンパク質配列における公知の変化と比較した。
各タンパク質に関して：
予測される強固な結合ペプチド － ＨＬＡ対の数（ＴＢ）、予測される弱い結合ペプチド － ＨＬＡ対の数（ＷＢ）、およびペプチド － ＨＬＡ対の総数（Ｔ）に基づく全体的な結合スコアは、
スコア＝（ＴＢ＋０．５＊ＷＢ）／Ｔ
として考えられる。
表Ｂ－考えられる結合体として含まれるＨＬＡ－ＤＲ分子
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０２
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ３＊０１０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ４＊０１０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１０１
このスコアは、ＥｐｉＶａｘ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、ＲＩ）によって作成されたいインシリコ免疫原性予測と良好な一致を示し、ＥｐｉＶａｘは、８個のＨＬＡのサブセットを使用する場合、イムノインフォマティクスおよび免疫原性を予測するインビトロ技法を使用する。８個のＨＬＡのこのサブセットを使用した。標準的なタンパク質のパネルで、同じ計算を実施して、ｕ－ＰＡ変異体を比較する同じ計算を実施した。
予測されるＨＬＡ結合プロファイルに対する突然変異の影響
変異体ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのいずれかに関する所与の配列位置の回数を、各ＨＬＡ複合体に関して、Ｋｄカットオフ５０ｎＭおよび５００ｎＭでマッピングした。各欄におけるスケールを固定するが、欄間では異なり、野生型ポリペプチドと比較して、突然変異が免疫原性プロファイルを変更したかどうかを評価した。ポリペプチド間では有意な差は観察されなかった。
凝集体免疫原性スコア
各配列に関する凝集体免疫原性スコアを計算するための、公開されているインシリコ免疫原性スコアと良好な一致を提供するような、ＥｐｉＶａｘ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、ＲＩ）によって予め検証された８個のＨＬＡ（表Ｃ）に対する各結合閾値でのペプチドであるＨＬＡ結合対の総数。ＥｐｉＶａｘは、イムノインフォマティクスおよび免疫原性を予測するインビトロ技法を使用する企業である。次に、これらの値を使用して、上記の方法の概要に記載されるように、全体的なスコアを計算した。
表Ｃ－全体的な免疫原性スコアに使用されるＨＬＡ－ＤＲサブセット
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１０１
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０２
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１
ペプチドの数 － ８個のＨＬＡのサブセットに関するＨＬＡ結合対およびｕＰＡに関する複合スコアを以下に示す：

Figure 2022516725000082

結果により、変異体の免疫原性が、野生型ポリペプチドと異なり得ないことが示される。比較体タンパク質のパネルに関する同じ分析の結果を以下に示す。
Figure 2022516725000083

ｗｔ－および変異体ｕ－ＰＡポリペプチドによるプラスミノゲンの活性化
本明細書で提供されるｕ－ＰＡポリペプチドのｗｔ－および抗Ｃ３変異体によるＧｌｕ－プラスミノゲンの活性化に関する触媒効率を、以下に記載するように検査した。これらの実験からのデータにより、抗Ｃ３ ｕ－ＰＡ変異体タンパク質が、野生型ｕ－ＰＡの生理学的に適切な基質であるプラスミノゲンに対して著しく低減した活性を示すことが実証された。実施例７からのデータと組み合わせて、これらのデータにより、抗Ｃ３ ｕ－ＰＡポリペプチドが、「新たな」基質に対する実質的により高い活性を示すだけでなく、ｗｔ ｕ－ＰＡの正常な生理学的基質に対して実質的に低減した活性も示すことが実証される。
したがって、本出願に記載される抗Ｃ３変異体へ導入された突然変異は、野生型ｕ－ＰＡの基質特異性と比較して、抗Ｃ３変異体ポリペプチドの基質特異性を劇的に変更させた。
ｗｔ－および抗Ｃ３変異体ｕ－ＰＡポリペプチドによるプラスミノゲン活性化
１）単一時点反応（３７℃で３０分間）を使用した分析
ａ）反応条件
プラスミノゲン活性化活性を、野生型ｕ－ＰＡ／Ｃ１２２Ｓ（配列番号５）ならびに突然変異Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ（配列番号４０）およびＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ（配列番号２１）を含有する抗Ｃ３ ｕ－ＰＡポリペプチド変異体に関して測定した。反応混合物中のプロテアーゼ濃度は、２５ｎＭ（ｗｔ－ｕ＝ＰＡ）または２５０ｎＭ（抗Ｃ３ ｕ－ＰＡ変異体）であり、基質（即ち、Ｇｌｕ－プラスミノゲン）濃度は、２．５μＭであった。反応容量は２０μＬであり、反応を３７℃で３０分間進行させた。１Ｍ ＤＴＴ ２μＬおよび４Ｘ試料緩衝剤７μＬを添加することと、８０℃で４５秒間加熱することとによって、各反応を終結させた。終結させた反応混合物を、４～１２％ ＢＩＳ－ＴＲＩＳゲルの個々のウェルに負荷して、ＸＴ ＭＥＳ緩衝剤中で、２００Ｖで４５分間流した後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
ｂ）反応産物（即ち、プラスミン）の測定
染色したＳＤＳゲルの分析により、ｗｔ ｕ－ＰＡが、反応液中に存在するプラスミノゲン全てを切断して、それを、３０分のインキュベーション中に二本鎖の活性プラスミンに変換することが示された。これに対して、この反応中でのｕ－ＰＡ変異体Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ（配列番号４０）の活性は、ｗｔ－ｕ－ＰＡの活性よりも実質的に低かったのに対して、プラスミノゲン活性化は、この反応液中で、ｕ－ＰＡ変異体Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒによって観察されなかった。
２）抗Ｃ３ ｕ－ＰＡポリペプチドによるＧｌｕ－プラスミノゲン活性化の動態
ｗｔ－または抗Ｃ３ ｕＰＡ変異体ポリペプチドによるＧｌｕ－プラスミノゲンの活性化の動態解析を、以下に記載されるように実施した。活性化反応は、０．１％ＢＳＡを含有するＩ＝０．１６Ｍ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝剤中で、３７℃にて実施した。ｕ－ＰＡポリペプチドは、１（ｗｔ）ｎＭまたは１０（変異体）ｎＭの濃度で存在した。二次速度定数（ｋｃａｔ／ＫＭ）は、発色性基質Ｓ－２２５１（Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ｐＮＡ ２ＨＣｌ）の加水分解（反応産物プラスミンによる）に関する初期反応速度対Ｇｌｕ－プラスミノゲン（即ち、ｕ－ＰＡ基質）濃度（０～４μＭ）のフィッティングされた直線関係から得られた。表２４も参照されたい。
Figure 2022516725000084

C4S当然変異は、プロテアーゼドメインには存在しない
１５個の変異体間での比較は、「抗Ｃ３ ｕ－ＰＡ変異体によるＧｌｕ－プラスミノゲンの活性化」と標識した以下に添えた表２４の結果を示した。
表２４に関して：
Ｇｌｕ－プラスミノゲンは、１ｎＭまたは１０ｎＭプロテアーゼのプロテアーゼ濃度で、Ｃ１２２Ｓ ｕＰＡまたは選択したｕＰＡ変異体によって活性化された。
反応は、０．１％ＢＳＡを含有するＩ＝０．１６Ｍ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝剤中で、３７℃にて実行した。
二次速度定数（ｋｃａｔ／ＫＭ）は、発色性基質Ｓ－２２５１（Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ｐＮＡ ２ＨＣｌ）の加水分解に関する初期反応速度対Ｇｌｕ－プラスミノゲン濃度（０～４μＭ）のフィッティングされた直線関係から得られた。
カニクイザル硝子体液中での補体タンパク質Ｃ３の例示的なｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン突然変異体切断
例示的な突然変異体を、配列番号５に示される野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを参照して以下の表２３に示す。網掛セルは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号５に示される参照ｕ－ＰＡポリペプチドと比較した場合に、この残基で突然変異されていることを示す。網掛されていないセルは、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号５に示される参照ｕ－ＰＡポリペプチドと同じアミノ酸を含有することを示す。改変ｕ－ＰＡポリペプチドの活性は、実施例２に詳述および提示されるように、基質補体タンパク質Ｃ３の切断によって決定され、ｕ－ＰＡ処置後のＣ３の残留レベル（ｎＭ）として提示される。改変ｕ－ＰＡポリペプチドによるＣ３の切断は、実施例３で詳述されるように、購入したカニクイザル硝子体液またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）対照中で実施した。以下の表２３に示される結果により、配列が配列番号５において示される参照ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインと比較して、改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、Ｃ３に対してより大きな活性を示すことが示される。硝子体液およびＰＢＳ中の活性％は、７日後の残存する活性のパーセンテージを示す。改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、配列番号５の参照野生型プロテアーゼドメインと比較して、比較的安定であり、幾つかが、他のものよりも高い安定性を示す。以下の表中のものを含む治療候補物は、特に硝子体液中で、高いＣ３切断活性、およびより大きな安定性を有するものである。
Figure 2022516725000085

*置換を含有するプロテアーゼドメインの配列番号
中でもとりわけ、これらのデータおよび他のデータは、下記を示す：
Ｒ３５Ｑ：この突然変異は、固有抗Ｃ３活性（即ち、緩衝剤中で）をおよそ２．７倍、および８０％ヒト血漿の存在下で、およそ４．３倍増大させた
Ｈ３７Ｙ：この突然変異は、抗Ｃ３活性を、緩衝剤中で、また８０％ヒト血漿の存在下で、およそ２．４～２．５倍増大させた
Ｒ３７ａＥ：この突然変異は、固有抗Ｃ３活性を、およそ３．２倍減少させたが、８０％ヒト血漿の存在下では、この突然変異は、抗Ｃ３活性に対して影響しなかった
Ｖ３８Ｅ：この突然変異は、緩衝剤および硝子体液中でタンパク質の安定性を改善し、抗Ｃ３活性を、８０％ヒト血漿中で、およそ１．５倍改善した
Ｔ３９Ｙ：この突然変異は、固有抗Ｃ３活性および８０％ヒト血漿中の抗Ｃ３活性を、およそ７．５～８．５倍増大させた
Ｖ４１Ｒ：この突然変異は、固有抗Ｃ３活性および８０％ヒト血漿中の抗Ｃ３活性を、およそ２５～２７倍増大させた
Ｄ６０ａＰ：この突然変異は、固有抗Ｃ３活性および８０％ヒト血漿中の抗Ｃ３活性を、およそ１．２～１．６倍増大させた
Ｙ６０ｂＱ：この突然変異は、固有抗Ｃ３活性を、およそ１．７倍減少させ、３７℃で７日間のインキュベーション後の硝子体中でのタンパク質の安定性を、およそ１．４倍減少させたが、８０％ヒト血漿の存在下で、この突然変異は、抗Ｃ３活性を、およそ１．１倍増大させた
Ｔ９７ａＩ：この突然変異は、固有抗Ｃ３活性および８０％ヒト血漿の存在下での抗Ｃ３活性を、およそ１．２～１．３倍増大させた
Ｌ９７ｂＡ：この突然変異は、抗Ｃ３活性を、緩衝剤および８０％ヒト血漿中で、およそ６．４倍８．２倍増大させた
Ｈ９９Ｑ：この突然変異は、抗Ｃ３活性を、緩衝剤および８０％ヒト血漿中で、およそ２．９～４．８倍増大させた
Ｙ１４９Ｒ：この突然変異は、抗Ｃ３活性を、緩衝剤および８０％ヒト血漿中で、およそ１．６～２．１倍減少させた。
同様の結果が、Ｉ４１Ｄ／Ｃ１２２Ｓ／Ｇ１５１Ｎ／Ｑ１９２Ｔを含有する改変ｕ－ＰＡポリペプチド（例えば、配列が配列番号４０に示される改変ｕ－ＰＡポリペプチド、同様にこれらの置換を含有する完全長および前駆体および成熟形態を参照されたい）のより低い突然変異負荷での置換に関して達成された。
データにより、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡが、様々な種においてＣ３を切断および不活性化することが示される。例えば、ヒトＣ３を不活性化させるヒトＣ３の切断は、残基７４０と７４１との間に存在し得る（配列番号４７）：
Ｑ Ｈ Ａ Ｒ ↓ Ａ Ｓ Ｈ Ｌ ７３７～７４４
Ｐ４ Ｐ３ Ｐ１↓Ｐ１’ Ｐ４’。
ｕ－ＰＡヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質のクローニング、発現および調製
Ａ．ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドのクローニング
ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質の発現用のコンストラクトを生成した（配列番号１０１５）。ｕ－ＰＡ－リンカー－ＨＳＡ断片を、合成オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＣＲ産物から構築して、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサーまたは独占所有権のある発現ベクター（Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ）の制御下で、発現用のｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ番号Ａ１４６９７）にクローニングした。分泌シグナル配列（配列番号９９９（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ））を、ｕ－ＰＡ Ｎ末端ドメイン（配列番号３のアミノ酸１～１５８）、および例示的な改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７に示される）の上流にクローニングして、リンカー（配列番号１００２（ＧＧＳＳＧＧ））を介して、ヒト血清アルブミンのコード領域（ＨＳＡ；配列番号９９１）に連結させた：
Figure 2022516725000086
コンストラクトは、シグナルペプチド（アミノ酸１～２０）、ｕ－ＰＡ Ｎ末端ドメイン、１２２位のＣを除く配列番号２１の改変プロテアーゼドメイン（配列番号９８７に示される）、ＧＳリンカー（ＧＧＳＳＧＧ、配列番号１００２）、続くＨＳＡコード領域を含む。配列番号１０１５に示される完全コンストラクト配列は、
Figure 2022516725000087
 である。
Ｂ．ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドの調製
１．ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドの形質転換および発現
改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３＿４発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）または独占所有権のある発現ベクター（Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ）に、セクションＡで詳述されるような分泌シグナル配列に対してＣ末端でクローニングした。続いて、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質を、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＨＥＫ ｅｘｐｉ２９３もしくはｅｘｐｉＣＨＯ発現細胞またはＬａｋｅ Ｐｈａｒｍａの独占所有権のあるＴｕｎａＣＨＯ（商標）細胞株において、発現培地１Ｌ容量で６日間、発現させた。
２．ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドのアフィニティ精製
改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質の酵素前駆体形態を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ヒトアルブミンアフィニティマトリクス系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ番号１９１２９７０１Ｌまたは１９１２７００５）として販売される系を使用して、製造業者の使用説明書に従って精製した。カラムは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）アフィニティマトリクス樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をカラムに添加することによって調製した。保管溶液をカラムに流した後、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）の１０倍カラム容量（ＣＶ）を添加して、樹脂を洗浄した。次に、ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質を含有する発現収集物をカラムに適用して、続いて、５～１０倍ＣＶのＰＢＳで洗浄した。結合されたｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質を、１０倍ＣＶの溶出緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）で溶出した。その後、１０倍ＣＶのグリシン（０．２Ｍ ｐＨ３．０）でカラムを流し落として、１０％ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１．５Ｍ、ｐＨ７．４）で中和して、ＰＢＳ中で再平衡化させた。フロースルーおよび溶出ステップの試料を収集して、還元型および非還元型ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動で分析して、試料純度を評価した。ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質を、ＰＢＳへ４℃で１６時間透析した。
３．改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドのプラスミン活性化
プラスミンは、野生型ｕ－ＰＡおよび野生型ｕ－ＰＡ活性化配列を有する他のｕ－ＰＡ融合ポリペプチドにおける単結合を選択的に切断して、ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ酵素前駆体を活性化して、ジスルフィド結合によってＮ末端ｕ－ＰＡにドメインに係留されたＣ末端活性プロテアーゼドメインと、ジスルフィドを介して連結している二本鎖ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質を形成する。これらの実験に関して、使用されたコンストラクトは、配列番号１０１５に示される配列を有し、これは、配列番号２１の改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有するが、但し、キモトリプシンナンバリングによるＣ１１２Ｓは、遊離システインを提供するためのＣ１１２Ｓであり、シグナル配列（配列番号１０１５の残基１～２０）は含まれない。活性化後、得られた産物は、二本鎖を有する（配列番号１０１５を参照して）：残基２１～１７８を有するＡ鎖、および残基１７９～１０２２、ｕ－ＰＡ（残基１７９～４３１）、リンカー（残基４３２～４３７）、およびＨＳＡ（残基４３８～１０２２）を有するＢ鎖。Ａ鎖およびＢ鎖は、ジスルフィド結合によって、Ｃ１６８とＣ２９９（キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２に対応する）との間で連結している。
ＨＳＡドメインは、ＧＧＳＳＧＧリンカーを通じてプロテアーゼドメインのＣ末端にコンジュゲートされたままである。活性化は、以下の手順に従った：樹脂を、１×ＰＢＳで３回洗浄することによって、プラスミン－アガロース樹脂スラリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ；Ｃａｔ番号ＨＰＬ－１）を調製した。続いて、ｕ－ＰＡ融合ポリペプチド１ミリグラム当たり、１ｘ ＰＢＳ中の樹脂スラリー２００μＬを、ＰＢＳ中に、透析したｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドを含有する溶液に添加した。ｕ－ＰＡポリペプチド酵素前駆体の「活性化」は、タンパク質／樹脂溶液を室温で３時間、穏やかに振盪することによって遂行された。その後、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチド酵素前駆体を、対応する活性改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡプロテアーゼに完全に変換した。
活性化された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡを、０．２μｍのスピンフィルター（２．０ｍＬ容量）を使用して遠心分離して、プラスミン樹脂から回収して、製造業者の使用説明書に従って、活性化された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡをプラスミン樹脂から回収した。回収を最大限にするために、さらなる濾過技法が想定されてもよい（樹脂を遠心沈降することとピペット抽出によって上清を回収することとは対照的）。他の低タンパク質結合濾過装置もまた、さらなる樹脂の濾過に使用することができる。活性化されたｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質を、４℃で保管したか、またはアリコートで凍結させた。完全活性化ステップの確認は、プロテアーゼドメインＨＳＡ融合コンジュゲートからＮ末端ドメインを分離させるための還元性条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって可視化された。
４．活性化された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質の阻害
幾つかの実験に関して、ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチド（上記で論述されるように配列番号１０１５の残基２１残基１０２２として示されている；例えば、配列番号１０１９を参照されたい）の触媒的に不活性な形態を使用することが望ましかった。阻害された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ（ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉ）と称されるタンパク質を生成するために、活性化された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ（ｕ－ＰＡ－ＨＳＡａ）を、不可逆的活性部位阻害剤であるＧｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－クロロメチルケトン（ＥＧＲ－ＣＭＫ）とともにインキュベートして、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチドのいかなる自己触媒も、インビボ実験中の不活性化／切断も防止した（例えば、実施例１５および実施例１６を参照されたい）。ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉを調製するために、凍結乾燥したＥＧＲ－ＣＭＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ；Ｃａｔ番号ＧＧＡＣＫ）を、１０ｍＭ ＨＣｌ中で１００ｍＭになるように再構成させた。１ｘ ＰＢＳ中で１ｍＭ ＥＧＲ－ＣＭＫ阻害剤の最終阻害剤濃度に到達するように、濃縮されたＥＧＲ－ＣＭＫを、活性化された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ試料（ｕ－ＰＡ－ＨＳＡａ）にストック濃度で添加して、混合物を室温で１時間インキュベートした。
ｕ－ＰＡ－ＨＳＡａが完全に阻害されたかどうかを評価するために、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉの分解を、安定性実験で、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡａと比較した。簡潔に述べると、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡａを、０時間、１日間または７日間、３７℃でインキュベートした。改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉおよびｕ－ＰＡ－ＨＳＡａ分解を、還元条件および非還元型条件下で、還元型および非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって視覚的にモニタリングした。バンドを、クマシーまたは他の類似した市販の染色によって視覚化した。結果により、３７℃で１日間または７日間のインキュベーション後の改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡの観察される分解と比較して、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉに関しては、最大７日の任意の時点で改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉに関して、分解産物が観察されなかったため、阻害剤によるプレインキュベーションは、ポリペプチドを安定することが実証される。
５．活性化後のｕ－ＰＡ－ＨＳＡａおよびｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉポリペプチドの精製
最終の精製回の間に、活性で阻害された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチドを、サイズ排除クロマトグラフィを使用して、高分子量不純物および低分子量不純物から単離した。精製は、主要なｕ－ＰＡ－ＨＳＡピークに先立つ個別のピークとして溶出される高分子量種を排除した。高分子量種は、さらに分析されず、プロセスにおける発現または活性化ステップ中に形成された凝集体または多量体を表し得る。発現または活性化中に生成されるアルブミンを含まないと考えられている第２の低分子量種もまた排除した。
精製は、以下の通りに進めた；改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉ（０．８ｍｇ）のおよそ３００μＬ試料または改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡａ（０．８ｍｇ）のおよそ４００μＬ試料を、流速０．５ｍＬ／分で、ＰＢＳ中で、サイズ排除クロマトグラフィカラム（ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ ＨＲ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ番号ＧＥ１７－１１６６－０１）上に負荷した。タンパク質は一般的に、樹脂に関して製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用説明書に従って精製され、主要ピークは、改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉまたはｕ－ＰＡ－ＨＳＡａを含有した。
調製物の品質および分離の程度を、還元性および非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によってさらに評価した。改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉまたはｕ－ＰＡ－ＨＳＡａポリペプチド試料の溶出画分を、各１２ウェルの非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの「レーン」に負荷して、バンドが十分に識別可能になるまで、４０Ｖで流して、様々なサイズのタンパク質種を、標準的なクマシー染色を上回って感度を改善するように銀染色によって可視化させた。予測分子量７５ｋＤａで移動する単一バンドを含有する画分をプールして、最終濃度およそ２ｍｇ／ｍＬで、液体窒素中で急速冷凍させて、使用するまで－８０℃で保管した。最終濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して、２８０ｎＭでの吸収によって決定した。タンパク質サイズおよび発現は、後に、クマシー染色およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。個々のｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチド試料の品質を、活性アッセイおよび質量分析によってさらに評価した。
硝子体内注射後の改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質薬物動態評価
改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合ポリペプチドの薬物動態および顕性眼毒性を評価した。融合タンパク質は、実施例１４において上記されるように、改変ｕ－ＰＡポリペプチドプロテアーゼドメイン（配列番号９８７、Ｃ１２２ＳがＣ１２２Ｃであること以外は配列番号２１である）を含有する。融合タンパク質は、配列番号１０１５の残基２１～１０２２である、配列番号１０１９に示される配列を有する。実施例１４に記載されるように、改変ｕ－ＰＡのプロテアーゼドメインは、配列番号９８７に示されている。活性化および阻害された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質（配列番号１０１５）の薬物動態プロファイルを、ダッチベルテッドウサギにおいて、インビボで評価して、配列番号２１に示されるような改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのみの薬物動態プロファイルと比較した。８匹のウサギを、３つの処置群それぞれに割り当てた（群１：改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡａ；群２：改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉ；群３：改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１））。研究動物に、眼１つ当たり２．１ｍｇ／ｍＬの改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉおよびｕ－ＰＡ－ＨＳＡａ、または１．１５ｍｇ／ｍＬの改変ｕ－ＰＡ（配列番号２１）のいずれか５０μＬを、硝子体内注射（ＩＶＴ）により投与した。改変プロテアーゼを含有する改変ｕ－ＰＡで処置した群に関して、右眼には、改変ｕ－ＰＡポリペプチドを付与し、左目に、媒体対照（ＰＢＳ）としてＰＢＳを注射した。以下の表は、群および条件、ならびに実施した評価について概要する。
Figure 2022516725000088

*OSおよびODは、それぞれ、右眼および左眼を指す
１．改変ｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質の眼許容性
投薬期間中、および安楽死前に、臨床的観察および眼の観察を行い、体重を記録した。検眼を、投薬の１日後、３日後、および１４日後（群１および群２）に、または投薬の１日後、３日後、および７日後（群３）に両眼で実施して、ドレーズスケールを使用して、眼の刺激をスコアリングした。ドレーズスコアリング系［Draize et al., (1944) J Pharm Exper Ther 82 (3) 377-90］は、角膜、虹彩および結膜における眼の刺激を評価して、０～２または０～４スケールで、刺激をスコアリングする基準を提供する。「０」のスコアは、角膜、虹彩、または結膜が正常であることを示す。全ての時点で、眼の刺激は、全ての動物に関してドレーズ基準を使用して評価する場合、０とスコアリングされたが、但し、「血管が、正常を超えて明らかに鬱血している」「発赤」および結膜の「正常を超える腫脹」を有する「結膜浮腫」を示す、「１」の２つのスコアを有する１匹のウサギを除く。これらの「１」のスコアは、群２（ｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉ）における１匹のウサギに関して、１日目にｕ－ＰＡ－ＨＳＡｉの硝子体内投与後の数時間以内に観察された。最も重要なことには、改変ｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ活性化融合タンパク質の硝子体内投与後に毒性は観察されなかった。
２．改変ｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡ融合タンパク質の薬物動態
改変ｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチドの濃度（ｎＭ）ならびに薬物動態パラメータの決定に関して、眼の組織および液体のターミナル試料を、１つの時点につき２匹の動物を使用して、１日目、３日目、７日目および１４日目に、両眼の眼球除去後に収集した。安楽死後、ｕ－ＰＡおよびｕ－ＰＡ－ＨＳＡの発現ならびに活性の評価のために、各ウサギの両眼を収集して、眼の組織および液体（水様液（ＡＨ）、硝子体液（ＶＨ）、網膜、および脈絡膜）の収集のために解剖した。収集後、ウサギの硝子体液、網膜、およびの脈絡膜の重量を、２．８ｍｍのセラミックビーズを含有する耐衝撃性マイクロチューブ（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において均質化した。ＶＨ、網膜、および脈絡膜組織に関して、組織１ミリグラにつき一定のアリコートのリン酸緩衝食塩水を各チューブに添加した。網膜および脈絡膜試料は、リン酸緩衝食塩水を用いて、９：１（希釈剤容量：組織容量）で希釈して、ＶＨ試料は、４：１（希釈剤容量：ＶＨ容量）で希釈した。試料を、完全に均質化されるまで、０～１０℃で、５５００ｒｐｍにて３×３０秒サイクルで、サイクル間に２０秒の休止を伴って均質化した（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー）。
ＶＨにおける改変ｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチドのＥＬＩＳＡ（ｎＭ）および活性（ｎＭ）によって決定される場合の濃度を、それぞれ、ＥＬＩＳＡおよび活性アッセイを使用して決定した。濃度決定に関して、抗ｕ－ＰＡサンドイッチＥＬＩＳＡを以下の通りに実行した：捕捉抗体ＰＡ１－３６１６６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＥＬＩＳＡプレート上に、４℃で一晩または室温で２時間、１００ｍＭカーボネート緩衝剤、ｐＨ９．５中に１．０μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。続いて、プレートを、ＰＢＳＴ（ｔｗｅｅｎを含有する１Ｘ ＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＰＢＳ－ｔｗｅｅｎ中の１％ ＢＳＡで、４℃で一晩または室温で２時間ブロックした。各試料５０μＬを、振盪しながら室温で３０分間インキュベートして、続いて、ＰＢＳで３回洗浄し、検出抗体ＰＡ１－３６０１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、０．２５μｇ／ｍＬで３０分間）とともにインキュベートした。ウェルを再び洗浄して、続いて、ＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）とともに、１：３０，０００希釈で、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄した後、結合された改変ｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチドを、１－ｓｔｅｐ ＴＭＢ（３４０２８、Ｔｈｅｒｏ）による検出によって可視化させて、２Ｎ硫酸でクエンチした後、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
クエンチされた蛍光ペプチド基質（ＦＲＥＴ）の加水分解に基づくアッセイを使用して、ＶＨにおける改変ｕ－ＰＡおよび改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチドの、活性による定量化を行い、公知の活性濃度の改変ｕ－ＰＡポリペプチドの標準曲線に対して較正した。このアッセイは、ヒト補体３（Ｃ３）の切断配列に基づいて、ＦＲＥＴペプチド基質を使用する。ペプチドの配列は、ＲＱＨＡＲ／ＡＳＨＬであり、ここで、“／”は、切断部位を示す。ペプチドのＮ末端側を、ＤＡＢＣＹＬフルオロフォアで標識して、Ｃ末端側を、ＥＤＡＮＳフルオロフォアで標識する。ペプチドの切断は、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ ＦＲＥＴ対を分離して、蛍光シグナルを発生させて、蛍光シグナルは、マルチウェル蛍光プレートリーダーで測定される。
アッセイは、以下の通りに行った：検査試料は通常、アッセイ緩衝剤（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－８０、ｐＨ７．４）中に、１：２０の最低限必要とされる希釈に希釈する。希釈した試料を、９６ウェルプレートにおいて、８０μＭ ＦＲＥＴ基質を用いて１：２でさらに希釈する。希釈した検査試料および基質を組み合わせたら即座に、ＦＲＥＴ基質加水分解後の蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーにおいて、３０秒毎の測定で２時間評価した。ＦＲＥＴペプチド基質の酵素的加水分解により、ＥＤＡＮＳ蛍光産物が生成される。蛍光強度の発生速度を、ＥＤＡＮＳ標準曲線に対して内挿して、ＥＤＡＮＳ産物生成速度を得る。２つの方法で比活性を算出し得る。第１に、産物生成速度に希釈因子を乗じて、試料１ｍＬ当たりの反応１分当たりの産物ｎｍｏｌの単位（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）で、容量的比活性を得る。容量的比活性は、試料中の活性酵素の総量を示す。第２に、比活性は、容量的比活性を、試料酵素濃度で除算することによって算出され、酵素１ｍｇ当たりの反応１分当たりの産物ｎｍｏｌの単位（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）で、容量的比活性を得る。未知の試料（例えば、インビボＰＫ試料）の見かけのプロテアーゼ濃度を決定するための実験に関して、試料の容量的比活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）を、対照改変ｕ－ＰＡまたは改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡポリペプチドの酵素比活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）で除算して、試料中の見かけのプロテアーゼ濃度（ｍｇ／ｍＬ）を得る。
各眼および動物に関するデータを、以下の表に提供する。各眼に関して得られた濃度を、動物１匹につき平均化した。続いて、各動物に関する薬物濃度を、各時点で平均化して、動物間の変動を相殺した。各時点での平均値を計算して、以下の表に提示する。続いて、得られたデータを、下記の分析方法論に付した：まず、Leeらによって開発されたセミパラメトリック区分的ロバスト回帰アプローチ［Lee et al., (1990) J. Lab Clin. Med. 115:745-748；およびLee et al. (1997) "The use of robust regression techniques to obtain improved coagulation factor half-life estimates. XVIth Congress of the International Society for Thrombosis and Hemostasis," Florence,Italyを参照されたい］を、半減期を計算するのに使用した。それは、コンパートメントモデルである。データは、ＦＤＡ提出用に認証および使用されているプログラムＤｅｍｉｔａｓｓｅを使用して評価した。時間曲線下面積（ＡＵＣ）および他のＰＫパラメータの分析に関して、台形公式に基づく非コンパートメントモデルを使用した。ＰＫパラメータを算出して、以下の表に示す。
表
Figure 2022516725000089

Figure 2022516725000090

*太字のセルは、検出限界の外側であり、および/または外れ値とみなされたか、もしくは外れ値検査に基づいて排除された
表
Figure 2022516725000091

Figure 2022516725000092

ＥＬＩＳＡおよび活性アッセイに基づいて、ｕ－ＰＡの改変プロテアーゼドメイン（配列２１の改変ｕ－ＰＡポリペプチドを含有する）は、およそ２日の半減期を有する。ＨＳＡへの融合により、タンパク質の半減期が増大される。活性化された改変ｕ－ＰＡ－ＨＳＡは、それぞれ、ＥＬＩＳＡおよび活性によって測定される場合、２．４２日および３．２７日の半減期を有した。半減期は、ＥＬＩＳＡで決定した半減期３．４２日で、阻害プロトコールに付されたｕ－ＰＡ－ＨＳＡに関して増大した。したがって、ｕ－ＰＡの、ＨＳＡへの融合により、インビボでタンパク質半減期が増大し、融合タンパク質は、インビボでプロテアーゼ活性を保持する。
ｕ－ＰＡ融合タンパク質のクローニング、発現および調製
Ａ．ｕ－ＰＡ融合ポリペプチドのクローニング
Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで、融合パートナーを用いて、ｕ－ＰＡ融合タンパク質を生成した。
１．例示的な融合タンパク質
ｕ－ＰＡ融合タンパク質の発現用の幾つかのオルタネートコンストラクトを生成した（以下に記載される）。例えばＮ末端融合タンパク質を生成した（例えば、図２Ａを参照されたい）。コンストラクトは、（Ｎ末端からＣ末端まで）：（１）分泌シグナル（例えば、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域（ＩｇＧκ）（配列番号９９９））、（２）融合パートナー（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号９９２））、（３）ＡＧＳ（配列番号１００３）等のリンカー、（４）野生型ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７；配列番号１のアミノ酸１６７～１７８）、および（５）改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）を含有した。Ｎ末端融合タンパク質１の例を、配列番号１００４に示す。
Ｃ融合末端タンパク質も生成した（例えば、図３を参照されたい）。幾つかの例では、コンストラクトは、（Ｎ末端からＣ末端まで）：（１）分泌シグナル（例えば、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域（ＩｇＧκ）（配列番号９９９））、またはヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ２）（配列番号１０００））、（２）野生型ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７または９９８）、フューリン活性化配列（配列番号９９５、９９６、または１０４１）、または活性化配列なし、（３）改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７または２１）または野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２または５）、（４）リンカー（配列番号１００２または１００３）、および（５）融合パートナー（即ち、ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号９９２）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（配列番号９９１）、コラーゲンＩＩｍ（Ｃ２ｓｃＦｖ）に結合するｃＦＶ（配列番号９９３）、またはヒアルロン酸結合ドメイン（ＨＡＢＤ）（配列番号９９４））を含有した。Ｃ末端融合タンパク質の例を、配列番号１００６～１０１０、１０１２、１０１３、１０１６、および１０４０に示す（例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照されたい）。
ｕ－ＰＡ Ｎ末端領域を含有するＣ末端融合タンパク質もまた生成した。コンストラクトは、（Ｎ末端からＣ末端まで）：（１）分泌シグナル（例えば、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域（ＩｇＧκ）；配列番号９９９）、（２）野生型ｕ－ＰＡ Ｎ末端領域（配列番号１のアミノ酸２１～１７８または配列番号１０４２）、（３）ｕ－ＰＡの活性化配列（配列番号９９７または９９８）またはフューリン活性化配列（配列番号９９５、９９６、または１０４１）、（４）改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン（キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２を除く配列番号９８７または配列番号５、または配列番号２１）、（５）リンカー（配列番号１００２または１００３）、および（６）融合パートナー（即ち、ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号９９２）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（配列番号９９１））を含有した。Ｃ末端融合タンパク質の例を、配列番号１０１１、１０１４、１０１５および１０３６に示す（例えば、図３Ｃを参照されたい）。また、ｕ－ＰＡに代わってフューリン活性化配列を含有する配列番号１０１０も参照されたい。
Ｎ末端にＳＵＭＯを、またＣ末端に融合パートナーを含有する融合タンパク質もまた、生成した。コンストラクトは、（Ｎ末端からＣ末端まで）：（１）分泌シグナル（例えば、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域（ＩｇＧκ）（配列番号９９９））、（２）ＨＩＳリンカーおよびＳＵＭＯ配列（配列番号９９０）、（３）改変ｕ－ＰＡ触媒ドメイン（配列番号９８７）、（４）リンカー（配列番号１００２）、および（５）融合パートナー（即ち、ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号９９２）、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（配列番号９９１））を含有した。Ｃ末端融合タンパク質の例を、配列番号１０１６および１０１７に示す。
融合パートナーに融合していない完全長ｕ－ＰＡタンパク質を、対照として生成した（
例えば、図２Ｂを参照されたい）。コンストラクトは、（Ｎ末端からＣ末端まで）：（１）分泌シグナル（例えば、マウスＩｇカッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域（ＩｇＧκ）（配列番号９９９））、（２）ｕ－ＰＡのＮ末端ドメイン（配列番号１０４０、配列番号１のアミノ酸２１～１６６）、（３）ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７）、および（４）改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）を含有した。完全長ｕ－ＰＡタンパク質の例を、配列番号１０１５に示す。以下は、生成されたコンストラクトの概要である。
Figure 2022516725000093

対照タンパク質は、配列番号１００５に示される配列を有する。対照配列は、ｕ－ＰＡ Ｎ末端（配列番号３の残基１～１５８）、野生型ｕ－ＰＡ活性化配列、およびｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号９８７）を含有し、融合パートナーなしである。配列番号１００４に示される融合タンパク質は、Ｎ末端に融合パートナー（Ｆｃ）を含む。配列番号１００６～１００９に示される融合タンパク質は、Ｃ末端に種々の融合パートナーを有し、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインのＮ末端にある活性化配列を欠いている。配列番号１０１０および１０１１に示される融合タンパク質は、Ｃ末端にＦｃを含有し、互いに異なって活性化される：配列番号１０１０に示される融合タンパク質は、フューリン活性化配列を含有し、配列番号１０１１に示される融合タンパク質は、ｕ－ＰＡのｎ末端領域および野生型ｕ－ＰＡ活性化配列を含有する。配列番号１０１２および１０１３に示される融合タンパク質は、それぞれ、配列番号１００６および１００７に示される融合タンパク質と同じであるが、改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインに代わって、野生型ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインを有する。
配列番号１０１４～１０１６に示される融合タンパク質は、Ｃ末端にＨＳＡを含有し、互いに異なって活性化される：配列番号１０１４に示される融合タンパク質は、フューリン活性化配列を含有し、配列番号１０１５に示される融合タンパク質は、活性化用の野生型ｕ－ＰＡ活性化配列を含有し、配列番号１０１６に示される融合タンパク質は、活性化用のフューリンドメインを含有する。配列番号１０１７および１０１８に示される融合タンパク質は、Ｎ末端に活性化ドメインとしてＳＵＭＯを、またそれぞれＣ末端にＨＳＡまたはＩｇＧ－Ｆｃを含有する。フューリン活性化部位を、配列番号１０１０、１０１４、および１０１６に示される融合タンパク質に付加して、その結果、タンパク質は、発現中に活性化させることができ、それにより、下流のプロセシング中の活性化ステップの必要性を排除する。
２．コンストラクト生成
（ａ）ｕ－ＰＡコンストラクトの調製
コンストラクトを、合成オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＣＲ産物から構築して、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサーの制御下で、発現用のｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ番号Ａ１４６９７）にクローニングした。
（ｂ）ＳＵＭＯ－ｕ－ＰＡコンストラクトの調製
ＳＵＭＯタグ（配列番号１０１７および１０１８に示される）を含有する融合タンパク質の発現に関して、Ｃ１２２Ｓを有する改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号２１に示される）を、コドン最適化ｐＥ５発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；配列番号９８８に示される配列）にクローニングした。ｐＥ５プラスミドは、融合パートナー（ＨＳＡまたはＦｃ）および改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメインをクローニングするために、ＳＵＭＯ配列に対してＣ末端に多重クローニング部位を含有する。最終的な融合タンパク質は、（１）融合パートナー（ＨＳＡまたはＦＣ）、（２）Ｃ１２２Ｓを有する改変ｕ－ＰＡプロテアーゼドメイン（配列番号２１）、（３）Ｎ末端６ｘＨｉｓ精製タグ、および（４）ＳＵＭＯである。
Ｂ．ｕ－ＰＡ融合ポリペプチドの調製
ｕ－ＰＡ融合タンパク質の予測分子量を、以下に示す：
Figure 2022516725000094

１．ｕ－ＰＡ融合タンパク質の形質転換、発現、フォールディングおよびリフォールディング
配列番号１００４～１０１３に示される配列を有する融合タンパク質を、上記の実施例１４に詳述されるように、形質転換および発現させた。
２．ｕ－ＰＡ ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）融合タンパク質の形質転換、発現、フォールディングおよびリフォールディング
配列番号１０１７および１０１８に示される配列を有する融合タンパク質を、以下で詳述されるように調製した。
大腸菌発現のためのＳＵＭＯ－改変ｕ－ＰＡ融合ポリペプチドのクローニング
コンピテントＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）大腸菌細胞を、標準的なヒートショック法を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって調製された発現ベクター（配列番号９８８）において、ｕ－ＰＡ融合タンパク質を用いて形質転換する。プラスミドＤＮＡを、ＭＱ水５０μＬ中に再懸濁して、１００ｎｇ／ｍＬのストック溶液を得る。プラスミドＤＮＡおよびコンピテントＢＬ２１ Ｇｏｌｄ ＤＥ３細胞を氷上で解凍する。ＤＮＡ ０．５μＬを、滅菌マイクロフュージチューブにおいて細胞５０μＬに添加して、氷上で３０分間インキュベートする。細胞／ＤＮＡ混合物を、４２℃で４５分間置くことによって、ヒートショックを与える。細胞／ＤＮＡ混合物を即座に移動して氷上に戻し、氷上で２分間インキュベートする。予め加温した（３７℃）ＳＯＣ培地４５０μＬを、細胞／ＤＮＡ混合物に添加して、得られたＳＯＣ／細胞／ＤＮＡ混合物を、振盪しながら３７℃でインキュベートする。ＳＯＣ中の細胞（２～２００μＬ）を、ＬＢ－カルベニシリンプレートに蒔いて、広げて、３７℃で一晩インキュベートする。細菌コロニーを保有するプレートを、インキュベーターから取り出して、パラフィルムで密封して、４℃で保管する。個々の形質転換コロニーのグリセロールストックを標準的な方法によって調製し、－７０℃で保管する。
Ｃ．哺乳動物細胞培養体における融合タンパク質のタンパク質発現の評価
ｅｘｐｉ２９３細胞培養体上清（実施例１４を参照されたい）からのタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡによって、またウェスタンブロットによって定性的に評価した。ウェスタンブロッティング後のタンパク質発現を、１～５のスケールでスコアリングして、ここで、１は、最大の発現を表し、５は、発現なしを表す。
６個の試料を各コンストラクトに関して検査した。結果を、以下の表に示す。結果により、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングによって、配列番号１００４、１００７～号１００９および１０１３に示される融合タンパク質は、発現されにくかったことが示される。配列番号１００５、１０１０および１０１１に示されるタンパク質は、定性的ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって評価された場合に、最大発現を有していた。
Figure 2022516725000095


R二乗=0.9993;検出限界=0.109ng/mL;定量限界=1.375ng/mL
Figure 2022516725000096

Ｄ．融合タンパク質活性化戦略
様々な戦略を、ｕ－ＰＡ活性化に用いた。配列番号１００４～１００５、１０１１および１０１５に示されるタンパク質を、実施例１４において上記で詳述されるように、プラスミンによって活性化した。配列番号１０１０、１０１４および１０１６に示されるタンパク質は、発現中に細胞内フューリンによって活性化されると予想された。配列番号１００６～１００８に示されるタンパク質は、発現中に自己活性化されると予測された。配列番号１０１７および１０１８に示されるタンパク質は、ＳＵＭＯプロテアーゼ処置によって活性化された。ＳＵＭＯ－ｕ－ＰＡコンストラクトを活性化するために、通常、タンパク質１ｍｇにつき１０ユニットのＳＵＭＯプロテアーゼを添加して、４℃で一晩インキュベートした。ＨｉｓＴｒａｐニッケルキレート化カラムでのさらなる精製により、Ｈｉｓでタグ付けされたＳＵＭＯ部分が効率的に除去される。
Figure 2022516725000097

Ｅ．酵素活性の測定
４０μＭヒトＣ３ ＦＲＥＴペプチドに対するｕ－ＰＡ融合タンパク質を含有するｅｘｐｉ２９３ ＨＥＫ上清の容量比活性を、表１５に示されるように評価した。内挿した希釈調整された初期速度（ｎＭ ＥＤＡＮＳ／分／試料μＬ）を算出した。配列番号１００４、１００５、１００８および１０１１～１０１３に示される融合タンパク質は、活性を示さなかった。配列番号１００６、１００７、１００９および１０１０に示される融合タンパク質は、ｕ－ＰＡプロテアーゼ活性を示した。ｕ－ＰＡのＮ末端にフューリン活性化配列を有し、Ｃ末端にＩｇ ＦＣ融合体を有する、改変ｕ－ＰＡは、最大活性を示した。結果を、以下の表に示す。
Figure 2022516725000098

Ｆ．アフィニティ精製
配列番号１０１０および１０１１に示される融合タンパク質は、ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによって評価された場合、最大発現を有した。それぞれ、配列番号１０１０および１０１１に示されるフューリン－変異体ｕ－ＰＡ－Ｆｃおよび完全長ｕＰＡ－Ｆｃ融合タンパク質を、製造業者が推奨する条件（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡアフィニティ精製した。
Ｇ．高発現性融合タンパク質の精製および活性の評価
アフィニティ精製後、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度によって、またｕ－ＰＡ ＥＬＩＳＡよって評価した（実施例１５を参照されたい）一方で、純度は、実施例１４において上記されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動および分析用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって評価した。両方の融合タンパク質は、発現した。純度は、ゲル電気泳動および染色によって、また分析用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって評価された場合、その配列が配列番号１０１０（ｕ－ＰＡ フューリン ｗ／ｏ Ｃｙｓ）に示される融合タンパク質に関して不十分であるとみなされた。ゲル電気泳動による純度は、配列番号１０１１（完全長ＷＴ ｕＰＡ ｗ／Ｃｙｓ）に示される融合タンパク質に関して良好であるとみなされた。結果を、以下の表に示す。
Figure 2022516725000099

アフィニティ精製後のｕ－ＰＡ酵素活性を、実施例１５において上記されるように、ヒトＣ３ ＦＲＥＴペプチドアッセイで評価した。結果を、以下の表に示す。
Figure 2022516725000100


アフィニティ精製後のｕ－ＰＡ酵素活性を、実施例１５において上述されるように、ヒトＣ３ ＦＲＥＴペプチドアッセイで評価した。酵素活性を、実施例１４において上記されるように、プラスミン活性化後に評価した。結果を、以下の表に示す。
Figure 2022516725000101

Ｈ．Ｃ３を切断する改変ｕ－ＰＡポリペプチドを有するタンパク質の説明
ｕ－ＰＡポリペプチドを有する融合タンパク質を以下に記載する。例示的な配列を、下記の考察で提供する。
１．触媒的ドメイン
触媒的ドメイン（プロテアーゼドメイン）は、本明細書で提供される改変ｕ－ＰＡポリペプチドのプロテアーゼドメインのいずれか（実施例２、表１４を参照されたい、これは、本明細書で、および実施例において記載されるように、様々な改変を含有するプロテアーゼドメインに関して、ＥＤ５０を提供する）、特に、実施例２に記載されるように、１００ｎＭ未満、または５０ｎＭ、３０ｎＭ、もしくは１０ｎＭ未満のＥＤ５０を有するいずれかであり得る。改変ｕＰＡプロテアーゼドメインの例は、配列番号２１に示されるものであるが、但し、それを使用して、二本鎖ポリペプチドを産生するように活性化する場合は、残基１２２（キモトリプシンナンバリングによる）は、Ｃであり、配列番号２１で見られるようにＳではない。Ｔａｂ 改変ｕＰＡポリペプチドプロテアーゼドメイン：
配列番号９８７：
Figure 2022516725000102
配列番号２１ Ｃ１２２Ｓ突然変異を含有する改変ｕＰＡポリペプチドプロテアーゼドメイン：
Figure 2022516725000103
 は、自然ｕＰＡポリペプチドプロテアーゼドメイン配列番号２：
Figure 2022516725000104
 と比較して、または配列番号５：
Figure 2022516725000105
 に示されるように残基１２２（キモトリプシンナンバリングによる）のＣがＳであるプロテアーゼドメインと比較して、アミノ酸置換を含有する。
本明細書で示されるように、改変ｕ－ＰＡポリペプチドは、自然ｕ－ＰＡと比較して、変更された加水分解活性および生化学的特性を示す。ｕ－ＰＡポリペプチドは、本明細書に記載されるように、Ｃ３を切断することに対して増大した活性を有するように、またそれらの自然基質を切断することに対して低減した活性を有するように改変される。
２．分泌シグナル
タンパク質発現中に、改変ｕ－ＰＡポリペプチドの細胞外分泌を保証するために、発現すると、コードされたポリペプチドの分泌を誘導するように、コンストラクト中に分泌シグナルが含まれ得る。多くのこうしたシグナルが、当業者に公知である。これらのシグナルは、自然ｕ－ＰＡシグナル、およびｍＫＬＣ分泌シグナル（配列番号９９９（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ））配列またはヒトＩＬ２分泌シグナル（配列番号１０００（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ））等の他のシグナル、および本明細書で例示される他のシグナルを包含する。シグナル配列は一般的に、分泌を誘導するように、ポリペプチドのＮ末端に現れ、シグナル配列は、宿主細胞によって除去される。
３．融合パートナー
アミノ酸置換、挿入または欠失の他に、さらなる改変を、ｕＰＡポリペプチドに付加して、融合体またはキメラタンパク質を創出することができる。多数の融合パートナーおよびそれらの特性が、当業者に公知である。これらとして、例えば、多量体化され得る融合パートナー、血清半減期を増大させ得る融合パートナー、および結合特性を変更させるか、またはポリペプチドを標的とする融合パートナーが挙げられる。例えば、改変ｕＰＡポリペプチドおよび自然ｕＰＡポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドＩｇＧ１（配列番号９９２(DKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG))またはコラーゲンII scFv(配列番号９９３(QVQLQQPGADL VRPGVSVKLSCKASGYTFTS YWMNWVKQRP GQGLEWIGMI HPSDSETRLS QKFKDKATLT VDKSSSTAYMQLSSPTSEDS AVYYCARLKP GGTWFAYWGQ GTLVTVSAGG GGSGGGGSGG GGSGGSDIVLTQSPASLTVS LGQRATISCR ASKSVDSYGN SFMEWYQQKP GQPPKLLIYR ASNLESGIPARFSGSGSRTD FTLTINPVEA DDVATYYCQQ SNEDPYTFGG GTKLEIK))のＦｃ領域等の抗体断片または多量体化ドメインに連結されて、ｕ－ＰＡポリペプチドの薬理学的特性を変更させることができる。
薬理学的特性を変更させるために、ｕＰＡポリペプチドは、例えば、抗体等のリガンドもしくはポリペプチド、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、配列番号９９１）：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL)、もしくはＴＳＧ－６等のヒアルロン酸結合ドメイン（ＨＡＲＤ）（配列番号９９４）ERAAGVYHREA RSGKYKLTYAEAKAVCEFEG GHLATYKQLE AARKIGFHVC AAGWMAKGRV GYPIVKPGPN CGFGKTGIIDYGIRLNRSER WDAYCYNPHA KE
等の他のタンパク質に融合され得る。
通常、ｕ－ＰＡプロテアーゼ活性は、得られた融合タンパク質内で機能的に活性のままであるが、融合ペプチドは、ｕ－ＰＡポリペプチドの薬物動態的パラメータおよび薬理学的パラメータを変化させ得る。ｕ－ＰＡ改変ポリペプチドを含有する他の融合タンパク質は、増殖因子または受容体を用いて創出されて、薬物動態的パラメータおよび薬理学的パラメータを変更させ得る。
４．活性化配列
ｕ－ＰＡポリペプチドは、不活性形態（酵素前駆体）で産生されてもよく、タンパク質分解的切断により翻訳後改変されて、成熟および活性化形態を生成してもよい。そのために、活性化配列は、自然または改変ｕ－ＰＡポリペプチドに含まれて、その酵素活性を抑制する。タンパク質発現後、活性化配列の切断により、成熟ｕ－ＰＡタンパク質が産生される。活性化配列の例として、野生型ｕ－ＰＡ活性化配列（配列番号９９７（ＱＣＧＱＫＴＬＲＰＲＦＫ）または配列番号９９８（ＱＳＧＱＫＴＬＲＰＲＦＫ））またはフューリン切断配列（配列番号９９５、９９６１０４１、または１０４４（例えば、ＱＣＧＱＫＴＬＲＲＲＫＲ、またはＱＳＧＱＫＴＬＲＲＲＫＲ、またはＱＳＧＫＴＬＲＲＫＲ、またはＱＳＧＱＫＴＬＲＲＫＲ））が挙げられるが、これらに限定されない。ジスルフィド結合は、活性化配列内のシステインと、ｕ－ＰＡ触媒的ドメイン内のシステイン（キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２）との間で維持され得る。活性化部位の切断時に、活性化された分子は、Ｎ末端断片活性化または完全Ｎ末端ドメイン間に共有結合を保持する。
５．リンカー
ｕ－ＰＡポリペプチドを、他のポリペプチド配列と結合させるために、アミノ酸の短い可撓性配列（リンカー）が使用される。リンカーの例として、ＧＧＳＳＧＧまたはＧＧＧＧＳまたはＡＧＳ（例えば、配列番号１００１～１００３および１０２４～１０３０に示されるもの）、ならびに詳細な説明で考察されているものが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーが、配列（ＧＧＳＳＧＧ）ｎ＋１（ここで、ｎは、０または１～２０の間の整数である）を有するように、反復されたこれらの配列の連結を有する、より長い結合もまた包含される。他のリンカーは、配列表および詳細な説明で示されている。
６．ｕ－ＰＡの他の改変
６ｘＨｉｓ ＳＵＭＯ（例えば、配列番号９９０、および１０３１～１０３３(
Figure 2022516725000106
 )に示されるもの）等の他のペプチド配列を付加して、ｕ－ＰＡポリペプチドの発現、分泌または精製を容易とし得る。ｕ－ＰＡポリペプチドの薬力学的特性を変更させるために、変更されたｕ－ＰＡポリペプチドまたは自然ｕ－ＰＡポリペプチドに対するさらなる化学的改変および翻訳後改変として、ＰＥＧ化、ＰＡＳ化、およびシアリル化等の、ポリマーへのコンジュゲーションが挙げられ得るが、これらに限定されない。
７．Ｎ末端融合を有する例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチド
Figure 2022516725000107

Figure 2022516725000108

*配列番号21のu-PAプロテアーゼドメイン(C122S置換を有する、およびC122S置換を有さない)
図２は、配列番号１００４および１００５に示されるＮ末端融合ポリペプチド等の、Ｎ末端融合を有するｕ－ＰＡポリペプチドの概略図を示す。
８．Ｃ末端融合を有する例示的な改変ｕ－ＰＡポリペプチド
Figure 2022516725000109


Figure 2022516725000110

Figure 2022516725000111

Figure 2022516725000112

Figure 2022516725000113

Figure 2022516725000114


Figure 2022516725000115


Figure 2022516725000116


Figure 2022516725000117



Figure 2022516725000118



Figure 2022516725000119



Figure 2022516725000120



Figure 2022516725000121


Figure 2022516725000122


Figure 2022516725000123


Figure 2022516725000124


Figure 2022516725000125
図３は、配列番号１００６～１０１８および１０３６に示されるＣ末端融合ポリペプチド等の、Ｃ末端融合を有するｕ－ＰＡポリペプチドの概略図を示す。
Ｉ．ｕ－ＰＡ量および補体経路活性を評価するためのアッセイ
Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞において哺乳動物発現系において、変更されたｕ－ＰＡポリペプチド融合体および自然ｕ－ＰＡポリペプチド融合体をコードするｐｃＤＮＡ３＿４ベクターのトランスフェクション後に、ｕ－ＰＡポリペプチド融合体を産生した。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞において正確に発現されたｕ－ＰＡポリペプチドを、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰまたはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘで精製して、ｕ－ＰＡ ＥＬＩＳＡ等の生化学アッセイ用に加工処理して、ｕＰＡ力価またはＣ３ ＦＲＥＴタンパク質切断アッセイを検査して、ｕ－ＰＡポリペプチド触媒活性を検査した。結果を以下の表に示す：
Figure 2022516725000126

１．ｕ－ＰＡ ＥＬＩＳＡレベル
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ｕ－ＰＡポリペプチドの存在を測定する（例えば、実施例１５を参照されたい）。通常、ｕ－ＰＡの測定は、ｕ－ＰＡの、捕捉抗体（１．０ｕｇ／ｍＬのＰＡ１－３６１６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への結合の間接的な尺度である。続いて、捕捉されたｕ－ＰＡポリペプチドを、ＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６０５－４０３－Ｂ６９）によって認識される検出抗体（０．２５ｕｇ／ｍＬのＰＡ１－３６０１５）で検出する。ＨＲＰ酵素は、ＴＭＢ基質を添加すると、比色反応を誘発する。ｕ－ＰＡ ＥＬＩＳＡ法を使用して、４つのｕ－ＰＡポリペプチドが、高いｕＰＡ力価レベルで発現すると同定され（配列番号１００５、１０１０、１０１１、１０１２、１０１５）、２つのｕ－ＰＡポリペプチドが、中程度の力価で発現すると同定され（配列番号１００６および１０１３）、配列番号１００４、１００７～１００９に示されるｕ－ＰＡポリペプチドは、発現しなかった。
２．酵素活性（ヒトＣ３ ＦＲＥＴペプチド）。
ヒトＣ３に対するｕＰＡポリペプチドのタンパク質分解活性を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって産生されるヒトＣ３ ＦＲＥＴペプチドＲＨＱＡＲＡＳＨＬ ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ（ロット＃９４０４５９９０００５／ＰＥ６３７９）を使用して、インビトロで測定した（例えば、実施例１５を参照されたい）。ペプチドのＮ末端側を、ＤＡＢＣＹＬフルオロフォアで標識して、Ｃ末端側を、ＥＤＡＮＳフルオロフォアで標識する。ペプチドの切断により、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ ＦＲＥＴ対が分離して、蛍光シグナルを発生し、それは、マルチウェルプレートリーダーで測定される。蛍光強度の発生速度を、ＥＤＡＮＳ標準曲線に対して内挿して、ＥＤＡＮＳ産物生成速度を得る。産物生成速度に、希釈因子を乗じて、試料１ｍＬ当たりの反応１分当たりの産物ｎｍｏｌの単位で容量的比活性（ｎｍｏｌ／分／ｍＬ）を得る。容量的比活性は、試料における活性酵素の総量を示す。第２の比活性は、容量的比活性を、試料酵素濃度で除算することによって算出され、酵素１ｍｇ当たりの反応１分当たりの産物ｎｍｏｌの単位で酵素比活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）を得る。酵素比活性は、濃度にかかわらず、試料におけるｕＰＡポリペプチドの固有活性を示す。ヒトＣ３ ＦＲＥＴ活性アッセイを使用して、配列番号１０１０に示されるｕＰＡポリペプチドは、活性であることが示された。
改変は、当業者に明らかであるため、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されると意図される。

Claims (244)

  1. 改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータ（ｕ－ＰＡ）ポリペプチドであって、Ｒ３５Ｑ、Ｈ３７Ｙ、Ｖ４１Ｒ、Ｖ４１Ｌ、Ｙ４０Ｑ、Ｄ６０ａＰ、Ｌ９７ｂＡ、Ｔ９７ａＩ、およびＨ９９Ｑに相当する置換、ならびにそれらの保存的アミノ酸改変から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、これにより、前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、前記ｕ－ＰＡポリペプチドの非改変活性形態と比較して、補体タンパク質に対して増大した活性／特異性を有し、
    前記アミノ酸改変が、前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドの一次配列内の置換、挿入、および欠失から選択され；
    前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、補体タンパク質を切断することによって、前記アミノ酸改変を含有しない非改変ｕ－ＰＡポリペプチドと比較して、補体活性化を阻害または低減し；
    残基が、キモトリプシンナンバリングによって付番され；
    前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、野生型（ＷＴ）全長ｕ－ＰＡ、ＷＴプロテアーゼドメインｕ－ＰＡ、ＷＴ成熟ｕ－ＰＡ、キモトリプシンナンバリングによるＣ１２２Ｓを有する全長ｕ－ＰＡ、Ｃ１２２Ｓを有するプロテアーゼドメインｕ－ＰＡ、Ｃ１２２Ｓを有する成熟ｕ－ＰＡを示す配列番号１～６のいずれかに示される配列、またはアミノ酸置換を含むその触媒活性断片を含み；
    前記保存的改変が、Ｒ３５Ｙ、Ｗ、Ｆ、またはＮ；Ｈ３７Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｗ、またはＦ；Ｖ４１Ｋ；Ｄ６０ａＳ；Ｔ９７ａＤ、Ｌ、またはＶ；Ｌ９７ｂＧまたはＳ、およびＨ９９Ｎから選択される、改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  2. Ｒ３５Ｑ、Ｈ３７Ｙ、Ｖ４１Ｒ、Ｖ４１Ｌ、Ｙ４０Ｑ、Ｄ６０ａＰ、Ｌ９７ｂＡ、Ｔ９７ａＩ、およびＨ９９Ｑに相当する置換から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項１に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  3. プラスミノゲン内の基質配列の切断に対して低減した活性または特異性を有する、請求項１または２に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  4. 前記補体タンパク質がＣ３である、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  5. Ｃ３の切断に対する活性の増大が、配列番号５のプロテアーゼドメインを含む前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または配列番号１～４および６のいずれかに示されるｕ－ＰＡの対応する形態よりも最低３倍大きい、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  6. 前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号１～６のいずれかに示されるアミノ酸の配列からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  7. 前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸の配列からなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  8. 配列番号１～６（ＷＴ全長ｕ－ＰＡ、ＷＴプロテアーゼドメインｕ－ＰＡ、ＷＴ成熟ｕ－ＰＡ、Ｃ１２２Ｓを有する全長ｕ－ＰＡ、Ｃ１２２Ｓを有するプロテアーゼドメインｕ－ＰＡ、Ｃ１２２Ｓを有する成熟ｕ－ＰＡ）のいずれかのポリペプチド、またはその触媒活性断片に対して、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する、請求項１～５および７のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  9. 配列番号１～６のいずれかの前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチド、またはその触媒活性部分と比較して、１つ、または最大２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、もしくは１５個のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する、請求項１～５および７のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  10. 置換Ｖ４１Ｒを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  11. 置換Ｖ４１Ｌを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  12. 置換Ｖ３８Ｅをさらに含む、請求項１０または１１に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  13. 置換Ｈ３７Ｙを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  14. 置換Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  15. 置換Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７ＫまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｋを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  16. 置換Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８ＥまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  17. 置換Ｌ９７ｂＡを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  18. Ｒ３５Ｑを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  19. Ｈ９９Ｑを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  20. Ｄ６０ａＰを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  21. Ｔ９７ａＩを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  22. Ｔ３９Ｙ、Ｔ３９Ｗ、Ｔ３９Ｆに相当するアミノ酸置換、またはＴ３９ＭもしくはＴ３９Ｌから選択される保存的置換をさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  23. アミノ酸置換Ｔ３９Ｙをさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  24. アミノ酸置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７ＹもしくはＶ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ１４９Ｒ、またはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＴ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  25. Ｃ３の不活性化切断についてのＥＤ５０が、インビトロアッセイにおいて、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、または２５ｎＭ以下である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  26. 表１４に示されるプロテアーゼドメインを含み；
    １００ｎＭ以下のＥＤ５０５０を有するか、５０ｎＭ以下のＥＤ５０５０を有するか、３０ｎＭ未満のＥＤ５０５０を有するか、または２５ｎＭ未満のＥＤ５０５０を有する、請求項２５に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  27. 前記アッセイが、ＥＤ５０を求めるための、３７℃で１時間の各改変プロテアーゼの種々の濃度での、基質補体タンパク質ヒトＣ３のインキュベーションを含む、請求項２５または２６に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  28. ５０ｎＭ以下のＥＤ５０によりＣ３を切断する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  29. 改変Ｖ４１Ｒを含む、請求項２８に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  30. 改変Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒを含む、請求項２８に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  31. 位置Ｒ３５、Ｈ３７、およびＶ３８の１つまたは複数での置換をさらに含む、請求項２９に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  32. Ｖ３８での前記置換がＥである、請求項３１に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  33. Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  34. Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｐ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ８２Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｋ１１０ａＲ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ／Ｋ１７９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ９２Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｖ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＷ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｅ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ９２Ｓ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｒ／Ｋ６２Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ／Ｋ１７９Ｓ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＬ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｔ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｓ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｒ／Ｑ１９２Ｙ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｓ／Ｋ６２Ｓ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ａ／Ｈ３７Ｅ／Ｒ３７ａＧ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｔ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｐ／Ｍ１５７Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＷ／Ｙ６０ｂＰ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｋ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｓ／Ｑ１９２Ｈ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＱ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｉ１７Ｖ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｈ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｎ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｍ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｓ；
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ８２Ｓ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｋ１１０ａＳ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＬ／Ｄ９７Ｔ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＧ／Ａ９８Ｓ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＧ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｑ／Ｄ６０ａＨ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＷ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＱ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｐ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｒ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｔ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｐ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｎ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｅ／Ｒ７２Ｈ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ／Ｑ１６９Ｋ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｓ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｓ／Ｑ１９２Ｈ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｔ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＬ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｖ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｓ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｑ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｓ／Ｑ１９２Ｎ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｖ／Ｖ４１Ｒ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｖ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｖ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｉ１７Ｖ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｖ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＭ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｗ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｎ２６Ｄ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｅ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｒ１１０ｄＳ／Ｐ１１４Ｓ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｌ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｐ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｔ１５８Ｓ／Ｅ１６７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｅ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ２４２Ａ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｌ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＱ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＨ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｇ３７ｂＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｖ／Ｒ３７ａＷ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｔ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｍ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＦ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｔ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ／Ｑ１９２Ｔ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＲ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｉ１７Ｖ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｉ１７Ｖ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｈ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｉ１３８Ｖ／Ｅ１６７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｔ／Ｑ１９２Ｈ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｇ３７ｂＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｔ１５８Ｓ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＧ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＩ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｍ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｖ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｍ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｋ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ａ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｒ／Ｑ１９２Ｔ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｎ１４５Ｓ／Ｓ１４６Ｖ／Ｔ１４７Ｍ／Ｄ１４８Ｇ／Ｙ１４９Ｑ／Ｌ１５０Ｆ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｉ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｖ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＮ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ５６Ｓ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｔ１５８Ｓ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｋ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ａ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＲ／Ｔ９７ａＷ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｅ１７５Ｄ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＭ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｎ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｋ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｒ／Ｑ１９２Ｔ；
    Ｖ４１Ｒ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｖ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｐ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｑ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｓ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｐ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＷ／Ｙ６０ｂＰ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｉ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｆ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＶ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｓ３７ｄＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＡ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ａ９６Ｄ／Ｄ９７Ｅ／Ａ９８Ｇ／Ｔ９７ａｄｅｌ／Ｈ９９Ｌ／Ｌ９７ｂｄｅｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｔ１７８Ｓ／Ｒ２１７Ｄ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ａ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｋ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｋ６１Ｅ／Ｉ６５Ｔ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＬ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＳ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＧ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｉ２４Ｎ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｎ８７Ｄ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｈ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ａ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｋ６１Ｄ／Ｉ６５Ｒ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ／Ｋ１８７Ｒ／Ｋ２２３Ｒ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｓ／Ｑ１９２Ｔ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｐ６０ｃＳ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｉ１３８Ｖ／Ｅ１６７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＴ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｉ１７Ｖ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ５６Ａ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｒ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ａ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｉ２４Ｔ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｉ１７Ｖ／Ｆ３０Ｙ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｋ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｔ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｌ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＦ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｌ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｍ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｉ１７Ｖ／Ｆ３０Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｖ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｎ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ／Ｑ１９２Ｈ；
    Ｒ３５Ｖ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｍ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ；
    Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｐ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｑ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｒ３５Ｖ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ａ９６Ｇ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｔ３９Ｌ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ
    Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＬ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｓ１４６Ｆ／Ｍ１５７Ｋ／Ｑ１９２Ｈ／Ｋ２４３Ｑ
    Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｋ６１Ｌ／Ｉ６５Ｖ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ；
    Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｖ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｖ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｅ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ａ／Ｈ３７Ｔ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｓ；
    Ｒ３５Ｓ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ；
    Ｒ３５Ｓ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｑ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ｓ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＫ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｅ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｑ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｋ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｒ３７ａＫ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＧ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｑ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ａ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｋ６１Ｄ／Ｉ６５Ｖ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ５６Ａ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｎ／Ｈ３７Ｔ／Ｒ３７ａＹ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３７ａＨ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ５６Ａ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｔ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３６Ｌ／Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ８２Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｖ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｌ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｎ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３６Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｎ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｓ／Ｒ３７ａＡ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｖ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｑ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｈ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＶ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｈ／Ｈ３７Ｉ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｗ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ／Ｒ２１７Ｓ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｒ３５Ｆ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｒ３６Ｓ／Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｌ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＩ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｒ３５Ｓ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＶ／Ｔ９７ａＬ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｌ；
    Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ５６Ａ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｋ２４３Ｍ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｒ３７ａＨ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｅ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｑ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｇ３７ｂＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｒ３５Ｓ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｖ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｉ１３８Ｖ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｈ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｉ６５Ｔ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｖ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３６Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｐ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＬ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｇ３７ｂＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｋ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ／Ｋ１８７Ｓ／Ｋ２２３Ｓ／Ｋ２２４Ｙ；
    Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｋ６１Ｅ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ／Ｒ２０６Ｈ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ａ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｒ２１７Ｑ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｌ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ／Ｒ２１７Ｄ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｆ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＤ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｉ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＶ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｓ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｑ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＷ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｌ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＷ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｆ１４１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ／Ｔ１５８Ａ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＡ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｑ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＰ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ５６Ａ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｅ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＬ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｗ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｗ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＳ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｌ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｙ１５１Ｐ／Ｍ１５７Ｋ／Ｑ１９２Ｈ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｍ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＤ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｌ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＶ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｆ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＰ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ９７Ｅ／Ａ９８Ｇ／Ｔ９７ａｄｅｌ／Ｈ９９Ｌ／Ｌ９７ｂｄｅｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｅ／Ｒ２１７Ｄ；
    Ｒ３５Ｍ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ／Ｑ１９２Ｈ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｆ；
    Ｈ３７Ｍ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ａ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｔ２２Ｉ／Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｓ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｉ１３８Ｖ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｌ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｌ／Ｖ３８Ｄ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｎ７６Ｓ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｍ１５７Ｋ／Ｋ１８７Ｅ；
    Ｆ３０Ｈ／Ｖ３８Ｄ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｓ；
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＨ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｇ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｑ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｗ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｇ３７ｂＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｍ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｎ／Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＰ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｄ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｋ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｑ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＮ／Ｙ６０ｂＰ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ａ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＶ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｅ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｑ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｈ３７Ｔ／Ｒ３７ａＬ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｒ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｆ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３５Ｗ／Ｒ３６Ｈ／Ｈ３７Ｓ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｙ６０ｂＮ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｗ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＬ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｇ３７ｂＤ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＫ／Ｔ９７ａＳ／Ｌ９７ｂＲ／Ｈ９９Ｅ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｅ１７５Ｄ／Ｑ１９２Ｔ／Ｒ２１７Ｅ／Ｋ２２４Ｒ；
    Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｌ／Ｙ４０Ｌ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＷ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；
    Ｆ３０Ｙ／Ｒ３６Ｈ／Ｖ３８Ｅ／Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｎ／Ｌ１５０Ｖ／Ｍ１５７Ｋ；
    Ｒ３５Ｓ／Ｖ３８Ｄ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｍ１５７Ｙ；
    Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｄ／Ｔ３９Ｙ／Ｙ４０Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ／Ｒ２１７Ｔ；
    Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｙ６０ｂＥ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    Ｙ４０Ｈ／Ｖ４１Ｔ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｒ２１７Ｔ；および
    Ｃ１２２ＳがＣ１２２Ｃであるこれらのポリペプチドのいずれか（キモトリプシンナンバリングによる）
    から選択される改変を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  35. アミノ酸改変Ｒ３５Ｑ、Ｙ６０ｂＱ、およびＹ１４９Ｒの１つまたは複数をさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  36. アミノ酸改変Ｒ３７ａＥまたはＲ３７ａＳをさらに含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  37. 置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１ＲまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｃ１２２Ｓを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  38. アミノ酸改変Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  39. アミノ酸改変Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９ＱまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  40. 置換Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  41. Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２ＳまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡまたはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡに相当するアミノ酸改変を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  42. Ｒ３７ａＳ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９ＱまたはＲ３７ａＳ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓに相当するアミノ酸改変を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  43. Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２ＳまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９ＱまたはＴ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑに相当するアミノ酸改変を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  44. Ｈ９９Ｑに相当する置換をさらに含む、請求項４１に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  45. Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＴ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＴ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒ
    に相当するアミノ酸改変を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  46. 前記非改変ポリペプチドが、配列番号２または配列番号５のポリペプチド、プロテアーゼドメインからなる、請求項４５に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  47. 前記非改変ポリペプチドが、配列番号３または配列番号６の成熟ｕ－ＰＡからなる、請求項４５に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  48. 前記非改変ポリペプチドが、配列番号１または配列番号４のプロペプチドからなる、請求項４５に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  49. アミノ酸改変：
    Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＡ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ｌ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ｍ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＤ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｗ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ａ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｆ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＰ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｔ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｈ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＡ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；
    または
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｄ／Ｒ３７ａＳ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＥ／Ｙ６０ｂＳ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｇ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＴ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ；または
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＬ／Ｄ９７Ｔ／Ｔ９７ａＥ／Ｌ９７ｂＧ／Ａ９８Ｓ／Ｈ９９Ｌ／Ｃ１２２Ｓ；または
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｋ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ａ；または
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｖ／Ｒ３７ａＷ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＥ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｔ；または
    Ｒ３５Ｙ／Ｈ３７Ｓ／Ｒ３７ａＰ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ；または
    Ｒ３５Ｗ／Ｈ３７Ｐ／Ｒ３７ａＮ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｋ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＤ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１５１Ｌ／Ｑ１９２Ｔ；またはＣ１２２に置換がない各々を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  50. Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９ＲまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒに相当するアミノ酸改変を含み、前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号２または配列番号５に示されるプロテアーゼドメインを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  51. 配列番号８～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  52. 配列番号２１または９８７に示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  53. 配列番号１８に示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  54. 前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ酸残基の配列からなる、請求項１～５３のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  55. 前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸残基の配列からなる、請求項４９に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  56. 前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ酸残基の配列からなる、請求項５０に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  57. ヒトＣ３（配列番号４７）の残基ＱＨＡＲＡＳＨＬＧ（残基７３７～７４５）内を切断する、請求項１～５６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  58. Ｐ１－Ｐ１’がＲＡである、請求項５７に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  59. ＰＢＳまたは体液中での７日間のインキュベーション後に、５０％を超える安定性を有する、請求項１～５８のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  60. ＰＢＳまたは体液中での７日間のインキュベーションの後に、８０％を超える安定性を有する、請求項１～５９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  61. インキュベーションが体液中で実施される、請求項５９または６０に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  62. 前記体液が水様液である、請求項６１に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  63. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、活性形態である場合、非改変ｕ－ＰＡポリペプチドの対応する形態と比較して、プラスミンに対する活性が１００分の１以下に低下している、請求項１～６２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  64. 別の部分またはポリマーに直接的に、またはリンカーを介してコンジュゲートしている、請求項１～６３のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  65. 融合タンパク質である、請求項６４に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  66. ペグ化されている、請求項６４または６５に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  67. 血清半減期を延長させる、かつ／または免疫原性を低減するポリマーを含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  68. 前記ポリマーがポリペプチドを含む、請求項６７に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  69. 血清アルブミンに直接的にまたは間接的に連結している、請求項６４～６８のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  70. 前記血清アルブミンがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項６９に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  71. 前記ＨＳＡが、配列番号９９１に示される配列、またはこれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する形態を含む、請求項６９または７０に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  72. 前記ポリマーがＦｃドメインである、請求項６４に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  73. 前記Ｆｃドメインが、配列番号５０もしくは配列番号９９２に示される配列、またはこれに対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する形態を含む、請求項７２に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  74. 前記ポリマーが前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドに直接的に連結している、請求項６４～７３のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  75. 前記ポリペプチドまたはポリマーが、ペプチドリンカーを介して、前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドに連結している、請求項６４～７４のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  76. 前記リンカーがＧｌｙおよび／またはＳｅｒを含む、請求項７５に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  77. 前記リンカーが、最大２０、３０、４０、または５０個のアミノ酸残基を含有する、請求項７５または７６に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  78. 前記リンカーが、（ＧＳ）ｎまたは（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｎまたは（ＧＧＳ）ｎまたは（ＳＧＧ）ｎまたは（ＧＧＳＳＧＧ）ｎまたは（ＡＧＳ）ｎを含み、ｎが、１～５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０である、またはＳ、Ｇ、Ｅ、およびＫを含有する最大２５個の残基を含有するリンカーである、請求項７５に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  79. 配列番号１００１～１００３、１０２４～１０２９のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列、およびそれらの多量体、ならびにこれらに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７８に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド。
  80. 非プロテアーゼポリペプチドまたはその部分に融合している、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または改変ｕ－ＰＡポリペプチドの触媒活性部分を含む融合タンパク質。
  81. 前記非プロテアーゼポリペプチドが、多量体化ドメインまたはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である、請求項８０に記載の融合タンパク質。
  82. 前記非プロテアーゼポリペプチドが、Ｆｃドメインである多量体化ドメインである、請求項８０に記載の融合タンパク質。
  83. フューリン活性化部位を含む、請求項８０に記載の融合タンパク質。
  84. 前記フューリン活性化部位が、ＱＳＧＱＫＴＬＲＲＲＫＲ（配列番号９９６）もしくはＱＣＧＱＫＴＬＲＲＲＫＲ（配列番号９９５）もしくはＱＳＧＱＫＴＬＲＲＫＲ（配列番号１０４４）、またはこれらに対して少なくとも９８％の配列同一性を有するフューリン活性化部位を含む、請求項８３に記載の融合タンパク質。
  85. 請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む融合タンパク質であって、シグナル配列、および前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む融合タンパク質。
  86. 前記シグナル配列が、Ｉｌ－２、ｕ－ＰＡ、またはＩｇＧκに由来する、請求項８５に記載の融合タンパク質。
  87. 融合パートナーを含む、請求項８０～８６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  88. 前記融合パートナーが多量体化ドメインである、請求項８７に記載の融合タンパク質。
  89. 前記融合パートナーが、アルブミン、またはＦｃドメイン、または単鎖抗体、または抗体の他の抗原結合断片、またはヒアルロン酸結合ドメイン（ＨＡＢＤ）である、請求項８７に記載の融合タンパク質。
  90. 前記融合パートナーが、腫瘍壊死因子刺激遺伝子－６（ＴＳＧ－６）であるＨＡＢＤである、請求項８９に記載の融合タンパク質。
  91. 前記融合パートナーがＨＳＡである、請求項８９に記載の融合タンパク質。
  92. 前記融合パートナーがＩｇＧ Ｆｃである、請求項８９に記載の融合タンパク質。
  93. 前記融合パートナーが、抗ＩＩ型コラーゲン抗体ｓｃＦｖ断片、または抗ＶＥＧＦＲ抗体もしくはその断片である、請求項９１に記載の融合タンパク質。
  94. 活性化配列を含む、請求項８０～９３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  95. 前記活性化配列がシステインを含み、前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが遊離システインを含み、それにより、活性化すると、生じる活性化ポリペプチドが２本の鎖を含む、請求項９４に記載の融合タンパク質。
  96. 前記活性化配列が、ｕ－ＰＡ活性化配列またはフューリン活性化配列である、請求項９４に記載の融合タンパク質。
  97. 前記活性化配列が、配列番号９９５～９９８、１０４１、および１０４４のいずれかに示される配列、またはこれらに対して少なくとも９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有する、請求項９６に記載の融合タンパク質。
  98. 活性化配列、改変ｕ－ＰＡポリペプチド、およびＨＳＡを含む、請求項８０～９７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  99. 配列番号１００６、１００７、１００９、および１０１０のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項８０に記載の融合タンパク質。
  100. 配列番号１００４～１０１９および１０３４～１０４０のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項８０に記載の融合タンパク質。
  101. 配列番号１０１５または１０１９に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項８０に記載の融合タンパク質。
  102. シグナル配列を有していない、または発現すると前記シグナル配列が除去される、請求項８０～１０１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  103. Ａ鎖およびＢ鎖を含有する二本鎖活性化形態である、請求項８０～１０２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  104. 前記Ｂ鎖が、前記ポリペプチドの前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドの残基ＩＩＧＧから始まって、前記融合タンパク質のＣ末端で終わる、請求項１０３に記載の融合タンパク質。
  105. 改変ｕ－ＰＡポリペプチドおよびＨＳＡを含む、請求項１０３に記載の融合タンパク質。
  106. 配列番号１００５、１０１１、１０１４、１０１５、１０１６、１０１９、および１０３６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含むが、前記シグナル配列を欠いている、請求項１０３または１０４に記載の融合タンパク質。
  107. 残基２１～１７８のＡ鎖、および残基１７９～から前記タンパク質のＣ末端までのＢ鎖を含み、残基１６８～２９９間にジスルフィド結合を有する、請求項１０６に記載の融合タンパク質。
  108. 二本鎖活性化融合タンパク質であり、Ａ鎖およびＢ鎖を含み、前記Ａ鎖が、配列番号１０１５の残基２１～１７８からなり、前記Ｂ鎖が残基１７９～１０２２からなり；前記Ａ鎖およびＢ鎖が、配列番号１０１５のＣ１６８とＣ２９９との間で、ジスルフィド架橋を介して連結している、請求項８０～１０７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  109. 相補的多量体化ドメインの相互作用を介した二量体である、請求項８８に記載の融合タンパク質。
  110. 前記多量体化ドメインがＦｃドメインである、請求項１０９に記載の融合タンパク質。
  111. 請求項１～１１０のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
  112. 請求項１１１に記載の核酸分子を含むベクター。
  113. 原核生物ベクターである、請求項１１２に記載のベクター。
  114. 真核生物ベクターである、請求項１１２に記載のベクター。
  115. ウイルスベクターである、請求項１１２に記載のベクター。
  116. 酵母ベクターである、請求項１１２に記載のベクター。
  117. ヘルペスウイルスシンプレックスベクター、またはワクシニアウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、または昆虫ベクターである、請求項１１２～１１６のいずれか一項に記載のベクター。
  118. 発現ベクターである、請求項１１２～１１７のいずれか一項に記載のベクター。
  119. 遺伝子治療ベクターである、請求項１１２～１１７のいずれか一項に記載のベクター。
  120. 補体活性化によって媒介されるか、または補体活性化が関与する疾患または状態を処置する遺伝子治療のための、請求項１１１に記載の核酸、または請求項１１２～１１９のいずれか一項に記載のベクターの使用であって、補体活性化の阻害が、前記疾患または状態の処置または寛解をもたらす、使用。
  121. 補体活性化を阻害することによって補体媒介疾患を処置するのに使用される、請求項１１２～１１９のいずれか一項に記載のベクター。
  122. 補体活性化によって媒介されるか、または補体活性化が関与する疾患または状態を処置する方法であって、請求項１１１に記載の核酸分子または請求項１１２～１１９のいずれか一項に記載のベクターを投与することを含む方法。
  123. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、炎症性疾患および炎症性状態、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、心血管疾患、膜性増殖性疾患および膜性増殖性状態、眼科疾患もしくは眼科障害または眼疾患もしくは眼障害、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、移植臓器拒絶、ならびに虚血再灌流傷害から選択される、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記疾患または状態が、眼疾患もしくは眼科疾患であるか、または移植臓器に起因する拒絶もしくは炎症である、請求項１２２に記載の方法。
  125. 前記疾患または状態が、糖尿病性網膜症または黄斑変性である、請求項１２２に記載の方法。
  126. 前記疾患または状態が黄斑変性である、請求項１２２に記載の方法。
  127. 前記黄斑変性が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項１２５に記載の方法。
  128. 前記疾患または状態が、移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）である、請求項１２２に記載の方法。
  129. 前記疾患または状態が非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である、請求項１２２に記載の方法。
  130. 前記疾患または状態が補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）である、請求項１２２に記載の方法。
  131. 前記補体媒介疾患または状態が、炎症性疾患および炎症性状態、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、眼疾患、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、および虚血再灌流傷害から選択される、請求項１２０に記載の使用。
  132. 前記疾患または状態が、眼科疾患もしくは眼疾患であるか、または移植臓器に起因する拒絶もしくは炎症である、請求項１２０に記載の使用。
  133. 前記疾患または状態が、糖尿病性網膜症または黄斑変性である、請求項１２０に記載の使用。
  134. 前記疾患または状態が黄斑変性である、請求項１２０に記載の使用。
  135. 前記黄斑変性が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項１３３に記載の使用。
  136. 前記疾患または状態が、移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）である、請求項１２０に記載の使用。
  137. 前記疾患または状態が非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である、請求項１２０に記載の使用。
  138. 前記疾患または状態が補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）である、請求項１２０に記載の使用。
  139. 請求項１１１に記載の核酸分子または請求項１１２～１１９のいずれか一項に記載のベクターを含む、単離された細胞または細胞培養体。
  140. 請求項１１１に記載の核酸分子または請求項１１２～１１９のいずれか一項に記載のベクターを含む非ヒト細胞。
  141. 請求項１１１に記載の核酸分子または請求項１１２～１１９のいずれか一項に記載のベクターを含む単離された細胞であって、ヒト接合子でない、単離された細胞。
  142. 補体活性化を阻害する方法であって、活性形態である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を補体タンパク質Ｃ３と接触させることによって、補体活性化が低減または阻害されるように、補体タンパク質Ｃ３を切断することを含む方法。
  143. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドを補体タンパク質Ｃ３と接触させることが、インビトロで実施される、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドを補体タンパク質Ｃ３と接触させることが、インビボで実施される、請求項１４２に記載の方法。
  145. 補体活性化の前記阻害が、炎症性障害、神経変性障害、および心血管障害から選択される補体媒介疾患または補体媒介障害と関連する炎症性症状の軽減をもたらす、請求項１３８～１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、炎症性疾患および炎症性状態、敗血症、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、眼障害、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、および虚血再灌流傷害から選択される、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記虚血再灌流傷害が、心筋梗塞症（ＭＩ）、卒中、血管形成術、冠状動脈バイパス移植片、心肺バイパス（ＣＰＢ）、および血液透析から選択される事象または処置によって引き起こされる、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、対象の処置に由来する、請求項１４２～１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドによる処置が、対象の処置前に実施される、請求項１４２～１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 補体活性化によって媒介されるか、または補体活性化が関与する疾患または状態を処置する方法であって、活性形態である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含み、補体活性化の阻害が、前記疾患または状態の処置または寛解をもたらす、方法。
  151. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、炎症性疾患および炎症性状態、敗血症、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、眼疾患、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、および虚血再灌流傷害から選択される、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記疾患または状態が、眼疾患であるか、または移植臓器に起因する拒絶もしくは炎症である、請求項１５０に記載の方法。
  153. 前記疾患または状態が、糖尿病性網膜症または黄斑変性である、請求項１５０に記載の方法。
  154. 前記疾患または状態が黄斑変性である、請求項１５０に記載の方法。
  155. 前記黄斑変性が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項１５０に記載の方法。
  156. 前記疾患または状態が、移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）である、請求項１５０に記載の方法。
  157. 前記疾患または状態が非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である、請求項１５０に記載の方法。
  158. 前記疾患または状態が補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）である、請求項１５０に記載の方法。
  159. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチド、またはコードする核酸分子もしくはベクターが静脈内投与される、請求項１２０～１３８および１４２～１５８のいずれか一項に記載の方法または使用。
  160. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチド、またはコードする核酸分子もしくはベクターが皮下投与される、請求項１２０～１３８および１４２～１５８のいずれか一項に記載の方法または使用。
  161. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチド、またはコードする核酸分子もしくはベクターが眼に投与される、請求項１２０～１３８および１４２～１５８のいずれか一項に記載の方法または使用。
  162. 眼への投与が、硝子体内注射、または網膜下注射、または網膜内注射によって実施される、請求項１６１に記載の方法または使用。
  163. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、硝子液中への形質導入を促進するように形質導入ドメインに連結されている、請求項１６１または１６２に記載の方法または使用。
  164. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドがペグ化されている、請求項１２０～１３８および１４２～１６３のいずれか一項に記載の方法または使用。
  165. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化（ｆａｒｎｙｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、ＨＥＳ化、および／またはＰＡＳ化によって改変されている、請求項１２０～１３８および１４２～１６３のいずれか一項に記載の方法または使用。
  166. 単回投薬量が、投与経路に応じて、０．１～１０ｍｇである、請求項１２０～１３８および１４２～１６５のいずれか一項に記載の方法または使用。
  167. 前記処置が複数回繰り返される、請求項１２０～１３８および１４２～１６６のいずれか一項に記載の方法または使用。
  168. 前記処置が、２日毎に、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、毎週、月に２回、または毎月繰り返される、請求項１２０～１３８および１４２～１６７のいずれか一項に記載の方法または使用。
  169. 処置が、２ヵ月毎に、３ヵ月毎に、または４ヵ月毎に繰り返される、請求項１２０～１３８および１４２～１６８のいずれか一項に記載の方法。
  170. （ａ）請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質；および
    （ｂ）補体媒介疾患または補体媒介障害を処置するための１種または複数の第２の薬剤
    を含む組合せ。
  171. 前記第２の薬剤が、抗炎症剤または抗凝固剤である、請求項１７０に記載の組合せ。
  172. 前記第２の薬剤が、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、代謝拮抗薬、副腎皮質ステロイド、鎮痛薬、細胞傷害剤、炎症誘発性サイトカイン阻害剤、抗炎症サイトカイン、Ｂ細胞標的化剤、Ｔ抗原標的化化合物、接着分子遮断薬、ケモカイン受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ－γ（ガンマ）リガンド、補体阻害剤、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン、ＥＤＴＡ、シトラート、オキサラート、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびキシメラガトランのいずれか１つまたは複数から選択される抗炎症剤である、請求項１７０または１７１に記載の組合せ。
  173. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、改変Ｖ４１ＲまたはＶ４１Ｌを含む、請求項１２０～１３８および１４２～１６９のいずれか一項に記載の方法、使用、または組合せ。
  174. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが改変Ｖ４１Ｒを含む、請求項１２０～１３８および１４２～１６９のいずれか一項に記載の方法、使用、または組合せ。
  175. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが改変Ｖ３８Ｅ／Ｖ４１Ｒを含む、請求項１２０～１３８および１４２～１６９のいずれか一項に記載の方法、使用、または組合せ。
  176. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、改変Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ、またはＲ３７ａＳ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＧ／Ｈ９９Ｑを含む、請求項１２０～１３８および１４２～１６９のいずれか一項に記載の方法、使用、または組合せ。
  177. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、改変：Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒを含む、請求項１２０～１３８および１４２～１６９のいずれか一項に記載の方法、使用、または組合せ。
  178. 前記非改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項１７３～１７７のいずれか一項に記載の方法、使用、または組合せ。
  179. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質が、配列番号２１もしくは９８７に、または配列番号４０～４４、もしくはキモトリプシンナンバリングによるＣ１２２に改変がない配列番号４０～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２０～１３８および１４２～１７８のいずれか一項に記載の方法、使用、もしくは組合せ。
  180. ＤＧＦを処置する方法であって、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を静脈内投与することを含む方法。
  181. 非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を処置する方法であって、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む方法。
  182. 補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）を処置する方法であって、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む方法。
  183. 単回投薬量が、０．１～３ｍｇ、または０．１～２ｍｇ、または１～３ｍｇ、または１～１０ｍｇである、請求項１８０～１８２のいずれか一項に記載の方法。
  184. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質が、配列番号２１もしくは９８７に、または配列番号４０～４４、もしくはキモトリプシンナンバリングによるＣ１２２に改変がない配列番号４０～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項１８０～１８２のいずれか一項に記載の方法。
  185. 前記処置が複数回繰り返される、請求項１８０～１８４のいずれか一項に記載の方法。
  186. 前記処置が、２日毎に、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、毎週、月に２回、または毎月繰り返される、請求項１８０～１８５のいずれか一項に記載の方法。
  187. 処置が、２ヵ月毎に、３ヵ月毎に、または４ヵ月毎に繰り返される、請求項１８０～１８６のいずれか一項に記載の方法。
  188. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒを含む、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  189. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質が、配列番号２１もしくは９８７に示されるプロテアーゼドメイン、またはその触媒活性部分を含む、請求項１８０～１８８のいずれか一項に記載の方法。
  190. 眼科障害または眼障害を処置する方法であって、請求項１～７２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を眼に投与することを含む方法。
  191. 前記障害が、黄斑変性または糖尿病性網膜症である、請求項１９０に記載の方法。
  192. 前記障害がＡＭＤである、請求項１９１に記載の方法。
  193. 単回投薬量が、０．１ｍｇ／眼から２ｍｇ／眼または３ｍｇ／眼である、請求項１９０～１９２のいずれか一項に記載の方法。
  194. 単回投薬量が、１ｍｇ／眼から２ｍｇ／眼である、請求項１９０～１９２のいずれか一項に記載の方法。
  195. 単回投薬量が０．１～１ｍｇである、請求項１９０～１９２のいずれか一項に記載の方法。
  196. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号２１もしくは９８７のいずれかに、または配列番号４０～４４、もしくはキモトリプシンナンバリングによるＣ１２２に改変がない配列番号４０～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項１８０～１９５のいずれか一項に記載の方法。
  197. 前記処置が複数回繰り返される、請求項１８０～１９６のいずれか一項に記載の方法。
  198. 前記処置が、２日毎に、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、毎週、月に２回、毎月、２ヵ月毎に、３ヵ月毎に、または４ヵ月毎に繰り返される、請求項１８０～１９７のいずれか一項に記載の方法。
  199. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９ＲまたはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒを含む、請求項１８０～１９８のいずれか一項に記載の方法。
  200. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、置換Ｙ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡを含む、請求項１８０～１９９のいずれか一項に記載の方法。
  201. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号２１もしくは９８７に示されるプロテアーゼドメイン、またはその触媒活性部分を含む、請求項１８０～２００のいずれか一項に記載の方法。
  202. ＡＭＤまたはＤＧＦを処置するための改変ｕ－ＰＡポリペプチドの使用であって、前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、置換Ｒ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｃ１２２Ｓ／Ｙ１４９Ｒ、またはＲ３５Ｑ／Ｈ３７Ｙ／Ｒ３７ａＥ／Ｖ３８Ｅ／Ｔ３９Ｙ／Ｖ４１Ｒ／Ｄ６０ａＰ／Ｙ６０ｂＱ／Ｔ９７ａＩ／Ｌ９７ｂＡ／Ｈ９９Ｑ／Ｙ１４９Ｒ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡ／Ｃ１２２Ｓ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｌ／Ｌ９７ｂＡ、またはＹ４０Ｑ／Ｖ４１Ｒ／Ｌ９７ｂＡを含む、使用。
  203. 補体活性化を阻害するための、活性形態である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
  204. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドを補体タンパク質Ｃ３と接触させることによって、補体活性化が低減または阻害されるように、補体タンパク質Ｃ３を切断し；
    前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドを補体タンパク質Ｃ３と接触させることが、インビトロで、またはヒト以外の動物において実施される、請求項２０３に記載の使用。
  205. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドを補体タンパク質Ｃ３と接触させることが、インビボで実施される、請求項２０３に記載の使用。
  206. 補体活性化の前記阻害が、炎症性障害、神経変性障害、および心血管障害から選択される補体媒介疾患または補体媒介障害と関連する炎症性症状の軽減をもたらす、請求項２０３～２０５のいずれか一項に記載の使用。
  207. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、炎症性疾患および炎症性状態、敗血症、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、眼障害、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、および虚血再灌流傷害から選択される、請求項２０６に記載の使用。
  208. 前記虚血再灌流傷害が、心筋梗塞症（ＭＩ）、卒中、血管形成術、冠状動脈バイパス移植片、心肺バイパス（ＣＰＢ）、および血液透析から選択される事象または処置によって引き起こされる、請求項２０７に記載の使用。
  209. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、対象の処置に由来する、請求項２０３～２０８のいずれか一項に記載の使用。
  210. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドによる処置が、対象の処置前に実施される、請求項２０３～２０９のいずれか一項に記載の使用。
  211. 補体活性化によって媒介されるか、または補体活性化が関与する疾患または状態を処置するための、活性形態である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用であって、補体活性化の阻害が、前記疾患または状態の処置または寛解をもたらす、使用。
  212. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、炎症性疾患および炎症性状態、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、眼疾患、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、および虚血再灌流傷害から選択される、請求項２１１に記載の使用。
  213. 遺伝子治療のための、請求項１～４２のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチドをコードする核酸、または前記核酸を含むベクターの使用。
  214. 前記疾患または状態が、眼疾患であるか、または移植臓器に起因する拒絶もしくは炎症である、請求項２１１～２１３のいずれか一項に記載の使用。
  215. 前記疾患または状態が、糖尿病性網膜症または黄斑変性である、請求項２１１または２１３に記載の使用。
  216. 前記疾患または状態が黄斑変性である、請求項２１１または２１３に記載の使用。
  217. 前記黄斑変性が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項２１６に記載の使用。
  218. 前記疾患または状態が、移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）である、請求項２１１または２１３に記載の使用。
  219. 前記疾患または状態が非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である、請求項２１１または２１３に記載の使用。
  220. 前記疾患または状態が補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）である、請求項２１１または２１３に記載の使用。
  221. 眼科障害の処置用の硝子体内注射、または網膜内注射、または網膜下注射のための、請求項２１３～２１８のいずれか一項に記載の使用。
  222. 単回投薬量が０．１～１ｍｇである、請求項２２１に記載の使用。
  223. 単回投薬量が０．１ｍｇ／眼から２ｍｇ／眼または３ｍｇ／眼である、請求項２２１に記載の使用。
  224. 単回投薬量が、１ｍｇ／眼から２ｍｇ／眼である、請求項２２１に記載の使用。
  225. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドが、配列番号２１もしくは９８７に、または配列番号４０～４４、もしくはキモトリプシンナンバリングによるＣ１２２に改変がない配列番号４０～４４のいずれかに示されるアミノ酸残基の配列を含む、請求項２０３～２２４のいずれか一項に記載の使用。
  226. 前記処置が複数回繰り返される、請求項２０３～２２５のいずれか一項に記載の使用。
  227. 前記処置が、２日毎に、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、毎週、月に２回、毎月、２ヵ月毎に、３ヵ月毎に、または４ヵ月毎に繰り返される、請求項２０３～２２６のいずれか一項に記載の使用。
  228. 改変ｕ－ＰＡポリペプチドを製造する方法であって、
    請求項１～７９のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸またはベクターを細胞中に導入することと；
    前記ポリペプチドが発現される条件下で前記細胞を培養することと；
    適宜、発現された前記ポリペプチドを単離することと
    を含む方法。
  229. 前記細胞が真核生物細胞である、請求項２２８に記載の方法。
  230. 前記細胞が、哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項２２９に記載の方法。
  231. 請求項１～７９のいずれか一項に記載の改変ｕ－ＰＡポリペプチド、または請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、医薬的に許容される媒体内に含む医薬組成物。
  232. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質が、二本鎖活性化形態である、請求項２３１に記載の医薬組成物。
  233. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質が、配列番号２１または配列番号９８７のプロテアーゼドメインを含む、請求項２３０または２３１に記載の医薬組成物。
  234. 前記改変ｕ－ＰＡポリペプチドまたは融合タンパク質が、配列番号１０１５または１０１９に示される配列を有する、請求項２３１～２３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  235. 補体媒介疾患または補体媒介障害または補体媒介状態の処置に使用される、請求項２３１～２３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  236. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、炎症性障害、神経変性障害、および心血管障害から選択される、請求項２３５に記載の医薬組成物。
  237. 前記補体媒介疾患または補体媒介障害が、炎症性疾患および炎症性状態、補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、眼障害、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症性筋無力症（ＭＧ）、喘息、炎症性腸疾患、免疫複合体（ＩＣ）媒介急性炎症性組織傷害、アルツハイマー病（ＡＤ）、および虚血再灌流傷害から選択される、請求項２３５に記載の医薬組成物。
  238. 前記疾患または傷害が、眼疾患であるか、または移植臓器に起因する拒絶もしくは炎症である、請求項２３５に記載の医薬組成物。
  239. 前記疾患または状態が、糖尿病性網膜症または黄斑変性である眼疾患である、請求項２３８に記載の医薬組成物。
  240. 前記疾患または傷害状態が黄斑変性である、請求項２３９に記載の方法。
  241. 前記黄斑変性が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項２４０に記載の方法。
  242. 前記疾患または状態が、移植腎機能発現遅延（ＤＧＦ）である、請求項２３５に記載の方法。
  243. 前記疾患または状態が非定型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である、請求項２３５に記載の方法。
  244. 前記疾患または状態が補体３糸球体症（Ｃ３Ｇ）である、請求項２３５に記載の方法。
JP2021538046A 2018-12-28 2019-12-27 改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータポリペプチドおよび使用方法 Pending JP2022516725A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862786302P 2018-12-28 2018-12-28
US62/786,302 2018-12-28
PCT/US2019/068839 WO2020140101A1 (en) 2018-12-28 2019-12-27 Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022516725A true JP2022516725A (ja) 2022-03-02
JPWO2020140101A5 JPWO2020140101A5 (ja) 2023-02-03

Family

ID=69400631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021538046A Pending JP2022516725A (ja) 2018-12-28 2019-12-27 改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータポリペプチドおよび使用方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20230242895A1 (ja)
EP (1) EP3902913A1 (ja)
JP (1) JP2022516725A (ja)
KR (1) KR20210110848A (ja)
CN (1) CN113661239A (ja)
AU (1) AU2019413431A1 (ja)
CA (2) CA3123872A1 (ja)
CL (1) CL2021001710A1 (ja)
CO (1) CO2021008338A2 (ja)
IL (1) IL284323A (ja)
JO (1) JOP20210146A1 (ja)
MX (1) MX2021007843A (ja)
PE (1) PE20211664A1 (ja)
SG (1) SG11202106244RA (ja)
WO (1) WO2020140101A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ760116A (en) 2017-06-22 2024-03-22 Vertex Pharma Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
CN114854728B (zh) * 2022-05-12 2023-11-24 云南师范大学 一种脯氨酸消旋酶及其制备和应用

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US844A (en) 1838-07-17 Boiler for
US5990A (en) 1848-12-26 of baltimore
US569A (en) 1838-01-09 Caruiag-e-spiiln g
US5795A (en) 1848-09-19 Saddletree for carts
US5324A (en) 1847-10-09 Cooking-stove
US237A (en) 1837-06-15 Egbert beale
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4997766A (en) 1986-07-11 1991-03-05 American Home Products Corporation Poly-kringle plasminogen activator
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
EP0266032A1 (en) * 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme
US5580559A (en) 1986-12-05 1996-12-03 Ciba-Geigy Corporation Hybrid plasminogen activator
NL8701021A (nl) 1987-04-29 1988-11-16 Stichting Centraal Lab Humane t-pa(u-pa) substitutie-mutant eiwitten, daarvoor coderend recombinant dna, getransfecteerde gastheercellen, bereiding van de mutant eiwitten, en farmaceutische preparaten.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
EP0336508A1 (en) * 1988-04-06 1989-10-11 K.U. Leuven Research & Development Recombinant human single-chain urokinase-type plasminogen activator mutant produced by site-specific mutagenesis of lysine 158 to histidine 158
AU3410289A (en) 1988-04-22 1989-11-24 Collaborative Research Inc. Plasminogen activators with increased fibrin selectivity
GB8822147D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Ciba Geigy Ag Pharmaceutically active combination
JPH04506897A (ja) 1988-10-27 1992-12-03 ネーデルランセ　オルハニサチエ　フォール　トゥーヘパスト―ナツールウェーテンシャッペ　ルック　オンデルズク　テーエヌオー 修飾されたクリングルドメインを有する血栓溶解剤
ATE226636T1 (de) 1989-03-06 2002-11-15 Univ Texas Serpin-resistenter t-pa; mutanten; gene
EP0387380A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-19 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Mutants of urinary plasminogen activator, their production and use
JPH04506148A (ja) 1989-04-07 1992-10-29 カンサーフォースクニングスフォンデン・アフ・１９８９（フォンデン・チル・フレメ・アフ・エクスペリメンテル・カンサーフォースクニング） ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター
US5891664A (en) 1989-04-07 1999-04-06 Cancerforskningsfondet Af 1989 Vectors and methods for recombinant production of uPA-binding fragments of the human urokinase-type plasminogen receptor (uPAR)
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE3921528A1 (de) 1989-06-30 1991-01-10 Draegerwerk Ag Messzelle fuer den elektrochemischen gasnachweis
US5129569A (en) 1989-12-21 1992-07-14 Stanton Norman C Apparatus to attach a flexible covering to a semi-rigid member
US5648253A (en) 1990-12-20 1997-07-15 Tsi Corporation Inhibitor-resistant urokinase
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
GB9216558D0 (en) 1992-08-04 1992-09-16 British Bio Technology Modified proteases
US5571708A (en) 1993-04-19 1996-11-05 Bristol-Myers Squibb Company Thrombin-activatable plasminogen activator
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5472692A (en) * 1993-07-02 1995-12-05 New England Deaconess Hospital Corporation Pro-urokinase mutants
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
CZ288926B6 (cs) 1994-03-31 2001-09-12 Amgen Inc. MGDF derivát, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek s jeho obsahem
US5811252A (en) 1994-07-07 1998-09-22 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Modified proenzymes as substrates for proteolytic enzymes
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996013160A1 (en) 1994-11-01 1996-05-09 New England Deaconess Hospital Use of urokinase-type plasminogen activators to inhibit hiv infectivity
US5980886A (en) 1994-12-14 1999-11-09 University Of Washington Recombinant vectors for reconstitution of liver
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US7070925B1 (en) 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
WO1999045026A1 (en) 1998-03-05 1999-09-10 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule
US20020106775A1 (en) 1999-03-05 2002-08-08 Jieyi Wang Highly crystalline urokinase
AU2903899A (en) 1998-03-12 1999-09-27 Shearwater Polymers Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
WO2000002017A2 (en) 1998-07-03 2000-01-13 Neles Field Controls Oy Method and arrangement for measuring fluid
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
EP1157275A4 (en) 1999-02-28 2003-01-15 Univ Washington NEW TRANSDUCTION MOLECULES AND METHOD FOR USING THE SAME
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6461802B1 (en) 1999-08-02 2002-10-08 Agfa-Gevaert Adhesive layer for polyester film
WO2001032711A2 (en) 1999-10-21 2001-05-10 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Adeno-associated virus aav rep78 major regulatory protein, mutants thereof and uses thereof
ATE317868T1 (de) 1999-12-22 2006-03-15 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
AU7485301A (en) 2000-05-16 2001-11-26 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
US6680178B2 (en) 2000-06-02 2004-01-20 The Regents Of The University Of California Profiling of protease specificity using combinatorial fluorogenic substrate libraries
GB0103110D0 (en) 2000-08-25 2001-03-28 Aventis Pharma Inc A membrane penetrating peptide encoded by a nuclear localization sequence from human period 1
WO2002040503A2 (en) 2000-11-17 2002-05-23 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the plau gene
MXPA00011713A (es) 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
DE60144439D1 (de) 2000-12-20 2011-05-26 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
DE10153601A1 (de) 2001-11-02 2003-05-22 Paion Gmbh DSPA zur Behandlung von Schlaganfall
AU2002352524B2 (en) 2001-11-07 2007-10-04 Nektar Therapeutics Branched polymers and their conjugates
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7192468B2 (en) 2002-04-15 2007-03-20 Fluor Technologies Corporation Configurations and method for improved gas removal
KR20120088836A (ko) 2002-10-02 2012-08-08 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
US20040147027A1 (en) 2003-01-28 2004-07-29 Troy Carol M. Complex for facilitating delivery of dsRNA into a cell and uses thereof
US20060178297A1 (en) 2003-01-28 2006-08-10 Troy Carol M Systems and methods for silencing expression of a gene in a cell and uses thereof
DK1596887T3 (da) 2003-02-26 2022-06-20 Nektar Therapeutics Polymer-Faktor VIII-konjugat
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
CN1311076C (zh) 2003-04-16 2007-04-18 普罗特奥姆技术公司 生产重组尿激酶的方法
CA2426115A1 (en) 2003-04-18 2004-10-18 Victor Gurewich Methods, devices, and compositions for lysis of occlusive blood clots while sparing wound sealing clots
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
DK2644206T3 (da) 2003-05-23 2019-06-11 Nektar Therapeutics PEG-derivater indeholdende to PEG-kæder
US7595306B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Method of treating neurodegenerative disease
AU2004316996A1 (en) 2003-06-20 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Polypeptide transduction and fusogenic peptides
PT1718677E (pt) 2003-12-19 2012-07-18 Genentech Inc Fragmentos de anticorpo monovalentes úteis como agentes terapêuticos
GB0405330D0 (en) 2004-03-10 2004-04-21 Astrazeneca Ab Enzyme and preparation method
US7811771B2 (en) 2004-12-23 2010-10-12 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Method for the functional determination of mannan-binding-lectin associated serine proteases (MASPs) and complexes thereof
EP1940457B1 (en) 2005-10-21 2012-12-12 Catalyst Biosciences, Inc. Modified proteases that inhibit complement activation
JP2009513158A (ja) 2005-11-01 2009-04-02 アリゾナ ボード オブ リージェンツ ア ボディー コーポレート アクティング オン ビハーフ オブ アリゾナ ステイト ユニバーシティ 新規タンパク質伝達ドメインおよびその使用
US7579318B2 (en) 2005-12-06 2009-08-25 Centre De La Recherche De La Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
KR100859972B1 (ko) 2006-02-20 2008-09-25 이화여자대학교 산학협력단 막투과 단백질 도메인 펩타이드
EP1867661A1 (en) 2006-06-12 2007-12-19 Diatos Compositions and methods for delivering anti-activated ras antibodies into cells
US20090010916A1 (en) 2006-06-22 2009-01-08 Victor Gurewich C-1 Inhibitor prevents non-specific plasminogen activation by a prourokinase mutant without impeding fibrin-specific fibrinolysis
EP2046951B1 (en) 2006-07-05 2011-10-26 Catalyst Biosciences, Inc. Protease screening methods and proteases identified thererby
EP2242501A4 (en) 2008-01-09 2011-10-19 Intrexon Corp THERAPEUTIC INHIBITORS OF PAI-I FUNCTION AND METHODS OF USE

Also Published As

Publication number Publication date
CA3176021A1 (en) 2020-07-02
WO2020140101A1 (en) 2020-07-02
CN113661239A (zh) 2021-11-16
CO2021008338A2 (es) 2021-10-29
US20230242895A1 (en) 2023-08-03
KR20210110848A (ko) 2021-09-09
CA3123872A1 (en) 2020-07-02
SG11202106244RA (en) 2021-07-29
JOP20210146A1 (ar) 2023-01-30
PE20211664A1 (es) 2021-08-26
IL284323A (en) 2021-08-31
AU2019413431A1 (en) 2021-07-08
EP3902913A1 (en) 2021-11-03
MX2021007843A (es) 2021-08-11
CL2021001710A1 (es) 2021-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11807882B2 (en) Modified membrane type serine protease 1 (MTSP-1) polypeptides and methods of use
US11613744B2 (en) Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
US20230242895A1 (en) Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
JP5219819B2 (ja) 補体活性化を阻害する修飾プロテアーゼ
US11524050B2 (en) C3B binding polypeptide
JP2020527331A (ja) Ｃ３ｂ不活性化ポリペプチド
KR20150003785A (ko) 발작성 야간혈색뇨증의 치료를 위해 masp-1, masp-2 및/또는 masp-3를 억제하는 조성물 및 방법
JP2003515338A (ja) 補体結合酵素、ｍａｓｐ−３、及びその使用
KR20190017868A (ko) Gm-csf 변이체 및 사용 방법
CN115551529A (zh) 增强房水流出并降低眼内压的方法

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20221212

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221222

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231128

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240227