KR20190017868A

KR20190017868A - Gm-csf 변이체 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20190017868A
Application number: KR1020197000107A
Authority: KR
Inventors: 토마스 루트코스키; 알렉세이 테플리야코프; 니콜 운더러
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2017-06-07
Publication date: 2019-02-20
Also published as: JP2019524062A; EP3468603A2; US10562948B2; CN109328071A; UY37281A; WO2017214249A2; US11208450B2; CA3026803A1; WO2017214249A3; ES2913497T3; JP7050007B2; JP2022043051A; IL263379A; CN109328071B; EP3468603B1; US20200148736A1; US20170355742A1; DK3468603T3; PT3468603T; AU2017277438A1

Abstract

과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 변이체, GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 면역-관련 장애, 예컨대 염증성 장 질병 (IBD)의 치료를 위한 GM-CSF 변이체의 제조 및 사용 방법이 개시된다. GM-CSF 변이체의 아미노산 서열 및 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 추가로 개시된다.

Description

GM-CSF 변이체 및 사용 방법

본 발명은 GM-CSF 변이체, 이를 인코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

염증성 장 질병 (IBD)은, 전형적으로 설사, 경련, 복부 통증, 체중 손실 및 직장 출혈, 피로감, 빈혈, 누공, 천공, 장의 폐색 및 외과적 중재에 대한 빈번한 필요성을 특징으로 하는 미지의 병인의 장애이다. 미국 질병 통제 예방 센터(US Center for Disease Control and Prevention)에 따르면, 미국에서는 약 140만 명의 사람들이 IBD를 앓고 있으며, 이로써 이는 미국에서 가장 유행하는 위장 질병 중 하나가 된다. 미국에서 IBD의 전체 건강관리 비용은 미국 달러로 연간 17억 달러를 초과하는 것으로 추정된다.

크론병, 궤양성 결장염, 불확정 결장염, 현미경적 결장염 및 콜라겐성 결장염을 비롯한 다수의 장애가 IBD의 부류 내에 속한다. IBD의 가장 일반적인 형태는 크론병 및 궤양성 결장염이다. 궤양성 결장염은 대장 (결장) 및 직장에 영향을 미치며, 장벽의 내층(inner lining) (예를 들어, 점막 및 점막하 층)을 침범한다. 크론병은 위장관의 임의의 섹션 (예를 들어, 입, 식도, 위, 소장, 대장, 직장, 항문 등)에 영향을 미칠 수 있고, 장벽의 모든 층을 침범할 수 있다. IBD의 임상 증상은 직장 및/또는 장 출혈, 복부 통증 및 경련, 설사, 및 체중 손실을 포함한다. 게다가, IBD는 결장암에 대한 위험 인자이며, 결장암에 대한 이러한 위험은 IBD가 8 내지 10년이 지난 후에 유의하게 증가한다.

IBD는 치유되지 않는다. 현재의 요법은 염증성 과정을 감소시키는 것 및 질병과 관련된 염증성 과정의 해로운 효과를 감소시키는 것을 지향하며, 항염증 약물 (예를 들어, APRISO® (메살라민), AZULFIDINE® (설파살라진), REMICADE® (인플릭시맙), HUMIRA® (아달리무맙, 프레드니손, 부데소니드) 및 면역억제 약물 (예를 들어, 6-메르캅토푸린, 아자티오프린, 사이클로스포린)의 투여를 포함한다. 그러한 요법은 구역, 구토, 식욕 부진, 소화불량, 권태, 두통, 복통, 열, 발진, 췌장염, 골수 억제, 항체의 형성, 주입 반응, 및 증가된 기회성 감염과 같은 유해한 부작용과 관련될 수 있다.

따라서, IBD에 대한 추가의 요법에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF와 대비하여 치환 S29C 및 치환 S69C를 포함하고, 선택적으로 서열 번호 1의 잔기 R23, L49 또는 K107에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 적어도 하나의 치환을 추가로 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 2, 3, 4, 6, 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF와 대비하여 치환 S29C 및 치환 S69C를 포함하고, 선택적으로 서열 번호 1의 잔기 R23, L49 또는 K107에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 적어도 하나의 치환을 추가로 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공하며, 상기 GM-CSF 변이체는 반감기 연장 모이어티(half-life extending moiety)에 접합된다.

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 GM-CSF 변이체가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 GM-CSF 변이체를 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 염증성 장 질병 (IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 IBD를 치료하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 GM-CSF 변이체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

도 1은 GM-CSF의 안정성을 개선하기 위하여 조작이 고려되는 잔기를 보여주는 인간 GM-CSF의 구조 (PDB: 2GMF (문헌[Rozwarski et al., 1996]))를 나타낸다.
도 2a는 잔기 1-60으로부터의 다양한 GM-CSF 변이체들 사이의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 행의 시작 지점의 숫자는 아미노산 서열의 서열 번호를 나타낸다.
도 2b는 잔기 61-127로부터의 다양한 GM-CSF 변이체들 사이의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 행의 시작 지점의 숫자는 아미노산 서열의 서열 번호를 나타낸다.
도 3은 3 mg/mL 판크레아틴을 함유하는 FaSSIF(fasted state simulated intestinal fluid) 중에서의 시간 경과 (이 도면에 나타낸 바와 같이 1, 10 및 30분)에 따른 S29C/S69C, L49P, S29C/S69C/K107I 및 S29C/S69C/R23L/L49P/K107I GM-CSF 변이체의 안정성을 나타낸다. C: 대조군.
도 4a는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성은 3 mg/mL 판크레아틴이 보충된 FaSSIF와의 30분 인큐베이션 후에 유지된 반면, 야생형 GM-CSF의 생물학적 활성은 완전히 소실되었음을 나타낸다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 4b는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이, 3 mg/mL 판크레아틴이 보충된 FaSSIF와의 1시간 인큐베이션 후에 FaSSIF + 판크레아틴을 함유하지 않는 야생형 GM-CSF와 비견되는 수준으로 유지되었음을 나타낸다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 4c는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성은 3 mg/mL 판크레아틴이 보충된 FaSSIF와의 4시간 인큐베이션 후에 FaSSIF + 판크레아틴을 함유하지 않는 야생형 GM-CSF와 비견되는 수준으로 유지되었으며, 변이체 S29C/L49P/S69C/K107I는 이 시점에서 약간의 활성을 보여줌을 나타낸다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 4d는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이 3 mg/mL 판크레아틴이 보충된 FaSSIF와의 6시간의 인큐베이션 후에 유지되었음을 나타낸다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 5a는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성은 나이브(

) 사이노몰거스 원숭이 (CC)로부터의 결장 내용물과 함께 30분 동안 인큐베이션 후에 유지된 반면, 야생형 GM-CSF의 생물학적 활성은 거의 완전히 소실되었음을 나타낸다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 5b는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이 나이브 사이노몰거스 원숭이 (CC)로부터의 결장 내용물과 함께 2시간 동안 인큐베이션 후에 유지되었음을 나타낸다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 5c는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이 나이브 사이노몰거스 원숭이 (CC)로부터의 결장 내용물과 함께 6시간 동안 인큐베이션 후에 유지되었음을 나타낸다. GM-CSF의 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체는 비처리 변이체 사이토카인과 대비하여 5배 활성 손실을 나타낸 반면, 야생형 GM-CSF의 활성은 완전히 소실되었다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 5d는 GM-CSF 및 그의 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이 나이브 사이노몰거스 원숭이 (CC)로부터의 결장 내용물과 함께 24시간 동안 인큐베이션 후에 소실되었음을 나타낸다. PP1A7: 야생형 GM-CSF, GSFD96: R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체; GSFD97: S29C/L49P/S69C/K107I 변이체. STAT5의 Tyr694의 퍼센트 (%) 인산화를 평가함으로써 TF-1 세포에서 생물학적 활성을 측정하였으며, 검정에 사용된 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.
도 6은 S29C 및 S69C 돌연변이를 갖는 GM-CSF 변이체의 컨센서스 서열을 나타낸다.

본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 등가의 임의의 조성물 및 방법이 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있으나, 예시적인 조성물 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.

"폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 다른 등가의 공유결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 분자를 지칭한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.

"폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합으로 결합된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다.

"펩티드"는 길이가 최대 30개의 아미노산인 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.

"벡터"는 생물 시스템 내에서 복제가 가능하거나, 이러한 시스템 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 생물 시스템, 예컨대 세포, 바이러스, 동물, 식물 및 벡터를 복제할 수 있는 생물 성분을 이용하는 재구성된 생물 시스템에서 이러한 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 요소, 예컨대 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커를 함유한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥인 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 하이브리드일 수 있다.

"발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 지칭한다.

"상보적 서열"은 단리된 제1 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 역평행하고, 제1 폴리뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

"약"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 값이 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 어떻게 그 값이 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 제한사항에 부분적으로 좌우될 것이다. 특정 검정, 결과 또는 실시 형태와 관련하여 실시예에서 또는 명세서에서의 어딘가 다른 곳에서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "약"은 당업계의 관행에 따른 1 표준 편차, 또는 최대 5%의 범위 어느 쪽이든 더 큰 값 이내에 있음을 의미한다.

"샘플"은 대상체 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라, 대상체로부터 단리된 유사한 유체, 세포, 또는 조직의 집합을 지칭한다. 예시적인 샘플은 생물학적 유체, 예컨대 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 림프, 소변, 타액, 낭액, 눈물 방울, 배설물, 객담, 분비 조직 및 장기의 점막 분비물, 질 분비물, 복수액, 흉강, 심낭, 복막강, 복강 및 다른 체강의 유체, 기관지 세척에 의해 수집된 유체, 윤활액, 대상체 또는 생물학적 공급원과 접촉된 액체 용액, 예를 들어, 세포 또는 장기 컨디셔닝된 배지를 포함하는 세포 및 장기 배양 배지, 세척액 등, 조직 생검물, 세침 흡인물, 또는 외과적으로 절제된 조직이다.

"와 병용하여"는 둘 이상의 치료제가 대상체에게 혼합물 상태로 함께 투여되거나, 단제(single agent)로서 동시에 투여되거나, 또는 단제로서 임의의 순서로 순차적으로 투여됨을 의미한다.

"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 언급된 경우를 제외하고는, 용어 "환자"와 "대상체"는 상호교환 가능하게 사용된다.

"변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 참조 폴리펩티드 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 변이체는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 하나 이상의 변형, 예를 들어 치환, 삽입, 또는 결실에 의해, 서열 번호 1의 야생형 성숙 GM-CSF 폴리펩티드, 또는 서열 번호 18의 서열을 갖는 야생형 성숙 GM-CSF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상이하다.

"단리된"은 분자가 생성되는 시스템, 예컨대 재조합 세포의 다른 성분으로부터 실질적으로 분리되고/되거나 정제된 분자 (예컨대 합성 폴리뉴클레오티드 또는 합성 폴리펩티드)의 상동 집단뿐만 아니라, 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 단백질을 지칭한다. "단리된 GM-CSF 변이체"는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 GM-CSF 변이체를 지칭하며, 더 높은 순도로, 예컨대 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도로 단리된 변이체를 포함한다.

"염증성 장 질병 (IBD)"은 GI 관에서의 염증 활성을 특징으로 하는 장애 또는 질병을 지칭한다. IBD는 크론병, 궤양성 결장염, 요네병, 베체트 증후군, 콜라겐성 결장염, 전환 결장염, 불확정 결장염, 현미경적 결장염, 감염성 결장염, 허혈성 결장염, 림프구성 결장염, 소장 및/또는 근위 소장의 특발성 염증, IBD-관련 설사, 및 위장관과 밀접하게 관련된 질병 및 장애를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

본 명세서 전체에 걸쳐, GM-CSF 변이체에서 치환된 잔기들은 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF에서의 그들의 위치에 따라 넘버링된다. 예를 들어, 본 명세서에서의 "S29C"는 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF에서의 위치 29에 상응하는 잔기 위치에서의 세린의 시스테인으로의 치환을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 천연 아미노산의 약어가 표 1에 제시되어 있다.

[표 1]

조성물

본 발명은 야생형 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)와 대비하여 향상된 안정성 및/또는 생물학적 활성을 갖는 GM-CSF 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한 위장관의 환경을 모방한 환경에서 개선된 안정성을 갖는 GM-CSF 변이체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 경구 투여에 적합할 수 있다.

본 발명의 GM-CSF 변이체는 염증성 장 질병 (IBD), 또는 GM-CSF 활성의 증강이 요구되는 다른 질병 또는 질환을 가진 대상체의 치료적 치료(therapeutic treatment)에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 세포주는 본 발명의 GM-CSF 변이체를 생성하는 데 유용하다.

GM-CSF는 장 선천 면역의 핵심 조절인자이고 (문헌[

, 2014]), 장 장벽 완전성의 유지에 역할을 한다. 최근의 증거는 장용(enteric) GM-CSF가 또한 점막에서 내성을 유지하는 데 관여한다는 것을 입증한다 (문헌[Mortha et al., 2014]). 일부 크론병 (CD) 환자에서, 병인은 선천 면역 시스템의 조절이상, 구체적으로는 호중구 기능의 부전 및 다른 GM-CSF-반응성 면역 세포 기능의 부전인 것으로 가정되어 왔다 (문헌[Korzenik & Dieckgraefe, 2000]).

CD를 가진 환자에서 관해를 유도하는 능력에 대하여 전신 GM-CSF 투여가 임상에서 시험되어 왔다 (문헌[Dieckgraefe & Korzenik, 2002]; 문헌[Kelsen et al., 2010]; 문헌[Korzenik, 2005]; 문헌[Vaughan & Drumm, 1999]). 몇 가지 유망한 초기 임상 결과에도 불구하고, 몇몇 유해 사건이 II 상 CD 시험에서 GM-CSF 처리군에서 발견되었다 (문헌[Valentine et al., 2009]). 또한, IBD 환자에서의 혈전증 및 폐의 장애에 대하여 문헌에 기재된 증가된 위험 (Bernstein, Blanchard, Houston, & Wajda, 2001; Bernstein, Wajda, & Blanchard, 2008)이 또한 전신 GM-CSF 요법에 의해 증악될 수 있다.

국부 GI 전달을 위해 경구 투여되는 GM-CSF는 환자 순응도로부터뿐만 아니라 전신 노출을 최소화함으로써 안전성 관점으로부터 더 바람직한 것으로 입증될 수 있다. 그러나, 하부 위장관으로의 단백질의 경구 전달은 생물학적 약물이 노출될 가혹한 pH, 단백질 분해, 및 미생물 환경으로 인해 어려움을 제시한다 (문헌[Amidon, Brown, & Dave, 2015]). 실제로, GM-CSF의 것과 유사한 4-나선 번들 성장 인자는 시험관내(in vitro)에서 소화 프로테아제에 의해 신속하게 분해되는 것으로 입증되어 있다 (문헌[Jensen-Pippo, Whitcomb, DePrince, Ralph, & Habberfield, 1996]).

본 발명은 또한 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF와 대비하여 치환 S29C 및 치환 S69C를 포함하고, 선택적으로 서열 번호 1의 잔기 R23, L49 또는 K107에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 적어도 하나의 치환을 추가로 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공한다. 서열 번호 33은 S29C 및 S69C 치환 및 선택적으로 잔기 위치 R23, L49 또는 K107에서의 치환을 갖는 GM-CSF 변이체의 컨센서스 서열이다.

서열 번호 33

APARSPSPSTQPWEHVNAIQEAX₁RLLNLCRDTAAEMNETVEVISEMFDX₂QEPTCLQTRLELYKQGLRGCLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFX₃ENLKDFLLVIPFDCWEPVQE (상기 식에서,

X₁은 R 또는 L이고;

X₂는 L 또는 P이고;

X₃은 K 또는 I임).

S29C 치환 및 S69C 치환을 포함하는 GM-CSF 변이체는 야생형 GM-CSF와 대비하여 더 안정하고 더 강력하다. 이들 치환은 GM-CSF 루프 AB와 루프 BC를 연결하는 신규한 이황화물 결합을 생성한다.

S29C 치환 및 S69C 치환을 갖는 예시적인 GM-CSF 변이체는 서열 번호 2, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 서열을 갖는 변이체이다.

본 발명은 또한 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF와 대비하여 치환 S29C 및 치환 S69C를 포함하고, 선택적으로 서열 번호 1의 잔기 R23, L49 또는 K107에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 적어도 하나의 치환을 추가로 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공하며, 상기 변이체는 야생형 GM-CSF의 것과 대비하여 적어도 약 5℃ 더 높은 용융 온도 (T_m)를 나타내며, 여기서 T_m은 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 시차 주사 열량측정법을 사용하여 측정된다.

더 높은 T_m (예를 들어, 증가된 열 안정성)을 갖는 GM-CSF 변이체는 단백질 분해에 대한 개선된 저항성을 가질 것으로 예상되는데, 이는, 증가된 열 안정성이 일반적으로 단백질 분해에 대한 개선된 저항성으로 변환되기 때문이다 (문헌[Akasako, Haruki, Oobatake, & Kanaya, 1995]; 문헌[Daniel, Cowan, Morgan, & Curran, 1982]; 문헌[McLendon & Radany, 1978]; 문헌[Parsell & Sauer, 1989]).

본 발명은 또한 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF와 대비하여 치환 S29C 및 치환 S69C를 포함하고, 선택적으로 서열 번호 1의 잔기 R23, L49 또는 K107에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 적어도 하나의 치환을 추가로 포함하는 단리된 GM-CSF 변이체를 제공하며, 상기 변이체는 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 야생형 GM-CSF에 의한 TF-1 ATCC® CRL 2003™ 세포의 증식의 자극의 EC₅₀ 값과 대비하여 적어도 약 1.5배 더 적은 EC₅₀ 값으로 TF-1 ATCC® CRL 2003™ 세포의 증식을 자극한다.

야생형 GM-CSF와 대비하여 TF-1 세포 증식을 유도하는 데 있어서의 효과에 대해 더 낮은 EC₅₀ 값을 갖는 GM-CSF 변이체는 GM-CSF 신호전달 경로의 더 강력한 활성화 인자이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23A 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23D 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23E 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23F 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23G 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23H 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23I 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23K 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23L 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23M 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23N 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23P 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23Q 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23S 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23T 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23V 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23W 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 R23Y 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49A 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49D 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49E 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49F 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49G 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49H 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49I 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49K 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49M 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49N 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49P 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49Q 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49R 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49S 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49T 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49V 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49W 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 L49Y 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107A 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107D 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107E 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107F 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107G 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107H 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107I 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107L 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107M 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107N 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107P 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107Q 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107R 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107S 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107T 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107V 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107W 치환이다.

일부 실시 형태에서, 서열 번호 1의 잔기 K107A에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환은 K107Y 치환이다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 R23L 치환, L49P 치환 및 K107I 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능(potency)을 개선한다. 게다가, L49P 치환은 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 S29C 치환, S69C 치환 및 R23L 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 S29C 치환, S69C 치환 및 L49P 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다. 게다가, L49P 치환은 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 S29C 치환, S69C 치환 및 K107I 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 S29C 치환, S69C 치환, R23L 치환 및 L49P 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성을 개선한다. 게다가, L49P 치환은 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 S29C 치환, S69C 치환, R23L 치환 및 K107I 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성을 개선한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 S29C 치환, S69C 치환, L49P 치환 및 K107I 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다. 게다가, L49P 치환은 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 S29C 치환, S69C 치환, R23L 치환, L49P 치환 및 K107I 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다. 게다가, L49P 치환은 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 1의 잔기 R23에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 1의 잔기 L49에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 1의 잔기 K107에 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 치환을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 R23L 치환을 포함한다. 상기 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 L49P 치환을 포함한다. 상기 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성을 개선하고, 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 K107I 치환을 포함한다. 상기 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성을 개선한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 R23L 치환 및 L49P 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다. 게다가, L49P 치환은 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 R23L 치환 및 K107I 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 L49P 치환 및 K107I 치환을 포함한다. 이들 치환은 GM-CSF 변이체의 열 안정성 및 효능을 개선한다. 게다가, L49P 치환은 잠재적 MHC 클래스 II 에피토프를 제거하며, 이에 따라 L49P 치환을 갖는 GM-CSF 변이체는 덜 면역원성일 수 있다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 서열 번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

본 발명의 GM-CSF 변이체는 무세포 발현 시스템, 예컨대 망상적혈구 용해물 기반 발현 시스템의 사용에 의해 또는 표준 재조합 발현 시스템에 의해 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 축퇴 올리고뉴클레오티드를 이용하여 원하는 변이체를 생성하는, 미국 특허 제6521427호 및 제6670127호에 기재된 방법에 따라 화학적 유전자 합성을 사용하여, 또는 표준 PCR 클로닝 및 돌연변이생성에 의해 합성될 수 있다. GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 클로닝되고, 표준 절차를 사용하여 발현될 수 있다. 발현된 GM-CSF는, 예를 들어 CaptoQ 음이온 교환, Capto 페닐 HIC 수지 및 DEAE 음이온 교환을 사용하여 정제될 수 있다. 생성된 GM-CSF 변이체는, 예를 들어 실시예 1에 기재된 검정을 사용하여 그들의 개선된 열 안정성 및 효능에 대해 시험될 수 있다.

상동성 GM- CSF 분자

생성된 변이체가 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF와 대비하여 치환 S29C 및 치환 S69C를 포함하고 모 GM-CSF 변이체와 대비하여 향상된 열 안정성 및/또는 효능을 유지하거나 갖는 한, 본 발명의 GM-CSF 변이체에 대한 추가의 치환이 이루어질 수 있다. 열 안정성 및 효능은 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 평가될 수 있다.

이루어질 수 있는 추가의 치환은 앞서 기재된 것들이다:

미국 특허 제5391485호에 기재된 R24L;

미국 특허 제5405952호에 기재된 R23L/N27D/T39E/E123K;

국제 특허 출원 공개 WO1989/010403호에 기재된 Q20A 및/또는 E21A;

표 2 및 표 3에 나타낸 그리고 미국 특허 제7208147호에 기재된 바와 같은 치환.

생성된 변이체가 서열 번호 1의 야생형 GM-CSF와 대비하여 치환 S29C 및 치환 S69C를 포함하고 모 GM-CSF 변이체와 대비하여 향상된 열 안정성 및/또는 효능을 유지하거나 갖는 한, 본 발명의 GM-CSF 변이체에 대한 보존적 변형이 또한 이루어질 수 있다.

"보존적 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 분자의 특성에 유의한 영향을 주지 않거나 그를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 잘 규정되어 있고, 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄 (예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 황-함유 측쇄 (시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 더욱이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 대해 이전에 기재된 바와 같다(문헌[MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67]; 문헌[Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1-24]).

치환은 알려진 방법을 사용하여 개별적으로 또는 조합적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 GM-CSF 변이체에 대한 아미노산 치환은 알려진 방법에 의해, 예를 들어 PCR 돌연변이생성 (미국 특허 제4,683,195호)에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는데, 예를 들어 무작위 (NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산 (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩함 - 을 사용하여 생성할 수 있다. 생성된 GM-CSF 변이체는 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 그들의 열 안정성 및 효능에 대해 시험될 수 있다.

[표 2]

[표 3]

반감기 연장 모이어티

본 발명은 또한 반감기 연장 모이어티에 접합된 GM-CSF 변이체를 제공한다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민 (HAS), 인간 혈청 알부민의 변이체, 예컨대 C34S 변이체, 트랜스티레틴 (TTR), 티록신-결합 글로불린 (TGB), 알부민-결합 도메인, 또는 Fc 또는 이의 단편이다. 반감기 연장 모이어티는 GM-CSF 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 접합될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 GM-CSF의 N-말단에 접합된다.

일부 실시 형태에서, Fc는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형이다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 GM-CSF의 N-말단에 접합된 HSA의 C34S 변이체이다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 서열 번호 23의 링커를 통해 GM-CSF의 N-말단에 접합된 HSA의 C34S 변이체이다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 서열 번호 27의 링커를 통해 GM-CSF의 N-말단에 접합된 HSA의 C34S 변이체이다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 GM-CSF의 N-말단에 접합된 Fc이다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 서열 번호 23의 링커를 통해 GM-CSF의 N-말단에 접합된 Fc이다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 서열 번호 27의 링커를 통해 GM-CSF의 N-말단에 접합된 Fc이다.

일부 실시 형태에서, 링커는 서열 번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, Fc는 적어도 하나의 치환을 포함한다. Fc에 접합된 GM-CSF 변이체의 이펙터 기능 및 약동학적 특성을 조절하기 위하여 Fc에 대해 Fc 치환이 이루어질 수 있다.

Fc 함유 분자의 반감기를 조절하기 위해 치환될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 문헌[Dall'Acqua et al., (2006) J Biol Chem 281:23514-240], 문헌[Zalevsky et al., (2010) Nat Biotechnol 28:157-159], 문헌[Hinton et al., (2004) J Biol Chem 279(8):6213-6216], 문헌[Hinton et al., (2006) J Immunol 176:346-356], 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276:6591-6607], 문헌[Petkova et al., (2006). Int Immunol 18:1759-1769], 문헌[Datta-Mannan et al., (2007) Drug Metab Dispos, 35:86-94, 2007], 문헌[Vaccaro et al., (2005) Nat Biotechnol 23:1283-1288], 문헌[Yeung et al., (2010) Cancer Res, 70:3269-3277], 및 문헌[Kim et al., (1999) Eur J Immunol 29:2819]에 기재된 것들이며, 위치 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 및 435를 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 이루어질 수 있는 예시적인 치환은 치환 T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A 및 H435R이다. Fc 함유 분자의 반감기를 증가시키기 위해 이루어질 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 치환은 치환 M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A 및 T307A/E380A/N434A이다. Fc 함유 분자의 반감기를 감소시키기 위해 이루어질 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 치환은 치환 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A 및 H435R이다.

일부 실시 형태에서, Fc는 활성화 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 Fc 함유 분자의 결합을 감소시키고/시키거나 Fc-매개 이펙터 기능을 감소시키는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

활성화 FcγR에 대한 Fc 함유 분자의 결합을 감소시키고, 후속으로 이펙터 기능을 감소시키기 위해 치환될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 문헌[Shields et al., (2001) J Biol Chem 276:6591-6604], 국제 특허 출원 공개 WO2011/066501호, 미국 특허 제6,737,056호 및 제5,624,821호, 문헌[Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26], 문헌[Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543], 문헌[Bolt et al., (1993) Eur J Immunol 23:403-411], 문헌[Cole et al., (1999) Transplantation, 68:563-571], 문헌[Rother et al., (2007) Nat Biotechnol 25:1256-1264], 문헌[Ghevaert et al., (2008) J Clin Invest 118:2929-2938], 문헌[An et al., (2009) mAbs, 1:572-579]에 기재된 것들이며, 위치 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 및 365를 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 이루어질 수 있는 예시적인 치환은 gG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서의 치환 K214T, E233P, L234V, L234A, G236의 결실, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S 및 P331S이다. 감소된 이펙터 기능을 갖는 Fc 함유 분자를 가져오는 예시적인 조합 치환은 IgG1 상의 치환 L234A/L235A, IgG2 상의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, IgG4 상의 F234A/L235A, IgG4 상의 S228P/F234A/ L235A, 모든 Ig 동종형 상의 N297A, IgG2 상의 V234A/G237A, IgG1 상의 K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, IgG2 상의 H268Q/V309L/ A330S/P331S, IgG1 상의 S267E/L328F, IgG1 상의 L234F/L235E/D265A, IgG1 상의 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S이다. IgG2로부터의 잔기 117-260 및 IgG4로부터의 잔기 261-447을 갖는 Fc와 같은 하이브리드 IgG2/4 Fc 도메인이 또한 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리펩티드 링커를 통해 GM-CSF 변이체에 접합된다. 적합한 링커는, 예를 들어 표 4에 나타낸 링커이다.

[표 4]

일부 실시 형태에서, 반감기 연장 모이어티는 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자, 예컨대 PEG5000 또는 PEG20000, 덱스트란, 폴리라이신, 상이한 사슬 길이의 지방산 및 지방산 에스테르, 예를 들어 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레에이트, 아라키도네이트, 옥탄이산, 테트라데칸이산, 옥타데칸이산, 도코산이산 등, 폴리라이신, 옥탄, 또는 탄수화물 (덱스트란, 셀룰로스, 올리고당류 또는 다당류)이다. 이들 모이어티는 GM-CSF 변이체와의 직접 융합체일 수 있으며, 표준 클로닝 및 발현 기법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 잘 알려진 화학적 결합 방법이 본 발명의 GM-CSF 변이체에 모이어티를 부착하는 데 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 상보적 데옥시핵산 (cDNA)일 수 있고, 적합한 숙주에서의 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 잘 알려진 기술이다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 10, 11, 12, 14, 15, 16 또는 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 의도된 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 발현용 벡터, 트랜스포존 기반 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 백그라운드 내로 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드를 도입시키기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 예를 들어, 선택적으로 반감기 연장 모이어티에 접합된, 본 발명의 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터 내로 삽입된다. 면역글로불린 쇄를 인코딩하는 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 제어 서열은 신호 서열, 프로모터 (예를 들어, 천연 관련 프로모터 또는 이종 프로모터), 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하며, 항체를 발현하도록 선택된 숙주 세포에 적합하도록 선택된다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되었으면, 숙주는 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질의 고수준 발현에 적합한 조건 하에서 유지된다.

적합한 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 선택 마커, 예를 들어 암피실린-저항성, 하이그로마이신-저항성, 테트라사이클린 저항성, 카나마이신 저항성 또는 네오마이신 저항성을 함유하여, 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 한다.

적합한 프로모터 및 인핸서 요소가 당업계에 알려져 있다. 진핵 세포에서의 발현을 위하여, 예시적인 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소, 거대세포바이러스 전초기 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, 및 당업계에 알려진 다양한 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 잘 알려져 있다.

사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 32의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다.

서열 번호 31

MAWVWTLLFLMAAAQSIQA

서열 번호 32

ATGGCCTGGGTGTGGACCCTGCTGTTCCTGATGGCCGCCGCCCAGAGCATCCAGGCC

다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 알려져 있다. 다수의 것이 재조합 작제물의 생성을 위해 구매가능하다. 예시적인 벡터는 세균 벡터 pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (미국 캘리포니아주 라호이아 소재의 Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (스웨덴 웁살라 소재의 Pharmacia), 및 진핵세포 벡터 pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (스트라타진), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (Pharmacia), pEE6.4 (Lonza) 및 pEE12.4 (Lonza)이다. 예시적인 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소, 거대세포바이러스 전초기 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, 및 당업계에 알려진 다양한 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. "숙주 세포"는 벡터가 내부에 도입된 세포를 지칭한다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손, 그리고 또한 특정 대상 세포로부터 생성된 안정한 세포주도 지칭하고자 함이 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후세대에서 소정의 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그러한 후손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 간균강(bacilli), 예컨대 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균과(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 원핵 숙주 세포의 예이다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로미세스(Saccharomyces) (예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae)) 및 피키아(Pichia)가 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0(미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC (American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0 (영국 윌트셔주 솔즈베리 소재의 ECACC (European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266 (ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 CHO-K1SV (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 Lonza Biologics), CHO-K1 (ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 GM-CSF 변이체가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성된 GM-CSF 변이체를 회수하는 단계를 포함한다. 일단 (화학적으로 또는 재조합적으로) 합성되면, GM-CSF 변이체는 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 정제, 겔 전기영동 등을 포함한 표준 절차에 따라 정제될 수 있다 (전반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982))] 참조). 본 발명의 GM-CSF 변이체는 실질적으로 순수할 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 80% 내지 85% 순수하거나, 적어도 약 85% 내지 90% 순수하거나, 적어도 약 90% 내지 95% 순수하거나, 또는 적어도 약 98% 내지 99%, 또는 그 이상으로 순수할 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 GM-CSF 변이체 이외의 세포 잔해, 거대분자 등과 같은 오염물이 없다.

본 발명의 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 벡터 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 형질전환, 배양, 항체 발현 및 정제는 잘 알려진 방법을 사용하여 행해진다.

사용 방법

본 발명의 GM-CSF 변이체는 시험관내 및 생체내(in vivo) 치료적 및 예방적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 다양한 장애, 예컨대 염증성 장 질병 (IBD)을 치료, 예방, 및/또는 진단하기 위해 대상체에게 투여되거나, 또는 시험관내 또는 생체외에서 배양 중인 세포에 투여될 수 있다.

본 발명은 염증성 장 질병 (IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 IBD를 치료하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 GM-CSF 변이체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, IBD는 크론병이다.

일부 실시 형태에서, IBD는 궤양성 결장염이다.

일부 실시 형태에서, IBD는 요네병, 베체트 증후군, 콜라겐성 결장염, 전환 결장염, 불확정 결장염, 현미경적 결장염, 감염성 결장염, 허혈성 결장염, 림프구성 결장염, 소장 및/또는 근위 소장의 특발성 염증, IBD-관련 설사, 및 위장관과 밀접하게 관련된 질병 및 장애이다.

일부 실시 형태에서, 대상체는 관해 상태이다.

일부 실시 형태에서, 대상체는 치료제인 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절제, 항생제, 또는 생물제제 중 적어도 하나에 의한 치료에 저항성이다.

본 발명의 방법은 임의의 동물 분류에 속하는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 대상체의 예에는 포유동물, 예컨대 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다.

본 발명의 GM-CSF 변이체는 그러한 치료를 위한 약제의 제조에 유용할 수 있으며, 여기서 약제는 본 명세서에 정의된 투여량으로 투여하도록 제조된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 유도 요법으로 투여된다.

일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 유지 요법으로 투여된다.

IBD의 치료에 효과적인 본 발명의 GM-CSF 변이체의 "치료적 유효량"은 표준 연구 기법에 의해 결정될 수 있다. 특정 유효 용량의 선택은 몇몇 인자의 고려에 기초하여, 당업자에 의해 (예를 들어, 임상 시험을 통해) 결정될 수 있다. 그러한 인자는 치료 또는 예방하고자 하는 질병, 관련된 증상, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질병의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래하는 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.

"치료하다" 또는 "치료"는, 원치 않는 생리학적 변화 또는 질병을 둔화 (감퇴)시키거나, 치료 동안 유익하거나 원하는 임상 결과를 제공하는 것이 목적인 치료적 처리를 지칭한다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출가능하든 검출 불가능하든 어느 것이든 간에, 증상의 경감, 질병 정도의 저하, 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 질병 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 고식, 및 관해 (부분 또는 전체 어느 것이든)를 포함한다. "치료"는 또한 대상체가 치료를 받지 않고 있을 경우에 예측되는 생존과 비교할 때 연장되는 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 원치 않는 생리학적 변화 또는 질병을 이미 가진 대상체뿐만 아니라 생리학적 변화 또는 질병을 갖기 쉬운 대상체도 포함한다. 예시적인 유익한 임상 결과는 IBD에 대한 관해를 달성하는 것으로, 이는 (예를 들어, 내시경 검사에 의한) GI 관의 임상 및 시각적 검사에 의해 평가될 수 있다.

본 발명의 GM-CSF 변이체는 또한 자가면역 폐포 단백증 (aPAP)을 치료, 예방, 및/또는 진단하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. aPAPA는 표면활성 단백질의 축적으로부터 생기는 희귀 폐 질병이다. 표면활성 항상성은 GM-CSF 의존적 방식으로 폐포 대식세포에 의해 통상 유지된다 (문헌[Tazawa, et al., (2014). Chest, 145(4), 729-737]). aPAP의 원인은 폐에서의 고수준의 GM-CSF 자가항체에 기인되어 왔는데, 이는 폐포 대식세포의 기능을 제한한다. 전폐 세척(whole lung lavage)은 aPAP에 대한 표준 치료이지만, GM-CSF의 전신 또는 흡입 투여가 PAP 환자에 대한 임상 이득을 입증해 왔다 (문헌[Seymour et al., (2001) American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 163, 524-531]).

약제학적 조성물 및 투여

본 발명은 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. "담체"는 본 발명의 항체와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법 (예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 GM-CSF 변이체의 농도는 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 적어도 약 1 중량%까지, 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 수 있다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.

본 발명의 GM-CSF 변이체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 이러한 변이체를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐, 경점막 (구강, 비강내, 질내, 직장) 투여로서, 이러한 투여에서는 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자 형태이고, 주사기, 이식 디바이스, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 담긴 제형; 또는 당업자에 의해 인식되는 다른 수단을 사용하는데, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 GM-CSF 변이체는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내 (i.v.) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 대상체에게 투여될 수 있다. i.v. 주입은, 예를 들어 15, 30, 60, 90, 120, 180, 또는 240분, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간에 걸쳐 제공될 수 있다.

대상체에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하고 ("치료적 유효량"), 때때로 0.005 mg 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 0.05 mg 내지 약 30 mg/㎏ 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg/㎏, 또는 약 4 mg/㎏, 약 8 mg/㎏, 약 16 mg/㎏ 또는 약 24 mg/㎏, 또는, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 높을 수 있으며, 예를 들어 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏일 수 있다.

고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적에 기초해서, 예를 들어 500, 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m²일 수 있다. 환자를 치료하기 위해 통상 1 내지 8회 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 또는 그 횟수 이상의 용량이 제공될 수 있다.

본 발명의 GM-CSF 변이체의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 정맥내 주입에 의해 8주 동안 매주 간격으로 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 추가 16주 동안 2주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 4주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 일일 투여량으로서, 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 적어도 하나에 대해, 또는 대안적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 중 적어도 하나에 대해, 매 24, 12, 8, 6, 4, 또는 2시간마다의 단회 또는 분할 용량, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여, 1일당 약 0.1 내지 100 mg/㎏, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏의 양으로, 또는 이들의 임의의 조합으로 제공될 수 있다.

본 발명의 GM-CSF 변이체는 또한 IBD 발생 위험을 감소시키고/시키거나, IBD 진행에서의 사건의 발생의 개시를 지연시키고/시키거나, IBD가 관해기에 있을(in remission) 때 재발 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다.

GM-CSF 변이체는 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 잘 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.

경구 투여

본 발명의 GM-CSF 변이체는 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. GM-CSF 변이체는 고체 투여 형태, 예컨대 정제 및 캡슐의 배합에 관례적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 생체이용률이 최대화되고 전-전신적(pre-systemic) 분해가 최소화될 때 위장관 내의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 캡슐이 설계될 수 있다. GM-CSF 변이체의 흡수를 촉진시키도록 추가의 작용제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 또한 경구 투여에 적합한 투여량으로 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화될 수 있다. 그러한 담체는 환자에 의한 섭취를 위하여 약제학적 조성물이 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다.

경구 사용을 위한 약제학적 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 배합하고, 생성된 과립 혼합물 (선택적으로, 그라인딩 후)을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 얻어질 수 있다. 필요하다면, 적합한 보조제가 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예컨대, 락토스, 수크로스, 만니톨, 및 소르비톨을 포함한 당류; 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 또는 다른 식물로부터의 전분; 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스; 아라비아 검 및 트래거캔스를 포함한 검; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질을 포함한다. 필요하다면, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 및 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 소듐 알기네이트와 같은 붕해제 또는 가용화제가 첨가될 수 있다.

당의정 코어는 아라비아 검, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 또한 함유할 수 있는 적합한 코팅, 예컨대 농축된 당 용액과 함께 사용될 수 있다. 제품 확인을 위하여 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량을 특성화하기 위하여, 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 또한 젤라틴으로 제조된 푸시-피트(push-fit) 캡슐뿐만 아니라, 젤라틴 및 코팅, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-피트 캡슐은 충전제 또는 결합제, 예컨대 락토스 또는 전분, 윤활제, 예컨대 활석 또는 마그네슘 스테아레이트, 및 선택적으로 안정제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 안정제와 함께 또는 안정제 없이 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해 또는 현탁될 수 있다.

GM-CSF 변이체 약제학적 조성물은 장용 코팅 형태로 또한 제공될 수 있으며, 장용 코팅은 대상체의 하부 위장계 내에서 약제학적 조성물을 보호하고 제어된 방식으로 방출하도록, 그리고 전신 부작용을 피하도록 설계된다. 장용 코팅에 더하여, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 임의의 양립가능한 경구 약물 전달 시스템 또는 성분 내에 캡슐화되거나, 코팅되거나, 결합되거나, 달리 회합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 중합체 하이드로겔, 나노입자, 미소구체, 미셀, 및 다른 지질 시스템 중 적어도 하나를 포함하는 지질 담체 시스템 형태로 제공될 수 있다.

소장에서의 분해를 극복하기 위하여, 본 발명의 GM-CSF 변이체는 하이드로겔 중합체 담체 내에 함유될 수 있다. 본 발명의 GM-CSF 변이체는, GM-CSF 변이체의 용해 속도(dissolution kinetics)를 증가시키고 그의 장 흡수를 향상시키도록 설계된 담체 시스템과 양립가능한 사용을 위해 추가로 제형화될 수 있다. 예를 들어, GM-CSF 변이체는 리포좀, 미셀 및 나노입자로 제형화되어 GM-CSF 변이체의 GI 관 침투를 증가시킬 수 있다.

다양한 생물반응성 시스템이 또한 본 발명의 GM-CSF 변이체와 조합되어 경구 전달을 위한 약제학적 작용제를 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에서, GM-CSF 변이체는 생물반응성 시스템, 예컨대 수소 결합 기를 갖는 점막접착성(mucoadhesive) 중합체 및 하이드로겔 (예를 들어, PEG, 폴리(메타크릴)산[PMAA], 셀룰로스, Eudragit®, 키토산 및 알기네이트)과 조합하여 사용되어 경구 투여를 위한 치료제를 제공한다.

본 발명의 GM-CSF 변이체는 세포간(paracellular) 또는 경세포(transcellular) 투과를 증가시킴으로써 장 점막을 가로질러 GM-CSF 변이체의 수송을 촉진시키는 침투 증진제와 조합하여 투여될 수 있다. 예시적인 침투 증진제는 장쇄 지방산, 담즙염, 양친매성 계면활성제, 및 킬레이팅제를 포함한다.

병용 요법

본 발명은 또한 IBD를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 GM-CSF 변이체를 제2 치료제와 병용하여 IBD의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

"병용하여"는 본 명세서에 기재된 본 발명의 GM-CSF 변이체 및 제2 치료제를 단제로서 동시에, 또는 임의의 순서대로 단제로서 순차적으로 투여함을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 작용제는 그러한 작용제에 대해 결정된 용량으로 그리고/또는 시간 스케줄에 투여될 것이다.

제2 치료제는 IBD에 대해 알려진 임의의 요법일 수 있으며, 이에는 IBD의 치료에 유용한 것으로 알려져 있거나, 이를 위해 사용되었거나 현재 사용 중인 임의의 작용제 또는 작용제들의 병용물이 포함된다. 그러한 요법 및 치료제는 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절제, 항생제, 또는 생물제제를 포함한다.

아미노살리실레이트는 IBD의 경도 내지 중등도 사례를 치료하는 데뿐만 아니라 재발을 예방하고 관해를 유지하는 데 효과적이다. 이들은 통상 경구 또는 직장 투여된다. IBD에 널리 사용되는 최초의 아미노살리실레이트인 설파살라진 (Azulfidine®)은 경도 내지 중등도 질병을 가진 사람에서 관해를 달성 및 유지하는 데 효과적이다. 이것은 장에 5-아미노살리실산 (5-ASA)을 전달하지만, 일부 환자에서 두통, 구역, 식욕 상실, 구토, 발진, 열, 및 감소된 백혈구 카운트와 같은 불쾌한 부작용을 갖는다. 설파살라진은 의약을 복용하고 있는 동안 남성에서 정자 생성 및 기능을 감소시킬 수 있다. 이것은 드문 경우에 췌장염과 관련되어 왔다. 두통, 구역, 및 발진은 5-ASA의 장으로의 전달에 필요한 설파피리딘 모이어티의 방출로 인한 것으로 여겨진다.

5-ASA의 다른 유도체가 또한 합성되어 왔다. 그러한 유도체는 Asacol® 또는 Pentasa® (메살라민), Dipentum® (올살라진), 및 Colazal™ (발살라지드)을 포함한다. 국부 메살라민 제제는 위를 우회하여 조기 분해를 피하고, 이어서 장의 염증 부분 부근에서 방출된다. Pentasa® 및 Asaco® (메살라민)와 같은 경구 지연-방출 제제는 각각 소장 및 결장에, 또는 회장 및/또는 결장에 직접 5-ASA를 방출할 수 있다. 메살라민의 관장 제형인 Rowasa®는 약물이 좌측 결장에 직접 적용될 수 있게 한다. Rowasa®는 결장의 좌측에만 영향을 주는 경도 내지 중등도 결장염을 가진 환자의 80%에서 효과적이다. 직장으로부터 S상 결장까지 약물을 직접 전달하는 메살라민 좌제 (Canasa®)는 직장 및 결장의 하단으로 제한되는 UC를 가진 환자의 고비율에서 효과적이다. 올살라진의 경구 지연-방출 제제인 Dipentum®은 5-ASA를 단지 결장에만 직접 전달한다.

속효성 항염증제 및 면역억제제로서, 코르티코스테로이드가 50년에 걸쳐 IBD의 급성 플레어-업(flare-up)을 치료하는 데 사용되어 왔다. 그때 이래로, 이들 강력한 작용제는 질병에 대한 치료의 중심이 되어 왔다. 대부분의 환자는 코르티코스테로이드를 시작한지 수일 이내에 증상의 개선을 인지한다. 이러한 의약 그룹은 경구, 직장, 및 정맥내 (IV) 형태로 이용가능하다. 코르티코스테로이드는 플레어-업을 예방하는 데 효과적이지 않으며, 이에 따라 IBD에서의 유지 요법에는 거의 사용되지 않는다. 장기간 사용은 부작용을 초래하기 때문에, 이들 작용제는 관해를 달성하기 위하여 단지 단기간 사용에만 권고되지만, 이들은 후자의 경우에는 빈번하게 사용되지 않는다. 중등도 내지 중도 활성 질병을 가진 사람들을 위한 경구 코르티코스테로이드는 Deltasone® (프레드니손), Medrol® (메틸프레드니솔론), 및 하이드로코르티손을 포함한다. 아미노살리실레이트는 종종 코르티코스테로이드와 함께 복용된다.

경구 코르티코스테로이드인 Entocort® (부데소니드)는 소장의 말단부 및/또는 대장의 처음 부분을 침범하는 경도 내지 중등도 크론병을 치료하는 데 사용된다. 이러한 비전신 스테로이드는 전신보다는 장을 표적화한다. 코르티코스테로이드는 또한 관장제 (하이드로코르티손, 메틸프레드니손, Cortenema®), 폼제(foam) (하이드로코르티손 아세테이트, ProctoFoam-HC®), 및 좌제로서 직장에 제공될 수 있다. 그러한 제제는 직장 또는 직장의 하부로 제한되는 경도 내지 중등도 궤양성 결장염에 사용된다. 다른 요법과 병용하여 사용될 때, 이들 작용제는 또한 직장에서 시작되는 더 광범위한 질병에 대해 효과적이다. 메틸프레드니손 및 하이드로코르티손은 종종 중도 및 광범위 질병을 가진 환자에게 IV 주입에 의해 제공된다. 급성 IBD는 20 내지 30%의 사례에서 코르티코스테로이드 요법에 반응하지 않으며, 중등도 내지 중도 질병을 가진 사례의 30 내지 40%에서, 코르티코스테로이드는 갑자기 중단되는 경우 질병 플레어-업의 발생이 수반될 수 밖에 없다.

IBD는 과다활성 면역 시스템에 의해 야기되는 것으로 보이기 때문에, 면역조절제가 이 질병의 치료에 중요한 역할을 한다. 이들 약물은 하기 특징들 중 하나를 가진 자에게 사용된다: (a) 코르티코스테로이드 치료에 의한 부작용, (b) 스테로이드-의존성 질병, (c) 아미노살리실레이트, 항생제, 또는 코르티코스테로이드에 대한 무반응, (d) 항생제에 반응하지 않는 회음부 질병, 및 (e) 관해 유지의 필요성. 이들 약물은 질병의 활성 플레어 동안 반응을 가속시키기 위해 코르티코스테로이드와 병용될 수 있다.

Imuran®, Azasan® (아자티오프린) 및 Purinethol® (6-메르캅토푸린, 6-MP)은 크론병 및 UC에서 관해를 유지하는 데 사용되는 경구 면역조절제이다. 이들 작용제는 느린 작용 개시를 갖기 때문에, 이들은 더 속효성인 다른 약물, 예를 들어 코르티코스테로이드와 함께 통상 제공된다. IBD에 사용되는 다른 면역조절제는 Sandimmune®, Neoral® (사이클로스포린 A) 및 Prograf® (타크롤리무스)이다. 이들 작용제 중에서, 사이클로스포린 A가 가장 신속한 작용 개시를 갖는다. 고용량으로 IV로 제공될 때, 사이클로스포린 A는 활성 크론병에 유용하다. 이 약물은 타크롤리무스와 마찬가지로 중도 UC에 효과적이다. 후자의 작용제는 코르티코스테로이드가 효과적이지 않을 때 또는 누공이 발생할 때 크론병에 사용될 수 있다. 타크롤리무스는 입 또는 회음부 영역의 크론병을 치료하기 위해 국소 적용될 수 있다. 다른 치료제에 반응하지 않고 다른 면역억제제를 견딜 수 없는 크론병을 가진 사람들에 대한 선택지는 IV-투여 Rheumatrex® 또는 Mexate® (메토트렉세이트 (MTX))이다.

특정 감염성 인자가 IBD의 원인으로서 확인되어 있지는 않지만, 항생제가 1차 치료로서 빈번하게 사용된다. 항생제는 누공 (장의 루프들 사이 또는 장과 인접한 기관, 예를 들어 피부 사이) 또는 항문 부근의 재발성 농양을 가진 크론병 환자에서 장기간 요법으로서 효과적이다. 활성 질병이 항생제로 성공적으로 치료되는 환자는 유지 요법으로서 이들을 계속 사용할 수 있다. 일반적으로, 항생제는 UC를 가진 사람들에게는 유용한 것으로 여겨지지 않는데; 예외는 독성 거대결장이다.

IBD에 대해 가장 빈번하게 처방되는 광범위 스펙트럼 항생제는 Flagyl® (메트로니다졸) 및 Cipro® (시프로플록사신)이다. 메트로니다졸은 활성 크론병에 대한 1차 요법이며, 회장 절제 수술 후 처음 3개월 동안 크론병의 재발을 감소시키는 것으로 밝혀져 있다. 이 약물은 회음부 크론병을 관리하는 데 있어서 50%를 넘는 사례에서 효과적이다. 메트로니다졸보다 훨씬 더 안전한 시프로플록사신이 활성 크론병을 치료하는 데 일반적으로 사용된다. 경구 및 IV 메트로니다졸 및 시프로플록사신 둘 모두가 IBD 치료에 사용된다.

생물제제가 IBD에서 신체의 염증 반응을 방해하게 할 수 있는 가능한 표적은 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 인터류킨, 부착 분자, 콜로니-자극 인자, 및 기타를 포함한다. 이들의 기전이 표적화되기 때문에, 생물학적 요법은 IBD 치료에서 뚜렷한 이점을 제공한다. 전체 면역 시스템을 억제함으로써 주요 부작용을 야기하는 경향이 있는 코르티코스테로이드와는 달리, 생물제제는 선택적으로 작용한다. 생물제제는 IBD를 가진 사람들에서 또는 결장염의 동물 모델에서 결함이 있거나 결핍되어 있거나, 과도한 것으로 이미 입증된 특정 효소 및 단백질을 표적화한다. 항-TNF 작용제가 크론병 및 UC 둘 모두에서 사용되어 왔으며, 예컨대 REMICADE® (인플릭시맙), SIMPONI® (골리무맙) 및 HUMIRA® (아달리무맙)이다.

IBD에 대한 상기 의약 선택지에도 불구하고, 크론병 환자의 66 내지 75% 및 UC를 가진 자의 25 내지 40%는 결국 수술을 받게 될 것이다. 크론병에 대한 수술은 질병의 위치에 좌우된다. 이것이 소장에 있다면, 이환된 장의 영역은 정상 장의 영역과 번갈아 나타날 수 있다. 활성 질병의 영역이 좁아서, 협착(stricture)을 형성할 수 있으며, 이는 소화된 음식의 통과를 차단할 수 있다. 병변들이 분리되어 있으면, 협착성형술이 종종 사용된다. 여기서는, 협착된 영역이 넓어지고 소장의 여유분이 생기게 된다. 협착이 긴 경우 또는 다수의 협착들이 서로 근접해 있는 경우에는, 절제 및 문합이 필요할 수 있다. 비록 절제가 수년간의 완화를 제공할 수 있지만, 질병은 문합의 부위에서 또는 그 부근에서 재발할 수 있다. 결장에서 중도 크론병을 가진 환자에서는, 결장절제술이 행해질 수 있다. 직장이 영향을 받지 않은 경우, 회장의 말단부가 직장에 재결합될 수 있으며; 이에 따라 대변이 정상적으로 통과될 수 있다. 결장 및 직장 둘 모두가 침범된 경우, 회장조루술이 후속되는 직장결장절제술이 수행될 수 있다. 크론병을 가진 환자의 약 25%에서 누공 및/또는 농양이 결국 발생한다. 누공이 의약에 무반응성인 경우, 이들은 영향을 받은 장의 절제 후 문합을 행함으로써 제거된다. 농양은 배출되어야 하며; 일부 경우에, 이는 절제를 필요로 한다. 수년간, UC에 대한 표준 수술은 회장조루술을 동반한 직장결장절제술이었다. 현재 가장 일반적인 시술은 재건 직장결장절제술인데; 이는 환자가 항문을 통해 대변을 계속 통과할 수 있게 한다. 수술 후에 재발될 수 있는 크론병과 달리, UC는 일단 결장이 제거되면 "치유"된다.

키트

본 발명의 일 실시 형태는 본 발명의 GM-CSF 변이체를 포함하는 키트이다.

키트는 치료적 용도에 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 키트는 본 발명의 GM-CSF 변이체 및 GM-CSF 변이체를 검출하기 위한 시약을 포함한다. 키트는 하기를 포함한 하나 이상의 다른 요소를 포함할 수 있다: 사용 설명서; 다른 시약, 예를 들어 투여를 위한 GM-CSF 변이체를 준비하기 위한 디바이스 또는 다른 물질; 약제학적으로 허용되는 담체; 및 대상체에게 투여하기 위한 디바이스 또는 다른 물질.

일부 실시 형태에서, 키트는 용기 내에 본 발명의 GM-CSF 변이체를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 키트는 서열 번호 2의 GM-CSF 변이체를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 키트는 서열 번호 6의 GM-CSF 변이체를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 키트는 서열 번호 7의 GM-CSF 변이체를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 키트는 서열 번호 8의 GM-CSF 변이체를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 키트는 서열 번호 9의 GM-CSF 변이체를 포함한다.

이제 본 발명을 구체적인 비제한적 실시예를 통해 설명할 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

인간 GM- CSF 변이체의 생성:

GM-CSF의 다양한 His₆-태깅된 변이체를 인코딩하는 DNA 및 발현 벡터를 합성적으로 생성하고, 이를 사용하여 Expi293 (HEK 세포, ThermoScientific)을 일시적으로 형질감염시켰다. 분비된 단백질을 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 상층액으로부터 정제하고, 이어서 표준 방법을 사용하여 1X PBS 중으로 완충액-교환하고, 추가의 특성화를 위해 사용하였다. 사용된 신호 서열은 MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (서열 번호 19)였다.

TF -1 증식 검정

5 × 10³개 TF-1 세포 (ATCC® CRL 2003™)/웰을 96웰 플레이트 (Costar 3603)에서 검정 배지 (10% FBS - Gibco, 16140, 1% PenStrep - Gibco, 10378을 함유하는 RPMI1640 - Gibco, 11875) 중에서 플레이팅하였다. 인간 GM-CSF 변이체뿐만 아니라 구매가능한 재조합 단백질 (R&D Systems: Cat# 215-GM/CF; 양성 대조군으로서)의 연속 희석물을 검정 배지 중에서 제조하고, 50 μL/웰의 GM-CSF 적정물(titration)을 세포에 첨가하였다. 세포를 5% CO₂ 분위기를 갖는 가습된 인큐베이터 내에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 Promega CellTiter 96® Aqueous One Solution (20 μL/웰)을 첨가하고, 세포를 37℃에서 추가 4시간 동안 인큐베이션함으로써 세포 증식을 측정하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 진탕하고, 490 nm에서의 흡광도를 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 원시 OD_490nm 값을 GraphPad Prism 6.02를 사용하여 재조합 인간 GM-CSF (rhGM-CSF)의 농도에 대하여 도표로 나타내어 EC₅₀ 값을 결정하였다.

시차 주사 열량측정법 ( DSC )에 의한 열 안정성 분석

시차 주사 열량측정법을 사용하여 GM-CSF의 정제된 변이체의 열 안정성을 평가하였다. 간략하게 말하면, 정제된 단백질을 1X PBS 중에 1 mg/mL로 희석시키고, MicroCal VP-DSC 기기를 사용하여 1℃/min의 스캔 속도로 25℃부터 120℃까지 가열하였다. 열량측정 데이터를 Origin7 (Origin Lab Corporation)을 사용하여 분석하였다. 원시 열량측정 데이터를 샘플 농도에 대해 정규화하고, 기저선을 감산하고, 마지막으로 Origin7 소프트웨어를 사용하여 비-2-상태 풀림 모델에 적합화하여 T _m 값 (풀림의 중간점에서의 온도) 및 다른 열역학적 파라미터를 얻었다.

실시예 2: GM- CSF 변이체의 설계

GM-CSF 변이체를 설계하고, 후속으로, 표적 세포 증식을 유도하는 이들의 능력을 유지 및/또는 개선하면서 나타내는 이들의 개선된 안정성 (가열 시의 입체구조 안정성)에 대해 특성화하였다.

인간 GM-CSF 결정 구조, PDB 코드 2GMF의 분석에 의해 돌연변이를 설계하였다 (문헌[Rozwarski, Diederichs, Hecht, Boone, & Karplus, 1996]). 돌연변이에 대한 위치는 GM-CSF:수용체 복합체의 결정 구조, PDB 코드 3CXE에 따른 수용체 결합을 방해하지 않도록 선택하였다 (문헌[Hansen et al., 2008]). 추가적으로, L49P 및 R23L 치환의 선택은 50가지 상이한 종으로부터 성숙 GM-CSF 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열의 정렬로부터 생성된 컨센서스 GM-CSF 서열에 의해 지지되었다. 단백질에서의 열안정성을 조작하기 위한 컨센서스 설계는 이미 기재되어 있다 (문헌[M. Lehmann, Pasamontes, Lassen, & Wyss, 2000]; 문헌[M. Lehmann, Kostrewa, et al., 2000]; 문헌[Martin Lehmann & Wyss, 2001]). 도 1은 야생형 GM-CSF의 결정 구조 및 치환을 위해 고려되는 잔기의 위치를 나타낸다.

표 5는 생성된 치환 및 각각의 치환에 대한 이론적 근거를 제시한다. 잔기 넘버링은 서열 번호 1의 성숙 인간 GM-CSF에 따른다. 개별 치환 및 이들의 조합을 갖는 GM-CSF 변이체를 제조하고, 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 이들의 세포 효능 및 안정성에 대해 특성화하였다.

서열 번호 1

APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQ EPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE

서열 번호 18: 성숙 WT GM-CSF를 인코딩하는 cDNA

GCCCCCGCCCGCTCCCCCTCCCCATCGACCCAACCCTGGGAACACGTGAACGCCATTCAGGAGGCTAGGAGACTGCTGAACCTGTCCCGGGATACCGCAGCCGAGATGAACGAAACCGTGGAGGTCATCTCCGAAATGTTTGACTTGCAAGAACCTACTTGTCTGCAAACTCGCCTCGAGCTGTACAAACAGGGACTCCGGGGAAGCCTCACTAAGCTGAAGGGGCCTCTGACCATGATGGCCTCCCACTACAAGCAGCACTGCCCGCCGACGCCGGAAACCAGCTGCGCGACCCAGATCATTACCTTCGAATCGTTCAAGGAAAACCTGAAGGACTTCCTGCTTGTGATCCCGTTCGACTGCTGGGAGCCTGTGCAGGAGTAA

[표 5]

R23L 변이체는 Hercus et al. (문헌[Hercus et al., 1994])에 의하면, 1차 CML 세포의 GM-CSF 의존적 증식에서의 활성에 있어서 2배 증가를 갖는 것으로 보고되어 있다. 그러나, 상기 치환은 결과적인 개선된 입체구조 안정성과는 연관되지 않았다.

K107I 치환을 포함시켜 인접한 잔기 L70 및 F103과의 소수성 상호작용을 통해 루프 AB를 안정화하였다. 래트 GM-CSF에서 발견되는 소수성 아미노산의 이러한 조합, L70/F103/I107에 대해서는 자연계에 전례가 있다.

표 6은 생성된 변이체의 아미노산 서열을 보여주며, 표 7은 생성된 GM-CSF 변이체를 인코딩하는 cDNA 서열을 보여준다. 도 2는 생성된 변이체의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.

[표 6]

[표 7]

표 8은, 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 측정되고 용융 온도 T_m으로 표현되고, 야생형 GM-CSF 단백질과 대비하여 T_m에서의 이동(shift)으로 표현된, 인간 GM-CSF 변이체의 열 안정성의 요약을 나타낸다. 모든 변이체는 야생형 단백질과 대비하여 유의하게 개선된 열 안정성을 나타내었다. 개별 치환으로부터, 야생형 GM-CSF 내로의 S29C/S69C에서의 이황화물 가교의 도입은 L49P, K107I 및 R23L 치환 단독과 대비하여 가장 향상된 안정화를 가져왔다. 변이체들의 도입은 대략 상가적 방식으로, 생성된 변이체의 열 안정성을 조합적으로 추가로 개선하였다. 전술된 모든 5개의 아미노산 치환을 함유하는 변이체, S29C/S69C/R23L/L49P/K107I는 T _m 값이 야생형 단백질의 T _m 값보다 28℃ 더 높았다.

[표 8]

생성된 변이체를 TF-1 세포 증식 검정에서 그들의 효능에 대해 시험하였다. 표 9는 각각의 변이체에 대해 2개의 개별 측정치의 평균으로서 표현된 EC₅₀ 값 및 야생형 GM-CSF 대비 배수 변화를 나타낸다. S29C/S69C는 야생형 GM-CSF와 대비하여 약 2.6배 개선을 보여주었다. 개별 치환 L49P 및 R23L은 효능에 있어서 미약한 개선을 가졌으며, 한편 K107I 치환은 약간 감소된 효능을 갖는 변이체를 생성하였다. 일반적으로, GM-CSF 변이체의 세포 효능의 증가는 변이체의 입체구조 안정성과 상관되었는데, 가장 안정한 변이체 (S29C/S69C/R23L/L49P/K107I)가 TF-1 세포의 증식을 자극함에 있어서 가장 큰 향상 (4 배)을 나타내었다.

[표 9]

실시예 3. GM - CSF 변이체는 공복 상태 모의 장액(fasted state simulated intestinal fluid)에서 안정적이다.

국부 전달을 위해 경구 투여되는 GM-CSF는 환자 순응도로부터뿐만 아니라 전신 노출을 최소화함으로써 안전성 관점으로부터 더 바람직한 것으로 입증될 수 있다. 그러나, 하부 위장관으로의 단백질의 경구 전달은 생물학적 약물이 노출될 가혹한 pH, 단백질 분해, 및 미생물 환경으로 인해 많은 어려움을 제시한다 (문헌[Amidon, Brown, & Dave, 2015]).

생성된 GM-CSF 변이체의 안정성을, GI 관의 일부분들과 유사한 환경에서 그들의 안정성을 평가하기 위하여, 판크레아틴 (3 mg/mL; 트립신, 아밀라제, 리파제, 리보뉴클레아제, 및 기타 프로테아제)이 보충된 공복 상태 모의 장액 (FaSSIF)에서 시험하였다.

FaSSIF-V2 (Biorelevant; 영국 런던 소재)를 제조자의 사용설명서에 따라 새로 제조하고, 돼지 췌장으로부터의 판크레아틴 (Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 3 mg/mL의 최종 농도로 보충하였다. 1 × PBS 중에 제형화된 GM-CSF 변이체를 FaSSIF (판크레아틴을 함유함)를 사용하여 1 mg/mL의 최종 농도로 희석시키고, 37℃에서 0 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열한 후 동결시킴으로써 분해를 정지시켰다. 레인(lane)당 10 ㎍의 GM-CSF (전처리 농도에 기초함)를 로딩함으로써 샘플의 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 생성된 겔을 밀도측정법에 의해 분석하여, 남아 있는 온전한 변이체 GM-CSF의 양을 정량화하였는데, 이는 비처리 대조군의 백분율로서 표현하였다.

R23L 변이체 (데이터는 도시되지 않음)를 제외한 모든 시험된 변이체는 야생형 GM-CSF와 대비하여 시간 경과에 따른 단백질 분해적 분해에 대해 개선된 안정성을 보여주었다. 도 3은 3 mg/mL 판크레아틴을 함유하는 FaSSIF 중에서의 시간 경과에 따른 S29C/S69C, L49L, S29C/S69C/K107I 및 S29C/S69C/R23L/L49P/K107I GM-CSF 변이체의 안정성을 나타낸다. 30분의 효소적 노출 후에, 판크레아틴을 함유하는 FaSSIF 중에서 1분 이내에 완전 분해되는 야생형 GM-CSF와 대비하여, S29C/S69C/R23L/L49P/K107I 변이체 단백질은 절반 넘게 온전한 상태로 남아 있다.

실시예 4. 선택된 GM- CSF 변이체의 면역원성 위험의 컴퓨터 모의실험( in silico ) 평가

2개의 GM-CSF 변이체를 컴퓨터 모의 실험 분석을 거쳐서, (야생형 GM-CSF와 대비하여) 아미노산 치환 중 어느 것이 클래스 II MHC 분자에 대한 임의의 구량체 펩티드의 결합 친화성을 증가시킬 것으로 예측될지를 결정하고, 이에 따라 ImmunoFilter™ 기술을 사용하여 T 세포 에피토프를 예측하였다. 시험된 변이체 (S29C/S69C/R23L/L49P/K107I 및 S29C/S69C/L49P/K107I 변이체)에서는 주요 잠재적인 면역원성 결점이 확인되지 않았다.

L49P 아미노산 치환은 면역원성 위험을 감소시키는 것으로 나타났다. HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4 및 HLA-DR5에 대한 L49P 치환을 갖는 하나의 구량체의 예측된 결합 점수는 24 내지 32%로부터 4 내지 8%로 감소되었다.

실시예 5. GM-CSF 변이체는 공복 상태 모의 장액 (FaSSIF)에서 그들의 기능적 활성을 유지한다

GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성을, 하기에 그리고 도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d에 나타낸 바와 같이 다양한 기간에서, 돼지 췌장 프로테아제 및 리보뉴클레아제의 외분비 세포에 의해 생성된, 트립신, 아밀라제 및 리파제, 리보뉴클레아제, 및 다른 프로테아제가 보충된 FaSSIF에 노출 후에 평가하였다.

변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I 둘 모두는 GI 관을 모방한 단백질 분해 환경에 대한 30분 (도 4a), 1시간 (도 4b) 및 4시간 (도 4c)의 노출 시에 그들의 활성을 완전히 또는 부분적으로 유지한 반면, 야생형 GM-CSF는 30분의 노출 후에 완전히 불활성이었다 (도 4a). 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I는 단백질 분해 환경에 대한 6시간의 노출 후에도 그의 생물학적 활성의 상당한 부분을 유지하였다 (도 4d). 두 변이체 모두는 비-단백질 분해 환경 (FaSSIF의 부재 하에서의 인큐베이션)에서도 야생형 GM-CSF와 대비하여 STAT5 인산화를 유도하는데 더 강력하였다.

방법

돼지 판크레아틴 (Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)이 3 mg/mL의 최종 농도로 보충된 모의 장액 (FaSSIF-v2 분말로부터 제조됨; Biorelevant; 영국 런던 소재) 중에 인간 GM-CSF의 변이체를 1 mg/mL의 최종 농도로 희석시켰다. 인간 GM-CSF의 변이체를 37℃에서 0.5 내지 6시간 동안 이 용액 중에서 인큐베이션하였다. 완전 프로테아제 억제제 (Roche)를 10배로 첨가함으로써 단백질 분해적 분해를 정지시켰다. 모의 장액-처리된 GM-CSF 샘플을 RPMI1640 무혈청 배지 (Gibco) 중에 2배 연속 희석시키고, 5% CO₂ 하에서 37℃에서 2시간 동안 혈청 기아 상태에 둔 TF-1 세포 (ATCC; 1e5개 세포/웰)에 적용하였다. 처리된 TF-1 세포를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. TF-1 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 Tris 용해 완충액 (Meso Scale Discovery)으로 용해시켰다. 총 STAT5a,b에 대한 STAT5 (Tyr694)의 인산화를 면역검정 (Meso Scale Discovery)에 의해 결정하였다. STAT5 단백질의 인산화 (총 STAT5a,b에 대한 %)를 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다.

실시예 6. GM-CSF 변이체는 결장 내용물에 노출 시 그들의 기능적 활성을 유지한다

GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성을 다양한 기간에서 나이브 사이노몰거스 원숭이로부터의 결장 내용물에 노출 후에 평가하였다.

도 5a는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성은 나이브 사이노몰거스 원숭이로부터의 결장 내용물과 함께 30분 동안 인큐베이션 후에 완전히 유지된 반면, 야생형 GM-CSF의 생물학적 활성은 거의 완전히 소실되었음을 나타낸다.

도 5b는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이 나이브 사이노몰거스 원숭이로부터의 결장 내용물과 함께 2시간 동안 인큐베이션 후에 유지되었음을 나타낸다. GM-CSF의 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체는 2시간 동안 결장 내용물에 대한 노출 후 활성에 있어서 단지 2배의 손실만을 나타내었으며, 결장 내용물에 노출되지 않은 야생형 GM-CSF보다 2배 더 큰 효능을 여전히 보유하였다. GM-CSF의 S29C/L49P/S69C/K107I 변이체는 비처리 사이토카인에 비해 6배의 활성 손실을 나타내었다.

도 5c는 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이 나이브 사이노몰거스 원숭이로부터의 결장 내용물과 함께 6시간 동안 인큐베이션 후에 유지되었음을 나타낸다. GM-CSF의 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 변이체는 비처리 변이체 사이토카인과 대비하여 5배 활성 손실을 나타낸 반면, 야생형 GM-CSF의 활성은 완전히 소실되었다.

도 5d는 GM-CSF 및 그의 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I 및 S29C/L49P/S69C/K107I의 생물학적 활성이 나이브 사이노몰거스 원숭이로부터의 결장 내용물과 함께 24시간 동안 인큐베이션 후에 소실되었음을 나타낸다.

표 10은 변이체에 대한 기능적 검정에서의 EC₅₀ 값을 나타낸다.

[표 10]

재료 및 방법

인간 GM-CSF의 변이체를 1X 인산염-완충 식염수 또는 나이브 사이노몰거스 원숭이로부터의 결장 내용물 (BioreclamationIVT; 미국 뉴욕주 롱 아일랜드 소재) 중에 1 mg/mL의 최종 농도로 희석시키고, 이것을 1X 인산염-완충 식염수 중에 3 mg/mL의 최종 단백질 농도에 대해 정규화하였다. 인간 GM-CSF의 변이체를 37℃에서 0.5 내지 24시간 동안 이 용액 중에서 인큐베이션하였다. 지시된 인큐베이션 기간 후, GM-CSF 함유 샘플을 RPMI1640 무혈청 배지 (Gibco) 중에 2배 연속 희석시키고, 5% CO₂ 하에서 37℃에서 2시간 동안 혈청 기아 상태에 둔 TF-1 세포 (ATCC; 1e5개 세포/웰)에 적용하였다. 처리된 TF-1 세포를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. TF-1 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (Roche Life Science)를 함유하는 Tri 용해 완충액 (Meso Scale Discovery; 미국 메릴랜드주 록빌 소재)으로 용해시켰다. 총 STAT5a,b에 대한 STAT5 (Tyr694)의 인산화를 면역검정 (Meso Scale Discovery)에 의해 결정하였다. STAT5의 인산화 (총 STAT5a,b에 대한 %)를 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다. 이들 실험에서, 야생형 GM-CSF 및 S29C/L49P/S69C/K107I 변이체는 C-말단에 GS 링커를 통해 GM-CSF에 결합된 6x-His 태그를 가졌다.

실시예 7. GM-CSF 변이체는 상이한 개( canine ) 모의 소장액 (SSIF)에서 그들의 기능적 활성을 유지한다

TF-1 세포에서 STAT5 인산화를 자극하기 위한 야생형 인간 GM-CSF 및 GM-CSF 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I의 능력을, 표 11에 나타낸 바와 같은 돼지 췌장 프로테아제 및 리보뉴클레아제의 외분비 세포에 의해 생성된, 트립신, 아밀라제 및 리파제, 리보뉴클레아제, 및 다른 프로테아제가 보충된 SSIF에 2시간 노출 후에 평가하였다.

His-태깅된 야생형 인간 GM-CSF의 기능적 활성은 개 SSIF의 4개의 조제물 중 어느 것에도 2시간 노출 후에 완전히 소실되었다. 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I는, SSIF가 pH 7로 제조되고, 밀리리터당 200 USP 단위의 프로테아제 활성과 동등한 1 mg/mL 판크레아틴이 보충된 경우, 2시간 노출 후 완전한 자극 활성을 유지하였다. 동일한 시간프레임에 걸쳐 pH 7.0의 10배 더 많은 판크레아틴 (10 mg/mL; 2,000 USP 단위/mL)에 노출되었을 때, R23L/S29C/L49P/S69C/K107I GM-CSF는 SSIF에 노출되지 않은 변이체 GM-CSF와 대비하여 효능에 있어서 24배 손실을 나타내었다. 변이체 R23L/S29C/L49P/S69C/K107I는, 모의액이 pH 5.5로 제조되고, 밀리리터당 200 USP 단위의 프로테아제 활성과 동등한 1 mg/mL 판크레아틴이 보충된 경우, 개 SSIF에 대한 2시간 노출 후 기능적 활성에 있어서 5배 손실을 나타내었다. pH 5.5의 10배 더 많은 판크레아틴 (10 mg/mL; 2,000 USP 단위/mL)에 노출되었을 때, R23L/S29C/L49P/S69C/K107I GM-CSF는 전처리되지 않은 샘플과 대비하여 효능에 있어서 47배 손실을 나타내었다. 개 SSIF에 의한 전처리의 부재 하에서도, R23L/S29C/L49P/S69C/K107I GM-CSF는 TF-1 세포에서 STAT5 인산화를 유도하는 데 있어서 야생형 GM-CSF보다 2.5배 더 강력하였다.

[표 11]

방법

돼지 판크레아틴 (Sigma 카탈로그 P7545; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)이 1 또는 10 mg/mL의 최종 농도로 보충된 모의 장액 (개 FaSSIF/개 FaSSGF 분말로부터 5.5 또는 7의 최종 pH로 제조됨; Biorelevant; 영국 런던 소재) 중에 인간 GM-CSF의 변이체를 1 mg/mL의 최종 농도로 희석시켰다. 인간 GM-CSF의 변이체를 37℃에서 2시간 동안 이 용액 중에서 인큐베이션하였다. 완전 프로테아제 억제제 (Roche)를 10배로 첨가함으로써 단백질 분해적 분해를 정지시켰다. 모의 장액-처리된 GM-CSF 샘플을 RPMI1640 무혈청 배지 (Gibco) 중에 2배 연속 희석시키고, 5% CO₂ 하에서 37℃에서 2시간 동안 혈청 기아 상태에 둔 TF-1 세포 (ATCC; 1e5개 세포/웰)에 적용하였다. 처리된 TF-1 세포를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. TF-1 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 Tris 용해 완충액 (Meso Scale Discovery)으로 용해시켰다. 총 STAT5a,b에 대한 STAT5 (Tyr694)의 인산화를 면역검정 (Meso Scale Discovery)에 의해 결정하였다. STAT5 단백질의 인산화 (총 STAT5a,b에 대한 %)를 GM-CSF 농도의 함수로서 도표로 나타내었다. Prism 7 (GraphPad)에서 곡선-적합화를 수행하여 EC₅₀ 값을 얻었다.

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Claims

서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 GM-CSF 변이체.
제1항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 GM-CSF와 대비하여 적어도 약 5℃ 더 높은 용융 온도 (T_m)를 나타내며, 상기 T_m은 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 시차 주사 열량측정법을 사용하여 측정되는, GM-CSF 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 상기 야생형 GM-CSF에 의한 TF-1 ATCC® CRL 2003™ 세포의 증식의 자극의 EC₅₀ 값과 대비하여 적어도 약 1.5배 미만인 EC₅₀ 값으로 TF-1 ATCC® CRL 2003™ 세포의 증식을 자극하는, GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, GM-CSF 변이체.
서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 GM-CSF 변이체.
서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 10, 14, 15, 16 또는 17의 합성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 반감기 연장 모이어티(half-life extending moiety)에 접합되는, GM-CSF 변이체.
제12항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 이의 변이체, 항체 Fc 영역 또는 이의 단편, 알부민-결합 도메인 또는 폴리에틸렌 글리콜인, GM-CSF 변이체.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 링커(linker)를 통해 상기 GM-CSF 변이체에 접합되는, GM-CSF 변이체.
제14항에 있어서, 상기 링커는 서열 번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는, GM-CSF 변이체.
서열 번호 2, 3, 4, 6, 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 GM-CSF 변이체.
a. 제16항의 GM-CSF 변이체를 인코딩하고/하거나;
b. 서열 번호 10, 11, 12, 14, 15, 16 또는 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
제17항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
제18항에 있어서, 발현 벡터인, 벡터.
제18항 또는 제19항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
GM-CSF 변이체를 생성하는 방법으로서,
상기 GM-CSF 변이체가 발현되는 조건 하에서 제20항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 발현된 GM-CSF 변이체를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 GM-CSF 변이체를 포함하는, 키트.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 GM-CSF 변이체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
염증성 장 질병 (IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 IBD를 치료하는 방법으로서,
상기 IBD를 치료하기에 충분한 시간 동안 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 GM-CSF 변이체의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 IBD는 요네병, 베체트 증후군, 콜라겐성 결장염, 전환 결장염, 불확정 결장염, 현미경적 결장염, 감염성 결장염, 허혈성 결장염, 림프구성 결장염, 소장 및/또는 근위 소장의 특발성 염증, 또는 IBD-관련 설사인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 IBD는 크론병 또는 궤양성 결장염인, 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 제2 치료제는 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절제, 항생제, 또는 생물제제인, 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 관해기에 있는(in remission), 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GM-CSF 변이체는 경구 투여되는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, IBD를 가진 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, GM-CSF 변이체.
제31항에 있어서, 상기 IBD는 요네병, 베체트 증후군, 콜라겐성 결장염, 전환 결장염, 불확정 결장염, 현미경적 결장염, 감염성 결장염, 허혈성 결장염, 림프구성 결장염, 소장 및/또는 근위 소장의 특발성 염증, 또는 IBD-관련 설사인, 상기에 따른 사용을 위한, GM-CSF 변이체.
제31항에 있어서, 상기 IBD는 크론병인, 상기에 따른 사용을 위한, GM-CSF 변이체.
제31항에 있어서, 상기 IBD는 궤양성 결장염인, 상기에 따른 사용을 위한, GM-CSF 변이체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 GM-CSF 변이체를 포함하는, IBD를 가진 대상체를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제35항에 있어서, 상기 IBD는 요네병, 베체트 증후군, 콜라겐성 결장염, 전환 결장염, 불확정 결장염, 현미경적 결장염, 감염성 결장염, 허혈성 결장염, 림프구성 결장염, 소장 및/또는 근위 소장의 특발성 염증, 또는 IBD-관련 설사인, 약제학적 조성물.