JP2008106076A - II型TGF−βレセプター/免疫グロブリン定常領域融合タンパク質 - Google Patents
II型TGF−βレセプター/免疫グロブリン定常領域融合タンパク質 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】TGF−βレセプターへのTGF−βの結合を競合的に阻害する、単離されたTGF−βレセプター融合タンパク質、ならびに細菌および哺乳動物宿主細胞のTGF−βレセプター融合タンパク質の発現を可能にするベクターおよびそれらの使用の方法。
【選択図】なし
Description
トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)は、ポリペプチドのファミリー(そのうちの3つは、哺乳動物に存在するTGF-β1、TGF-β2およびTGF-β3に存在する)を意味する。これらの因子は、細胞増殖および分化における全体的な効果を有する(RobertsおよびSporn(1990)Handbk.Exp.Pharm.95:419-58)。TGF-βはまた免疫プロセスを調節するという証拠の増大する具体例(growing body)がある(Wahlら(1989)Immunol.Today10:258-61)。損傷部位の免疫細胞の集合を刺激することに加えて、TGF-βはまた、それ自身の続く合成のための強力なポジティブフィードバックを提供する(Kimら(1990)Mol. Cell. Biol.10:1492-1497)。
従って、本発明は、線維増殖障害を有する患者の治療的処置のための新規の組成物および方法に関する。
なお別の実施態様において、本発明の方法は、静脈内、眼内、関節内、経皮および腸内への方法によるTGF-βレセプター融合タンパク質投与を提供する。本発明の別の実施態様において、TGF-βレセプター融合タンパク質が、コラーゲン血管障害(例えば、全身性硬化症、多発性筋炎、強皮症、皮膚筋炎、または全身性エリテマトーデス)を有する患者に対して投与される。
・(項目1) TGF-βレセプターへのTGF-βの結合を競合的に阻害する、単離されたTGF-βレセプター融合タンパク質。
・(項目2) TGF-βII型レセプターではない第2タンパク質に連結されるTGF-βII型レセプターを含む、項目1に記載の融合タンパク質。
・(項目3) 項目2に記載の融合タンパク質であって、ここで上記第2タンパク質が免疫グロブリンの定常領域である、融合タンパク質。
・(項目4) 配列番号8または配列番号9を含む、項目3に記載の融合タンパク質。
・(項目5) 配列番号8のアミノ酸1〜160を含む、単離されたTGF-βレセプター融合タンパク質。
・(項目6) 配列番号9のアミノ酸1〜160を含む、単離されたTGF-βレセプター融合タンパク質。
・(項目7) 項目5または6に記載の単離されたタンパク質であって、ここで上記アミノ酸が免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分に連結される、単離されたタンパク質。
・(項目8) 発現において、TGF-βII型レセプターではない第2タンパク質に連結されるTGF-βII型レセプターをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
・(項目9) 項目8に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、以下:
(a)配列番号10または12;
(b)標準的なハイブリダイゼーション条件下で上記配列にハイブリダイズし、そしてTGF-βII型レセプター融合タンパク質のTGF-β阻害活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および
(c)発現において、任意の上記ポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
・(項目10) 薬学的に受容可能なキャリア中のTGF-βレセプター融合タンパク質を含む組成物であって、上記融合タンパク質がTGF-βリガンドへのTGF-βの結合を競合的に阻害するために十分な量である、組成物。
・(項目11) 項目9に記載の上記ポリヌクレオチド配
列を含む、ベクター。
・(項目12) 項目11に記載のベクターを含む、宿主細胞。
・(項目13) TGF-βレセプター融合タンパク質を産生するための方法であって、項目12に記載の宿主細胞を培養する工程、上記細胞に融合タンパク質を発現させる工程、上記融合タンパク質を単離および精製する工程を包含する、方法。
・(項目14) TGF-βのレベルを低下させる必要性がある個体においてTGF-βのレベルを低下させるための方法であって、配列番号8または9に記載のアミノ酸配列を含むTGF-βレセプター融合タンパク質であるTGF-βアンタゴニストのTGF-βを低減する量を上記個体に投与する工程を包含する、方法。
・(項目15) 関節炎を有する個体において、TGF-βのレベルを低下させるための方法であって、配列番号8または9に記載のアミノ酸配列を含むTGF-βレセプター融合タンパク質であるTGF-βアンタゴニストの有効量を上記個体に投与する工程を包含する、方法。
・(項目16) TGF-β過剰産生と関連する医学的状態に関して個体を処置するための方法であって、配列番号8または9に示されるアミノ酸配列を有するTGF-βII型レセプター融合タンパク質を、上記個体中のTGF-β活性を減少させるために十分な量で、上記個体に投与する工程を包含する、方法。
・(項目17) 項目16に記載の方法であって、ここで上記TGF-βレセプター融合タンパク質が、静脈内投与、眼内投与、関節内投与、経皮投与、および腸内投与からなる群から選択される方法によって投与される、方法。
・(項目18) 項目16に記載の方法であって、ここで上記医学的状態が線維増殖障害を含む、方法。
・(項目19) 項目18に記載の方法であって、ここで上記線維増殖障害が、腎臓線維症、眼内線維症、および肺線維症からなる群から選択される線維症を含む、方法。
・(項目20) 項目18に記載の方法であって、ここで上記線維増殖障害が、糖尿病腎障害、糸球体腎炎、増殖性硝子体網膜症、および骨髄線維症からなる群から選択される、方法。
・(項目21) 項目18に記載の方法であって、ここで上記線維増殖障害が、全身性硬化症、多発性筋炎、強皮症、皮膚筋炎、または全身性エリテマトーデスからなる群から選択されるコラーゲン血管障害である、方法。
以下の用語を本明細書中で使用する:
定義
本明細書中で使用される「組換え」は、タンパク質が組換え(例えば、微生物または哺乳動物の)発現系に由来することを意味する。「微生物の」は、細菌または真菌(例えば、酵母)の発現系で作製された組換えタンパク質をいう。産物としての「組換え微生物の」は、微生物の発現系において産生されたタンパク質を定義し、これは本質的ネイティブな内因性物質を含まない。ほとんどの細菌の培養(例えば、E.coli)で発現されるタンパク質は、グリカンを含まない。酵母で発現されるタンパク質は、哺乳動物細胞で発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。
A.可溶性TGF-βレセプター融合物およびTGF-βアンタゴニストとしてのそれらのアナログ
本発明は、単離されそして精製されたTGF-βアンタゴニストポリペプチドを利用する。本発明で使用される単離されそして精製されたTGF-βアンタゴニストポリペプチドは、天然または内因性起源の物質を含む他のものを実質的に含まず、そして約1%未満の産生プロセスの残存タンパク質夾雑物量を含む。本発明で使用されるTGF-βポリペプチドアンタゴニストは必要に応じて、ネイティブパターンのグリコシル化と関連しない。
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、発現される際には野生型TGF-βレセプターをコードする、ポリヌクレオチドに由来する(例えば、配列番号1〜4、10、および12)。米国特許第5,693,607号もまた、参照のこと。TGF-βレセプターII型分子をコードするcDNA(すなわち、配列番号2の832〜1311として番号付けられたヌクレオチド、言い換えると配列番号4)は、TGF-βレセプターをコードする相補的DNA(cDNA)配列である。TGF-βレセプターファミリーの他のメンバーは、野生型TGF-βI型ポリヌクレオチド(REF)、および野生型III型ポリヌクレオチド(REF)として提示される。
本明細書中に記載される単離されたポリペプチドは、当該分野において公知の任意の適切な方法によって生成され得る。このような方法は、直接タンパク質合成法から、単離されたポリペプチド配列をコードするDNA配列を構築し、そしてこれらの配列を適切な形質転換宿主中で発現することに及ぶ。例えば、cDNAは、配列番号8,9,11または13のポリペプチドをコードする標識されたDNAフラグメントでヒトcDNAライブラリーをスクリーニングし、そしてオートラジオグラフィーによってポジティブなクローンを同定することによって入手され得る。従来の方法を使用して、さらなる回数のプラーク精製およびハイブリダイゼーションが行われる。
一旦、(合成、部位特異的変異誘発または別の方法によって)アセンブリされると、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードする変異型DNA配列は発現ベクターに挿入され、そして所望の宿主でのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結される。適したアセンブリは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素地図法および適切な宿主内での生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認され得る。当該分野において周知のように、宿主にトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るため、この遺伝子は、選択された発現宿主において機能的である転写および翻訳発現制御配列に作動可能に連結されなければならない。
好ましくは、組換え発現ベクターが使用されて、TGF-βレセプター融合物をコードするDNAを増幅または発現する。組換え発現ベクターは複製可能なDNA構築物であり、これは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、TGF-βレセプター融合物または生物学的に等価なアナログをコードする、合成またはcDNA由来DNAフラグメントを有する。転写単位は、一般的に、以下に詳細に記載されるように、(1)遺伝子エレメントまたは遺伝子発現において調節的な役割を有するエレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、(2)mRMAへと転写されそしてタンパク質へと翻訳される構造的配列またはコード配列、ならびに(3)適切な転写および翻訳の開始および終結配列、のアセンブリを含む。このような調節エレメントには、転写を制御するオペレーター配列が含まれ得る。通常、宿主内で複製する能力は複製起点によって付与され、そして形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み込まれ得る。DNA領域は、これらが互いに機能的に関連する場合は、作動可能に連結される。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)についてのDNAが、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合は、ポリペプチドについてのDNAに対して作動可能に連結されるか、プロモーターが、それが配列の転写を制御する場合にはコード配列に作動可能に連結されるか、またはリボソーム結合部位が、それが翻訳を可能にするように配置される場合はコード配列に作動可能に連結される。一般的に、作動可能に連結されるとは、連続することを意味し、そして分泌リーダーの場合は、連続およびリーディングフレーム内にあることを意味する。酵母発現系での使用を意図される構造的エレメントには、好ましくは、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列を伴わずに発現される場合、N末端メチオニン残基を含み得る。続いて、この残基は発現された組換えタンパク質から、必要に応じて、切断されて最終産物を提供し得る。
形質転換された宿主によって産生されたタンパク質は、任意の適切な方法にしたがって精製され得る。このような標準的な方法には、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解性、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術による方法を含む。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオンSトランスフェラーゼのようなアフィニティータグは、適切なアフィニティーカラムに通すことによって容易な精製を可能にするためにタンパク質に付着させ得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびX線結晶解析のような技術を使用して物理的に特徴付けられ得る。
単離されたタンパク質のフラグメント(例えば、配列番号8のフラグメント)はまた、組換え方法によって、タンパク質分解性消化によって、または化学的合成によって、当業者に公知の方法を使用して効率的に産生され得る。組換え法において、ポリぺプチドの内部フラグメントまたは末端フラグメントが、単離されたポリぺプチドをコードするDNA配列の一端(末端フラグメントについて)または両端(内部フラグメントについて)から、1つ以上のヌクレオチドを除去することによって生成され得る。変異誘発されたDNAの発現は、ポリぺプチドフラグメントを産生する。「末端ニブリング(nibbling)」エンドヌクレアーゼでの消化によりまた、フラグメントのアレイをコードするDNAを生成し得る。タンパク質のフラグメントをコードするDNAもまた、ランダム剪断、制限消化、または組み合わせ、または両方によって生成され得る。
タンパク質のアミノ酸配列改変体(例えば、配列番号8の改変体)は、タンパク質またはその特定の部分をコードするDNAのランダム変異誘発によって調製され得る。有用な方法には、PCR変異誘発および飽和変異誘発が含まれる。ランダムアミノ酸配列改変体のライブラリーはまた、縮重オリゴヌクレオチド配列のセットの合成によって生成され得る。改変されたDNAおよびペプチドを使用して所与のタンパク質のアミノ酸配列改変体を生成する方法は、当該分野で周知である。このような方法の以下の実施例は、本発明の範囲を限定することを意図しないが、単に、代表的な技術を例示するために提供される。当業者は、他の方法もまた、この点において有用であることを認識する。
非ランダム、または指向された変異誘発は、単離されたポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド配列の特定の部分に特異的な配列または変異を提供し、単離されたポリぺプチドの公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入、または置換を含む改変体を提供する。変異部位は、個々にまたは連続的に、例えば、(1)まず保存されたアミノ酸を置換し、次いで達成された結果に依存してよりラジカルな選択を置換することにより;(2)標的残基を欠失させることにより;または(3)配置された位置に隣接して、同じかまたは異なるクラスの残基を挿入することにより、あるいは選択1〜3の組み合わせにより、改変され得る。
本発明のタンパク質の誘導体はまた、生物学的活性を維持する一次タンパク質の種々の構造形態を含む。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基の存在により、例えば、TGF-βレセプター融合タンパク質は、酸性もしくは塩基性の塩の形態、または中性の形態であり得る。個々のアミノ酸残基はまた、酸化または還元によって改変され得る。一次アミノ酸構造(例えば、TGF-βRII部分の構造)は、他の化学的部分(例えば、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基など)と共有結合体または凝集的な結合体を形成することによって、またはアミノ酸配列変異体を作製することによって改変され得る。
本発明は、医学的状態を有する個体に、十分な量のTGF-βレセプター融合タンパク質(例えば、TGF-βRII:Fc)を、個体におけるTGF-β活性を低減させるために投与することを提供する。本発明はさらに、TGF-βRII:Fcを、TGF-βが過剰である部位(例えば、繊維増殖(fibroproliferation)、および感染性疾患に付随するような免疫抑制によって特徴付けられる疾患状態における)に送達することを提供する。
本発明のタンパク質の処方、投与の方法および用量は、処置されるべき障害および患者の病歴に依存する。これらの要素は、治療の過程において容易に決定され得る。過剰なTGF-βにより生じた状態をともなう適切な患者は、実験室試験、病歴および身体的所見により同定され得る。TGF-β過剰は、患者血清または患部組織の免疫アッセイにより直接決定され得る。過剰なTGF-βはまた、Kekowら(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8321-25によって記載される細胞増殖アッセイのようなバイオアッセイによって決定され得る。過剰のTGF-βはまた、TGF-βmRNAレベルの測定によって間接的に(例えば、Kekowらのポリメラーゼ連鎖反応において)決定され得る。
ウサギII型TGFβ(「TGFβ」)レセプターをコードする全長クローン(MIS_3f11)を、ウサギ卵巣cDNAライブラリーから記載のように(diClementeら、Mol. Endcrinol. 8:1006[1994])単離する。ヒトIgG1のFc部分(配列番号2由来のヌクレオチド1312〜1995)に融合したウサギII型レセプターの細胞外ドメイン(配列番号2由来のヌクレオチド832〜1311)からなる、組換えウサギTGFβRII:Fc融合遺伝子を以下のようにして構築する:
フラグメント1)479bpフラグメント(ウサギTGFβII型レセプターの細胞外ドメインを含む)を適切なオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号5および配列番号6)を使用する従来のPCRにより、クローンMIS_3f11から増幅する。これらのオリゴヌクレオチドは、得られたPCR産物に、隣接するNot1およびSal1制限酵素部位を付与し、続いて、このPCR産物をこれらの2つの制限酵素を用いて消化する。
組換えウサギTGFβR:Fc融合遺伝子(発現ベクター配列番号1内に含まれる配列番号2)を280ボルトでのエレクトロポレーションにより、COS細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM培地において増殖させる。5日後、細胞を遠心分離により培養物から除去し、そして上清をSDS/ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS/PAGE)により、組換えウサギTGFβRII:Fcの発現について評価する。細胞培養物の上清中に存在するTGFβRII:Fcを、TGFβに結合する能力について試験する。[125I]-TGFβ(NENLife Science Products)を、ウサギTGFβRII:FcまたはコントロールIgG、およびIgGのFc部分に結合するプロテインA-Sepharoseを含む馴化細胞培養培地とともに2.5時間インキュベートする。得られたプロテインA:Fc複合体を遠心分離により回収し、リン酸緩衝化生理食塩水中で洗い、そしてSDS/PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析する。TGFβRII:Fcは、[125I]-TGFβを免疫沈降させるが、コントロールIgGは免疫沈降させない。
ミンク肺上皮細胞(CCL64)の増殖をTGFβ1により阻害する。従って、本発明者らは、TGFβ1の抗増殖効果をブロックするTGFβR:Fcの能力を試験し得る。CCL64細胞は、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、および10%ウシ胎児血清を補充したMEMにおいて維持する。試験するために、96ウェルマイクロタイター組織培養プレートにおけるアッセイ培地(100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、および10%ウシ胎児血清を補充したMEM)中で、TGFβR:Fcの段階希釈物を、0.1ng/mlのTGFβ1とともに1時間インキュベートする。CCL64細胞をアッセイ培地中で再懸濁し、そして1ウェルあたり4000個の細胞濃度でアッセイプレートに添加する。細胞を37℃で72時間インキュベートし、そしてさらに4時間、[3H]チミジン(70〜86Ci/mmol)でパルス刺激する。細胞増殖を反映するDNA合成を、[3H]チミジンの取り込みを測定することにより、決定する。細胞が培地単独中で増殖可能な場合、取り込まれた[3H]チミジンの量は、188,745計数/分(CPM)と測定される。TGFβ1を培地に含む場合、増殖は阻害され、そして取り込まれた[3H]チミジンの量は49088計測/分と測定される。以下に、漸増量のTGFβR:FcまたはコントロールIgGを培地に添加する場合の結果を示す。
体重が400g、そして約3〜4ヶ月齢の雄性Sprague-Dawleyラット(Bantin& Kingman, Edwards, WA)を始めから終わりまで使用した。全ての外科手術の手順を、キシラジン(2.2mg/kg, AnaSedTM, Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA)およびケタミン(540mg/kg, Ketaset TM, Aveco Co.,Fort Dodge, IA)の腹腔内注射による全身麻酔下で行う。左総頚動脈を、外頚動脈を通してカテーテルを導入することにより、2Fバルーンカテーテルを用いて露出させる。遠位左総頚動脈および外部頚動脈を、頚部における正中線の創傷を介して露出する。カテーテルを、わずかな抵抗性を生じるように生理食塩水で充分に拡張したバルーンで3回通す;この方法は、頚動脈自体の拡張を生じ、外部頚動脈は、カテーテルの除去および創傷を閉じた後に連結する。
肺におけるコラーゲンの過剰蓄積は、肺線維症の特徴である。組織におけるコラーゲンの量は、コラーゲンの合成速度およびコラーゲンの分解速度に依存し、そして線維症の場合においては、コラーゲン合成速度は、コラーゲン分解速度を凌駕する。
生化学的研究のために用いる動物の肺を、氷冷した等張生理食塩水を用いて右心室を介して、インサイチュで灌流して、血液を左心室における開口部を通して肺血管系から洗い流す。肺葉をすばやく非柔組織を含まない組織に切開分離し、急速な凍結のために液体窒素中に滴下し、次いで-80℃で保存する。凍結した肺を後に融解し、そしてPolytronホモジナイザーを用いて0.1M KC、0.02M Tris 緩衝液(pH7.6)中でホモジナイズする。1mlのホモジネートのアリコートのいくつかを種々の生化学的アッセイが行われる時間まで、-80℃で保存する。
ハムスターを心停止のレベルまで麻酔する。胸郭を開き、心臓を、心基底で結紮し、そして気管にカニューレを挿入する。肺および心臓をひとまとめにして取り出し、重量を量り、そして通常の生理食塩水槽中に置き、そして肺を0.12M カコジル酸緩衝液中の1% グルタルアルデヒド-パラホルムアルデヒド固定液を、400m Osm、30cm H2O圧で滴注する。肺を約2時間この圧を介して固定し、次いで閉塞した気管とともに固定液中に保存する。包埋する前に、おおざっぱな解剖により、心臓および全ての非肺組織から肺を単離し、そして取り出す。組織のブロックをそれぞれの肺の右上葉(cranial)、右下葉(caudal)、および左肺葉からの少なくとも2つの矢状厚板(sagittalslab)(2〜3mm厚)から切断する。約1cm2表面を有する各ブロックに切断する。そのブロックを段階的な系列のエタノール中で脱水し、そしてパラフィンに包埋する。切片(5μm厚)をパラフィンブロックから切り出し、そして組織病理学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
コントロールおよび処置した動物の肺において異なる生化学的な決定因子についての値を、1mgの肺タンパク質またはDNAあたりで表す。しかし、1mgの肺タンパク質またはDNAに基づくデータの表現は、人為的なより低い値を処置動物に導入する傾向にあることに注意すべきである。この問題は、リンパ球の浸潤、灌流後でさえも肺の中に残存する血漿タンパク質の存在、ならびにブレオマイシンで処置したハムスターの肺における長期間の研究におけるII型細胞および線維芽細胞の増殖による。値の人為的な低下を回避するために、データを、肺1つを基準に表現する。Starcherら、Am.Rev. Resp. Dis.,117:299-305(1973)およびWitschi,Essays Toxicol., 6:125-191(1975)を参照のこと。
本発明のタンパク質の効果を、糸球体腎炎モデルにおいて評価する。ウサギ由来の抗糸球体基底膜腎毒素血清(NTS)の単回注射を用いて、実験的な糸球体腎炎をラットに誘導する。実験的な病変は、急性糸球体間質増殖性の糸球体腎炎であり、これは糸球体間質のマトリックスの増大および過細胞性(hypercellularity)により特徴付けられる。損傷した細胞はまた、より多くのTGFβ1mRNA、およびTGFβ1を発現し、これは次いで、2つのプロテオグリカン、ビグリカン、およびデコリンの合成を刺激する。特に興味深いことに、腎炎は、糸球体および尿細管間質の瘢痕を介して、腎疾患の最終段階まで再現性よく進行する。
病原体を有さない約100gの体重の雌性LEWラット(Harlan Sprague Dawely, Indianapolis, Ind)に関節炎を誘導する。各ラットに、1用量のA型連鎖球菌(SCW)由来の細胞壁フラグメント(30μgラムノース/体重(g))を、Brandesら、(1991)J. Clin. Invest. 87:1108において記載の技術に従って腹腔内(ip)注射する。SCWを注射したLEWラットおよびコントロールLEWラットに以下のうちの1つを後脚関節の1箇所に関節内(IA)注射する:
1.本発明のタンパク質を含む25μlのPBS
2.PBSのみ、または
3.IgGコントロール。
本発明は、実施例および直接的な記載の両方により記載されている。当業者が、上記の精神に従うがその範囲内にある、請求の範囲に記載される発明との等価物を推測し得ることが明白であるはずである。これらの等価物は、本発明の範囲内に含まれるべきである。
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