JP4731016B2 - 血管内皮細胞増殖因子アンタゴニストとその用途 - Google Patents

Description

【０００１】
(発明の分野)
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、該アンタゴニストを含む治療用組成物並びに診断および治療目的のために該アンタゴニストを使用する方法に関する。特に、本発明はＶＥＧＦアンタゴニストを用いる脳卒中又は浮腫の治療方法に関する。
【０００２】
(発明の背景)
脈管系の２つの主要な細胞成分は内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は全血管の内部表面の内張りを形成し、血液と組織の間の非血栓形成性界面を構成する。加えて、内皮細胞は新しい毛細血管や血管の発育のために重要な成分である。よって、内皮細胞は、腫瘍増殖および転移並びに種々の非新生物疾病または疾患に随伴した、脈管形成または新血管形成中に増殖する。
天然に生じる種々のポリペプチドは内皮細胞の増殖を誘発することが報告されている。これらのポリペプチドには、塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ブルゲス（Burgess）およびマシアグ（Maciag）、Annual Rev．Biochem.、58:575（1989年）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、イシカワ（Ishikawa）等、Nature、338:557（1989年）、並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、リュング（Leung）等、Science 246:1306（1989年）；フェララ（Ferrara）およびヘンゼル（Henzel）、Biochem．Biophys．Res．Commun．161:851（1989年）；ティッシャー（Tischer）等、Biochem．Biophys．Res．Commun．165:1198（1989年）；フェララ等、ＰＣＴ公開特許第ＷＯ 90/13649号（1990年11月15日公開）がある。
ＶＥＧＦは最初、ウシ下垂体小胞または星状小胞細胞で条件づけた培地中で同定された。生化学分析によって、ウシＶＥＧＦは二量体タンパク質であって、見かけ上の分子量は約45,000ダルトンであり、血管内皮細胞に対して明白な細胞分裂誘発性特異性を有していることが示されている。ウシＶＥＧＦをコードするＤＮＡは、ハイブリッド形成プローブとしてタンパク質のアミノ末端アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用して上記細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして単離された。
【０００３】
ヒトＶＥＧＦは、ウシＶＥＧＦ ｃＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして使用して、ヒト細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを先ずスクリーニングして得られた。こうして同定された１つのｃＤＮＡは、ウシＶＥＧＦと95％以上の相同性を有する165アミノ酸のタンパク質をコードしており、このタンパク質はヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）と称されている。ヒトＶＥＧＦの細胞分裂促進活性は、哺乳動物宿主細胞中でヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡを発現することによって確認された。ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞で条件づけた培地は毛細血管内皮細胞の増殖を促進したが、対照細胞では促進しなかった。リュング等、Science 246:1306（1989年）。
更に幾つかのｃＤＮＡが、ｈＶＥＧＦの121−、189−および206−アミノ酸イソ型(集合的に、ｈＶＥＧＦ関連タンパク質とも称される)をコードするヒトｃＤＮＡライブリー中で同定された。121−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基116から159の間の44個のアミノ酸を欠失しているためｈＶＥＧＦと異なっている。189−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基116に24個のアミノ酸挿入があるためｈＶＥＧＦと異なっており、明らかにヒト血管透過性因子（ｈＶＰＦ）と同一である。206−アミノ酸タンパク質は、ｈＶＥＧＦの残基116に41個のアミノ酸の挿入があるためｈＶＥＧＦと異なっている。フック（Houck）等、Mol．Endocrin．5:1806（1991年）；フェララ等、J．Cell．Biochem．47:211（1991年）；フェララ等、Endocrine Reviews 13:18（1992年）；ケック（Keck）等、Science 246:1309（1989年）；コノリ（Connolly）等、J．Biol．Chem．264:20017（1989年）；ケック等、ＥＰＯ公開特許第0 370 989号（1990年5月30日公開）。
ＶＥＧＦに対するレセプターは文献に記載されている。２つのこのようなレセプター、ｆｌｔ−１とｆｌｋ−１が、ＶＥＧＦ効果を媒介することがわかっている［デブリーズ（DeVries）等、Science 255:989（1992年）；シブヤ（Shibuya）等、Oncogene 5:519（1990年）；マシューズ（Matthews）等、Proc．Nat．Acad．Sci．88:9026（1991年）；ターマン（Terman）等、Oncogene 6:1677（1991年）；ターマン等、Biochem．Biophys．Res．Comm．187:1579（1992年）；ノイフェルド（Neufeld）等、Prog. Growth Factor Res. 5:89-97（1994年）；ウォルテンバーガー（Waltenberger）等、J. Biol. Chem. 269:26988（1994年）；クイン(Quinn)等、Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7533（1993年）］が、それらの調節及びメカニズムはまだ十分には理解されていない。レンミラー（Lennmyr）等、J. Neuropathology及びExp. Neurology 57:874-882（1998年）。ｆｌｔ−１レセプターとｆｌｋ−１レセプターの双方が膜貫通レセプターであり、クラスＩＩＩのチロシンキナーゼレセプターファミリーに属している。バーレオン（Barleon）等、J. Cell Biochem. 54:56（1994年）；上掲のノイフェルド等。
ＶＥＧＦは血管内皮細胞増殖を刺激するばかりでなく、脈管形成をも誘発する。先在する内皮からの新しい血管の形成を含む脈管形成は、腫瘍増殖および転移、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生性緑内障、加齢性黄斑変性、血管腫、移植された角膜組織とその他の組織の免疫拒絶反応、および慢性炎症を含む様々な疾病や疾患の重要な成分である。
【０００４】
腫瘍増殖の場合には、脈管形成が過形成から新生物形成への変移および増殖中の固形腫瘍への栄養供給に決定的に重要であるように思われる。フォークマン（Folkman）等、Nature 339:58（1989年）。また、脈管形成は腫瘍と宿主の血管床の接触を可能にし、この血管床が腫瘍細胞の転移経路を提供すると思われる。腫瘍転移における脈管形成の役割の証拠は、例えば、ヒト浸潤乳癌の組織学的切片中の微小血管の数および密度と実際の遠位転移の存在との間の関係を示す研究によって提供されている。ワイドナー（Weidner）等、New Engl．J．Med．324:1（1991年）。
また、ＶＥＧＦは内皮及び血管透過性に関与していることが報告されている。フェララ等、Endocrine Reviews 18:4-25（1997年）；ドブロゴウスカ（Dobrogowska）等、J. Neurocytology 27:163（1998年）。十分には理解されてはいないが、ＶＥＧＦは皮膚、網膜及び腫瘍組織における内皮細胞漏洩を増加させると考えられている。コリンズ（Collins）等、Brit. J. Pharmacology 109:195（1993年）；コノリ等、J. Clin. Invest. 84:1470（1989年）；スウェイキ（Shweiki）等、Nature 359:843（1992年）；モナシ（Monacci）等、Am. J. Physiol. 264:C995（1993年）；ストーン(Stone)等、J. Neurosci. 15:4738（1995年）；デトマー(Detmar)等、J. Invest. Dermatol. 108:263（1997年）；ウェインデル（Weindel）等、Neurosurgery 35:437（1994年）。また、内皮細胞及び血液脳関門の透過性におけるＶＥＧＦ（そのレセプター、特にｆｌｔ−１レセプター）の潜在的効果と役割も調査されている。例えば、ロセンステイン（Rosenstein）等、Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7086（1998年）；ドブロゴウスカ（Dobrogowska）等、上掲；コバクス（Kovacs）等、Stroke 27:1865（1996年）を参照されたい。成体ラットの脳において、ＶＥＧＦｍＲＮＡは、比較的広範囲で発現していることが見出されているが、量は幾分少ない。モナシ等、Am. J. Physiol. 146:368-378（1993年）。しかしながら、酸素張力の低減により、ＶＥＧＦ発現が誘発されることも示されており[ドール（Dor）及びケシェット（Keshet）、Trends in Cardiovascular Med. 7:289-294（1998年）]、ＶＥＧＦ、ｆｌｔ−１及びｆｌｋ−１のレベルの増加は、ラットの脳において、限局性脳虚血の誘発に続いて生じることが示されている。ハヤシ等、Stroke 28:2039（1997年）；コバクス等、上掲；レンミラー等、J. Neuropathology and Experimental Neurology 57:874（1998年）。脳卒中及びＢＢＢ（血液脳関門）衰弱の病原におけるＶＥＧＦの役割は、文献に引用された矛盾する実験観察により明白にはされていない。例えば、ナグ（Nag）等、J. Neuropathology and Experimental Neurology 56:912（1997年）には、この皮質が冷傷害を受けたラットモデルにおいて、ダメージを受けた組織内の透過性軟膜血管及び細動脈に壁在性ＶＥＧＦが存在していることが示されており、この観察から、ＶＥＧＦがＢＢＢ衰弱及び浮腫形成を媒介するいくつかの要因の一つであることが推察される。他方、ハヤシ等、J. Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18:887（1998年）には、ＶＥＧＦそれ自体を一過性脳動脈閉塞後に再灌流したラットの脳表面に局所的に適用すると、虚血による脳損傷、梗塞容量及び浮腫形成が低減されることが報告されている。
【０００５】
（発明の概要）
本発明はＶＥＧＦのアンタゴニストを提供し、これらには（ａ）ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプター、またはｈＶＥＧＦレセプターと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体と特異的に結合できる抗体およびそれらの変異体、（ｂ）ｈＶＥＧＦレセプターおよびそれらの変異体、並びに（ｃ）ｈＶＥＧＦ変異体が含まれる。これらのアンタゴニストはｈＶＥＧＦの細胞分裂活性、脈管形成活性、血管透過活性、又は他の生物学的活性を抑制、隔絶または中和するので、望ましくない過度の新血管形成を特徴とする疾病または疾患の治療に有用であり、これらの例としては腫瘍、特に固形悪性腫瘍、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（バセドウ病を含む）、角膜および他の組織の移植、並びに慢性炎症が含まれる。また、アンタゴニストは、腫瘍、脳卒中、頭部外傷に随伴した浮腫、悪性腫瘍に随伴した腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜滲出液（例えば、心膜炎に随伴するもの）、並びに胸水等の疾病または疾患の治療にも有用である。
他の側面では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、（ａ）非ｈＶＥＧＦエピトープ、例えば、血栓形成もしくは血栓溶解に関与するタンパク質のエピトープ、または腫瘍細胞表面抗原、又は（ｂ）ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプターまたはｈＶＥＧＦレセプターと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体と結合し得る多特異性モノクローナル抗体である。
更に他の側面では、ＶＥＧＦアンタゴニストは細胞毒性部分と抱合体を形成する。
もう１つの側面では、本発明は、上記したようなモノクローナル抗体をコードする単離核酸およびこのようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関するものである。
もう１つの側面では、本発明は、哺乳動物においてｈＶＥＧＦ介在細胞分裂活性、脈管形成活性、又は他の生物学的活性を減少させるかまたは消失させるのに有効な量のＶＥＧＦアンタゴニストを含む製薬組成物のような組成物に関するものである。
別の側面では、本発明は、哺乳動物、好ましくは治療を必要としているヒト患者に有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを含む治療方法に関するものである。所望される場合には、ＶＥＧＦアンタゴニストは一または複数の他のＶＥＧＦアンタゴニスト、抗腫瘍もしくは抗脈管形成物質と、同時にまたは順次に同時投与され、もしくは処理されている疾病又は病状に適した療法において投与される。
もう１つの側面では、本発明は、ｈＶＥＧＦと特異的に結合可能な抗体と試験試料を接触させ、このような結合の程度を測定することによって試験試料中のｈＶＥＧＦを検出する方法に関するものである。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ｈＶＥＧＦの一または複数の生物学的活性を阻止、封鎖又は中和し得るｈＶＥＧＦのアンタゴニストを提供する。ｈＶＥＧＦのアンタゴニストは、ｈＶＥＧＦと細胞レセプターの結合を妨げ、ｈＶＥＧＦによって活性化されている細胞を無能力化もしくは死滅させ、またはｈＶＥＧＦと細胞レセプターの結合後に血管内皮細胞活性化を妨げることによって作用する。ｈＶＥＧＦアンタゴニストによるかかる介入点は全て、本発明の目的に対しては等価であると考えるべきである。よって、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプターまたはｈＶＥＧＦレセプターと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体と結合する抗体、モノクロール抗体及びヒト化抗体、またはそれらのフラグメントが本発明の範囲内に含まれる。更に、ｈＶＥＧＦレセプターと結合するが天然ｈＶＥＧＦの生物学的活性を示さないｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる。さらに、ｈＶＥＧＦを結合し得るｈＶＥＧＦレセプターおよびそれらのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体も本発明の範囲内に含まれる。
ここで使用する「ｈＶＥＧＦ」という用語は、リュング等、Science 246:1306（1989年）、及びフック等、Mol．Endocrin．5:1806（1991年）に記載されているような、165−アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子、および関連のある121−、189−および206−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子と、これら増殖因子の天然に生じる対立遺伝子体およびプロセシングを受けた形態を意味する。
ここで使用する「ｈＶＥＧＦレセプター」または「ｈＶＥＧＦr」という用語は、ｈＶＥＧＦの細胞レセプターで、通常は血管内皮細胞に見られる細胞表面レセプター、並びにｈＶＥＧＦを結合する能力を保持しているそれらのフラグメントと変異体を意味する。典型的には、ｈＶＥＧＦアンタゴニストであるｈＶＥＧＦレセプターおよびそれらのフラグメント及び変異体は、天然での場合のように細胞膜中に組み入れられるかまたは細胞表面に固定されているというよりむしろ単離された形態であろう。ｈＶＥＧＦレセプターの一例は、fms様チロシンキナーゼ（ｆｌｔ又はｆｌｔ−１）、即ちチロシンキナーゼ属の膜貫通レセプターである。デブリーズ（DeVries）等、Science 255:989（1992年）；シブヤ（Shibuya）等、Oncogene 5:519（1990年）。全長ｆｌｔレセプターは、チロシンキナーゼ活性を持つ細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含んでいる。細胞外ドメインはｈＶＥＧＦの結合に関与しているが、細胞内ドメインはシグナル伝達に関与している。
【０００７】
ｈＶＥＧＦレセプターのもう一つの例はｆｌｋ−１レセプター（ＫＤＲとも称される）である。マシューズ（Matthews）等、Proc．Nat．Acad．Sci．88:9026（1991年）；ターマン（Terman）等、Oncogene 6:1677（1991年）；ターマン等、Biochem．Biophys．Res．Commun．187:1579（1992年）。
ｈＶＥＧＦとｆｌｔレセプターの結合によって、見かけ上の分子量が205,000と300,000ダルトンである少なくとも２つの高分子量複合体が形成される。300,000ダルトンの複合体はｈＶＥＧＦの１分子にレセプター２分子が結合したものを含む二量体であると考えられる。
ｈＶＥＧＦrの変異体も本発明の範囲内に含まれる。代表的な例には、少なくとも膜貫通および細胞質ドメインが全長レセプター分子から欠失しているレセプターの切断型、および非ｈＶＥＧＦrポリマーまたはポリペプチドがｈＶＥＧＦrと抱合している融合タンパク質、または好ましくはそれらの切断型が含まれる。このような非ｈＶＥＧＦポリペプチドの例は免疫グロブリンである。その場合には、例えば、ｈＶＥＧＦrの細胞外ドメイン配列は免疫グロブリン軽鎖または（好ましくは）重鎖のＦｖドメインと置換しており、レセプターの細胞外ドメインのＣ末端は重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２または他のフラグメントのアミノ末端と共有結合している。このような変異体は既知のイムノアドヘシンと同じようにして製造される。例えば、ガスコイン（Gascoigne）等、Proc．Nat．Acad．Sci．84:2936（1987年）；カポン（Capon）等、Nature 337:525（1989年）；アルフォ（Aruffo）等、Cell 61:1303（1990年）；アシュケナジ（Ashkenazi）等、Proc．Nat．Acad．Sci．88:10535（1991年）；ベネット（Bennett）等、J．Biol．Chem．266:23060（1991年）参照。種々のｆｌｔ−ＩｇＧ融合タンパク質の例を以下の実施例３に記載する。本発明において使用を意図しているｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインの切断された形態には、ＥＣＤフラグメント（例えば、欠失したＥＣＤ配列において一又は複数のアミノ酸を有するもの）及び欠失したＥＣＤにおいて一又は複数の免疫グロブリン様ドメインを有するＥＣＤ形態のものが含まれる。例えば、実施例３Ｂには、Ｆｃ−ＩｇＧに融合したｆｌｔの最初の３つの免疫グロブリン様ドメインのみを含有する切断された形態のＥＣＤが記載されている。好ましくは、アンタゴニスト分子の作製に使用される切断された形態のＥＣＤは、ｈＶＥＧＦに対する所望の結合を確実にするのに十分な免疫グロブリン様ドメインを含む。
【０００８】
他の実施態様では、ｈＶＥＧＦr又はそれらのフラグメント又は変異体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非タンパク様ポリマー（例えば、デービス（Davis）等、米国特許第4,179,337号；グッドソン（Goodson）等、BioTechno1ogy 8:343〜346（1990年）；アバチョウスキー（Abuchowski）等、J．Biol．Chem．252:3578（1977年）；アバチョウスキー等、J．Biol．Chem．252:3582（1977年）参照）または炭水化物（例えば、マーシャル（Marshall）等、Arch．Biochem．Biophys．167:77（1975年）参照）と抱合している。これは、ｈＶＥＧＦrの生物学的半減期を延ばし、レセプターが投与される哺乳動物で免疫原性である可能性を減少させるのに役立つ。
ｈＶＥＧＦrは、アンタゴニストの親和性およびｈＶＥＧＦに対するその原子価を考慮して、ｈＶＥＧＦの抗体と実質的に同じ態様で使用される。ｈＶＥＧＦレセプター自体または免疫グロブリンポリペプチドもしくは他の担体ポリペプチドと融合したｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン配列は、宿主中に存在しているが細胞表面のｈＶＥＧＦrと結合していないｈＶＥＧＦを隔離する能力によって、ｈＶＥＧＦのアンタゴニストとして特に有用である。
ｈＶＥＧＦrとそのフラグメント及び変異体は、ｈＶＥＧＦのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するスクリーニングアッセイにも有用である。例えば、ｈＶＥＧＦr（例えば、ｆｌｔまたはｆｌｋ−１）をコードするＤＮＡでトランスフェクションされた宿主細胞は細胞表面でレセプターポリペプチドを過剰発現し、このような組換え体宿主細胞を、試験化合物（例えば、小分子、線形もしくは環状ペプチドまたはポリペプチド）のｈＶＥＧＦrとの結合能の分析に理想的に適したものとする。ｈＶＥＧＦrおよびｈＶＥＧＦr融合タンパク質、例えばｈＶＥＧＦr−ＩgＧ融合タンパク質は類似の態様で使用することができる。例えば、融合タンパク質を固定支持体に結合させ、試験化合物が融合タンパク質のｈＶＥＧＦrドメインから放射標識ｈＶＥＧＦを追い出す能力を測定する。
ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦレセプター、抗体または他のタンパク質に関して使用される用語「組換え体」は、宿主細胞中で組換え体ＤＮＡ発現によって産生されるタンパク質を意味する。宿主細胞は原核細胞（例えば、大腸菌のような細菌細胞）または真核細胞（例えば、酵母または哺乳動物細胞）でありうる。
【０００９】
（アンタゴニスト抗体）
ここで使用する「モノクローナル抗体」という用語は実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、即ち、少量で存在することがある天然に生じうる突然変異を除いて、特異性および親和性が同一の集団を構成する個々の抗体を意味する。このような天然に生じる突然変異等の結果として、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦrと会合したｈＶＥＧＦを含む複合体（「ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体」）と特異的に結合し得る抗体を主として含有する本発明のモノクローナル抗体組成物は少量の他の抗体も含有する可能性があることは理解されなければならない。
よって、「モノクローナル」という修飾語は、このような実質的に同種の抗体集団から得られるような抗体の特徴を示すものであって、何か特別の方法で抗体が産生されることを要求していると考えるべきでない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、最初にコーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）、Nature256:495（1975年）に記載されたハイブリドーマ方法を使用して製造することができ、または組換えＤＮＡ方法によって製造することができる。カビリ（Cabilly）等、米国特許第4,816,567号を参照されたい。
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適当な宿主動物を皮下、腹腔内、または筋肉内経路で抗原を用いて免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘引する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次に、リンパ球はポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる。ゴーディング（Goding）、モノクローナル抗体：原理と実際、59〜103頁（Academic Press、1986年）。
抗原はｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦr、またはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体でありうる。抗原は、場合によってはｈＶＥＧＦとそのレセプターの１つとの結合に関与する一又は複数のアミノ酸残基を有するｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧＦrのいずれか１つのフラグメントまたは部分又は変異体である。例えば、ｈＶＥＧＦrの細胞外ドメイン配列（例えば、少なくとも膜貫通および細胞内ドメインを欠失している切断ｈＶＥＧＦrポリペプチド）による免疫化は、ｈＶＥＧＦ結合に関与しているのが細胞外ドメイン内の領域であるので、ｈＶＥＧＦのアンタゴニストである抗体を産生するのに特に有用であろう。
【００１０】
ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るモノクローナル抗体は、特に非会合（非複合化）ｈＶＥＧＦおよびｈＶＥＧＦrにも結合しないならば、有用である。よって、このような抗体はｈＶＥＧＦによって直ぐに活性化を受ける細胞と結合するだけで、従って哺乳動物中に通常見られるような遊離のｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧＦrでは隔絶されない。このような抗体は、典型的には、レセプターとｈＶＥＧＦ間の一または複数の接触点に及ぶエピトープと結合する。このような抗体は他のリガンドレセプター複合体に対して産生されており、ここで同じ態様で産生させることができる。これらの抗体は、抗体が非会合ｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧＦrと結合し得るか否かに拘わらず、非会合ｈＶＥＧＦもしくはｈＶＥＧＦrの生物学的活性を中和または阻止する必要はなく、中和または阻止することもできない。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻止する一又は複数の物質を好ましくは含有する適当な培養培地に接種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有し（ＨＡＴ培地）、これら物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
好ましいミエローマ細胞は効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性であるものである。これらのなかで、好ましいミエローマ細胞株はネズミミエローマ株、例えば、米国カリフォルニア州サンジエゴのソーク・インスチチュート・セル・ディストリビューション・センター（Salk Institute Cell Distribution Center）から入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、米国バージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるＳＰ−２細胞、およびイエルトン（Yelton）等がCurr．Top．Microbiol．Immunol．81:1（1978年）に記載したＰ３Ｘ６３Ａg８Ｕ．１細胞から誘導されるものである。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生に対して記載されている。コズボル（Kozbor）、J．Immunol．133:3001（1984年）；ブロデュア（Brodeur）等のモノクローナル抗体産生技術と応用、51〜63頁（Marcel Dekker，Inc．ニューヨーク、1987年）。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降法またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される。本発明のモノクローナル抗体は、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrもしくはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体を優先的に免疫沈降させるかまたは結合アッセイで上記抗原の少なくとも１つと優先的に結合し、ｈＶＥＧＦの生物学的活性を阻止し得るものである。
【００１１】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性および活性のアンタゴニスト抗体を産生することを確認した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化し、標準的方法で増殖させることができる。ゴーディング、モノクローナル抗体：原理と実際、59〜104頁（Academic Press、1986年）。この目的に適する培地には、例えば、ダルベッコの修正イーグル培地またはＲＰＭＩ−1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンが分泌したモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーのような慣用の免疫グロブリン精製方法を使用して培地、腹水または血清から適切に分離される。
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離されそして常套的な方法を使用して（例えば、ネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列が決定される。本発明のハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれをシミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生等しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクションして組換え体宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。
場合によっては、発現によって産生される免疫グロブリンの特性を変えるためにＤＮＡを修飾することができる。例えば、ネズミ抗体のヒト型化形態は、ネズミ抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応する領域で置換することによって産生される。或る実施態様では、ネズミ抗体の選択されたフレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸残基がまたヒト抗体中の対応するアミノ酸残基で置換される。カーター（Carter）等、Proc．Nat．Acad．Sci．89:4285（1992年）；カーター等、BioTechno1ogy 10:163（1992年）。ネズミ抗体のキメラ形態も、選択したヒト重および軽鎖定常ドメインのコード化配列を同種ネズミ配列の代わりに置換して産生される。カビリ等、米国特許第4,816,567号；モリソン（Morrison）等、Proc．Nat．Acad．Sci．81:6851（1984年）。
【００１２】
本発明において使用が考えられる特定のヒト化抗体には、公開されたPCT出願WO98/45331（1998年10月15日公開）及びWO98/45332（1998年10月15日公開）に記載されているヒト化及び親和成熟抗ｈＶＥＧＦ抗体が含まれる。このようなヒト化又は親和成熟抗ＶＥＧＦ抗体はWO98/45331及びWO98/45332に記載されている方法と技術を使用して調製され又は作製されうる。好ましくは、抗ｈＶＥＧＦ抗体は、上述したPCT出願において、ＹＯ３１７と命名された親和成熟抗体、又はＦ（ａｂ）−１２と命名されたヒト化Ｆ（ａｂ）を含む。Ｆｉｇ１４Ａ−Ｂ及び１５Ａ−Ｂは、ＹＯ１９２；ＹＯ２３８−３；ＹＯ２３９−１９；ＹＯ３１３−２；ＹＯ２４３−１；及びＹＯ３１３−１と命名された他の親和成熟抗ＶＥＧＦ抗体と共に、これらの抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列（軽及び重鎖）を示している。このような抗ＶＥＧＦ抗体は全てここで記載した方法での使用が考えられるものである。これらのPCT出願に開示されているように、いくつかのヒト化及び親和成熟抗体は異なる種類のインビトロアッセイにおいてＶＥＧＦ活性を低減又は阻害し、よってＶＥＧＦアンタゴニストとして作用することが示された。
よって、本発明の範囲内に含まれる抗体には、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体、並びに非ｈＶＥＧＦエピトープと結合し得る免疫グロブリン鎖を有するキメラ（「ヒト化型」を含む）抗体およびハイブリッド抗体のような変異体抗体が含まれる。
ここでの抗体には、全ての起源種、並びに免疫グロブリンクラス（例えば、ＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧおよびＩgＭ）およびサブクラス、並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ）が、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合可能であり、ｈＶＥＧＦの生物学的活性と拮抗し得る限り、含まれる。
本発明の好ましい実施態様では、抗体は、例えば、ムンソン（Munson）およびポラード（Pollard）、Anal．Biochem．107:220（1980年）のスカッチャード分析によって測定して、免疫化抗原に対して少なくとも約10⁹リツトル／モルの親和性を有する。さらに、モノクローナル抗体は典型的には、例えば、WO98/45331及びWO98/45332に記載されたような、又は実施例２に記載されるようなインビトロ細胞生存または増殖アッセイによって測定して、ｈＶＥＧＦの細胞分裂促進活性または脈管形成活性を少なくとも約50％、好ましくは80％を越えて、そして最も好ましくは90％を越えて阻止する。
或る治療上および診断上の応用に対しては、モノクローナル抗体がｈＶＥＧＦの異なる分子形態の全てよりもより少ないものと反応性であることが望ましい。例えば、165−アミノ酸配列ｈＶＥＧＦとは特異的に結合できるが121−または189−アミノ酸配列ｈＶＥＧＦポリペプチドとは結合できないモノクローナル抗体を有することが望ましい。このような抗体は異なったｈＶＥＧＦポリペプチドの比較ＥＬＩＳＡアッセイまたは比較免疫沈降法によって容易に同定される。
【００１３】
（細胞毒性部分との抱合体）
或る実施態様では、ｈＶＥＧＦ特異的モノクローナル抗体またはｈＶＥＧＦrと抱合した細胞毒性部分を提供することが望ましい。これらの実施態様では、細胞毒素はｈＶＥＧＦもしくはそのレセプターを発現または結合している細胞を無力化するかまたは死滅させるのに役立つ。ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るドメインによって抱合体が細胞に標的とされる。しかして、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合できるモノクローナル抗体が細胞毒素と抱合させられる。同様に、ｈＶＥＧＦrが細胞毒素と抱合させられる。モノクローナル抗体は最も望ましくは、ｈＶＥＧＦ単独（細胞毒素を有していない）の活性を中和できるが、この実施態様ではモノクローナル抗体またはレセプターがｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体ともはや結合できる必要はない。
或るクラスの免疫グロブリンの場合には、モノクローナル抗体自体のＦｃドメインが細胞毒素を提供するようになることがある（例えばＩgＧ2抗体の場合には、該抗体は補体を固定し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関与することができる）が、典型的には、細胞毒素はタンパク質細胞毒素、例えばジフテリア、リシンまたはシュードモナス毒素である。しかしながら、細胞毒素はタンパク質様である必要はなく、例えば腫瘍治療用にこれまでに使用されている化学療法剤を含めることができる。
細胞毒素は典型的には、抗体のＦｃドメイン内で（またはＦｃドメインの一部もしくは全ての代わりに）骨格のアミド結合によってモノクローナル抗体またはそのフラグメントと結合する。標的化機能がｈＶＥＧＦｒによって提供される場合、細胞毒性部分はｈＶＥＧＦ結合に関与しないレセプターの任意のドメイン上に置換され；好ましくは、該部分はレセプターの膜貫通および／または細胞質ドメインの代わりまたは該ドメイン上に置換される。最適な置換部位は日常的な実験によって決定され、十分に通常の技量の範囲内である。
タンパク質融合体である抱合体は、抱合体をコードする遺伝子を発現させることによって組換え体細胞培養物中で容易に作成される。或いは、抱合体は、例えば、イミノチオレートやメチル−４−メルカプトブチリマデートを使用して、チオエステル結合によるジスルフィド交換または結合のようなそれ自体既知の方法を使用して、細胞毒性部分を抗体またはレセプターのアミノ酸残基側鎖またはＣ末端カルボキシルに共有的に交差結合させて製造される。
【００１４】
（他の部分との抱合体）
ｈＶＥＧＦのアンタゴニストであるモノクローナル抗体およびｈＶＥＧＦrもまた、それら自体では細胞毒素として容易には分類されないが、ここでの組成物の活性を増す物質と抱合される。例えば、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るモノクローナル抗体またはｈＶＥＧＦrは、ウイルス配列のような異種ポリペプチド、細胞レセプター、ＴＮＦ、インターフェロンまたはインターロイキンのようなサイトカイン、凝血促進活性を有するポリペプチドおよび他の生物学的または免疫学的に活性なポリペプチドと融合される。このような融合体は組換え方法によって容易に製造される。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは抗ｈＶＥＧＦもしくは抗ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体抗体の定常ドメイン、またはｈＶＥＧＦrの膜貫通および／または細胞内ドメインに置換される。或いは、それらは、ここに記載した抗ｈＶＥＧＦ抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換される。
好ましい実施態様では、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、ここに記載した抗体の定常ドメインと結合されるかまたはそれらに置換される。ベネット等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067（1991年）。或いは、上記ポリペプチドは本発明の抗体のＦｖに置換され、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体に対して特異性を有する少なくとも１つの残存抗原結合部位、および出発抗体とは異なる機能または特異性を有する代用抗原結合部位を含むキメラ多価抗体が創製される。
【００１５】
（異種特異性抗体）
ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得るモノクローナル抗体は、列挙したエピトープ、典型的には１つの重−軽鎖複合体またはそのフラグメントに対して１つの結合部位を有してさえいれば良い。しかしながら、このような抗体は、場合によってはｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体のいずれの内部にも見られないエピトープと結合し得る抗原結合ドメインも有している。例えば、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体以外の抗原に対して特異性を有する抗体の相補性決定残基および、必要ならば、フレームワーク残基で、天然の抗ｈＶＥＧＦ、抗ｈＶＥＧＦrまたは抗ｈＶＥＧＦ−抗ｈＶＥＧＦr複合体抗体の対応するアミノ酸配列またはアミノ酸残基を置換することによって、ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と非ｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体抗原に対して特異性を有するもう１つの抗原結合部位を含む多特異的抗体が創製される。これらの抗体は少なくとも二価であるが、選択される抗体クラスに所有されている抗原結合部位の数に応じて、多価であることもできる。例えば、ＩgＭクラスの抗体は多価である。
本発明の好ましい実施態様では、このような抗体はｈＶＥＧＦまたはｈＶＥＧＦrエピトープと、（ａ）プロテインＣもしくは組織因子のような血液凝固に活性のポリペプチド、（ｂ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のような細胞毒性タンパク質、または（ｃ）ＣＤ４もしくはＨＥＲ−２レセプターのような非ｈＶＥＧＦr細胞表面レセプターのいずれかと結合することができる（マッドン（Maddon）等、Cell 42:93（1985年）；コーセンス（Coussens）等、Science 230:1137（1985年））。異種特異性の多価抗体は、宿主細胞を両抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡで同時形質転換させ、その後免疫アフィニティークロマトグラフィ等によって回収して簡便に製造され、発現された抗体の部分は所望の抗原結合特性を有している。或いは、このような抗体は単一特異性抗体のインビトロ組換えによって製造される。
【００１６】
（一価抗体）
ｈＶＥＧＦrまたはｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦr複合体と結合し得る一価抗体はｈＶＥＧＦのアンタゴニストとして特に有用である。本発明を如何なる特定の生物学的活性のメカニズムにも限定するものではないが、細胞ｈＶＥＧＦレセプターの活性化は、ｈＶＥＧＦと細胞ｈＶＥＧＦレセプターとの結合がレセプターの凝固を誘発し、ついで細胞内レセプターキナーゼ活性を活性化するというメカニズムで進行すると考えられる。一価の抗ｈＶＥＧＦレセプター抗体はこのような凝固を誘発できず、それ故上記メカニズムによってｈＶＥＧＦレセプターを活性化できないので、上記抗体はｈＶＥＧＦの理想的なアンタゴニストである。
しかしながら、これらの抗体はレセプターのｈＶＥＧＦ結合部位を指向するかまたはそうでない場合、ｈＶＥＧＦレセプターと結合するｈＶＥＧＦを、例えばレセプターに対するｈＶＥＧＦの接近を立体的に障害することによって、妨げることが可能でなければならないことに注意すべきである。しかしながら、本願明細書の他の場所で記載したように、ｈＶＥＧＦの結合を妨げることができない抗ｈＶＥＧＦr抗体は、非免疫グロブリン部分、例えば細胞毒素と抱合したとき有用である。
一価抗体の調製方法は当該分野で良く知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖および修飾した重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般に重鎖架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、関連システイン残基は、架橋を防止するようにもう一つのアミノ酸残基で置換されるかまたは欠失される。インビトロ方法もまた一価抗体の調製に適している。例えば、Ｆａｂフラグメントは無傷の抗体の酵素開裂によって調製される。
【００１７】
（診断用途）
診断適用では、本発明の抗体またはｈＶＥＧＦrは典型的には検出可能部分で標識される。検出可能部分は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に作りだすことができる任意のものでありうる。例えば、検出可能部分は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓもしくは¹²⁵Ｉのような放射性同位元素、蛍光イソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンのような蛍光または化学ルミネセンス化合物、例えば¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃもしくは³Ｈのような放射性同位元素標識、またはアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼもしくは西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素でありうる。
抗体またはｈＶＥＧＦrを検出可能部分と別個に抱合させる当該分野で既知の任意の方法を使用することができ、これらの方法にはハンター（Hunter）等、Nature 144:945（1962年）；デービッド（David）等、Biochemistry 13:1014（1974年）；ペイン（Pain）等、J．Immunol．Meth．40:219（1981年）；およびニグレン（Nygren）、J．Histochem．and Cytochem．30:407（1982年）に記載されている方法が含まれる。本発明の抗体およびレセプターは既知の任意のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイを使用することができる。ゾラ（Zola）、モノクローナル抗体：技術マニュアル、147〜158頁（CRC Press，Inc.、1987年）。
【００１８】
競合結合アッセイは標識された標準（これはｈＶＥＧＦまたはその免疫学的反応性部分でありえる）の一定量の抗体と結合する試験試料分析物（ｈＶＥＧＦ）との競合能力に依拠している。試験試料中のｈＶＥＧＦ量は、抗体またはレセプターと結合されることになる標準品の量に逆比例する。結合されることになる標準品の量の測定を促進するために、抗体またはレセプターは一般に競合前後に不溶化されるので、抗体またはレセプターと結合する標準品およびアナライトは結合していない標準品およびアナライトから便宜的に分離することができる。
サンドイッチアッセイは、検出すべきタンパク質の異なった免疫原性部分またはエピトープとそれぞれ結合し得る２つの抗体またはレセプターを使用することを含む。サンドイッチアッセイでは、試験試料分析物は固形支持体上に固定されている第１の抗体またはレセプターによって結合され、その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３つの部分からなる複合体を形成する。デービッドおよびグリーン（Greene）、米国特許第4,376,110号。第２の抗体またはレセプターはそれ自体検出可能部分で標識されうるか（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能部分で標識されている抗免疫グロブリン抗体を使用して測定することができる（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合は、検出可能部分は酵素である。
ここでの抗体またはレセプターはインビボ画像診断にも有用であり、検出可能部分で標識された抗体またはｈＶＥＧＦrが患者の好ましくは血流に直接投与され、患者内の標識抗体またはレセプターの存在と位置がアッセイされる。この画像診断技術は、例えば、新生物の段階付けおよび治療に有用である。抗体またはｈＶＥＧＦrは、核磁気共鳴であろうと、放射学であろうと、それとも当該分野で知られている他の検出手段であろうと、哺乳動物において検出可能である任意の部分で標識される。
【００１９】
（ｈＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体）
ここに記載した抗体に加えて、ｈＶＥＧＦの他の有用なアンタゴニストには、ｈＶＥＧＦレセプターと結合するが天然ｈＶＥＧＦの生物学的活性を示さない天然ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体が含まれる。例えば、このようなアンタゴニストには、ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインを含むが生物学的活性を与えるドメインを欠いているかまたはそうでない場合、細胞ｈＶＥＧＦレセプターの活性化が不完全なフラグメントおよびアミノ酸配列変異体、例えば、細胞ｈＶＥＧＦ−レセプターの凝集または活性化誘発能力を欠いているフラグメントまたはアミノ酸配列変異体の場合が含まれる。「レセプター結合ドメイン」という用語は、ｈＶＥＧＦレセプター結合に関与するｈＶＥＧＦ中のアミノ酸配列を意味する。「生物学的活性ドメイン」または「生物学的活性付与ドメイン」という用語は、細胞分裂促進活性、脈管形成活性、又は血管透過活性のような、因子の特定の生物学的活性をもたらすｈＶＥＧＦ中のアミノ酸配列を意味する。
ｈＶＥＧＦが細胞表面上の２つまたはそれ以上のｈＶＥＧＦr分子と複合体を形成できるように思われるという知見は、ｈＶＥＧＦがｈＶＥＧＦrへの少なくとも２つの別個の結合部位を有しており、成長ホルモン、プロラクチン等の態様で活性化が生じる前に、ｈＶＥＧＦが連続的な態様で、最初に１つの部位で、その後他の部位で上記細胞レセプターと結合することを示唆している（例えば、カニングハム（Cunningham）等、Science 264:821（1991年）；ディブオス（deVos）等、Science 255:306（1992年）；フー（Fuh）等、Science 256:1677（1992年）を参照されたい）。従って、ｈＶＥＧＦの１つのレセプター結合部位（典型的にはｈＶＥＧＦとｈＶＥＧＦrの初期結合に関与している部位）が修飾されないまま残っている（または修飾されている場合、結合を高めるように変えられている）一方、ｈＶＥＧＦの第２のレセプター結合部位が典型的には、該結合部位を無効にするために、非保存的アミノ酸残基置換または欠失で修飾されているｈＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体が選択される。
ｈＶＥＧＦ中のレセプター結合ドメインおよびｈＶＥＧＦr中のｈＶＥＧＦ結合ドメインはＸ線試験、突然変異分析および抗体結合実験を含む当該分野で既知の方法によって測定される。突然変異方法には、逸脱突然変異体の選択と組み合わせた無作為飽和突然変異誘発および挿入突然変異誘発の技術が含まれる。リガンド内のレセプター結合ドメインの同定に適する他の方策はアラニン（Ａla）スキャンニング突然変異誘発として知られている。カニングハム等、Science 244、1081〜1985（1985年）。この方法は、荷電アミノ酸側鎖を含む領域の同定を含んでいる。同定された各領域中の荷電残基（即ち、Ａrg、Ａsp、Ｈis、ＬysおよびＧlu）はＡlaで置換され（突然変異体１分子当たり１つの領域）、得られたリガンドのレセプター結合が試験されて、レセプター結合における特定の領域の重要性を評価する。レセプター結合ドメインを局在化させるさらに強力な方法は抗ｈＶＥＧＦ抗体の中和の使用によるものである。キム（Ｋim）等、Growth Factors 7:53（1992年）。通常、これら方法と類似方法を組み合せて、レセプター結合に関与するドメインの局在化に使用する。
【００２０】
ｈＶＥＧＦに関して使用される「アミノ酸配列変異体」という用語は、ｈＶＥＧＦの天然形態のアミノ酸配列と或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、アンタゴニストアミノ酸配列変異体は天然のｈＶＥＧＦの少なくとも１つのレセプター結合ドメインと少なくとも約70％の相同性を有しており、好ましくは天然ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインと少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％の相同性を有している。アミノ酸配列変異体は、ｈＶＥＧＦレセプターと結合する能力を保持する（その結果、ｈＶＥＧＦレセプターとの結合に関して天然ｈＶＥＧＦと競合する）が、内皮細胞増殖、脈管形成または血管透過性のようなｈＶＥＧＦの１つまたは複数の生物学的効果を誘発できないように、天然ｈＶＥＧＦのアミノ酸配列内の或る位置での置換、欠失および／または挿入を有している。
「相同性」は、いかなる保存的置換も配列相同性パーセントの一部とはみなさずに、配列を整列させ、必要な場合には最大パーセントの相同性を達成するために間隙を導入した後に、天然ｈＶＥＧＦのレセプター結合ドメインのアミノ酸配列中の残基と同一であるアミノ酸配列変異体中の残基のパーセントとして定義される。整列の方法およびコンピュータープログラムは当該分野で良く知られている。一つのこのようなコンピュータープログラムはジェネンテック（Genentech）Inc．の著作の「Align ２」であり、これは1991年12月10日に20559ワシントンＤＣの米国著作権庁に使用者用説明書と共に提出された。当業者であれば、日常的な技量を使用して、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００２１】
置換変異体は、天然配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を除去し、同じ位置の場所に別のアミノ酸が挿入されているものである。置換は単一で、分子中の一つのアミノ酸だけが置換されているか、多重で、２つもしくはそれより多いアミノ酸が同じ分子内で置換されている。
挿入変異体は天然配列の特定の位置のアミノ酸に直ぐに隣接して挿入された一又は複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に直ぐに隣接するとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかと結合することを意味する。
欠失変異体は、天然配列の一又は複数のアミノ酸残基が除去されているものである。通常、欠失変異体は分子の特定の領域で１つまたは２つのアミノ酸残基が欠失している。
ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸配列変異体は当該分野の既知の方法、例えば天然因子をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって容易に製造される。突然変異ＤＮＡを適当な発現ベクター中に挿入し、ついで宿主細胞を組換えベクターでトランスフエクションする。組換え宿主細胞と適当な培地で増殖させ、その後宿主細胞で発現された所望のフラグメントまたはアミノ酸配列変異体をクロマトグラフィーまたは他の精製方法で組換え細胞培養物から回収する。
或いは、当該分野で既知の他の等価な化学合成法を使用することができるが、ｈＶＥＧＦのフラグメントおよびアミノ酸変異体を、例えば、天然ｈＶＥＧＦのタンパク質分解によって、またはメリーフィールド（Merrifield）（J．Am．Chem．Soc．85:2149（1963年））が記載した標準的な固相ペプチド合成方法を使用する合成によってインビトロで製造される。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適当な樹脂に結合させてペプチドのＣ末端から開始される。アミノ酸は、ペプチド結合の形成に対して当該分野で周知の技術を使用してペプチド鎖と結合される。
【００２２】
（治療用途）
ここで使用される「治療する」、「治療」、「療法」及び「治療的」という用語は、治癒治療、予防（prophylactic）治療及び防止（preventative）治療を意味する。
治療用途では、本発明のアンタゴニストは哺乳動物、好ましくはヒトに、大量瞬時投与（ボーラス）として静脈内にまたは一定期間の連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、硬膜内、くも膜下内、経口、局所もしくは吸入経路でヒトに投与されるようなものを含む、許容できる投与形態で投与される。アンタゴニストはまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲経路で適切に投与されて局所的並びに全身的治療効果を発揮する。腹膜内経路は、例えば、卵巣腫瘍の治療に特に有用である。静脈注入は、例えば脳浮腫の治療に、特に有用であると予想される。
このような投与形態は、本来的に非毒性で非治療的な担体を含む。このような担体の例には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質およびポリエチレングリコールが含まれる。アンタゴニストの局所用またはゲル系形態用の担体には多糖類、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびモクロウアルコールが含まれる。慣用的なデポー形態を適切に使用することができる。このような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻用スプレー、舌下錠および徐放製剤が含まれる。アンタゴニストは典型的には、約0.1mg／mlから100mg／mlの濃度でこのようなビヒクル中に処方される。
徐放製剤の適当な例には、アンタゴニストを含有する固形の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、これらマトリックスは成形物、例えば膜またはマイクロカプセルの形態である。徐放製剤マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ランガー（Langer）等、J．Biomed．Mater．Res．15:167（1981年）およびランガー、Chem．Tech.、12:98〜105（1982年）に記載されているポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号））、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（シドマン（Sidman）等、Biopolymers、22:547（1983年））、非分解性エチレン−ビニルアセテート（ランガー等、上掲）、ルプロンデポー（Lupron Depot）（登録商標）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注入可能な微小球体）並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは100日間以上にわたって分子を放出させることができるが、或るヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセルに入れたポリペプチドアンタゴニストが体内に長時間留まると、37℃で水分に暴露された結果として変性または凝集し、その結果、生物学的活性の消失が生じ、おそらく免疫原性の変化が生じることがある。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な方策を工夫することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合は、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を制御し、適当な添加剤を使用し、特定なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成することができる。
【００２３】
徐放ｈＶＥＧＦアンタゴニスト組成物にはリポソームとして取り込まれたアンタゴニスト抗体又はｈＶＥＧＦrも含まれる。アンタゴニストを含有するリポソームは、エプスタイン（Epstein）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、82:3688（1985年）；フワング（Hwang）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、77:4030（1980年）；米国特許第4,485,045号；米国特許第4,544,545号に記載されたような当該分野で既知の方法で製造される。通常、リポソームは小さい（約200〜800オングストローム）単層タイプであり、脂質含量は約30モル％のコレステロールより多く、選択された割合は最適のＨＲＧ療法のために調節される。循環時間が長くなったリポソームが米国特許第5,013,556号に開示されている。
本発明のもう一つの用途は成形物中にｈＶＥＧＦアンタゴニストを導入することを含む。このような物品は、例えば内皮細胞増殖および脈管形成の調節に使用することができる。加えて、腫瘍浸潤および転移をこれら物品で調節することができる。
アンタゴニストの適切で有効な投与量は、ここで特定した治療される疾病又は病状のタイプ、疾病又は病状の重症度および経過、アンタゴニストが予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の臨床的履歴およびアンタゴニストに対する応答、並びに担当医の自由裁量に依存する。アンタゴニストの有効な投与量は、典型的には、投与されるアンタゴニストにより、最も効果的な所望量のＶＥＧＦ生物学的活性の阻害が達成される量である。アンタゴニストは適切には、１回でまたは一連の治療にわたって患者に投与される。
【００２４】
ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、種々の新生物および非新生物疾病および病状の治療に有用である。治療を受けられる新生物および関連状態には乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、莢膜細胞種、男性胚腫、頚部癌、子宮内膜癌、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部および頚部癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞、シュワン鞘腫、寡突起膠腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウイルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に関連した異常な血管増殖、並びにメーグス症候群が含まれる。
一実施態様では、腫瘍の血管形成を併用療法で攻撃する。一又は複数のｈＶＥＧＦアンタゴニストを腫瘍を持つ患者に、例えば腫瘍または存在するならば、その転移病巣の壊死を観察して決定される治療的に有効な投与量で投与する。この治療は、もはや更なる有益な効果が観察されないかまたは臨床検査で痕跡量の腫瘍も示されないかもしくはどんな転移病巣も示されないようなときまで継続される。他の補助的薬剤は、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、α−、β−もしくはγ−インターフェロン、抗ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン、抗ヘレグリン抗体、Ｄ因子、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または、抗プロテインＣ抗体、抗プロテインＳ抗体もしくはＣ４ｂ結合タンパク質（1991年2月21日に公開されたエスモン等のＰＣＴ公開特許第ＷＯ91／01753号参照）のような腫瘍の微小血管凝固を促進する薬剤、または加熱もしくは照射である。
補助的薬剤は有効性が変わるので、常套的な形でマトリックススクリーニングによってそれらが腫瘍に与える影響を比較することが望ましい。ｈＶＥＧＦアンタゴニストおよび例えばＴＮＦの投与は、所望の臨床効果が達成されるまで繰り返すことができる。或いは、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、ＴＮＦと場合によっては補助的薬剤と一緒に投与される。固形腫瘍が四肢または全身循環から隔離し易い他の場所に見られる場合、ここに記載した治療薬剤は隔離された腫瘍または器官に投与する。他の実施態様では、ＦＧＦまたは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト、例えば抗ＦＧＦまたは抗ＰＤＧＦ中和抗体がｈＶＥＧＦアンタゴニストと一緒に患者に投与される。ｈＶＥＧＦアンタゴニストによる治療は、最適には外傷治癒または所望の血管新形成の期間中中止することができる。
【００２５】
治療を受けられる非新生物状態には関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生性緑内障、加齢性黄斑変性、甲状腺過形成（バセドウ病を含む）、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜滲出液（例えば、心膜炎に関連したもの）、および胸膜滲出液が含まれる。
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、年輩者において程度の酷い視覚喪失に至る第１の原因である。ＡＭＤの滲出形態は脈絡膜新血管形成及び網膜色素内皮細胞剥離により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の劇的悪化に関連しているため、本発明のＶＥＧＦアンタゴニストは、ＡＭＤの重症度を低減させるのに特に有用であると予想される。
治療可能な他の病状には浮腫が含まれる。ここで、「浮腫」という用語は一般的な意味で使用され、遊離の細胞外水単独のため、もしくは増加した細胞内水と組み合わされるために生じる血管外組織水含量の増加により特徴付けられる体の症状または付随する脳卒中又は頭部損傷を含む。浮腫は体内の種々の組織中に存在し得る。特に、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、典型的には脳容積の増加により特徴付けられる脳浮腫、並びに脊髄又は脊髄管浮腫又は頭蓋内圧の増加に至る他の病状（例えば、局所的脊髄損傷）を含む中枢神経系（ＣＮＳ）浮腫の治療に使用することができると考えられる。例えば、脳容積の増加は、脳血液量の増加及び／又は組織水分量の増加の結果でありうる。ここで使用する「浮腫」という用語は、当該技術において、血管原性浮腫及び細胞毒性浮腫と称される病状を含む。典型的には、血管原性浮腫と称される病状は血液脳関門（ＢＢＢ）の崩壊を伴うものとして特徴付けられており、細胞毒性浮腫は無傷のＢＢＢを伴うものとして特徴付けられている。脳浮腫は、一般的に概説文献であるハリリ（Hariri）、Neurosurgical Intensive Care 5:687（1994年）に記載されている。
【００２６】
哺乳動物における浮腫は、限定されるものではないが、急性高血圧、髄膜炎、脳炎、膿瘍、新生物疾患（例えば上述したもの）（特に固形腫瘍）、外傷（例えば頭部損傷）、出血、ウイルス感染、脳マラリア症、脳卒中、放射、多発性硬化症、後心停止、出生時仮死、グルタミン酸毒性、脳症、低酸素症、虚血及び腎臓透析を含む種々の病状または刺激を伴うか又はこれらから生じるものである。
特に、本発明は、脳内における新生物に付随する脳浮腫、及び脳卒中に付随する脳浮腫を含む浮腫を治療するために、ｈＶＥＧＦアンタゴニストを用いて療法を意図している。脳組織内に新生物を有する哺乳動物において、哺乳動物に脳浮腫が発症し又はこれを被ることはよくあることである。本発明のｈＶＥＧＦアンタゴニストは、単独で又は脳新生物を治療するために施される化学療法又は放射線療法等の他の療法と組み合わせて投与され、脳内におけるこのような浮腫を低減し又は阻害することを意図している。
また、脳卒中を発症しているか、これを発症したことがある哺乳動物においても、脳浮腫が発症しているか、またはこれを被っていることがよくある。本出願における脳卒中という用語は一般的な意味に使用され、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中として当業者に周知の臨床状態を含む。患者の脳卒中は、例えば血流妨害の原因又は病原、病気に襲われている細胞又は組織の種類、及び組織（例えば脳組織）への管外滲出の存在性に依存して、様々な特定の種類の脳卒中に特徴付けされ又は分類されることが当該分野において認められる。臨床的に特徴付けられている種々の種類の脳卒中には、限定するものではないが、血栓性脳卒中、塞栓性脳卒中、血行力学的脳卒中、陰窩性脳卒中、及び脳内、くも膜下、脳室内、又は硬膜下出血に誘導されるか、又はこれらの結果生じる出血性脳卒中が含まれる。医療従事者であれば、このような脳卒中状態の種類を素早く認識して理解し、患者にこのような病状が存在するのか、又はその徴候があるのか検出し診断できるであろう。本発明の方法は、ｈＶＥＧＦアンタゴニスト分子が、全てのこのような脳卒中症状の治療において、特に浮腫を低減又は阻害し、細胞及び組織ダメージを保護するために使用できることを意図している。ｈＶＥＧＦアンタゴニストは脳卒中の開始に続く急性治療として投与され、例えば脳浮腫を低減又は阻害し、よって哺乳動物の脳卒中からの回復性を高める。ｈＶＥＧＦアンタゴニストを使用することにより、この治療で哺乳動物における手術（開頭術）の実施を防止又は回避し、脳組織内の過度の水分蓄積による頭蓋内圧を低減又は緩和するといった恩恵がある。また、ｈＶＥＧＦアンタゴニストによりこのような浮腫が低減又は防止されて、典型的に頭蓋内圧及び浮腫によりダメージを受けるおそれのある脳及びニューロン組織の量が低減するであろう（すなわち保護効果）。
【００２７】
治療される疾病又は病状のタイプおよび重症度に応じて、例えば、１回または複数回の分割投与によるかそれとも連続注入によろうとも、約１μg／kgから15mg／kgのアンタゴニストが患者に投与する初期候補投与量である。典型的な１日投与量は、上述の要因に依存して約１μg／kgから100mg／kgまたはそれ以上までの範囲であろう。数日間またはそれより長い反復投与では、病状に依存して、治療は疾病徴候の所望の抑制が生じるまで繰り返される。しかしながら、他の投与計画が有用であることがある。例えば、脳浮腫又は脳卒中の治療方法においては、損傷又は脳卒中の始まりから数時間内、もしくは１〜４日以内に、検出又は診断の際に直ぐにｈＶＥＧＦアンタゴニストを患者に投与することが望ましい。望ましい投与プロトコールは、典型的には医療従事者の裁量の範囲内である。ｈＶＥＧＦアンタゴニスト療法の進捗状況は、損傷又は脳卒中に関連した新生物病状及び浮腫形成については、例えば放射線写真技術（特に、磁気共鳴映像法、ＭＲＩ）含む慣用的の技術および検査法によって容易に監視され、また脳浮腫については頭蓋内圧が監視される。
本発明の他の実施態様では、疾病又は病状の予防または治療におけるアンタゴニストの効能は、これらの目的に効果的である別の薬剤、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性もしくは塩基性の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）もしくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の脈管形成活性を阻止もしくは中和し得る抗体、組織因子、プロテインＣもしくはプロテインＳの凝固活性を阻止もしくは中和し得る抗体（1991年2月21日に公開されたエスモン（Esmon）等のＰＣＴ公開特許第ＷＯ91／01753号参照）、ＨＥＲ２レセプターに結合可能な抗体（1989年7月27日に公開されたハドジアック（Hudziak）等のＰＣＴ公開特許第WO89/06692）、または例えば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の抗代謝物、抗生物質、ピリミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシドもしくはコルチコステロイドのような一または複数の慣用的な治療剤と組み合わせてまたは連続的にアンタゴニストを投与することによって改善することができる。このような他の薬剤は投与される組成物中に存在するかまたは別々に投与することができる。特に、浮腫又は脳卒中の治療では、アンタゴニストは、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は駆虫剤、抗生物質、血栓溶解剤（例えばｔ−ＰＡ）、浸透圧治療剤（例えばマンニトール）、又はステロイド類（デカドロン又はプレドニゾン）と組み合わせてまたは連続して投与されうる。アンタゴニストと組み合わせられるこのような薬剤の使用は、医療従事者の通常の技量の範囲内で行われ、このような薬剤の選択は、例えば治療される疾患又は病状に依存する。
本願で提供されるさらなる治療方法では、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは、特に脳卒中の治療において、ｈＶＥＧＦと連続して投与されることが考えられる。脳卒中の診断と検出の際には、ｈＶＥＧＦアンタゴニストは脳卒中の開始後直ちに又は約１〜４日内に投与され得る。浮腫形成を低減又は阻害するアンタゴニストの投与の完了に続いて、再血管形成を刺激又は促進させるのに十分な量のｈＶＥＧＦを患者に投与することが有益であると考えられる。好ましくは、ｈＶＥＧＦはｈＶＥＧＦの組換え形態であり、製薬的に許容可能な担体に投与される。
【００２８】
（他の用途）
本発明の抗ｈＶＥＧＦ抗体はまたアフィニティー精製剤としても有用である。この方法では、ｈＶＥＧＦに対する抗体を当該分野で周知の方法を使用して、セファデックス樹脂または濾紙のような適切な支持体上に固定する。次に、固定した抗体を精製すべきｈＶＥＧＦを含有する試料と接触させ、その後、固定された抗体と結合しているｈＶＥＧＦ以外の試料中の物質を全て実質的に除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、抗体からｈＶＥＧＦを放出させるグリシン緩衝液、ｐＨ 5.0のような別の適当な溶媒を用いて支持体を洗浄する。
以下の実施例は説明のためだけに提供するものであって、決して本発明を限定することを意図するものではない。本明細書における全ての特許と引用文献はその全体が出典明示によってここに取り込まれる。
【００２９】
【実施例】
実施例に引用されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明書に従い使用した。次の実施例と本明細書を通してＡＴＣＣ受託番号により特定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。
実施例１
抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の調製
免疫化用のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合したｈＶＥＧＦを得るために、組換え体ｈＶＥＧＦ（165アミノ酸）、リュング等、Science 246:1306（1989年）を0.05％グルタルアルデヒドの存在下４：１の比率でＫＬＨと混合し、その混合物を穏やかに撹拌しながら室温で３時間インキュベートした。次に、この混合物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に対して４℃で一夜透析した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、腹腔内注射によって20μｇのＫＬＨと抱合した５μｇのｈＶＥＧＦで２週間毎に４回免疫化し、細胞融合前に４日間ＫＬＨと抱合した同一投与量のｈＶＥＧＦで追加免疫した。
免疫したマウスから得た脾細胞を、Ｐ3Ｘ63Ａｇ8Ｕ．１ミエローマ細胞、エルトン等、Curr．Top．Microbiol．Immunol．81:1（1978年）と、記載されたようにして35％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合させた。ヤーマッシュ（Yarmush）等、Proc．Nat．Acad．Sci．77:2899（1980年）。ハイブリドーマをＨＡＴ培地中で選択した。
ハイブリドーマ細胞培養物から得た上清を、ｈＶＥＧＦ被覆マイクロタイタープレートを使用するＥＬＩＳＡアッセイによって抗ｈＶＥＧＦ抗体産生のためにスクリーニングした。各ウエル中のｈＶＥＧＦと結合した抗体を、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウスＩgＧ免疫グロブリンおよび色素産生基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを使用して判定した。ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）、抗体：実験室マニュアル、597頁（Cold Spring Harbor Laboratory、1988年）。このようにして抗ｈＶＥＧＦ抗体を産生すると判定されたハイブリドーマ細胞を限界希釈によってサブクローン化し、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２と命名した二種のクローンをさらなる実験のために選択した。
【００３０】
実施例２
抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の特徴づけ
Ａ．抗原特異性
Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマによって産生された抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡで測定した。モノクローナル抗体は、ｈＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦまたは表皮増殖因子（ＥＧＦ）で前もって被覆されたマイクロタイタープレートのウエルに加えた。ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩgＧ免疫グロブリンを用いて結合抗体を検出した。これらアッセイの結果、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦとは結合するが他のタンパク質増殖因子とは検出できるほどには結合しないことが確認された。
Ｂ．エピトープマッピング
競合結合ＥＬＩＳＡを使用して、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ内の同一のエピトープ（部位）に結合するのかそれとも異なるエピトープ（部位）に結合するのかを決定した。キム等、Infect．Immun．57:944（1989年）。個々の非標識抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１またはＢ２.６.２）または無関係の抗ＨＧＦ抗体（ＩgＧ１イソタイプ）を、ｈＶＥＧＦで前もって被覆されたマイクロタイタープレートのウエルに加えた。次に、ビオチン化抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（BIO−Ａ４.６.１またはBIO−Ｂ２.６.２）を加えた。ビオチチニル化抗体対非標識抗体の比率は１：1000であった。ビオチン化抗体の結合は、アビジン抱合ペルオキシダーゼ、続いてｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび過酸化水素を添加して視覚化した。結合したビオチン化抗体の量を示す着色反応は、495nmの波長で光学密度（Ｏ.Ｄ.）を測定することにより決定した。
Ｆｉｇ１に示されるように、各々の場合に、ビオチン化抗ｈＶＥＧＦ抗体の結合は対応する非標識抗体で阻止されたが、他の非標識抗ｈＶＥＧＦ抗体または抗ＨＧＦ抗体では阻止されなかった。これらの結果は、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦ内の異なったエピトープと結合することを示している。
【００３１】
Ｃ．イソタイプ決定
Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体のイソタイプをＥＬＩＳＡで決定した。各ハイブリドーマが増殖している培地の試料（上清）をｈＶＥＧＦで前もって被覆されたマイクロタイタープレートに加えた。捕捉された抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体を、異なったイソタイプ特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンと共にインキュベートし、抱合抗体と抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体との結合をｐ−ニトロフェニルホスフェートを添加して測定した。着色反応をＥＬＩＳＡプレート読取り器を用いて405nmで測定した。
上記方法によって、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマの両方で産生したモノクローナル抗体のイソタイプはＩgＧ１であると決定された。
【００３２】
Ｄ．結合親和性
Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体のｈＶＥＧＦに対する親和性を競合結合アッセイで測定した。予め定めた最適以下の濃度のモノクローナル抗体を、20,000〜40,000cpmの¹²⁵Ｉ−ｈＶＥＧＦ（１〜２ng）および種々の既知量の非標識ｈＶＥＧＦ（１〜1000ng）を含有する試料に加えた。室温で１時間後、100μlのヤギ抗マウスＩg抗血清（米国アーカンソー州ロジャーズのPel−Freez）を加え、この混合物を室温でさらに１時間インキュベートした。抗体と結合タンパク質の複合体（免疫複合体）を、４℃で６％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、モル分子量8000）を500μｌ添加し、続いて2000×Ｇ、４℃で20分間遠心分離して沈殿させた。各試料中の抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体と結合した¹²⁵Ｉ−ｈＶＥＧＦの量を、ペレット化した材料をガンマ計数器で計数することにより測定した。
親和性定数はスカッチャード分析によってデータから計算した。Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の親和性は1.2×10⁹リットル／モルであると計算された。Ｂ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の親和性は2.5×10⁹リットル／モルであると計算された。
【００３３】
Ｅ．ｈＶＥＧＦの細胞分裂促進活性の阻止
ウシ副腎皮質毛細血管内皮（ＡＣＥ）細胞、フェララ等、Proc，Nat．Acad．Sci．84:5773（1987年）を12個のマルチウエルプレート中に10⁴細胞／mlの密度で接種し、2.5ng／mlのｈＶＥＧＦを、Ａ４.６.１もしくはＢ２.６.２ハイブリドーマが産生した種々の濃度の抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体または無関係の抗ＨＧＦモノクローナル抗体の存在下または不存在下で各ウエルに加えた。５日間の培養後、各ウエルの細胞数をコールター（Coulter）計数器で計測した。対照として、ｈＶＥＧＦを添加しないでＡＣＥ細胞を培養した。
Ｆｉｇ２に示されるように、抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体は両方とも、添加したｈＶＥＧＦがウシＡＣＥ細胞の増殖または生存を支持する能力を阻害した。Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦの細胞分裂促進活性を完全に阻止する一方（約90％以上の阻止）、Ｂ２.６.２が産生したモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦの細胞分裂促進活性を部分的にしか阻止しなかった。
【００３４】
Ｆ．ｈＶＥＧＦ結合の阻止
ウシＡＣＥ細胞を、10％の仔ウシ血清、２mＭのグルタミンおよび１ng／mlの塩基性線維芽細胞増殖因子を含有するダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中24のウエルのマイクロタイタープレートに2.5×10⁴細胞／0.5ml／ウエルの密度で蒔いた。一夜培養した後、細胞を４℃で結合緩衝液（等量のＤＭＥＭおよびＦ12培地プラス25mＭのＨＥＰＥＳおよび１％のウシ血清アルブミン）を用いて１回洗浄した。
12,000cpmの¹²⁵Ｉ−ｈＶＥＧＦ（約５×10⁴cpm／ng／ml）を、Ａ４.６.１、Ｂ２.６.２またはＡ２.６.１ハイブリドーマ（250μｌの総容量）が産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体５μgと共に30分間予めインキュベートし、その後この混合物をマイクロタイタープレート中のウシＡＣＥ細胞に加えた。細胞を４℃で３時間インキュベートした後、細胞を４℃で結合緩衝液を用いて３回洗浄し、0.5mlの0.2Ｎ、ＮaＯＨを添加して溶解させ、ガンマ計数器で計数した。
Ｆｉｇ３（上）に示されるように、Ａ４.６.１およびＢ２.６.２ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦとウシＡＣＥ細胞の結合を阻止した。対照的に、Ａ２.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体はｈＶＥＧＦとウシＡＣＥ細胞の結合に与える明白な影響はなかった。上記した細胞増殖アッセイで得た結果と一致して、Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体はＢ２.６.２が産生したモノクローナル抗体よりさらに強くｈＶＥＧＦの結合を阻止した。
Ｆｉｇ３（下）に示されるように、Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体は、１：250のｈＶＥＧＦ対抗体のモル比でｈＶＥＧＦとウシＡＣＥ細胞の結合を完全に阻止した。
【００３５】
Ｇ．他のＶＥＧＦイソ型との交差反応性
Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦの121−および189−アミノ酸形態と反応性であるかどうかを決定するために、これらのポリペプチドを免疫沈降させる能力について抗体をアッセイした。
ヒト293細胞を、上記したようにして、121−および189−アミノ酸ｈＶＥＧＦポリペプチドの配列をコードするヌクレオチドを有するベクターでトランスフェクションした。リュング等、Science 246:1306（1988年）。トランスフェクションして２日後、システインおよびメチオニンを欠く培地に細胞を移した。細胞を上記培地中で30分問インキュベートし、その後100μＣi／mlの各³⁵Ｓ−メチオニンおよび³⁵Ｓ−システインを培地に加え、細胞をさらに２時間インキュベートした。細胞を無血清培地に移し、３時間インキュベートすることによって標識を追跡した。細胞培養培地を集め、溶解緩衝液（150mＭ ＮaＣｌ、１％ ＮＰ40、0.5％デオキシコレート、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、50mＭ トリス、ｐＨ 8.0）中で30分間インキュベートして細胞を溶解させた。細胞屑は、200×Ｇで30分間遠心分離して溶解物から除去した。
細胞培養培地および細胞溶解物の500μl試料を、２μlのＡ４.６.１ハイブリドーマ抗体（2.4mg／ml）と共に４℃で１時間インキュベートし、その後５μlのウサギ抗マウスＩgＧ免疫グロブリンと共に４℃で１時間インキュベートした。³⁵Ｓ−標識ｈＶＥＧＦと抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の免疫複合体をプロテインＡセファロース（Pharmacia）で沈殿させ、その後還元条件下でＳＤＳ−12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を施した。免疫沈降させ、放射標識したタンパク質をオートラジオグラフィーで分析するため、ゲルをＸ線フィルムに露出させた。
上記分析の結果、Ａ４.６.１ハイブリドーマが産生した抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体がｈＶＥＧＦの121−および189−アミノ酸形態の両方と交差反応性であることが示された。
【００３６】
実施例３
ＶＥＧＦレセプター−ＩgＧ融合タンパク質の調製
Ａ．
ｆｌｔ ｈＶＥＧＦレセプターのヌクレオチドおよびアミノ酸コード化配列はシブヤ等、Oncogene 5:519〜524（1990年）に開示されている。ｆｌｔ ｈＶＥＧＦレセプターの全細胞外ドメインのコード化配列を２段階方法でヒトＩgＧ１重鎖のコード化配列に融合させた。
部位特異的突然変異誘発を使用して、ｆｌｔのアミノ酸759のコドンに対して５’部位にｆｌｔをコードするＤＮＡ中にＢｓｔＢ１制限を導入し、プラスミドｐＢＳＳＫ’ＦＣ、ベネット等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067（1991年）の独特のＢｓｔＥＩＩ制限部位をＢｓｔＢＩ部位に変換した。改変したプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、得られたプラスミドＤＮＡの大きいフラグメントを、ｆｌｔ ｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜758）をコードするｆｌｔ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＢＩフラグメントと一緒にライゲートさせた。
得られた作成物を、ＣlａＩおよびＮｏｔＩで消化して約3.3kbのフラグメントを生成させ、次にこれをライゲーションによって哺乳動物発現ベクターｐＨＥＢＯ２（リュング等、Neuron 8:1045（1992年））の複数のクローニング部位に挿入する。3.3kbのフラグメントの末端を、例えばリンカーを加えて修飾して、正しい発現方向でのベクターへのフラグメント挿入がなされる。
哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＥＮ4細胞（リュング等、上掲））をエレクトロポーレーションによってｆｌｔ挿入物を含有するｐＨＥＢＯ２プラスミドでトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞を約10％のウシ胎児血清、２mＭのグルタミンおよび抗生物質を含有する培地中で培養し、約75％の集密性で血清不含培地に移した。培地を収集前の３〜４日間馴化し、ｆｌｔ−ＩgＧ融合タンパク質を、本質的にベネット等、J．Biol．Chem．266:23060〜23067（1991年）に記載されたようにして、プロテインＡアフィニティーマトリックスでのクロマトグラフィーにかけて条件培地から精製する。
【００３７】
Ｂ．
ヒトｆｌｔ−ＩｇＧ（ｈｆｌｔ(１−３)−ＩｇＧと称する）ｃＤＮＡを、デービス−スミス等、EMBO J. 15:4919-4927（1996年）に記載されているようにして作成した。この切断レセプター型には、Ｆｃ−ＩｇＧに融合したヒトｆｌｔの最初の３つの免疫グロブリン様ドメインのみが含まれていた。フェララ等、Nature Medicine 4:336（1998年）を参照。
ネズミｆｌｔ−ＩｇＧ（ｍｆｌｔ(１−３)−ＩｇＧと称する）を、上掲のフェララ等に記載されているプライマーを使用し、マウスの１７日齢の胚ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させることにより作成した(Clontech, Palo Alto, CA)。３’ＰＣＲプライマーの設計により、mｆｌｔ−１（１−３）の発現がネズミＩｇＧ２ｂ Ｆｃクローンと同じフレーム内であることが確実になった。得られた１−ｋｂフラグメントを、Ｃ１ａＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントとしてＴＡクローニングベクター（インビトロゲン、サンティエゴ、ＣＡ）中に最初にクローニングした。このフラグメントをｐＲＫベクター中でネズミＩｇＧ２ｂ Ｆｃの５'末端にライゲートさせた。哺乳動物細胞中にトランスフェクションしたとき、このプラスミドによりｍｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合タンパク質の発現が可能になった。
ＣＨＯ細胞中での発現のために、ｃＤＮＡをdicistronicなベクター中でサブクローン化し、ｆｌｔ誘導融合タンパク質の発現に、マーカーであるジヒドロホラートレダクターゼの発現を関連させる。ルカス（Lucas）等、Nucleic Acid れＳ。24:1774-1779（1996年）を参照。プラスミドをリポフェクションを介して、ＤＰ１２細胞、エル・チャシン（L. Chasin）（コロンビア大学、ニューヨーク）により開発されたＣＨＯ−Ｋ１ＤＵＸＢ１１細胞系の誘導体に導入し、グリシン−ヒポキサンチン−チミジン（Ｇ−Ｈ−Ｔ）不含培地で増殖させるように選択した。チショルム（Chisholm）等、ＤＮＡクローニング 4：実用的アプローチ、哺乳動物系（eds. Glover & Hames）、1〜39頁（Oxford Press、1995年）。続いて、第１ラウンドの選択からのクローンをメトトレキサートの濃度を増加させて培養した。ついで、クローンをヒト又はネズミＦｃのＥＬＩＳＡによる生産のためにスクリーニングした。最も高い生産性を示したクローンを懸濁培養用にし、無血清培養物を収集し、プロテインＡ−セファロースで精製した。タンパク質濃度をアミノ酸分析により決定した。最終的に精製された物質のエンドドキシン含有量は０．５ｅｕ／ｍｇを越えていなかった。
上掲のフェララ等に記載されたように、ネズミｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合タンパク質とヒトｆｌｔ（１−３）−ＩｇＧ融合タンパク質は両方とも試験した齧歯動物モデルにおいてＶＥＧＦの生物活性を阻害する活性を有していた。
【００３８】
実施例４
ｈＶＥＧＦアンタゴニストによる腫瘍増殖の阻止
培養物中で増殖している様々なヒト腫瘍細胞株をｈＶＥＧＦの産生についてＥＬＩＳＡでアッセイした。卵巣、肺、大腸、胃、乳および脳腫瘍細胞株はｈＶＥＧＦを産生することが分かった。さらなる試験のために、ｈＶＥＧＦを産生した３つの細胞株、ＮＥＧ55（Ｇ55とも称される）（Ｇ55とも称される）（ドイツ、ハンブルグのエッペンドル大学病院神経外科部のM．ウエストファル（Westphal）医師から得たヒト神経膠腫細胞株）、Ａ−673（細胞株番号ＣＲＬ 1598としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から取得したヒト横紋筋肉腫細胞株）およびＳＫ−ＬＭＳ−１（細胞株番号ＨＴＢ 88としてＡＴＣＣから取得した平滑筋肉腫細胞株）を使用した。
生後６〜10週齢の雌ベージュ／ヌードマウス（米国マサチューセッツ州ウィルミントンのCharles River Laboratory）に100〜200μｌのＰＢＳ中１〜５×10⁶個の腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖を確立した後種々の時間で、種々の投与量のＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体、無関係の抗ｇｐ120モノクローナル抗体（5Ｂ6）またはＰＢＳを１週間当たり１回または２回マウスに腹腔内注射した。腫瘍サイズを毎週測定し、試験終結時に腫瘍を切開し重量を測定した。
マウスのＮＥＧ55腫瘍の増殖に与える種々の量のＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果をＦｉｇ４およびＦｉｇ５に示す。Ｆｉｇ４は、ＮＥＧ55細胞を接種して１週間後に開始し25μgまたは100μgのＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体で治療したマウスを無関係の抗体またはＰＢＳで治療したマウスと比較したとき、腫瘍増殖速度が大幅に減少していたことを示している。Ｆｉｇ５は、ＮＥＧ55細胞を接種して５週間後に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体で治療したマウスの腫瘍の大きさが無関係抗体またはＰＢＳで治療したマウスの腫瘍の大きさより約50％（25μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）から85％（100μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）小さかったことを示している。
マウスのＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍の増殖に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果をＦｉｇ６に示す。ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞を接種して５週間後に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体で治療したマウスの腫瘍の大きさは、無関係抗体またはＰＢＳで治療したマウスの腫瘍の大きさより約75％小さかった。
マウスのＡ673腫瘍の増殖に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果をＦｉｇ７に示す。Ａ673細胞を接種して４週間後に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体で治療したマウスの腫瘍の平均的な大きさは、無関係抗体またはＰＢＳで治療したマウスの腫瘍の大きさより約60％（10μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）から90％以上（50〜400μg投与量の抗体で治療したマウスの場合）小さかった。
【００３９】
実施例５
培養物中で増殖している腫瘍細胞に与える 抗ｈＶＥＧＦ抗体の直接的な効果の分析
ＮＥＧ55ヒト神経膠腫細胞またはＡ673横紋筋肉腫細胞を、10％のウシ胎児血清、２mＭのグルタミンおよび抗生物質を含有するＦ12／ＤＭＥＭ培地のマルチウエルプレート（12ウエル／プレート）中に７×10³細胞／ウエルの密度で蒔いた。次に、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体を最終濃度が０〜20.0μgの抗体／mlになるように細胞培養物に加えた。５日後、ウエル内で増殖している細胞を、トリプシンに暴露して分離させ、コールター計数器で計数した。
Ｆｉｇ８および９はこれらの試験結果を示す。明らかなように、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体は、培養物中のＮＥＧ55またはＡ673細胞の増殖に対して何ら有意な効果を有していなかった。これらの結果は、Ａ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体が細胞毒性でないことを示しており、抗体の観察された抗腫瘍効果はＶＥＧＦ媒介性新血管形成の阻止によるものであることを強く示唆している。
【００４０】
実施例６
内皮細胞走化性に与える抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果
内皮細胞並びに単球およびリンパ球を含む他の細胞の走化性は関節リウマチの病原において重要な役割を果たしている。内皮細胞の遊走および増殖はリウマトイド滑膜内で生じる脈管形成を伴う。血管形成性組織（パンヌス）は関節軟骨に侵入し、これを破壊する。
ｈＶＥＧＦアンタゴニストがこのプロセスを妨げるかどうかを決定するために、我々は、関節リウマチの患者から得た滑液で刺激した内皮細胞の走化性に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果をアッセイした。対照として、我々は骨関節炎（関節リウマチで生じる脈管形成は骨関節炎では生じない）患者から得た滑液で剌激した内皮細胞の走化性に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体の効果もアッセイした。
内皮細胞の走化性は確立された方法に従って、変更したボイデンチャンバーを使用してアッセイした。トンプソン（Thompson）等、Cancer Res．51:2670（1991年）；フィリップス（Phillips）等、Proc．Exp．Biol．Med．197:458（1991年）。約10⁴個のヒト臍静脈内皮細胞を、0.1％のウシ胎児血清を含有する培養培地の48ウエルのマルチウエルマイクロチェンバー中でゼラチン被覆フィルター（0.8ミクロンの孔サイズ）に接着させた。約２時間後、チャンバーを逆さにし、試験試料（関節リウマチ滑液、骨関節炎滑液、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））（１μg／mlの最終濃度までか、またはＰＢＳ）およびＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦ抗体（10μg／mlの最終濃度まで）をウエルに加えた。２ないし４時間後、遊走した細胞を染色しそして計数した。
Ｆｉｇ１０は上記の試験の平均化した結果を示すものである。「滑液」と表示した欄および対照に関する頁の下部に示された値は滑液、ｂＦＧＦまたはＰＢＳ単独の存在下で遊走した内皮細胞の平均数である。「滑膜液＋ｍＡＢ ＶＥＧＦ」と表示した欄の値は、滑液プラス添加したＡ４.６.１−抗ｈＶＥＧＦ抗体の存在下で遊走した内皮細胞の平均数である。「抑制％］と表示した欄の値は、抗ｈＶＥＧＦ抗体の添加により生じた滑液誘発内皮細胞遊走の低下パーセントを示す。示されているように、抗ｈＶＥＧＦ抗体は、関節リウマチの滑液が内皮細胞の遊走を誘発する能力を有意に阻止する（平均53.40パーセントの阻止）が、骨関節炎の滑液はそうではなかった（平均13.64パーセントの阻止）。
【００４１】
実施例７
脳浮腫に与えるアンタゴニストの効果
インビボアッセイを行い、脳浮腫に与えるｆｌｔ−ＩｇＧアンタゴニストの効果を測定した。ＢＢＢ完全性の喪失と脳浮腫形成により脳梗塞がしばしば生じる。虚血性脳卒中におけるＢＢＢの破壊は、主として、脳卒中開始の最初の２４時間後に生じると考えられている。さらに、急性虚血の発生に続く血流の迅速で十分な復活という有益な効果は、ＢＢＢを含む脳微小血管に対する再灌流損傷によって台無しになると信じられており、脳浮腫の形成に寄与する。クラトゾ（Klatzo）等、Eds., Brain Edema, Tokyo, Springer（1984年）,1〜5頁。以下に記載するインビボアッセイは、臨床状態のこれら側面を反映するように計画された。
【００４２】
限局性皮質虚血を、チェン（Chen）等、脳卒中 17:738-743（1986年）に過去に記載された方法を使用し、中脳動脈（ＭＣＡ）の閉塞によりマウス脳内に誘発した。マウス（Ｃ５７ＢＬ−６Ｊ；１８−２５グラム）に、酸素中１．５％イソフランを用いて麻酔をかけた。右側ＭＣＡを開頭術により暴露させ１１−０縫合で結紮した。さらに、同側の共通する頸動脈を虚血中に閉塞させた。血管を４５分間、閉塞状態のままにした。手術に先だって、動物を無作為に２つの群に分け、ネズミｆｌｔ−ＩｇＧ（上述した実施例３Ｂに記載；さらにフェララ等、Nature Medicine 4:336（1998年）にも記載）又はｆｌｔ−ＩｇＧのＦｃと同じイソタイプに属する無関係対照ネズミ抗ＧＰ１２０抗体［フェララ等、上掲］を、手術の１２時間前、再灌流時、及びまた手術後１及び２日後に１０ｍｇ／ｋｇ投与量で腹腔内に投与した。浮腫形成の度合いを、虚血の開始後２４時間、Ｔ２加重ＭＲ画像診断により評価した。梗塞の最終的な大きさを高分解能解剖学用ＭＲＩを使用し、８−１２週間後に評価した。常套的な組織学的方法を使用して梗塞の大きさを検査するために、動物のサブセット（ｎ＝１２）を取り出した。
Ｆｉｇ１１に示すように、ｆｌｔ−Ｉｇの投与により、虚血開始の１日後に得られたＴ２加重ＭＲＩスキャン上の超強度領域により定められた脳浮腫容積の有意な低減が引き起こされた（２７％低減、ｐ＝０．０１スチューデントｔ検定、対照及び治療群のそれぞれにおいてｎ＝１５及びｎ＝１６）。反対側と比べて高信号強度領域として皮質浮腫の出現を示す代表的なＴ２加重ＭＲ画像をＦｉｇ１２に示す。このモデルにおいては、虚血ダメージの進行により、空洞形成及び皮質組織の喪失に至る。よって、梗塞の最大容量は、影響を受けていない皮質の量を描き、反対側の半球と比較することにより、高分解能解剖用画像から推定することができる。Ｆｉｇ１３に示すように、皮質梗塞のサイズは、８−１２週後に測定したところでは、ｆｌｔ−ＩｇＧの投与により有意に低減している（梗塞のサイズで２６％低減、ｐ＝０．００９ステューデントｔ検定、対照及び治療群のそれぞれにおいてｎ＝１１及びｎ＝１４）。ＭＲＩにより測定された梗塞のサイズと、常套的な組織学を使用して測定された梗塞のサイズとの間には良好な相関関係があった（Ｒ^２＝．６３３）。従って、治療された動物では脳浮腫の発達が低減されることが示されており、これはさらに神経保護の増大をもたらす。これらの結果には、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することで、虚血−再灌流関連脳浮腫及び損傷を低減可能であることが示されている。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１Ａ】 ｈＶＥＧＦに対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の結合に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１）または無関係な抗肝細胞増殖因子抗体（抗ＨＧＦ）の効果を示す。
【Ｆｉｇ１Ｂ】 ｈＶＥＧＦに対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の結合に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｂ２.６.２）または無関係な抗肝細胞増殖因子抗体（抗ＨＧＦ）の効果を示す。
【Ｆｉｇ２】 ウシ副腎皮質毛細血管内皮（ＡＣＥ）細胞の培養物中のｈＶＥＧＦの生物学的活性に対する抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１またはＢ２.６.２）または無関係な抗ＨＧＦ抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ３Ａ】 ウシＡＣＥ細胞に対するｈＶＥＧＦの結合における抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４.６.１、Ｂ２.６.２またはＡ２.６.１）の効果を示す。
【Ｆｉｇ３Ｂ】 Ｆｉｇ３Ａと同様の図である。
【Ｆｉｇ４】 マウスにおけるＮＥＧ55腫瘍増殖の増殖速度に対するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ５】 治療から５週後のマウスにおけるＮＥＧ55腫瘍のサイズに対するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ６】 マウスにおけるＳＫ−ＬＭＳ−１腫瘍の増殖に対するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（ＶＥＧＦ Ａｂ）治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ７】 マウスにおけるＡ673腫瘍の増殖に対するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体（ＶＥＧＦ Ａｂ）治療の様々な投与量の効果を示す。
【Ｆｉｇ８】 培養中のＮＥＧ55（Ｇ55）膠芽腫細胞の増殖および生存に対するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ９】 培養中のＡ673横紋筋肉腫細胞の増殖および生存に対するＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ１０】 ヒト内皮細胞のヒト滑液誘発走化性に与えるＡ４.６.１抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体の効果を示す。
【Ｆｉｇ１１】 Ｔ２加重磁気共鳴画像の高信号強度により示された浮腫組織範囲に対するｆｌｔ−ＩｇＧ治療の効果を示す。
【Ｆｉｇ１２】 対照群（上部パネル）と治療群（底部パネル）の両方に対する、虚血の始まりに続く２４時間に記録した代表的なＴ２加重磁気共鳴画像を示すもので、治療群において浮腫組織が減少してることを示す。
【Ｆｉｇ１３】 虚血の始まりに続く８−１２週に高分解能解剖用ＭＲＩを使用して測定した梗塞のサイズに対するｆｌｔ−ＩｇＧ処置の効果を示す。
【Ｆｉｇ１４Ａ】 Ｆ（ａｂ）−１２抗体と比較した、親和成熟抗ＶＥＧＦ抗体の各軽及び重可変ドメインに対するアミノ酸配列のアラインメントを示すもので、Ｆｉｇ１４Ｂと対をなしている図である（配列番号：１はＦｉｇ１４Ａに示し、配列番号：９はＦｉｇ１４Ｂに示す）。ＣＤＲには下線を付し、Ｌは軽鎖又はＨは重鎖を表し、１〜３の番号を付している。親和成熟配列はＹＯ２４３−１（配列番号２：はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１０はＦｉｇ１４Ｂに示す）；ＹＯ２３８−３（配列番号：３はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１１はＦｉｇ１４Ｂに示す）；ＹＯ３１３−１（配列番号：４はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１２はＦｉｇ１４Ｂに示す）；及びＹＯ３１７（配列番号：５はＦｉｇ１４Ａに示し；配列番号：１３はＦｉｇ１４Ｂに示す）と命名している。Ｆ（ａｂ）−１２との相違点は影付きボックスで示している。
【Ｆｉｇ１４Ａ】 上で説明した図である。
【Ｆｉｇ１５Ａ】 Ｆ（ａｂ）−１２抗体と比較した、親和成熟抗ＶＥＧＦ抗体の各軽及び重可変ドメインに対するアミノ酸配列のアラインメントを示すもので、Ｆｉｇ１５Ｂと対をなしている図である（配列番号：１はＦｉｇ１４Ａ及び１５Ａに示し、配列番号：９はＦｉｇ１４Ｂ及び１５Ｂに示す）。ＣＤＲには下線を付し、Ｌは軽鎖又はＨは重鎖を表し、１〜３の番号を付している。親和成熟配列はＹＯ１９２（配列番号６：はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１４はＦｉｇ１５Ｂに示す）；ＹＯ２３８−３（配列番号：３はＦｉｇ１４Ａ及び１４Ｂに示し；配列番号：１１はＦｉｇ１４Ｂ及び１５Ｂに示す）；ＹＯ２３９−１９（配列番号：７はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１５はＦｉｇ１５Ｂに示す）；及びＹＯ３１３−２（配列番号：８はＦｉｇ１５Ａに示し；配列番号：１６はＦｉｇ１５Ｂに示す）と命名している。Ｆ（ａｂ）−１２との相違点は影付きボックスで示している。
【Ｆｉｇ１５Ｂ】 上で説明した図である。

Claims (14)

1. 有効量のｈＶＥＧＦアンタゴニストを含有してなる、哺乳動物において虚血によって生じる脳浮腫の治療又は予防のための医薬であって、該ｈＶＥＧＦアンタゴニストが、ｆｌｔ ＶＥＧＦレセプターとＩｇＧとの融合タンパク質であり、細胞レセプターへのｈＶＥＧＦの結合を妨げるものである、医薬。
2. 前記虚血が脳卒中により生じる、請求項１に記載の医薬。
3. 脳卒中が虚血性脳卒中又は出血性脳卒中である、請求項２に記載の医薬。
4. 虚血性脳卒中は、血栓性脳卒中、塞栓性脳卒中、血行力学的脳卒中、又は陰窩性脳卒中である、請求項３に記載の医薬。
5. 出血性脳卒中は、脳内、くも膜下、脳室内、又は硬膜下出血に関する、請求項３に記載の医薬。
6. 有効量のｈＶＥＧＦアンタゴニストを含有してなる、哺乳動物の虚血によって生じる脳浮腫を治療するための医薬であって、該ｈＶＥＧＦアンタゴニストが、ｆｌｔ ＶＥＧＦレセプターとＩｇＧとの融合タンパク質であり、細胞レセプターへのｈＶＥＧＦの結合を妨げるものである、医薬。
7. 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストが抗ｈＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１ないし６の何れか一に記載の医薬。
8. 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がキメラ抗体を含む、請求項７に記載の医薬。
9. 前記抗ｈＶＥＧＦ抗体がヒト化抗体を含む、請求項７に記載の医薬。
10. 前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項７に記載の医薬。
11. 前記抗原結合抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２、又はＦｖ断片を含む、請求項７に記載の医薬。
12. 前記ｈＶＥＧＦアンタゴニストがｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質を含む、請求項１ないし６の何れか一に記載の医薬。
13. 前記ｈＶＥＧＦレセプター融合タンパク質が、免疫グロブリンに融合したｈＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン配列を含む、請求項１２に記載の医薬。
14. 虚血によって生じる脳浮腫が低酸素と関係している、請求項１に記載の医薬。

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