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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Antagonisten des
vaskulären
Endothelzellen-Wachstumsfaktors (VEGF) bei der Herstellung eines
Medikaments für
therapeutische Zwecke. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung
die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Ödems, das mit
einer nicht-neoplastischen Erkrankung oder einem nicht-neoplastischen
Zustand in Verbindung steht.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
zwei Hauptzellkomponenten des Gefäßsystems sind die Endothel-
und glatten Muskelzellen. Die Endothelzellen bilden die Auskleidung
der Innenoberfläche
aller Blutgefäße und sie
bilden eine nichtthrombogene Grenzfläche zwischen Blut und Gewebe.
Ferner sind Endothelzellen eine wichtige Komponente für die Entwicklung
neuer Kapillaren und Blutgefäße. Daher
proliferieren Endothelzellen während
der Angiogenese oder Revaskularisation in Verbindung mit Tumorwachstum
und -metastasierung sowie einer Vielzahl nicht-neoplastischer Erkrankungen
oder Störungen.
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Verschiedene
natürliche
vorkommende Polypeptide induzieren nach Berichten die Proliferation
von Endothelzellen. Zu diesen Polypeptiden gehören die basischen und sauren
Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF), Burgess und Maciag, Annual
Rev. Biochem., 58: 575 (1989), Plättchen-Endothelzellen-Wachstumsfaktor
(PD-ECGF), Ishikawa et al., Nature, 338: 557 (1989), und der vaskuläre endotheliale
Wachstumsfaktor (VEGF), Leung et al., Science 246: 1306 (1989);
Ferrara & Henzel,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851 (1989); Tischer et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1198 (1989); Ferrara et al.,
PCT Pat. Pub. Nr. WO 90/13649 (veröffentlicht am 15. November
1990).
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VEGF
wurde zum ersten Mal in Medien identifiziert, die durch follikulare
Zellen oder follikulare Sternzellen von Rinderhypophyse konditioniert
waren. Biochemische Analysen zeigen, dass Rinder-VEGF ein dimeres
Protein mit einer scheinbaren Molekulärmasse von etwa 45 000 Dalton
und mit einer scheinbaren mitogenen Spezifität für vaskuläre Endothelzellen ist. DNA
mit Codierung für
Rinder-VEGF wurde durch Screening einer aus derartigen Zellen hergestellten
cDNA-Bibliothek isoliert, wobei Oligonucleotide auf der Basis der aminoterminalen
Aminosäuresequenz
des Proteins als Hybridisierungssonden verwendet wurden.
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Humaner
VEGF wurde durch ein erstes Screening einer aus humanen Zellen hergestellten
cDNA-Bibliothek erhalten, wobei Rinder-VEGF-cDNA als Hybridisierungssonde
verwendet wurde. Eine dadurch identifizierte cDNA codiert ein 165-Aminosäuren-Protein
mit mehr als 95% Homologie zu Rinder-VEGF, wobei dieses Protein als humaner
VEGF (hVEGF) bezeichnet wird. Die mitogene Aktivität von humanem
VEGF wurde durch Expression der humanen VEGF-cDNA in Säugerwirtszellen
festgestellt. Durch mit der humanen VEGF-cDNA transfizierte Zellen
konditionierte Medien förderten
die Proliferation von Kapillarendothelzellen, während Kontrollzellen dies nicht
taten. Siehe Leung et al., Science 246: 1306 (1989).
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Mehrere
weitere cDNAs, die 121-, 189- und 206-Aminosäuren-Isoformen von hVEGF (kollektiv auch als
hVEGF-verwandte Proteine bezeichnet) codieren, wurden in humanen
cDNA-Bibliotheken identifiziert. Das 121-Aminosäuren-Protein unterscheidet
sich von hVEGF durch die Deletion der 44 Amino säuren zwischen den Resten 116
und 159 in hVEGF. Das 189-Aminosäuren-Protein
unterscheidet sich von hVEGF durch die Insertion von 24 Aminosäuren an
Rest 116 in hVEGF und es ist scheinbar identisch mit dem humanen
vaskulären
Permeabilitätsfaktor
(hVPF). Das 206-Aminosäuren-Protein
unterscheidet sich von hVEGF durch eine Insertion von 41 Aminosäuren an
Rest 116 in hVEGF. Houck et al., Mol. Endocrin. 5: 1806 (1991);
Ferrara et al., J. Cell. Biochem. 47: 211 (1991); Ferrara et al.,
Endocrine Reviews 13: 18 (1992); Keck et al., Science 246: 1309
(1989); Connolly et al., J. Biol. Chem. 264: 20017 (1989); Keck
et al., EPO Pat. Pub. Nr. 0 370 989 (veröffentlicht am 30. Mai 1990).
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Rezeptoren
für VEGF
wurden in der Literatur beschrieben. Für zwei derartige Rezeptoren,
flt-1 und flk-1, wurde ermittelt, dass sie VEGF-Wirkungen vermitteln
[DeVries et al., Science 255: 989 (1992); Shibuya et al., Oncogene
5: 519 (1990); Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 9026
(1991); Terman et al., Oncogene 6: 1677 (1991); Terman et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 187: 1579 (1992); Neufeld et al., Prog. Growth
Factor Res. 5: 89–97
(1994); Waltenberger et al., J. Biol. Chem. 269: 26988 (1994); Quinn
et al., Proc. Natl. Acac. Sci. 90: 7533 (1993)] doch sind deren
Regulation und Mechanismen noch nicht vollständig verstanden. Lennmyr et
al., J. Neuropathology and Exp. Neurology 57: 874–882 (1998).
Sowohl der flt-1- als auch der flk-1-Rezeptor sind membrandurchspannende
Rezeptoren und gehören
zur Klasse-III-Tyrosinkinaserezeptorfamilie. Barleon et al., J.
Cell Biochem. 54: 56 (1994); Neufeld et al., aaO.
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VEGF
stimuliert nicht nur die vaskuläre
Endothelzellproliferation, sondern induziert auch die Angiogenese.
Die Angiogenese, die die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierendem
Endothel umfasst, ist eine wichtige Kompo nente einer Vielzahl von
Erkrankungen und Störungen,
die Tumorwachstum und -metastasierung, rheumatoide Arthritis, Psoriasis,
Atherosklerose, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie,
neovaskuläres
Glaukom, altersbedingte Makuladegeneration, Hämangiome, Immunabstoßung von
transplantiertem Korneagewebe und anderen Geweben und chronische
Entzündung
umfassen.
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Im
Falle von Tumorwachstum scheint Angiogenese für den Übergang von Hyperplasie zu
Neoplasie und für
die Bereitstellung einer Ernährung
des wachsenden soliden Tumors entscheidend zu sein. Folkman et al.,
Nature 339: 58 (1989). Angiogenese ermöglicht auch den Kontakt von
Tumoren mit dem Gefäßbett des Wirts,
was einen Weg zur Metastasierung der Tumorzellen ergeben kann. Beweisanzeichen
für die
Rolle von Angiogenese bei Tumormetastasierung werden beispielsweise
durch Untersuchungen geliefert, die eine Korrelation zwischen der
Zahl und Dichte von Mikrogefäßen in histologischen
Schnitten eines invasiven humanen Brustkarzinoms und dem tatsächlichen
Vorhandensein entfernter Metastasen zeigen, Weidner et al., New Engl.
J. Med. 324: 1 (1991).
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Es
wurde auch berichtet, dass VEGF an der endothelialen und vaskulären Permeabilität beteiligt
ist. Siehe Ferrara et al., Endocrine Reviews 18: 4–25 (1997);
Dobrogowska et al., J. Neurocytology 27: 163 (1998). Obwohl dies
nicht vollständig
verstanden wird, wird angenommen, dass VEGF die Endothelzellendurchlässigkeit
in Haut-, Retina- und Tumorgeweben erhöht. Collins et al., Brit. J.
Pharmacology 109: 195 (1993); Connolly et al., J. Clin. Invest.
84: 1470 (1989); Shweiki et al., Nature 359: 843 (1992); Monacci
et al., Am. J. Physiol. 264: C995 (1993); Stone et al., J. Neurosci.
15: 4738 (1995); Detmar et al., J. Invest. Dermatol. 108: 263 (1997);
Weindel et al., Neurosurgery 35: 437 (1994). Die potentiellen Wirkungen
und die Rolle von VEGF (und von dessen Rezeptoren, insbesondere
des flt-1-Rezeptors)
auf die Endothelzellen- und Blut-Hirn-Schrankendurchlässigkeit
wurden ebenfalls untersucht. Siehe beispielsweise Rosenstein et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 7086 (1998); Dobrogowska, aaO; Kovacs
et al., Stroke 27: 1865 (1996). Eine relativ diffuse VEGF-mRNA-Expression
wurde in Hirn ausgewachsener Ratten, jedoch mit einer ziemlich geringen
Menge beobachtet. Monacci et al., Am. J. Physiol. 146: 368–378 (1993).
Jedoch wurde gezeigt, dass ein verringerter Sauerstoffdruck eine
VEGF-Expression auslöst
[Dor und Keshet, Trends in Cardiovascular Med., 7: 289–294 (1998)],
und es wurde gezeigt, dass erhöhte
Konzentrationen von VEGF, flt-1 und flk-1 in Rattenhirn nach der
Induktion einer fokalen zerebralen Ischämie auftreten. Hayashi et al.,
Stroke 28: 2039 (1997); Kovacs et al, aaO; Lennmyr et al., J. Neuropathology
and Experimental Neurology, 57: 874 (1998). Die Rolle von VEGF bei
der Pathogenese von Schlaganfall und BBB-Abbau ist unklar, wobei
in der Literatur widersprechende experimentelle Beobachtungen angegeben
werden. Beispielsweise zeigten Nag et al., J. Neuropathology and
Experimental Neurology 56: 912 (1997), in deren Rindenstrangläsionsrattenmodell
das Vorhandensein von muralem VEGF in permeablen Pialgefäßen und
Arteriolen innerhalb des geschädigten
Gewebes und aus dieser Beobachtung wurde gefolgert, dass VEGF einer
der mehreren Faktoren ist, die einen BBB-Abbau und eine Ödembildung
vermitteln können.
Andererseits wird in Hayashi et al., J. Cerebral Blood Flow and
Metabolism, 18: 887 (1998) berichtet, dass VEGF selbst, wenn er
topisch auf der Oberfläche
eines reperfundierten Rattenhirns nach vorübergehendem zerebralen Arterienverschluss
appliziert wurde, eine ischämische
Herzschädigung,
Infarktvolumen und Ödembildung
verringerte.
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Die
WO 94/10202 (D1) offenbart Antagonisten von VEGF und sie stellt
fest, dass die Antagonisten zur Behandlung von Erkrankungen oder
Störungen,
die durch eine unerwünschte
oder übermäßige Endothelzellproliferation
oder Revaskularisation gekennzeichnet sind, verwendbar sind.
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Die
WO 98/16551 (D2) offenbart Antagonisten von VEGF und sie stellt
fest, dass die Antagonisten zur Behandlung von Indikationen, bei
denen eine Modulation des Endothelzellenwachstums und der Angiogenese gewünscht ist,
verwendbar sind.
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Die
WO 00/29584 (D6), die unter Artikel 54(3) EPÜ fällt, offenbart Antagonisten
von VEGF und sie stellt fest, dass die Antagonisten zur Behandlung
von neoplastischen und nicht-neoplastischen Zuständen verwendbar sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines hVEGF-Antagonisten
bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention
eines Ödems
in Verbindung mit einer nicht-neoplastischen Erkrankung oder einem
nicht-neoplastischen
Zustand bei einem Säuger
bereit.
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Weitere
Ausführungsformen
der Erfindung sind wie in den Ansprüchen 2–20 beschrieben.
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Verwandte
Aspekte der Erfindung
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt ferner Antagonisten von VEGF, die
(a) Antikörper
und Varianten derselben, die spezifisch an hVEGF, einen hVEGF-Rezeptor
oder einen Komplex, der hVEGF in Verbindung mit einem hVEGF-Rezeptor
umfasst, binden können,
(b) einen hVEGF-Rezeptor und Varianten desselben und (c) hVEGF-Varianten
umfassen. Die Antagonisten hemmen, maskieren oder neutralisieren
die mitogene, angiogene, Gefäßpermeabilitäts- oder
sonstige biologische Aktivität
von hVEGF und sind daher zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die
durch eine unerwünschte übermäßige Revaskularisation
gekennzeichnet sind, die beispielsweise rheumatoide Arthritis, Psoriasis,
Atherosklerose, diabetische und andere Retinopathien, retrolentale
Fibroplasie, altersbedingte Makuladegeneration, neovaskuläres Glaukom,
Hämangiome,
Schilddrüsenhyperplasien
(einschließlich
von Basedow-Krankheit), Kornea- und eine sonstige Gewebetransplantation
und chronische Entzündung
umfassen, verwendbar. Die Antagonisten sind auch zur Behandlung
von Erkrankungen oder Zuständen,
wie einem Ödem,
das mit beispielsweise einem Schlaganfall, Kopftrauma in Verbindung
stehen kan, Aszites in Verbindung mit Malignomen, Meigs-Syndrom, Lungenentzündung, nephrotischem
Syndrom, Perikarderguss (beispielsweise in Verbindung mit Perikarditis)
und Pleuraerguss, verwendbar.
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In
weiteren Aspekten sind die VEGF-Antagonisten polyspezifische monoklonale
Antikörper,
die zur Bindung an (a) nicht-hVEGF-Epitop, beispielsweise ein Epitop
eines Proteins, das an der Thrombogenese oder Thrombolyse beteiligt
ist, oder ein Tumorzelloberflächenantigen,
oder (b) hVEGF, einen hVEGF-Rezeptor oder einen Komplex, der hVEGF
in Verbindung mit einem hVEGF-Rezeptor umfasst, fähig sind.
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In
noch weiteren Aspekten sind die VEGF-Antagonisten mit einer cytotoxischen
Einheit konjugiert.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung isolierte Nucleinsäuren mit
Codierung für
die monoklonalen Antikörper,
die im vorhergehenden beschrieben wurden, und Hybridomzelllinien,
die derartige monoklonale Antikörper
produzieren.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Zusammensetzungen,
beispielsweise pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen VEGF-Antagonisten
in einer zur Verringerung oder Beseitigung von hVEGF-vermittelter
mitogener, angiogener oder sonstiger biologischer Aktivität bei einem
Säuger
wirksamen Menge umfassen.
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In
einem verschiedenen Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung
eines Medikaments, das eine wirksame Menge eines VEGF-Antagonisten
umfasst, zur Verabreichung an einen Säuger, vorzugsweise einen humanen
Patienten, der dieses benötigt.
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Falls
gewünscht,
wird der VEGF-Antagonist entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend
gemeinsam mit einem oder mehreren weiteren VEGF-Antagonisten, Antitumor-
oder antiangiogenen Substanzen oder für die zu behandelnde Erkrankung
oder Störung
geeigneten Therapien verabreicht.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion
von hVEGF in einer Testprobe durch Inkontaktbringen der Testprobe
mit einem Antikörper,
der spezifisch an hVEGF binden kann, und Bestimmen des Ausmaßes dieser
Bindung.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt die Wirkung von Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpern (A4.6.1
oder B2.6.2) oder eines irrelevanten-Anti-Hepatocytenwachstumsfaktor-Antikörpers (Anti-HGF)
auf die Bindung der Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper an
hVEGF.
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2 zeigt
die Wirkung von Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpern (A4.6.1 oder B2.6.2)
oder eines irrelevanten-Anti- HGF-Antikörpers auf
die biologische Aktivität
von hVEGF in Kulturen von bovinen Nebennierenrindenkapillarendothel
(ACE) zellen.
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3 zeigt die Wirkung von Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpern (A4.6.1,
B2.6.2 oder A2.6.1) auf die Bindung von hVEGF an bovine ACE-Zellen.
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4 zeigt
die Wirkung einer Behandlung mit Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper A4.6.1 auf die Wachstumsrate
von NEG55-Tumoren bei Mäusen.
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5 zeigt
die Wirkung einer Behandlung mit Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper A4.6.1 auf die Größe von NEG55-Tumoren
bei Mäusen
nach einer fünfwöchigen Behandlung.
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6 zeigt
die Wirkung einer Behandlung mit Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper A4.6.1 (VEGF Ab) auf das
Wachstum von SK-LMS-1-Tumoren bei Mäusen.
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7 zeigt
die Wirkung einer Behandlung mit variierenden Dosen von Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper A4.6.1
(VEGF Ab) auf das Wachstum von A673-Tumoren bei Mäusen.
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8 zeigt
die Wirkung von Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper A4.6.1 auf das Wachstum
und Überleben
von NEG55(G55)-Glioblastomzellen in Kultur.
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9 zeigt
die Wirkung von Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper A4.6.1 auf das Wachstum
und Überleben
von A673-Rhabdomyosarcomzellen in Kultur.
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10 zeigt
die Wirkung von Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper A4.6.1 auf durch humane
Synovia induzierte Chemotaxis humaner Endothelzellen.
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11 zeigt
die Wirkung einer Behandlung mit flt-IgG auf das Ausmaß von ödematösem Gewebe,
das durch hohe Signalintensität
auf dem T2-gewichteten MR-Bild gezeigt wird.
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12 zeigt
repräsentative
T2-gewichtete MR-Bilder, die 24 h nach dem Einsetzen von Ischämie aufgezeichnet
wurden, für
sowohl die Kontrollgruppe (oberes Feld) als auch die Behandlungsgruppe
(unteres Feld), die eine Verringerung von ödematösem Gewebe in der Behandlungsgruppe
zeigen.
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13 zeigt
die Wirkung einer Behandlung mit flt-IgG auf die Größe eines
Infarkts, was unter Verwendung von hochauflösender anatomischer MRI 8–12 Wochen
nach dem Einsetzen von Ischämie
bestimmt wurde.
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14A–B
zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen
für die
leichten bzw. schweren variablen Domänen von affinitätsgereiften
Anti-VEGF-Antikörpern
im Vergleich mit dem F(ab)-12-Antikörper (SEQ ID NO: 1 in 14A angegeben; SEQ ID NO: 9 in 14B angegeben). Die CDRs sind unterstrichen und
mit L, leichte Ketten, oder H, schwere Ketten, und den Zahlen 1–3 bezeichnet.
Die affinitätsgereiften
Sequenzen sind mit YO234-1 (SEQ ID NO: 2 in 14A angegeben,
SEQ ID NO: 10 in 14B angegeben); YO238-3 (SEQ ID
NO: 3 in 14A angegeben, SEQ ID NO: 11
in 14B angegeben); YO313-1 (SEQ ID NO: 4 in 14A angegeben, SEQ ID NO: 12 in 14B angegeben); und YO317 (SEQ ID NO: 5 in 14A angegeben, SEQ ID NO: 13 in 14B angegeben) bezeichnet. Unterschiede gegenüber F(ab)-12
sind eingerahmt angegeben.
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15A–B
zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen
für die
leichten bzw. schweren variablen Domänen von affinitätsgereiften
Anti-VEGF-Antikörpern
im Vergleich mit dem F(ab)-12-Antikörper (SEQ ID NO: 1 in 14A und 15A angegeben;
SEQ ID NO: 9 in 14B und 15B angegeben).
Die CDRs sind unterstrichen und mit L, leichte Ketten, oder H, schwere
Ketten, und den Zahlen 1–3
bezeichnet. Die affinitätsgereiften
Sequenzen sind mit YO192 (SEQ ID NO: 6 in 15A angegeben,
SEQ ID NO: 14 in 15B angegeben); YO238-3 (SEQ
ID NO: 3 in 14A und 14B angegeben,
SEQ ID NO: 11 in 14B und 15B angegeben);
YO239-19 (SEQ ID NO: 7 in 15A angegeben,
SEQ ID NO: 15 in 15B angegeben); und YO313-2
(SEQ ID NO: 8 in 15A angegeben, SEQ ID NO: 16
in 15B angegeben) bezeichnet. Unterschiede gegenüber F(ab)-12
sind eingerahmt angegeben.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Herstellung von Medikamenten bereit,
die Antagonisten von hVEGF enthalten, die eine oder mehrere der
biologischen Aktivitäten
von hVEGF hemmen, maskieren oder neutralisieren können. Antagonisten
von hVEGF wirken durch Eingreifen in die Bindung von hVEGF an einen zellulären Rezeptor,
durch Untauglichmachen oder Abtöten
von Zellen, die durch hVEGF aktiviert wurden, oder durch Eingreifen
in die vaskuläre
Endothelzellaktivierung nach der Bindung von hVEGF an einen zellulären Rezeptor.
Alle derartigen Punkte eines Eingreifens durch einen hVEGF-Antagonisten sollen
für Zwecke dieser
Erfindung als äquivalent
betrachtet werden. Daher werden vom Umfang der Erfindung Antikörper, monoklonale
Antikörper
und humanisierte Antikörper
oder Fragmente derselben, die an hVEGF, hVEGF-Rezeptor oder einen Komplex, der hVEGF
in Verbindung mit einem hVEGF-Rezeptor umfasst, binden, umfasst.
Ebenfalls vom Umfang der Erfindung werden Fragmente und Aminosäuresequenzvarianten
von hVEGF, die an hVEGF-Rezeptor binden, jedoch nicht die biologische
Aktivität
von nativem hVEGF zeigen, umfasst. Ebenfalls vom Umfang der Erfindung
werden Varianten des hVEGF-Rezeptors und Fragmente der Aminosäuresequenz desselben,
die hVEGF binden können,
umfasst.
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Der
hier verwendete Ausdruck "hVEGF" bezeichnet den humanen
vaskulären
Endothelzellenwachstumsfaktor von 165 Aminosäuren und verwandte vaskuläre Endothelzellenwachstumsfaktoren
von 121, 189 und 206 Aminosäuren
gemäß der Beschreibung
bei Leung et al., Science 246: 1306 (1989) und Houck et al., Mol.
Endocrin. 5: 1806 (1991), zusammen mit den natürlich vorkommenden Allel- und
prozessierten Formen dieser Wachstumsfaktoren.
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Der
hier verwendete Ausdruck "hVEGF-Rezeptor" oder "hVEGFr" bezeichnet einen
zellulären
Rezeptor für
hVEGF, üblicherweise
einen Zelloberflächenrezeptor,
der sich auf vaskulären
Endothelzellen findet, sowie Fragmente und Varianten desselben,
die die Fähigkeit
zur Bindung von hVEGF beibehalten. Typischerweise sind die hVEGF-Rezeptoren
und Fragmente und Varianten desselben, die hVEGF-Antagonisten sind,
in isolierter Form und nicht in einer Zellmembran integriert oder
an einer Zelloberfläche
fixiert, wie dies in der Natur der Fall sein kann. Ein Beispiel
für einen
hVEGF-Rezeptor ist die fms-ähnliche
Tyrosinkinase (flt oder flt-1), ein Transmembranrezeptor in der
Tyrosinkinasefamilie. DeVries et al., Science 255: 989 (1992); Shibuya
et al., Oncogene 5: 519 (1990). Der flt-Rezeptor voller Länge umfasst
eine extrazelluläre
Domäne,
eine Transmembrandomäne
und eine intrazelluläre
Domäne
mit Tyrosinkinaseaktivität.
Die extrazelluläre
Domäne
ist an der Bindung von hVEGF beteiligt, während die intrazelluläre Domäne an der
Signalübertragung
beteiligt ist.
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Ein
weiteres Beispiel für
einen hVEGF-Rezeptor ist der flk-1-Rezeptor
(auch als KDR bezeichnet). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
88: 9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6: 1677 (1991); Terman
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579 (1992).
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Die
Bindung von hVEGF an den flt-Rezeptor führt zur Bildung von mindestens
zwei Komplexen mit hohem Molekulargewicht mit einem scheinbaren
Molekulargewicht von 205 000 und 300 000 Dalton. Es wird angenommen,
dass der Komplex mit 300 000 Dalton ein Dimer ist, das zwei Rezeptormoleküle an ein
einziges hVEGF-Molekül
gebunden umfasst.
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Varianten
von HVEGFr werden ebenfalls vom vorliegenden Umfang umfasst. Repräsentative
Beispiele umfassen gestutzte Formen eines Rezeptors, wobei mindestens
die Transmembran- und
Cytoplasmadomäne
von dem Rezeptormolekül
voller Länge
deletiert sind, und Fusionsproteine, wobei Nicht-hVEGFr-Polymere oder -Polypeptide
mit dem hVEGFr oder vorzugsweise gestutzten Formen desselben konjugiert
sind. Ein Beispiel für
ein derartiges Nicht-hVEGF-Polypeptid ist ein Immunglobulin. In
diesem Fall ist beispielsweise eine Sequenz der extrazellulären Domäne des hVEGFr
für die
Fv-Domäne
der leichten oder (vorzugsweise) schweren Kette eines Immunglobulins
substituiert, wobei der C-Terminus der extrazellulären Domäne des Rezeptors kovalent
an den Aminoterminus des CH1-, Gelenk-, CH2- oder eines anderen
Fragments der schweren Kette gebunden ist. Derartige Varianten werden
auf die gleiche Weise wie bekannte Immunadhäsine hergestellt. Siehe beispielsweise
Gascoigne et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 2936 (1987); Capon et
al., Nature 337: 525 (1989); Aruffo et al., Cell 61: 1303 (1990);
Ashkenazi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 10535 (1991); Bennett
et al., J. Biol. Chem. 266: 23060 (1991). Beispiele für verschiedene
flt-IgG-Fusionsproteine sind im folgenden Beispiel 3 beschrieben.
Gestutzte Formen der extrazellulären
Domäne
des hVEGF-Rezeptors, die zur Verwendung in der Erfindung betrachtet
werden, umfassen ECD-Fragmente (beispielsweise mit einer oder mehreren deletierten
Aminosäuren
in der ECD-Sequenz) und ECD-Formen mit einer oder mehreren deletierten
Immunglobulin-ähnlichen
Domänen
in der ECD. Das Beispiel 3B beschreibt beispielsweise eine gestutzte
Form von ECD, die nur die ersten drei Immunglobulin-ähnlichen
Domänen
von flt an ein Fc-IgG fusioniert umfasst. Vorzugsweise umfasst eine
gestutzte Form des ECD, die bei der Herstellung eines Antagonistenmoleküls verwendet
wird, (eine) ausreichend (e) Immunglobulin-ähnliche Domäne(n), um eine gewünschte Bindung
an hVEGF sicherzustellen.
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In
anderen Ausführungsformen
sind der hVEGFr oder Fragmente oder Varianten desselben mit einem nicht-proteinartigen
Polymer, wie Polyethylenglykol (PEG) (siehe beispielsweise Davis
et al., US-Patent 4 179 337; Goodson et al., BioTechnology 8: 343–346 (1990);
Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252: 3578 (1977); Abuchowski et
al., J. Biol. Chem. 252: 3582 (1977)) oder Kohlehydraten (siehe
beispielsweise Marshall et al., Arch. Biochem. Biophys. 167: 77
(1975)) konjugiert. Dies kann zur Verlängerung der biologischen Halbwertszeit
des hVEGFr und Verringerung der Möglichkeit, dass der Rezeptor
in dem Säuger,
dem er verabreicht wird, immunogen ist, dienen.
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Der
hVEGFr wird in im wesentlichen der gleichen Weise wie Antikörper für hVEGF
verwendet, wobei die Affinität
des Antagonisten und dessen Valenz für hVEGF berücksichtigt wird. Eine Sequenz
einer extrazellulären
Domäne
des hVEGF-Rezeptors,
entweder als solche oder an ein Immunglobulinpolypeptid oder ein
anderes Trägerpolypeptid
fusioniert, ist als Antagonist von hVEGF aufgrund deren Fähigkeit
zur Maskierung von hVEGF, das in einem Wirt vorhanden ist, jedoch
nicht an hVEGFr auf einer Zelloberfläche gebunden ist, besonders
günstig.
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hVEGFr
und Fragmente und Varianten desselben sind auch bei Screeningassays
zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten von hVEGF verwendbar.
Beispielsweise überexprimieren
Wirtszellen, die mit DNA mit Codierung für hVEGFr (beispielsweise flt
oder flk-1) transfiziert sind, das Rezeptorpolypeptid auf der Zelloberfläche, was
derartige rekombinante Wirtszellen zur Analyse der Fähigkeit
einer Testverbindung (beispielsweise eines kleinen Moleküls, linearen
oder cyclischen Peptids oder Polypeptids), an hVEGFr zu binden, ideal
geeignet macht. hVEGFr und hVEGFr-Fusionsproteine, beispielsweise
ein hVEGFr-IgG-Fusionsprotein, können
in ähnlicher
Weise verwendet werden. Beispielsweise wird das Fusionsprotein an
einen immobilisierten Träger
gebunden und die Fähigkeit
einer Testverbindung, radioaktiv markierten hVEGF von der hVEGFr-Domäne des Fusionsproteins
zu verdrängen,
bestimmt.
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Der
Ausdruck "rekombinant", der in Bezug auf
hVEGF, hVEGF-Rezeptor,
Antikörper
oder andere Proteine verwendet wird, bezeichnet Proteine, die durch
rekombinante DNA-Expression in einer Wirtszelle produziert werden.
Die Wirtszelle kann prokaryotisch (beispielsweise eine Bakterienzelle,
wie E. coli) oder eukaryotisch (beispielsweise eine Hefe- oder Säugerzelle)
sein.
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Antagonistenantikörper
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Der
hier verwendete Ausdruck "monoklonaler
Antikörper" bezeichnet einen
Antikörper,
der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten
wurde, d.h. die die Population umfassenden individuellen Antikörper sind
hinsichtlich Spezifität
und Affinität
mit Ausnahme von möglichen
natürlich
vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch.
Es ist anzumerken, dass in Folge von derartigen natürlich vorkommenden
Mutati onen und dgl. eine monoklonale Antikörperzusammensetzung der Erfindung,
die vorwiegend Antikörper
enthält,
die spezifisch hVEGF, hVEGFr oder einen Komplex, der hVEGF in Verbindung
mit hVEGFr umfasst, ("hVEGF-hVEGFr-Komplex") binden können, auch
geringe Mengen anderer Antikörper
enthalten kann.
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Daher
bezeichnet die Modifizierung "monoklonal" den Charakter des
Antikörpers,
dass er aus einer derartigen im wesentlichen homogenen Population
von Antikörpern
erhalten wurde, und sie soll nicht bedeuten, dass die Produktion
des Antikörpers
durch ein spezielles Verfahren erforderlich ist. Beispielsweise
können monoklonale
Antikörper
der Erfindung unter Verwendung des Hybridomverfahrens, das zum ersten
Mal von Kohler & Milstein,
Nature 256: 495 (1975) beschrieben wurde, hergestellt werden oder
durch Gentechnik hergestellt werden. Siehe beispielsweise Cabilly
et al., US-Patent 4 816 567.
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Bei
dem Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes passendes
Wirtstier mit einem Antigen auf subkutanem, intraperitonealem oder
intramuskulärem
Weg immunisiert, um Lymphocyten auszulösen, die Antikörper, die
spezifisch an das bzw. die zur Immunisierung verwendeten Protein(e)
binden, produzieren oder produzieren können. Alternativ können Lymphocyten
in vitro immunisiert werden. Die Lymphocyten werden dann mit Myelomzellen
unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie Polyethylenglykol,
unter Bildung einer Hybridomzelle fusioniert. Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, S. 59–103 (Academic Press, 1986).
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Das
Antigen kann hVEGF, hVEGFr oder ein hVEGF-hVEGFr-Komplex sein. Das
Antigen ist optional ein Fragment oder ein Teil oder eine Variante
von einem von hVEGF oder hVEGFr mit einem oder mehreren Aminosäureresten,
die an der Bindung von hVEGF an einen von dessen Rezeptoren teilnehmen.
Beispielsweise ist die Immunisierung mit einer Sequenz einer extrazellulären Domäne eines
hVEGFr (beispielsweise ein gestutztes hVEGFr-Polypeptid, dem mindestens
Transmembran- und
intrazelluläre
Domänen
fehlen) zur Produktion von Antikörpern,
die Antagonisten von hVEGF sind, besonders günstig, da es eine Region bzw. Regionen
innerhalb der extrazellulären
Domäne
sind, die an der hVEGF-Bindung beteiligt sind.
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Monoklonale
Antikörper,
die zur Bindung eines hVEGF-hVEGFr-Komplexes fähig sind, sind verwendbar,
insbesondere wenn sie nicht auch an nicht-assoziierten (nicht-komplexierten)
hVEGF und hVEGFr binden. Derartige Antikörper binden daher nur an Zellen,
die eine unmittelbare Aktivierung durch hVEGF erfahren, und sie
werden daher durch freien hVEGF oder hVEGFr, der normalerweise bei
einem Säuger
gefunden wird, nicht maskiert. Derartige Antikörper binden daher typischerweise
ein Epitop, das einen oder mehrere Kontaktpunkte zwischen dem Rezeptor
und hVEGF umspannt. Derartige Antikörper wurden für andere
Ligand-Rezeptor-Komplexe produziert und können hier auf die gleiche Weise
produziert werden. Diese Antikörper
müssen und
können
eine biologische Aktivität
von nicht-assoziiertem hVEGF oder hVEGFr, ungeachtet dessen, ob
die Antikörper
an nicht-assoziierten hVEGF oder hVEGFr binden können oder nicht, nicht neutralisieren
oder hemmen.
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Die
auf diese Weise hergestellten Hybridomzellen werden in einem geeigneten
Kulturmedium, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die
das Wachstum oder Überleben
der nicht-fusionierten Stammmyelomzellen hemmen, ausgesät und gezüchtet. Wenn
beispielsweise den Stammmyelomzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT
oder HRPT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise
Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), wobei diese Substanzen
das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
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Bevorzugte
Myelomzellen sind solche, die effizient fusionieren, eine stabile
hochgradige Expression von Antikörper
durch die ausgewählten
Antikörper
produzierenden Zellen unterstützen
und gegenüber
einem Medium, wie HAT-Medium, empfindlich sind. Von diesen sind
bevorzugte Myelomzelllinien murine Myelomlinien, wie die von MOPC-21-
und MPC-11-Maustumoren
abgeleiteten, die von Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, California, USA, erhältlich
sind, SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Manassas,
Virginia, USA, erhältlich
sind, und P3X63Ag8U.1-Zellen, die bei Yelton et al., Curr. Top.
Microbiol. Immunol. 81: 1 (1978) beschrieben sind. Humane Myelom-
und Maus-humane-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Produktion
humaner monoklonaler Antikörper
beschrieben. Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al.,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51–63 (Marcel
Dekker, Inc., New York, 1987).
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Kulturmedium,
in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf die Produktion von gegen
das Antigen gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet. Vorzugsweise
wird die Bindungsspezifität
von durch Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörpern durch
Immunpräzipitation
oder durch einen Invitro-Bindungstest, beispielsweise Radioimmunoassay
(RIA) oder enzymgekoppelten Immunsorptionstest (ELISA), bestimmt.
Die monoklonalen Antikörper
der Erfindung sind solche, die eine Immunpräzipitation mit hVEGF, hVEGFr
oder hVEGF-hVEGFr-Komplex
vorzugsweise ergeben oder die vorzugsweise an mindestens eines dieser
Antigene in einem Bindungstest binden und die eine biologische Aktivität von hVEGF
hemmen können.
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Nach
der Identifizierung von Hybridomzellen, die Antagonistenantikörper der
gewünschten
Spezifität, Affinität und Aktivität produzieren,
können
die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren
subkloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, S. 59–104 (Academic Press, 1986).
Geeignete Kulturmedien für
diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RPMI-1640-Medium. Ferner
können
die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumore in einem tierischen
Lebewesen gezüchtet
werden.
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Die
durch die Subklone sezernierten monoklonalen Antikörper werden
durch herkömmliche
Immunglobulinreinigungsverfahren, beispielsweise Protein-A-Sepharose-,
Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophoroese, Dialyse oder
Affinitätschromatographie,
von dem Kulturmedium, der Aszitesflüssigkeit oder Serum in geeigneter
Weise abgetrennt.
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DNA
mit Codierung für
monoklonale Antikörper
der Erfindung wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (beispielsweise
durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die spezifisch an Gene
mit Codierung für
die schweren und leichten Ketten muriner Antikörper binden können) ohne
weiteres isoliert und sequenziert. Die Hybridomzellen der Erfindung
dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn die DNA isoliert ist,
kann sie in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen,
wie Affen-COS-Zellen, Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen oder Myelomzellen,
die nicht in anderer Weise ein Immunglobulinprotein produzieren,
transfiziert werden, um die Synthese monoklonaler Antikörper in
den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten.
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Die
DNA kann optional modifiziert werden, um den Charakter des durch
deren Expression produzierten Immunglobulins zu ändern. Beispielsweise werden
humanisierte Formen muriner Antikörper durch Substitution einer
komplementaritätsbestimmenden
Region (CDR) der variablen Domäne
des murinen Antikörpers durch
die entsprechende Region eines humanen Antikörpers produziert. In einigen
Ausführungsformen
werden ausgewählte
Aminosäurereste
der Gerüstregion
(FR) des murinen Antikörpers
ebenfalls durch die entsprechenden Aminosäurereste in dem humanen Antikörper substituiert.
Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4285 (1992); Carter et
al., BioTechnology 10: 163 (1992). Chimäre Formen muriner Antikörper werden
auch durch Substitution der codierenden Sequenz für ausgewählte humane
Domänen
der schweren und leichten konstanten Kette anstelle der homologen
murinen Sequenzen produziert. Cabilly et al., US-Patent 4 816 567; Morrison
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851 (1984).
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Spezielle
humanisierte Antikörper,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen
werden, umfassen die humanisierten und affinitätsgereinigten Anti-hVEGF-Antikörper gemäß der Beschreibung
in den veröffentlichten
PCT-Anmeldungen WO 98/45331 (veröffentlicht
am 15. Oktober 1998) und WO 98/45332 (veröffentlicht am 15. Oktober 1998).
Derartige humanisierte oder affinitätsgereinigte Anti-hVEGF-Antikörper können unter
Verwendung der Verfahren und Techniken gemäß der Beschreibung in WO 98/45331
und WO 98/45332 hergestellt oder gemacht werden. Vorzugsweise umfasst
in den oben als Bezug angegebenen PCT-Anmeldungen der Anti-hVEGF-Antikörper das
humanisierte F(ab) der Bezeichnung F(ab)-12 oder den affinitätsgereinigten
Antikörper
der Bezeichnung YO317. Die 14A–B und 15A–B erläutern die
Aminosäuresequenzen
(leichte und schwere Ketten) für
diese Anti-hVEGF-Antikörper
zusammen mit anderen affinitätsgereinigten
Anti-VEGF-Antikörpern
der Bezeichnung YO192, YO238-3, YO239-19, YO313-2, YO243-1 und YO313-1.
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Alle
derartigen Anti-VEGF-Antikörper
werden zur Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren in Betracht
gezogen. wie in diesen veröffentlichten
PCT-Anmeldungen offenbart ist, wurde gezeigt, dass mehrere der humanisierten
und affinitätsgereinigten
Antikörper
die VEGF-Aktivität
in verschiedenen Arten von In-vitro-Assays verringern oder hemmen
und daher als VEGF-Antagonisten wirken.
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Die
vom Umfang der Erfindung umfassten Antikörper umfassen daher variante
Antikörper,
wie chimäre (einschließlich "humanisierte") Antikörper und
Hybridantikörper,
die Immunglobulinketten mit der Fähigkeit zur Bindung von hVEGF,
hVEGFr oder eines hVEGF-hVEGFr-Komplexes und eines Nicht-hVEGF-Epitops umfassen.
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Die
hier angegebenen Antikörper
umfassen alle Herkunftsarten und Immunglobulinklassen (beispielsweise
IgA, IgD, IgE, IgG und IgM) und -unterklassen sowie Antikörperfragmente
(beispielsweise Fab, F(ab')2 und Fv), sofern sie zur Bindung von hVEGF,
hVEGFr oder eines hVEGF-hVEGFr-Komplexes fähig sind und zur antagonistischen
Wirkung auf eine biologische Aktivität von hVEGF fähig sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung besitzt der Antikörper
eine Affinität
für das
Immunisierungsantigen von mindestens etwa 109 l/mol,
was beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal.
Biochem. 107: 220 (1980) bestimmt wurde. Ferner hemmt der monoklonale
Antikörper
typischerweise die mitogene oder angiogene Aktivität von hVEGF
zu mindestens etwa 50%, vorzugsweise mehr als 80% und noch besser
mehr als 90%, was beispielsweise durch einen In-vitro-Zellüberlebens-
oder Proliferationstest, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Beispiel
2 oder gemäß der Beschreibung
in WO 98/45331 und WO 98/45332, bestimmt wurde.
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Für einige
therapeutische und diagnostische Anwendungen ist es günstig, wenn
der monoklonale Antikörper
gegenüber
weniger als allen unterschiedlichen Molekülformen von hVEGF reaktiv ist.
Beispielsweise kann es günstig
sein, einen monoklonalen Antikörper
zu besitzen, der zur spezifischen Bindung an das hVEGF-Polypeptid
der Sequenz mit 165 Aminosäuren,
jedoch nicht an die hVEGF-Polypeptide der Sequenz mit 121 oder 189
Aminosäuren
fähig ist.
Derartige Antikörper
werden durch Vergleichs-ELISA-Tests oder Vergleichsimmunpräzipitation
der verschiedenen hVEGF-Polypeptide ohne weiteres identifiziert.
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Konjugate
mit cytotoxischen Einheiten
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In
einigen Ausführungsformen
ist es günstig,
eine cytotoxische Einheit mit einem hVEGF-spezifischen monoklonalen
Antikörper
oder mit hVEGFr konjugiert bereitzustellen. In diesen Ausführungsformen
dient das Cytotoxin zur Ausschaltung oder Abtötung von Zellen, die hVEGF
oder dessen Rezeptor exprimieren oder binden. Das Konjugat wird
durch die Domäne,
die zur Bindung an hVEGF, hVEGFr oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex fähig ist,
auf die Zelle zielgerichtet. Daher werden monoklonale Antikörper, die
zur Bindung an hVEGF, hVEGFr oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex fähig sind,
mit Cytotoxinen konjugiert. In ähnlicher
Weise wird hVEGFr mit einem Cytotoxin konjugiert. Während die
monoklonalen Antikörper
optimal allein zur Neutralisation der Aktivität von hVEGF (ohne das Cytotoxin)
fähig sind,
ist es in dieser Ausführungsform
nicht notwendig, dass der monoklonale Antikörper oder Rezeptor zu mehr
als der Bindung an hVEGF, hVEGFr oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex
fähig ist.
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Typischerweise
ist das Cytotoxin ein Proteincytotoxin, beispielsweise Diphterie-,
Ricin- oder Pseudomonastoxin, ob wohl im Falle bestimmter Immunglobulinklassen
die Fc-Domäne
des monoklonalen Antikörpers selbst
der Bereitstellung des Cytotoxins dienen kann (beispielsweise im
Falle von IgG2-Antikörpern, die
zur Fixierung von Komplement und Beteiligung an antikörperabhängiger zellulärer Cytotoxizität (ADCC)
fähig sind).
Jedoch muss das Cytotoxin nicht proteinartig sein und es kann Chemotherapeutika
umfassen, die bisher beispielsweise zur Behandlung von Tumoren verwendet
wurden.
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Das
Cytotoxin wird an einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment desselben
typischerweise durch eine Rückgratamidbindung
innerhalb der (oder anstelle eines Teils der oder der gesamten)
Fc-Domäne des
Antikörpers
gebunden. Wenn die Targetingfunktion durch hVEGFr geliefert wird,
wird die cytotoxische Einheit an einer beliebigen Domäne des Rezeptors,
die an der hVEGF-Bindung nicht teilnimmt, substituiert; vorzugsweise
wird die Einheit anstelle der oder an den Transmembran- und/oder
cytoplasmatischen Domänen des
Rezeptors substituiert. Die optimale Substitutionsstelle wird durch
Routinearbeiten bestimmt und ist dem Fachmann üblicher Erfahrung geläufig.
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Konjugate,
die Proteinfusionen sind, werden in einer rekombinanten Zellkultur
durch Expression eines Gens mit Codierung für das Konjugat ohne weiteres
hergestellt. Alternativ werden die Konjugate durch kovalente Vernetzung
der cytotoxischen Einheit mit einer Aminosäurerestseitenkette oder einem
C-terminalen Carboxyl des Antikörpers
oder des Rezeptors unter Verwendung von als solchen bekannten Verfahren,
beispielsweise Disulfidaustausch oder Verknüpfung durch eine Thioesterbindung
unter Verwendung von beispielsweise Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyramidat,
hergestellt.
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Konjugate mit anderen
Einheiten
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Die
monoklonalen Antikörper
und hVEGFr, die Antagonisten von hVEGF sind, können auch mit Substanzen, die
nicht ohne weiteres als Cytotoxine von sich aus klassifiziert werden
können,
die jedoch die Aktivität
der Zusammensetzungen hier erhöhen,
konjugiert werden. Beispielsweise werden monoklonale Antikörper oder
hVEGFr, die an hVEGF, hVEGFr oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex binden
können,
mit heterologen Polypeptiden, wie Virussequenzen, mit zellulären Rezeptoren,
mit Cytokinen, wie TNF, Interferonen oder Interleukinen, mit Polypeptiden
mit Prokoagulanzaktivität
und mit anderen biologisch oder immunologisch aktiven Polypeptiden
fusioniert. Derartige Fusionen werden durch rekombinante Verfahren
ohne weiteres durchgeführt.
Typischerweise werden derartige Nicht-Immunglobulinpolypeptide für die konstante(n)
Domäne(n)
eines Anti-hVEGF- oder Anti-hVEGF-hVEGFr-Komplex-Antikörpers oder für die Transmembran-
und/oder intrazelluläre
Domäne
eines hVEGFr substituiert. Alternativ werden sie für eine variable
Domäne
einer Antigenbildungsstelle eines hier beschriebenen Anti-hVEGF-Antikörpers substituiert.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
werden derartige Nicht-Immunglobulinpolypeptide
an die konstanten Domänen
eines hier beschriebenen Antikörpers
gebunden oder für
diese substituiert. Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23060–23067 (1991).
Alternativ werden sie für
das Fv eines Antikörpers
hier substituiert, wobei ein chimärer mehrwertiger Antikörper erhalten
wird, der mindestens eine verbleibende Antigenbindungsstelle mit
Spezifität
für hVEGF,
hVEGFr oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex und eine Surrogatantigenbindungsstelle
mit einer gegenüber
der des Ausgangsantikörpers
verschiedenen Funktion oder Spezifität umfasst.
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Heterospezifische Antikörper
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Monoklonale
Antikörper
mit der Fähigkeit
zur Bindung an hVEGF, hVEGFr oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex müssen nur
eine einzige Bindungsstelle für
die aufgezählten
Epitope, typischerweise einen einzigen schwere/leichte Kette-Komplex
oder ein Fragment desselben enthalten. Jedoch tragen derartige Antikörper optional
auch Antigenbindungsdomänen,
die zur Bindung eines Epitops, das sich nicht innerhalb von einem
von hVEGF, hVEGFr oder hVEGF-hVEGFr-Komplex findet, fähig sind.
Beispielsweise erzeugt die Substitution der entsprechenden Aminosäuresequenz
oder Aminosäurereste
eines nativen Anti-hVEGF-, Anti-hVEGFr- oder Anti-hVEGF-hVEGFr-Komplex-Antikörpers durch
die komplementaritätsbestimmenden
und, falls nötig,
Gerüstreste
eines Antikörpers
mit Spezifität
für ein
anderes Antigen als hVEGF, hVEGFr oder hVEGF-hVEGFr-Komplex einen polyspezifischen
Antikörper,
der eine Antigenbindungsstelle mit Spezifität für hVEGF, hVEGFr oder hVEGF-hVEGFr-Komplex
und eine andere Antigenbindungsstelle mit Spezifität für das Nicht-hVEGF-,
-hVEGFr- oder -hVEGF-hVEGFr-Komplex-Antigen
umfasst. Diese Antikörper
sind mindestens zweiwertig, können
jedoch in Abhängigkeit
von der Zahl der Antigenbindungsstellen, die die gewählte Antikörperklasse
besitzt, mehrwertig sein. Beispielsweise sind Antikörper der
IgM-Klasse mehrwertig.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung können
derartige Antikörper
ein hVEGF- oder hVEGFr-Epitop und entweder (a) ein bei der Blutgerinnung
aktives Polypeptid, beispielsweise Protein C oder Gewebefaktor,
(b) ein cytotoxisches Protein, wie Tumornekrosefaktor (TNF), oder
(c) einen nicht-hVEGFr-Zelloberflächenrezeptor, wie den CD4-
oder HER-2-Rezeptor, binden (Maddon et al., Cell 42: 93 (1985); Coussens
et al., Science 230: 1137 (1985)). Heterospezifische mehrwertige
Antikörper
werden günstigerweise durch
Cotransformation einer Wirtszelle mit DNA mit Codierung der schweren
und leichten Ketten beider Antikörper
und anschließende
Gewinnung des Teils exprimierter Antikörper mit den gewünschten
Antigenbindungseigenschaften durch Immunaffinitätschromatographie oder dgl.
hergestellt. Alternativ werden derartige Antikörper durch In-vitro-Rekombination
monospezifischer Antikörper
hergestellt.
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Einwertige
Antikörper
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Einwertige
Antikörper
mit der Fähigkeit
zur Bindung an hVEGFr oder hVEGF-hVEGFr-Komplex sind als Antagonisten
von hVEGF besonders günstig.
Ohne Beschränkung
der Erfindung auf einen speziellen Mechanismus der biologischen
Aktivität
wird angenommen, dass die Aktivierung von zellulären hVEGF-Rezeptoren durch einen Mechanismus erfolgt,
wobei die Bindung von hVEGF an zelluläre hVEGF-Rezeptoren die Aggregation
der Rezeptoren induziert und wiederum intrazelluläre Rezeptorkinaseaktivität aktiviert.
Da einwertige Anti-hVEGF-Rezeptor-Antikörper eine
derartige Aggregation nicht induzieren können und den hVEGF-Rezeptor
durch diesen Mechanismus nicht aktiviere können, sind sie ideale Antagonisten
von hVEGF.
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Es
ist jedoch anzumerken, dass diese Antikörper gegen die hVEGF-Bindungsstelle
des Rezeptors gerichtet sein sollten oder in anderer Weise die hVEGF-Bindung
an dem hVEGF-Rezeptor, beispielsweise durch sterische Hinderung
des Zugangs von hVEGF zum Rezeptor, stören können sollten. Wie hier an anderer
Stelle beschrieben, sind jedoch Anti-hVEGFr-Antikörper, die
die hVEGF-Bindung nicht stören
können,
verwendbar, wenn sie mit Nicht-Immunglobulineinheiten, beispielsweise
Cytotoxinen, konjugiert sind.
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Verfahren
zur Herstellung einwertiger Antikörper sind einschlägig bekannt.
Beispielsweise umfasst ein Verfahren die rekombinante Expression
der leichten Kette und modifizierten schweren Kette eines Immunglobulins.
Die schwere Kette wird allgemein an einem beliebigen Punkt in der
Fc-Region gestutzt, um die Querverbindung der schweren Kette zu
verhindern. Alternativ werden die relevanten Cysteinreste durch
einen anderen Aminosäurerest
substituiert oder deletiert, um eine Querverbindung zu verhindern.
In-vitro-Verfahren sind ebenfalls zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet.
Beispielsweise werden Fab-Fragmente durch enzymatische Spaltung
eines intakten Antikörpers
hergestellt.
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Diagnostische
Verwendungsmöglichkeiten
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Für diagnostische
Anwendungen werden die Antikörper
oder hVEGFr der Erfindung typischerweise mit einer detektierbaren
Einheit markiert. Die detektierbare Einheit kann eine beliebige
sein, die entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal
produzieren kann. Beispielsweise kann die detektierbare Einheit
ein Radioisotop, wie 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende
Verbindung, wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin;
radioaktive Isotopmarkierungen, beispielsweise 125I, 32P, 14C oder 3H, oder ein Enzym, wie alkalische Phosphatase,
beta-Galactosidase oder Merrettichperoxidase, sein.
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Jedes
einschlägig
bekannte Verfahren zur getrennten Konjugation des Antikörpers oder
von hVEGFr mit der detektierbaren Einheit kann verwendet werden,
einschließlich
der Verfahren gemäß der Beschreibung bei
Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry
13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981);
und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982). Die Antikörper und
Rezeptoren der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Assayverfahren,
beispielsweise Assays kompetitiver Bindung, direkte und indirekte
Sandwichassays und Immunpräzipitationsassays,
verwendet werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,
S. 147–158
(CRC Press, Inc., 1987).
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Assays
kompetitiver Bindung beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards
(der hVEGF oder ein immunologisch reaktiver Teil desselben sein
kann), mit dem Testprobenanalyt (hVEGF) um die Bindung mit einer
beschränkten
Antikörpermenge
zu konkurrieren. Die Menge von hVEGF in der Testprobe ist umgekehrt proportional
zur Menge des Standards, die an den Antikörpern oder Rezeptoren gebunden
wird. Zur Erleichterung der Bestimmung der Menge des Standards,
die gebunden wird, werden die Antikörper oder Rezeptoren allgemein
vor oder nach der Konkurrenzreaktion insolubilisiert, so dass der
Standard und Analyt, die an den Antikörpern oder Rezeptoren gebunden
sind, bequem von dem Standard und Analyt, der ungebunden bleibt, abgetrennt
werden kann.
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Sandwichassays
umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern oder Rezeptoren, die
jeweils zur Bindung an einen unterschiedlichen immunogenen Teil
oder ein entsprechendes Epitop des zu detektierenden Proteins fähig sind.
Bei einem Sandwichassay wird der Testprobenanalyt durch einen ersten
Antikörper
oder Rezeptor, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, gebunden
und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch
ein unlöslicher
dreiteiliger Komplex gebildet wird. David & Greene, US-Patent 4 376 110. Der
zweite Antikörper
oder Rezeptor kann selbst mit einer detektierbaren Einheit markiert
sein (direkte Sandwichassays) oder unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der
mit einer detektierbaren Einheit markiert ist, ermittelt werden
(indirekter Sandwichassay). Beispielsweise ist eine Art eines Sandwichassays
ein ELISR- Assay,
wobei in diesem Fall die detektierbare Einheit ein Enzym ist.
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Die
Antikörper
oder der Rezeptor hierbei sind auch zur In-vivo-Bildgebung verwendbar, wobei ein
mit einer detektierbaren Einheit markierter Antikörper oder
hVEGFr einem Patienten, vorzugsweise in den Blutstrom, verabreicht
wird und das Vorhandensein und die Position des markierten Antikörpers oder
Rezeptors in dem Patienten getestet wird. Diese Bildgebungstechnik
ist beispielsweise bei der Bestimmung und Behandlung von Neoplasmen
verwendbar. Der Antikörper
oder hVEGFr wird mit einer beliebigen Einheit, die in einem Säuger, sei
es durch Kernresonanz, Radiologie oder andere einschlägig bekannte
Detektionsmittel, detektierbar ist, markiert.
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Antagonistenvarianten
von hVEGF
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Zusätzlich zu
den hier beschriebenen Antikörpern
umfassen andere verwendbare Antagonisten von hVEGF Fragmente und
Aminosäuresequenzvarianten
von nativem hVEGF, die an den hVEGF-Rezeptor binden, jedoch nicht
die biologische Aktivität
von nativem hVEGF zeigen. Beispielsweise umfassen derartige Antagonisten
Fragmente und Aminosäuresequenzvarianten,
die eine Rezeptorbindungsdomäne
von hVEGF umfassen, denen jedoch eine biologische Aktivität verleihende
Domäne
fehlt oder die in anderer Weise fehlerhaft hinsichtlich der Aktivierung
zellulärer
hVEGF-Rezeptoren sind, beispielsweise im Falle eines Fragments oder einer
Aminosäuresequenzvariante,
die fehlerhaft hinsichtlich von deren Fähigkeit zur Induktion der Aggregation
oder Aktivierung von zellulären
hVEGF-Rezeptoren ist. Der Ausdruck "Rezeptorbindungsdomäne" bezeichnet die Aminosäuresequenzen
in hVEGF, die an der hVEGF-Rezeptorbindung beteiligt sind. Der Ausdruck "Domäne biologischer
Aktivität" oder "biologische Aktivität verleihende
Domäne" bezeichnet eine
Aminosäuresequenz
in hVEGF, die eine spezielle biologische Aktivität des Faktors, beispielsweise
mitogene, angiogene oder Gefäßperpeabilitätsaktivität, verleiht.
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Die
Beobachtung, dass hVEGF scheinbar zur Bildung eines Komplexes mit
zwei oder mehreren hVEGFr-Molekülen
auf der Oberfläche
einer Zelle fähig
ist, legt nahe, dass hVEGF mindestens zwei diskrete Stellen zur
Bindung an hVEGFr aufweist und dass es an derartige zelluläre Rezeptoren
in sequentieller Weise, zunächst
an einer Stelle und dann an der anderen bindet, bevor eine Aktivierung
erfolgt, gemäß einem
Wachstumshormon, Prolactin und dgl. (siehe beispielsweise Cunningham
et al., Science 254: 821 (1991); deVos et al., Science 255: 306
(1992); Fuh et al., Science 256: 1677 (1992)). Entsprechend werden
Antagonistenvarianten von hVEGF gewählt, in denen eine Rezeptorbindungsstelle
von hVEGF (typischerweise die Stelle, die an der ersten Bindung
von hVEGF an hVEGFr beteiligt ist) unmodifiziert bleibt (oder bei
Modifikation zur Verstärkung
der Bindung variert wird), während
eine zweite Rezeptorbindungsstelle von hVEGF typischerweise durch
nichtkonservative Aminosäurerestsubstitution(en)
oder -deletion(en) modifiziert wird, um diese Bindungsstelle dysfunktional
zu machen.
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Rezeptorbindungsdomänen in hVEGF
und hVEGF-Bindungsdomänen
in hVEGFr werden durch einschlägig
bekannte Verfahren bestimmt, die Röntgenuntersuchungen, Mutationsanalysen
und Antikörperbindungsstudien
umfassen. Die Mutationsansätze
umfassen die Techniken von Zufallssättigungsmutagenese gekoppelt
mit der Selektion von Escape-Mutanten und Insertionsmutagenese.
Eine weitere, zur Identifizierung von Rezeptorbindungsdomänen in Liganden
geeignete Strategie ist als Alanin (Ala)-Scanning-Mutagenese bekannt.
Cunningham et al., Science 244, 1081–1985 (1989). Dieses Verfahren
um fasst die Identifizierung von Regionen, die geladene Aminosäureseitenketten
enthalten. Die in jeder Region identifizierten geladenen Reste (d.h.
Arg, Asp, His, Lys und Glu) werden durch Ala ersetzt (eine Region
pro mutiertes Molekül)
und die Rezeptorbindung der erhaltenen Liganden wird getestet, um
die Bedeutung der speziellen Region bei der Rezeptorbindung festzustellen.
Ein weiteres starkes Verfahren zur Lokalisierung von Rezeptorbindungsdomänen gelingt
durch die Verwendung neutralisierender Anti-hVEGF-Antikörper. Kim
et al., Growth Factors 7: 53 (1992). Üblicherweise wird eine Kombination
von diesen und ähnlichen
Verfahren zur Lokalisierung der an der Rezeptorbindung beteiligten
Domänen
verwendet.
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Der
in Bezug auf hVEGF verwendete Ausdruck "Aminosäuresequenzvariante" bezeichnet Polypeptide mit
Aminosäuresequenzen,
die sich in gewissem Maße
von den Aminosäuresequenzen
der nativen Formen von hVEGF unterscheiden. Üblicherweise besitzen Antagonist-Aminosäuresequenzvarianten
mindestens etwa 70% Homologie mit mindestens einer Rezeptorbindungsdomäne eines
nativen hVEGF und vorzugsweise sind sie mindestens etwa 80%, vorzugsweise
mindestens etwa 90% homolog zu einer Rezeptorbindungsdomäne eines
nativen hVEGF. Die Aminosäuresequenzvarianten
besitzen Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen an bestimmten
Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz
von nativem hVEGF derart, dass die Varianten die Fähigkeit
zur Bindung an hVEGF-Rezeptor beibehalten (und dadurch mit nativem
hVEGF zur Bindung an hVEGF-Rezeptor konkurrieren), jedoch eine oder
mehrere der biologischen Wirkungen von hVEGF, wie Endothelzellproliferation,
Angiogenese oder Gefäßpermeabilität, nicht
induzieren können.
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"Homologie" ist als der Prozentsatz
von Resten in der Aminosäuresequenzvariante,
die mit den Resten in der Aminosäu resequenz
einer Rezeptorbindungsdomäne
eines nativen hVEGF nach Alinieren der Sequenzen und Einführung von
Lücken,
falls nötig,
um die maximale prozentuale Homologie zu erreichen identisch sind,
und ohne die Berücksichtigung
konservativer Substitutionen als Teil des Prozentsatzes der Aminosäurehomologie
definiert. Verfahren und Computerprogramme zum Alignment sind einschlägig bekannt.
Ein derartiges Computerprogramm ist "Align 2" des Autors Genentech, Inc., das mit
Nutzerdokumentation im United States Copyright Office, Washington,
DC 20559, am 10. Dezember 1991 eingereicht wurde. Der Fachmann kann
unter Verwendung routinemäßiger Fertigkeiten
passende Parameter zur Ermittlung eines Alignment einschließlich von
Algorithmen, die zum Erreichen eines maximalen Alignment über die
Strecke der Sequenzen, die verglichen werden, bestimmen.
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Substitutionsvarianten
sind solche, bei denen mindestens ein Aminosäurerest in einer nativen Sequenz
entfernt und eine unterschiedliche Aminosäure an dessen Stelle an der
gleichen Position insertiert wurde. Die Substitutionen können einzeln
sein, wobei nur eine Aminosäure
in dem Molekül
substituiert wurde, oder sie können
mehrere sein, wobei zwei oder mehrere Aminosäuren in dem gleichen Molekül substituiert
wurden.
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Insertionsvarianten
sind solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar benachbart
zu einer Aminosäure
an einer speziellen Position in einer nativen Sequenz insertiert
wurden. Unmittelbar benachbart zu einer Aminosäure bedeutet eine Verbindung
mit entweder der funktionalen α-Carboxy- oder α-Aminogruppe
der Aminosäure.
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Deletionsvarianten
sind solche, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste in einer nativen Sequenz
entfernt wurden.
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Üblicherweise
sind bei Deletionsvarianten ein oder zwei Aminosäurereste in einer speziellen
Region des Moleküls
deletiert.
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Fragmente
und Aminosäuresequenzvarianten
von hVEGF werden durch einschlägig
bekannte Verfahren, beispielsweise positionsspezifische Mutagenese
der DNA mit Codierung für
den nativen Faktor, ohne weiteres hergestellt. Die mutierte DNA
wird in einen passenden Expressionsvektor insertiert und Wirtszellen werden
dann mit dem rekombinanten Vektor transfiziert. Die rekombinanten
Wirtszellen werden in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und
das in den Wirtszellen exprimierte gewünschte Fragment oder die gewünschte Aminosäuresequenzvariante
werden dann aus der rekombinanten Zellkultur durch chromatographische
oder andere Reinigungsverfahren gewonnen.
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Alternativ
werden Fragmente und Aminosäurevarianten
von hVEGF in vitro, beispielsweise durch Proteolyse von nativem
hVEGF, oder durch Synthese unter Verwendung von Standard-Festphasenpeptidsyntheseverfahren
gemäß der Beschreibung
bei Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963)) hergestellt,
obwohl andere äquivalente,
einschlägig
bekannte chemische Synthesen verwendet werden können. Eine Festphasensynthese
wird am C-Terminus des Peptids durch Kopplung einer geschützten α-Aminosäure an ein
geeignetes Harz initiiert. Die Aminosäuren werden an die Peptidkette
unter Verwendung von einschlägig
bekannten Techniken zur Bildung von Peptidbindungen gekoppelt.
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Therapeutische
Verwendungen
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Die
hier verwendeten Ausdrücke "behandeln", "Behandlung", "Therapie" und "therapeutisch" bezeichnen eine
kurative Therapie, prophylaktische Therapie und präventive
Therapie.
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Für therapeutische
Anwendungen werden die Antagonisten der Erfindung an einen Säuger, vorzugsweise
einen Menschen, in einer akzeptablen Dosierungsform, die solche
umfasst, die einem Menschen intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche
Infusion über
einen Zeitraum auf intramuskulärem,
intraperitonealem, intrazerebrospinalem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem,
intraduralem, intrathekalen, oralem, topischem oder Inhalationsweg
verabreicht werden können,
verabreicht. Die Antagonisten werden auch in günstiger Weise auf intratumoralem,
peritumoralem, intraläsionalem
oder periläsionalem
Weg zur Ausübung lokaler
sowie systemischer therapeutischer Wirkungen verabreicht. Der intraperitoneale
Weg wird als besonders günstig,
beispielsweise zur Behandlung von Eierstocktumoren, angenommen.
Eine intravenöse
Infusion wird als besonders günstig
zur beispielsweise Behandlung eines zerebralen Ödems angenommen.
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Derartige
Dosierungsformen umfassen Träger,
die inhärent
nichttoxisch und nichttherapeutisch sind. Beispiele für derartige
Träger
umfassen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin,
Serumproteine, wie humanes Serumalbumin, Puffersubstanzen, wie Phosphate,
Glycin, Sorbinsäure,
Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische gesättigter pflanzlicher Fettsäuren, Wasser,
Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat,
Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid,
Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulosebasis
und Polyethylenglykol. Träger
für topische
oder gelbasierte Formen eines Antagonisten umfassen Polysaccharide,
wie Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon,
Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol
und Holzwachsalkohole. Herkömmliche
Depotformen können
in geeigneter Weise verwendet werden. Der artige Formen umfassen
beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposome, Pflaster, Inhalationsformen,
Nasensprays, sublinguale Tabletten und Zubereitungen mit nachhaltiger Freisetzung.
Der Antagonist wird in derartigen Vehikeln typischerweise mit einer
Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
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Geeignete
Beispiele für
Zubereitungen mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable
Matrizes fester hydrophober Polymere, die den Antagonist enthalten,
wobei die Matrizes in der Form von Formteilen, beispielsweise Filmen
oder Mikrokapseln, sind. Beispiele für Matrizes mit nachhaltiger
Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)
gemäß der Beschreibung
von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167 (1981), und Langer,
Chem. Tech., 12: 98–105
(1982), oder Poly(vinylalkohol), Polylactide (US-Patent 3 773 919),
Copolymere von L-Glutaminsäure
und γ-Ethyl-L-glutamat
(Sidman et al., Biopolymers, 22: 547 (1983), nicht-abbaubares Ethylen-vinylacetat
(Langer et al., aaO), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie Lupron
DepotTM (injizierbare Mikrokügelchen,
die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer
und Leuprolidacetat bestehen) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere,
wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen über mehr
als 100 Tage ermöglichen,
setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeiträume frei. Wenn verkapselte
Polypeptidantagonisten im Körper über einen
langen Zeitraum verbleiben, können
sie in Folge des Einwirkens von Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren
oder aggregieren, was zu einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Änderungen
der Immunogenität
führt.
Rationale Stragegien können
zur Stabilisierung in Abhängigkeit vom
beteiligten Mechanismus ersonnen werden. Beispielsweise kann, wenn
entdeckt wurde, dass der Aggregationsmechanismus eine intermolekulare
S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch ist, eine Stabilisierung
durch Modifizierung von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren
Lösungen,
Kontrolle des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung passender Additive
und Entwicklung spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen erreicht
werden.
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hVEGF-Antagonistenzusammensetzungen
mit nachhaltiger Freisetzung umfassen auch in Liposomen gefangene
Antagonistenantikörper
oder hVEGFr. Die Antagonisten enthaltende Liposome werden durch
einschlägig
bekannte Verfahren, beispielsweise gemäß der Beschreibung in Epstein
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); US-Patent 4 485 045,
US-Patent 4 544 545, hergestellt. Üblicherweise sind die Liposomen
der kleine (etwa 200–800 Å) unilamellare
Typ, wobei der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei
der ausgewählte
Anteil für
die optimale HRG-Therapie
eingestellt wird. Liposome mit verstärkter Zirkulationsdauer sind
in US-Patent 5 013 556 offenbart.
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Eine
weitere Verwendung der vorliegenden Erfindung umfasst die Einarbeitung
eines hVEGF-Antagonisten in Formteile. Derartige Teile können beispielsweise
zur Modulation von Endothelzellwachstum und Angiogenese verwendet
werden. Ferner kann eine Tumorinvasion und -metastasierung mit diesen
Teilen moduliert werden.
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Eine
passende und wirksame Dosierung eines Antagonisten hängt von
der Art einer zu behandelnden Erkrankung oder eines zu behandelnden
Zustands, die hier definiert sind, der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung
oder des Zustands, der Tatsache, ob die Antagonisten für präventive
oder therapeutische Zwecke verabreicht werden, einer vorherigen
Therapie, der klinischen Geschichte des Patienten und dem Ansprechen auf
den Antagonisten und dem Urteil des behandelnden Arztes ab. Eine
wirksame Dosierung eines Antagonisten ist typischerweise die Menge
eines Antagonisten, die verabreicht wird, um eine maximale der gewünschten
Hemmung der biologischen Aktivität
von VEGF zu erreichen. Der Antagonist wird dem Patienten günstigerweise
auf einmal oder über
eine Reihe von Behandlungen verabreicht.
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Die
hVEGF-Antagonisten sind bei der Behandlung eines Ödems, das
mit verschiedenen nicht-neoplastischen Erkrankungen und Zuständen in
Verbindung steht, verwendbar. Nicht-neoplastische Zustände, die einer
Behandlung zugänglich
sind, umfassen rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose,
diabetische und andere Retinopathien, retrolentale Fibroplasie,
neovaskuläres
Glaukom, altersbedingte Makuladegeneration, Schilddrüsenhyperplasien
(einschließlich
von Grave-Krankheit),
Kornea- und andere Gewebetransplantation, chronische Entzündung, Lungenentzündung, nephrotisches
Syndrom, Präeklampsie,
Aszites, Perikarderguss (beispielsweise in Verbindung mit Perikarditis)
und Pleuraerguss.
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Altersbedingte
Makuladegeneration (AMD) ist eine führende Ursache von schwerem
Sehverlust in der älteren
Bevölkerung.
Die exsudative Form von AMD ist durch Choroidearevaskularisation
und Retinapigmentepithelzellablösung
gekennzeichnet. Da Choroidearevaskularisation mit einer dramatischen
Verschlechterung der Prognose verbunden ist, wird angenommen, dass
die VEGF-Antagonisten der vorliegenden Erfindung bei der Verringerung
der Schwere von AMD besonders verwendbar sind.
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Hierbei
wird der Ausdruck "Ödem" in einem allgemeinen
Sinn verwendet und er umfasst Zustände im Körper oder in Begleitung eines
Schlaganfalls oder eines Kopftraumas, die durch eine Zunahme des
extravaskulären
Gewebewassergehalts ent weder aufgrund von erhöhtem freiem extrazellulärem Wasser
allein oder in Kombination mit erhöhtem intrazellulärem Wasser
gekennzeichnet sind. Das Ödem
kann in verschiedenen Geweben im Körper vorhanden sein. Insbesondere
wird in Betracht gezogen, dass die hVEGF-Antagonisten zur Behandlung
eines Zentralnervensystem(ZNS)ödems
einschließlich
eines Hirnödems,
das typischerweise durch eine Zunahme des Hirnvolumens gekennzeichnet
ist, sowie eines Rückenmark-
oder Spinalkanalödems oder
anderer Zustände,
die zu erhöhtem
intrakranialem Druck führen
(wie eine lokale Rückenmarkläsion) verwendet
werden können.
Die Zunahme des Hirnvolumens kann beispielsweise das Ergebnis eines
erhöhten
zerebralen Blutvolumens und/oder eines erhöhten Gewebewassergehalts sein.
Der hier verwendete Ausdruck "Ödem" umfasst die pathologischen
Zustände,
die einschlägig
als vasogenes Ödem
und cytotoxisches Ödem bezeichnet
werden. Typischerweise ist der als vasogenes Ödem bezeichnete Zustand dadurch
gekennzeichnet, dass er mit dem Bruch der Blut-Hirn-Schranke (BBB)
verbunden ist, während
ein cytotoxisches Ödem
dadurch gekennzeichnet ist, dass es mit einem intakten BBB verbunden
ist. Hirnödem
wird allgemein in dem Übersichtsartikel
von Hariri, Neurosurgical Intensive Care 5: 687 (1994) beschrieben.
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Ein Ödem bei
einem Säuger
kann von einer Vielzahl pathologischer Zustände oder Stimuli, die, ohne hierauf
beschränkt
zu sein, akute Hypertonie, Meningitis, Enzephalitis, Abszess, Trauma
(wie ein Kopftrauma), Hämorrhagie,
Virusinfektionen, Malaria cerebralis, Schlaganfall, Strahlung, Multiple
Sklerose, einen Zustand nach Herzstillstand, Geburtsasphyxie, Glutamattoxizität, Enzephalopathie,
Hypoxie, Ischämie
und Nierendialyse umfassen, stammen oder diese begleiten.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung eine Therapie unter Verwendung der hVEGF-Antagonisten
zur Behandlung eines Hirnödems,
das ein Hirnödem
in Begleitung eines Schlaganfalls umfasst. Es wird in Betracht gezogen,
dass die hVEGF-Antagonisten
der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Therapien
zur Verringerung oder Hemmung eines derartigen Ödems im Hirn verabreicht werden
können.
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Ferner
ist bei Säugern,
die einen Schlaganfall haben oder erlitten haben, die Entwicklung
oder Bildung eines Hirnödems
ebenfalls häufig.
Der Ausdruck Schlaganfall ist in der vorliegenden Anmeldung in einem
allgemeinen Sinn verwendet und er umfasst die dem erfahrenen Arzt
als ischämischer
Schlaganfall und hämorrhagischer
Schlaganfall bekannten klinischen Zustände. Es ist einschlägig bekannt,
dass ein Schlaganfall bei einem Patienten als verschiedene spezielle
Arten eines Schlaganfalls in Abhängigkeit
von beispielsweise der Ätiologie
oder Pathologie der Unterbrechung der Durchblutung, den betroffenen
Zellarten oder Geweben und dem Vorhandensein einer Blutextravasation
in Gewebe (wie Hirngewebe) gekennzeichnet oder klassifiziert werden
kann. Die verschiedenen Arten eines Schlaganfalls, die klinisch
charakterisiert wurden, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein,
thrombotischen Schlaganfall, embolischen Schlaganfall, hämodynamischen Schlaganfall,
lakunären
Schlaganfall und hämorrhagische
Schlaganfälle,
die von intrazerebraler, subarachnoidaler, intraventrikulärer oder
subduraler Hämorrhagie
abgeleitet sind oder davon herrühren.
Der erfahrene Mediziner erkennt ohne weiteres die Natur derartiger
Schlaganfallzustände
und er versteht diese und kann das Vorhandensein oder die Symptome
derartiger Zustände
bei Patienten detektieren und diagnostizieren. Die vorliegenden
erfindungsgemäßen Verfahren
ziehen in Betracht, dass die hVEGF-Antagonistenmoleküle bei der Behandlung
aller derartigen Schlaganfallzustände, insbesondere zur Verringerung
oder Hemmung eines Ödems
und zum Schutz vor einer Zell- und Gewebeschädigung verwendet werden können. Die
hVEGF-Antagonisten können
als Akutbehandlung nach dem Einsetzen eines Schlaganfalls zur Verringerung
oder Hemmung von beispielsweise einem Hirnödem verabreicht werden, um
dadurch die Erholung des Säugers
von dem Schlaganfall zu verstärken.
Die Verwendung der hVEGF-Antagonisten ist insofern vorteilhaft,
als die Behandlung die Durchführung
einer Operation (wie einer Kraniotomie) an dem Säuger zur Verringerung oder
Linderung von intrakranialem Druck aufgrund einer übermäßigen Wasseransammlung
in Hirngeweben verhindern oder vermeiden kann. Es wird auch in Betracht
gezogen, dass bei einer Verringerung oder Prävention eines derartigen Ödems durch
die hVEGF-Antagonisten eine Verringerung (d.h. Schutzwirkung) der
Menge von Gehirn und neuronalem Gewebe, das durch intrakranialen
Druck und Ödem
typischerweise geschädigt werden
kann, erfolgt.
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In
Abhängigkeit
von der Art und Schwere der Erkrankung oder des Zustands, die behandelt
werden, sind etwa 1 μg/kg
bis 15 mg/kg Antagonist eine Anfangskandidatendosierung zur Verabreichung
an den Patienten, entweder beispielsweise durch eine oder mehrere
getrennte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Eine
typische Tagesdosis kann in Abhängigkeit
von den oben genannten Faktoren im Bereich von etwa 1 μg/kg bis
100 mg/kg oder mehr liegen. Für
wiederholte Verabreichungen über
mehrere Tage oder länger
wird die Behandlung in Abhängigkeit
von dem Zustand wiederholt, bis eine gewünschte Verringerung der Krankheitssymptome
erfolgt. Jedoch können
andere Dosierungsprotokolle günstig
sein. Beispielsweise kann es bei dem Verfahren zur Behandlung eines
Hirnödems
oder Schlaganfalls günstig
sein, den (die) hVEGF-Antagonisten unmittelbar bei der Detektion
oder Diagnose bei dem Patienten innerhalb von mehreren Stunden der
Läsion
oder des Einsetzens eines Schlaganfalls oder innerhalb von 1 bis
4 Tagen danach zu verabreichen. Das gewünschte Verabreichungsprotokoll
hängt typischerweise
vom Urteil des behandelnden Mediziners ab. Der Fortschritt der hVEGF-Antagonistentherapie
wird durch herkömmliche
Techniken und Tests, die beispielsweise radiographische Techniken
(insbesondere Magnetic Resonance Imaging, MRI) für neoplastische Zustände und Ödembildung
in Verbindung mit einem Trauma oder Schlaganfall oder die Überwachung des
intrakranialen Drucks wegen einem Hirnödem umfassen, überwacht.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann die Wirksamkeit des Antagonisten zur Prävention
oder Behandlung eines Zustands oder einer Erkrankung durch eine
serielle Verabreichung des Antagonisten oder eine Verabreichung
in Kombination mit einem weiteren Mittel, das für diese Zwecke wirksam ist,
beispielsweise Tumornekrosefaktor (TNF), einem Antikörper mit
der Fähigkeit
zur Hemmung oder Neutralisation der angiogenen Aktivität von saurem
oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) oder Hepatocytenwachstumsfaktor
(HGF), einem Antikörper
mit der Fähigkeit
zur Hemmung oder Neutralisation der Koagulationsaktivitäten von
Gewebefaktor, Protein C oder Protein S (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichung
WO 91/01753, veröffentlicht
am 21. Februar 1991), einem Antikörper mit der Fähigkeit
zur Bindung an den HER2-Rezeptor (siehe Hudziak et al., PCT-Patentveröffentlichung
WO 98/06692, veröffentlicht
am 27. Juli 1989), oder einem oder mehreren herkömmlichen therapeutischen Mitteln,
beispielsweise Alkylierungsmitteln, Folsäureantagonisten, Antimetaboliten
des Nucleinsäurestoffwechsels,
Antibiotika, Pyrimidinanaloga, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Purinnucleosiden,
Aminen, Aminosäuren,
Triazolnucleosiden oder Corticosteroiden, verbessert werden. Derartige
weitere Mittel können
in der zu verabreichenden Zusammensetzung vorhanden sein oder getrennt
verabreicht werden. Insbesondere bei der Behandlung eines Ödems oder
Schlaganfalls kann der Antagonist seriell oder in Kombination mit
Mitteln, wie antiviralen, antimykotischen oder antiparasitischen Mitteln,
Antibiotika, Thrombolytika (wie t-PA), osmotischen Therapeutika
(beispielsweise Mannit) oder Steroiden (wie Decadron oder Prednison),
verabreicht werden. Die Verwendung derartiger Mittel in Kombination
mit dem Antagonisten ist dem praktizierenden Arzt üblicher
Erfahrung geläufig
und natürlich
hängt die
Wahl derartiger Mittel beispielsweise von der behandelten Erkrankung
oder dem behandelten Zustand ab.
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Ferner
wird in Betracht gezogen, dass der hVEGF-Antagonist seriell mit
hVEGF, insbesondere bei der Behandlung eines Schlaganfalls, verabreicht
werden kann. Bei der Diagnose oder Detektion eines Schlaganfalls
kann der hVEGF-Antagonist unmittelbar oder innerhalb von etwa 1
bis 4 Tagen nach dem Einsetzen des Schlaganfalls verabreicht werden.
Es wird angenommen, dass es nach der Beendigung der Verabreichung
des Antagonisten zur Verringerung oder Hemmung einer Ödembildung
vorteilhaft sein kann, dem Patienten eine Menge von hVEGF zu verabreichen,
die ausreichend ist, um die Revaskularisation zu stimulieren oder
zu fördern.
Vorzugsweise ist der hVEGF eine rekombinante Form von hVEGF und
er wird in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht.
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Andere Verwendungsmöglichkeiten
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Die
Anti-hVEGF-Antikörper
der Erfindung sind auch als Affinitätsreinigungsmittel verwendbar.
Bei diesem Verfahren werden die Antikörper gegen hVEGF auf einem
geeigneten Träger,
beispielsweise einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Verwendung
einschlägig
bekannter Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird
dann mit einer Probe, die den zu reinigenden hVEGF enthält, in Kontakt gebracht
und danach wird der Träger
mit einem geeigneten Lösemittel
gewaschen, das im wesentlichen das gesamte Material in der Probe
mit Ausnahme des hVEGF, das an den immobilisierten Antikörper gebunden
ist, entfernt. Schließlich
wird der Träger
mit einem weiteren geeigneten Lösemittel,
wie Glycinpuffer, pH-Wert 5,0, das den hVEGF von dem Antikörper freisetzt,
gewaschen.
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Die
folgenden Beispiele werden nur zur Erläuterung angeboten und sollen
die Erfindung in keinster Weise beschränken.
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BEISPIELE
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Im
Handel erhältliche
Reagentien, die in den Beispielen angegeben wurden, wurden nach
den Vorschriften des Herstellungs, falls nicht anders angegeben,
verwendet. Die Quelle der Zellen, die in den folgenden Beispielen
und durchgängig
in der Beschreibung durch ATCC-Hinterlegungsnummern identifiziert
sind, ist die American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.
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BEISPIEL 1
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Herstellung von Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpern
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Zur
Gewinnung von mit Schlüssellochnacktschnecken-Hämocyanin
(KLH) konjugiertem hVEGF zur Immunisierung wurde rekombinanter hVEGF
(165 Aminosäuren),
Leung et al., Science 246: 1306 (1989), mit KLH mit einem Verhältnis von
4:1 in Gegenwart von 0,05% Glutaraldehyd gemischt und das Gemisch
3 h unter leichtem Rühren
bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde dann gegen phosphpatgepufferte
Kochsalzlösung
(PBS) bei 4°C über Nacht
dialysiert.
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Balb/c-Mäuse wurden
alle zwei Wochen viermal durch intraperitoneale Injektionen mit
mit 20 μg
KLH konjugierten 5 μg hVEGF
immunisiert und mit der gleichen Dosis hVEGF, der mit KLH konjugiert
war, vier Tage vor der Zellfusion zur Verstärkung immunisiert.
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Milzzellen
der immunisierten Mäuse
wurden mit P3X63Ag8U.1-Myelomzellen,
Yelton et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81: 1 (1978) unter
Verwendung von 35% Polyethylenglykol (PEG) gemäß der Beschreibung von Yarmush
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2899 (1980) fusioniert. Hybridome
wurden in HAT-Medium selektiert.
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Überstände von
Hybridomzellkulturen wurden auf Anti-hVEGF-Antikörperproduktion durch einen
ELISA-Assay unter Verwendung von mit hVEGF beschichteten Mikrotiterplatten
gescreent. Antikörper,
der in jeder der Vertiefungen an hVEGF gebunden war, wurde unter
Verwendung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulin
und dem chromogenen Substrat p-Nitrophenylphosphat bestimmt. Harlow & Lane, Antibodies:
A Laboratory Manual, S. 597 (Gold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Hybridomzellen, von denen auf diese Weise bestimmt wurde, dass sie
Anti-hVEGF-Antikörper produzieren,
wurden durch Grenzverdünnung
subkloniert und zwei dieser Klone mit der Bezeichnung A4.6.1 und
B2.6.2 wurden für
weitere Untersuchungen gewählt.
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BEISPIEL 2
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Charakterisierung von
Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpern
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A. Antigenspezifität
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Die
Bindungsspezifitäten
der durch die Hybridome A4.6.1 und B2.6.2 produzierten Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper wurden
durch ELISA bestimmt. Die monoklonalen Antikörper wurden zu den Vertiefungen von
Mikrotiterplatten, die zuvor mit hVEGF, FGF, HGF oder epidermalem
Wachstumsfaktor (EGF) beschichtet worden waren, gegeben. Gebundener
Antikörper
wurde mit mit Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulinen detektiert.
Die Ergebnisse dieser Assays zeigten, dass die durch die A4.6.1-
und B2.6.2-Hybridome produzierten monoklonalen Antikörper an
hVEGF, jedoch nicht detektierbar an die anderen Proteinwachstumsfaktoren
binden.
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B. Epitopkartierung
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Ein
ELISA kompetitiver Bindung wurde verwendet, um zu bestimmen, ob
die durch die A4.6.1- und B2.6.2-Hybridome produzierten monoklonalen
Antikörper
an die gleichen oder verschiedene Epitope (Stellen) innerhalb von
hVEGF binden. Kim et al., Infect. Immun. 57: 944 (1989). Individuelle
unmarkierten Anti-hVEGF-monoklonale-Antikörper (A4.6.1 oder B2.6.2) oder
irrelevanter Anti-HGF-Antikörper
(IgG1-Isotyp) wurden zu den Vertiefungen von Mikrotiterplatten,
die zuvor mit hVEGF beschichtet wurden, gegeben. Biotinylierte Anti-hVEGF-monoklonale-Antikörper (BIO-A4.6.1
oder BIO-B2.6.2) wurden dann zugegeben. Das Verhältnis von biotinyliertem Antikörper zu
unmarkiertem Antikörper
betrug 1:1000. Die Bindung der biotinylierten Antikörper wurde
durch Zugabe von mit Avidin konjugierter Peroxidase und anschließend o-Phenylendiamindihydrochlorid
und Wasserstoffperoxid sichtbar gemacht. Die Farbreaktion, die die
Menge von gebundenem biotinyliertem Antikörper anzeigte, wurde durch
Messung der optischen Dichte (O.D) bei einer Wellenlänge von
495 nm bestimmt.
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Wie
in 1 gezeigt ist, wurde in jedem Fall
die Bindung des biotinylierten Anti-hVEGF-Antikörpers durch den entsprechenden
unmarkierten Antikörper,
jedoch nicht durch den anderen unmarkierten Anti-hVEGF-Antikörper oder
den Anti-HGF-Antikörper gehemmt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch die A4.6.1- und B2.6.2-Hybridome
produzierten monoklonalen Antikörper
an verschiedene Epitope innerhalb von hVEGF binden.
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C. Isotypbestimmung
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Die
Isotypen der durch die A4.6.1- und B2.6.2-Hybridome produzierten
Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper
wurden durch ELISA bestimmt. Proben von Kulturmedium (Überstand),
in denen die einzelnen Hybridome wuchsen, wurden zu den Vertiefungen
von Mikrotiterplatten, die zuvor mit hVEGF beschichtet wurden, gegeben.
Die eingefangenen Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper wurden
mit verschiedenen isotypspezifischen, mit alkalischer Phosphatase
knojugierten Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulinen
inkubiert und die Bindung der konjugierten Antikörper an die Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper wurde
durch die Zugabe von p-Nitrophenylphosphat bestimmt. Die Farbreaktion
wurde bei 405 nm mit einer ELISA-Plattenlesevorrichtung ermittelt.
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Durch
dieses Verfahren wurde der Isotyp der durch sowohl das A4.6.1- als
auch B2.6.2-Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper als
IgG1 bestimmt.
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D. Bindungsaffinität
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Die
Affinitäten
der durch die A4.6.1- und B2.6.2-Hybridome produzierten Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper für hVEGF
wurden durch Assays kompetitiver Bindung bestimmt. Eine vorbestimmte
suboptimale Konzentration eines monoklonalen Antikörpers wurde
zu Proben gegeben, die 20 000–40
000 cpm 125I-hVEGF (1–2 ng) und verschiedene bekannte
Mengen von nichtmarkiertem hVEGF (1–1000 ng) enthielten. Nach
1 h bei Raumtemperatur wurden 100 μl von Ziegen-Anti-Maus-Ig-Antiserum
(Pel-Freez, Rogers, AR, USA) zugegeben, und die Gemi sche wurden
eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Komplexe aus Antikörper und
gebundenem Protein (Immunkomplexe) wurden durch Zugabe von 500 μl von 6%
Polyethylenglykol (PEG, Molekulargewicht 8000) bei 4°C ausgefällt, worauf
eine Zentrifugation mit 2000 × G
während
20 min bei 4°C
folgte. Die Menge von an dem Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper gebundenem 125I-hVEGF in jeder Probe wurde durch Zählen des
pelletisierten Materials in einem Gammazähler bestimmt.
-
Affinitätskonstanten
wurden aus den Daten durch Scatchard-Analyse berechnet. Die Affinität des durch
das A4.6.1-Hybridom
produzierten Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpers wurde als 1,2 × 109 l/mol berechnet. Die Affinität des durch
das B2.6.2-Hybridom produzierten Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpers wurde
als 2,5 × 109 l/mol berechnet.
-
E. Hemmung der mitogenen
Aktivität
von hVEGF
-
Rindernebennierenrindenkapillarendothel(ACE)zellen,
Ferrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5773 (1987), wurden mit
einer Dichte von 104 Zellen/ml in 12-Mehrfachvertiefungen-Platten ausgesät und 2,5
ng/ml hVEGF wurde zu jeder Vertiefung in Gegenwart oder Abwesenheit
verschiedener Konzentrationen der durch die A4.6.1- oder B2.6.2-Hybridome
produzierten Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper oder eines irrelevanten
Anti-HGF-monoklonalen-Antikörpers
gegeben. Nach Kultivieren während
5 Tagen wurden die Zellen in jeder Vertiefung in einem Coulter Counter
gezählt.
Als Kontrolle wurden ACE-Zellen in Abwesenheit von zugesetztem hVEGF
kultiviert.
-
Wie
in 2 gezeigt ist, zeigten die beiden Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper die
Fähigkeit
des zugesetzten hVEGF, das Wachstum oder Überleben der Rinder-ACE-Zellen
zu unterstützen.
Der durch das A4.6.1-Hybridom produzierte monoklonale Antikörper hemmte
die mitogene Aktivität
von hVEGF vollständig (mehr
als etwa 90% Hemmung), während
der durch das B2.6.2-Hybridom produzierte monoklonale Antikörper die
mitogene Aktivität
von hVEGF nur partiell hemmte.
-
F. Hemmung der hVEGF-Bindung
-
Rinder-ACE-Zellen
wurden mit einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen/0,5
ml/Vertiefung in 24-Vertiefungen-Mikrotiterplatten in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM),
das 10% Kälberserum,
2 mM Glutamin und 1 ng/ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor
enthielt, ausgesät.
Nach dem Kultivieren über
Nacht wurden die Zellen einmal in Bindungspuffer (gleiche Volumina
von DMEM und F12-Medium + 25 mM HEPES und 1% Rinderserumalbumin)
bei 4°C
gewaschen.
-
12
000 cpm 125I-hVEGF (etwa 5 × 104 cpm/ng/ml) wurden 30 min mit 5 μg des durch
A4.6.1-, B2.6.2- oder A2.6.1-Hybridom produzierten Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörpers vorinkubiert
(250 μl
Gesamtvolumen), und danach wurden die Gemische zu den Rinder-ACE-Zellen
in den Mikrotiterplatten gegeben. Nach Inkubation der Zellen während 3
h bei 4°C
wurden die Zellen dreimal mit Bindungspuffer bei 4°C gewaschen, durch
Zugabe von 0,5 ml 0,2 N NaOH solubilisiert und in einem Gammazähler gezählt.
-
Wie
in 3 (oberer Teil) gezeigt ist, hemmten
die durch die A4.6.1- und B2.6.2-Hybridome produzierten Anti-hVEGF-monoklonalen-Antikörper die
Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen. Im Gegensatz dazu hatte
der durch das A2.6.1-Hybridom produzierte Anti-hVEGF-monoklonale-Antikörper keine
offensichtliche Wirkung auf die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen.
Konsistent mit den in dem oben beschriebenen Zellproliferationsassay
erhaltenen Ergebnis sen hemmte der durch das A4.6.1-Hybridom produzierte monoklonale
Antikörper
die Bindung von hVEGF in einem größeren Ausmaß als der durch das B2.6.2-Hybridom
produzierte monoklonale Antikörper.
-
Wie
in 3 (unterer Teil) gezeigt ist, hemmte
der durch das A4.6.1-Hybridom produzierte monoklonale Antikörper die
Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen mit einem 1:250-Molverhältnis von
hVEGF zu Antikörper.
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G. Kreuzreaktivität mit anderen
VEGF-Isoformen
-
Um
zu bestimmen, ob der durch das A4.6.1-Hybridom produzierte Anti-hVEGF-monoklonale-Antikörper mit
den Formen von hVEGF mit 121 und 189 Aminosäuren reaktiv ist, wurde der
Antikörper
auf dessen Fähigkeit
zur Immunpräzipitation
dieser Polypeptide getestet.
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Humane
293-Zellen wurden mit Vektoren transfiziert, die die Nucleotidcodierungssequenz
der hVEGF-Polypeptide mit 121 und 189 Aminosäuren gemäß der Beschreibung, Leung et
al., Science 246: 1306 (1989), umfassten. Zwei Tage nach der Transfektion
wurden die Zellen in Medium übertragen,
dem Cystein und Methionin fehlte. Die Zellen wurden 30 min in diesem
Medium inkubiert und dann wurden 100 μCi/ml von jeweils 35S-Methionin
und 35S-Cystein zu dem Medium gegeben und
die Zellen weitere 2 h inkubiert. Die Markierung wurde durch Übertragung
der Zellen in serumfreies Medium und Inkubation während 3
h vertrieben. Die Zellkulturmedien wurden gewonnen und die Zellen
wurden durch Inkubation während
30 min in Lysepuffer (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1%
Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris, pH-Wert 8,0) lysiert. Zellreste wurden
von den Lysaten durch Zentrifugation mit 200 × G während 30 min entfernt.
-
500-μl-Proben
von Zellkulturmedien und Zelllysaten wurden mit 2 μl von A4.6.1-Hybridom-Antikörper (2,4
mg/ml) 1 h bei 4°C
inkubiert und dann mit 5 μl
Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulin
1 h bei 4°C
inkubiert. Immunkomplexe von 35S-markiertem hVEGF
und Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper wurden mit Protein-A-Sepharose
(Pharmacia) gefällt
und dann SDS – 12%
Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen
unterzogen. Das Gel wurde auf einen Röntgenfilm zur Analyse der immunpräzipitierten
radioaktiv markierten Proteine durch Autoradiographie einwirken
gelassen.
-
Die
Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass der durch das A4.6.1-Hybridom
produzierte Anti-hVEGF-monoklonale-Antikörper eine Kreuzreaktion mit
der Form von hVEGF sowohl mit 121 Aminosäuren als auch mit 189 Aminosäuren einging.
-
BEISPIEL 3
-
Herstellung von VEGF-Rezeptor/IgG-Fusionsproteinen
-
A.
-
Die
Nucleotid- und Aminosäurecodierungssequenzen
des flt-hVEGF-Rezeptors
sind in Shibuyat et al., Oncogene 5: 519–524 (1990) offenbart. Die
codierende Sequenz der gesamten extrazellulären Domäne des flt-hVEGF-Rezeptors
wurde mit der codierenden Sequenz der schweren Kette von humanem
IgG1 in einem zweistufigen Verfahren fusioniert.
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Positionsspezifische
Mutagenese wurde zur Einführung
einer BstBI-Restriktion in DNA mit Codierung für flt an einer Stelle 5' zu dem Codon für die Aminosäure 759
von flt und zur Umwandlung der singulären BstEII-Restriktionsstelle
in dem Plasmid pBSSK– FC, Bennett et al.,
J. Biol. Chem. 266: 23060–23067
(1991), in eine BstBI-Stelle verwendet. Das modifizierte Plasmid
wurde mit EcoRI und BstBI verdaut und das gebildete große Fragment
von Plasmid-DNA wurde mit einem EcoRI-BstBI-Fragment der flt-DNA
mit Codierung für
die extrazelluläre
Domäne
(Aminosäuren
1–758)
des flt-hVEGF-Rezeptors
zusammenligiert.
-
Das
gebildete Konstrukt wurde mit ClaI und NotI verdaut, wobei ein Fragment
von etwa 3,3 kb erzeugt wurde, das dann in die multiple Klonierungsstelle
des Säugerexpressionsvektors
pHEBO2 (Leung et al., Neuron 8: 1045 (1992)) durch Ligation insertiert
wird. Die Enden des 3,3-kb-Fragments werden beispielsweise durch
Addition von Linkern modifiziert, um die Insertion des Fragments
in den Vektor in der richtigen Orientierung zur Expression zu erhalten.
-
Säugerwirtszellen
(beispielsweise CEN4-Zellen (Leung et al., aaO)) werden mit dem
pHEBO2-Plasmid, das das flt-Insert enthält, durch Elektroporation transfiziert.
Transfizierte Zellen werden in Medium, das etwa 10% fetales Rinderserum,
2 mM Glutamin und Antibiotika enthält, kultiviert und bei etwa
75% Konfluenz in serumfreies Medium übertragen. Das Medium wird
3–4 Tage
vor der Gewinnung konditioniert, und das flt-IgG-Fusionsprotein
wird aus dem konditionierten Medium durch Chromatographie auf einer
Protein-A-Affinitätsmatrix
im wesentlichen gemäß der Beschreibung
bei Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23060–23067 (1991) gereinigt.
-
B.
-
Humane
flt-IgG (als hflt(1-3)-IgG bezeichnet)-cDNA wurde gemäß der Beschreibung
bei Davis-Smyth et al., EMBO J. 15: 4919–4927 (1996) konstruiert. Diese
gestutzte Rezeptorform umfasste nur die ersten drei immunglobulinähnlichen
Domänen
von humanem flt an ein Fc-IgG fusioniert. Siehe Ferrara et al.,
Nature Medicine 4: 336 (1998).
-
Ein
murines flt-IgG (als mflt(1-3)-IgG bezeichnet) wurde durch PCR-Amplifikation
von Maus-cDNA eines 17 Tage alten Embryos (Clontech, Palo Alto,
CA) unter Verwendung von Primern gemäß der Beschreibung bei Ferrara
et al., aaO, konstruiert. Die Gestaltung des 3'-PCR-Primers stellte sicher, dass die
Expression des mflt-1(1-3) in Frame mit einem murinen IgG2b-Fc-Klon
war. Das gebildete 1-kb-Fragment wurde zunächst in einen TA-Klonierungsvektor
(Invitrogen, San Diego, CA) als ClaI-BstEII-Fragment kloniert. Dieses
Fragment wurde an das 5'-Ende
von murinem IgG2b-Fc in einem pRK-Vektor ligiert. Dieses Plasmid
ermöglichte
die Expression eines mflt(1-3)-IgG-Fusionsproteins bei Transfektion
in Säugerzellen.
-
Zur
Expression in CHO-Zellen wurden die cDNAs in einen dicistronischen
Vektor, der die Expression des Markers Dihydrofolatreduktase mit
der Expression des von flt abgeleiteten Fusionsproteins verknüpft, subkloniert.
Siehe Lucas et al., Nucleic Acid Res. 24: 1774–1779 (1996). Plasmide wurden
in DP12-Zellen, ein Derivat der CHO-K1DUXB11-Zelllinie, die von
L. Chasin (Columbia University, New York) entwickelt wurde, durch
Lipofektion eingeführt
und auf Wachstum in Glycin-Hypoxanthin-Thymidin (G-H-T)-freiem Medium
selektiert. Chisholm et al., DNA Cloning 4: A Practical Approach,
Mammalian Systems (Hrsg. Glover & Hames) S.
1–39 (Oxford
Press, 1995). Klone der ersten Selektionsrunde wurden anschließend mit
zunehmenden Konzentrationen von Methotrexat ausplattiert. Die Klone
wurden dann auf die Produktion von humanem oder murinem Fc durch
ELISA gescreent. Klone, die die höchste Produktion zeigten, wurden
zur Suspensionskultur angepasst, und serumfreie Kulturen wurden
geerntet und durch Protein-A-Sepharose gereinigt. Proteinkonzentrationen
wurden durch Aminosäureanalyse
bestimmt. Der Endotoxingehalt des gereinigten Endmaterials überstieg 0,5
eu/mg nicht.
-
Gemäß der Beschreibung
bei Ferrara et al., aaO, waren sowohl das murine flt(1-3)-IgG-Fusionsprotein als
auch das humane flt(1-3)-IgG-Fusionsprotein hinsichtlich der Hemmung
der Bioaktivität
von VEGF in dem getesteten Nagetiermodell aktiv.
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BEISPIEL 4
-
Hemmung des
Tumorwachstums mit hVEGF-Antagonisten
-
Verschiedene
in Kultur wachsende humane Tumorzelllinien wurden auf die Produktion
von hVEGF durch ELISA getestet. Es wurde ermittelt, dass Eierstock-,
Lungen-, Kolon-, Magen-, Brust- und Hirntumorzelllinien hVEGF produzierten.
Drei Zelllinien, die hVEGF produzierten, NEG 55 (auch als G55 bezeichnet)
(humane Gliomzelllinie, von Dr. M. Westphal, Department of Neurosurgery,
University Hospital Eppendor, Hamburg, Deutschland, erhalten, auch
als G55 bezeichnet), A-673 (humane Rhabdomyosarcomzelllinie, von
der American Type Culture Collection (ATCC) als Zelllinie Nummer
CRL 1598 erhalten) und SK-LMS-1 (Leiomyosarcomzelllinie, von der
ATCC als Zelllinie Nummer HTB 88 erhalten), wurden für weitere
Untersuchungen verwendet.
-
Sechs
bis zehn Wochen alte weibliche Beige/nackte Mäuse (Charles River Laboratory,
Wilmington, Massachusetts, USA) erhielten subkutan 1–5 × 106 Tumorzellen in 100–200 μl PBS injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten
nach der Feststellung von Tumorwachstum erhielten die Mäuse intraperitoneal
einmal oder zweimal pro Woche verschiedene Dosen von A4.6.1-Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper, einem
irrelevanten Anti-gp120-monoklonalen-Antikörper (5B6) oder PBS injiziert.
Die Tumorgröße wurde
jede Woche gemessen und am Ende der Untersuchung wurden die Tumore
herausgeschnitten und gewogen.
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Die
Wirkung verschiedener Mengen von A4.6.1-Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper auf
das Wachstum von NEG-55-Tumoren in Mäusen ist in 4 und 5 gezeigt. 4 zeigt,
dass Mäuse,
die mit 25 μg
oder 100 μg
von A4.6.1-Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper ab eine Woche nach der
Inokulation von NEG-55-Zellen behandelt wurden, im Vergleich zu
Mäusen,
die mit entweder irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden,
eine wesentlich verringerte Rate des Tumorwachstums aufwiesen. 5 zeigt,
dass fünf
Wochen nach der Inokulation der NEG-55-Zellen die Größe der Tumore
in mit A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper
behandelten Mäusen
etwa 50% (im Falle von mit 25-μg-Dosierungen
des Antikörpers
behandelten Mäusen)
bis 85% (im Falle von mit 100-μg-Dosierungen
des Antikörpers
behandelten Mäusen)
geringer als die Größe von Tumoren
in mit irrelevantem Antikörper
oder PBS behandelten Mäusen
war.
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Die
Wirkung einer Behandlung mit A4.6.1-Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper auf
das Wachstum von SK-LMS-1-Tumoren bei Mäusen ist in 6 gezeigt.
Fünf Wochen
nach der Inokulation der SK-LMS-1-Zellen war die durchschnittliche
Größe von Tumoren
in mit dem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelten Mäusen etwa
75% geringer als die Größe von Tumoren
in mit irrelevantem Antikörper
oder PBS behandelten Mäusen.
-
Die
Wirkung einer Behandlung mit A4.6.1-Anti-hVEGF-monoklonalem-Antikörper auf
das Wachstum von A673-Tumoren bei Mäusen ist in 7 gezeigt.
Vier Wochen nach der Inokulation der A673-Zellen war die durchschnittliche
Größe von Tumoren
bei mit A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper
behandelten Mäusen
etwa 60% (im Falle von mit 10-μg-Dosierungen
des Antikörpers
behandelten Mäusen)
bis mehr als 90% (im Falle von mit 50–400-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelten Mäusen) geringer
als die Größe von Tumoren in
mit irrelevantem Antikörper
oder PBS behandelten Mäusen.
-
BEISPIEL 5
-
Analyse der
direkten Wirkung von Anti-hVEGF-Antikörper auf in Kultur wachsende
Tumorzellen
-
Humane
Glioblastomzellen NEG55 oder Rhabdomyosarcomzellen A673 wurden mit
einer Dichte von 7 × 103 Zellen/Vertiefung in Mehrfachvertiefungenplatten
(12 Vertiefungen/Platte) in F12/DMEM-Medium, das 10% fetales Kälberserum,
2 mM Glutamin und Antibiotika enthielt, ausgesät. A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper wurde
dann zu den Zellkulturen bis zu einer Endkonzentration von 0–20,0 μg Antikörper/ml
gegeben. Nach fünf Tagen
wurden die in den Vertiefungen wachsenden Zellen durch Einwirken
von Trypsin dissoziiert und in einem Coulter Counter gezählt.
-
8 und 9 zeigen
die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Wie offensichtlich ist, hatte
der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper
keine signifikante Wirkung auf das Wachstum der NEG55- oder A673-Zellen
in Kultur. Diese Ergebnisse zeigen, dass der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper nicht
cytotoxisch ist, und sie legen stark nahe, dass die beobachteten
Antitumorwirkungen des Antikörpers
auf dessen Hemmung einer VEGF-vermittelten Revaskularisation beruhen.
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BEISPIEL 6
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Wirkung von
Anti-hVEGF-Antikörper
auf Endothelzellenchemotaxis
-
Chemotaxis
von Endothelzellen und anderen Zellen einschließlich von Monocyten und Lymphocyten spielt
eine wichtige Rolle in der Pathogenese von rheumatoider Arthritis.
Endothelzellenmigration und -proliferation begleiten die Angiogenese,
die im rheumatoiden Synovium erfolgt. Vaskularisiertes Gewebe (Pannus) dringt
in den Gelenkknorpel ein und zerstört diesen.
-
Um
zu bestimmen, ob hVEGF-Antagonisten in diesen Prozess eingreifen,
testeten wir die Wirkung des A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpers auf die durch Synovia
von Patienten mit rheumatoider Arthritis stimulierte Endothelzellenchemotaxis.
Als Kontrolle testeten wir auch die Wirkung des A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpers auf die
durch Synovia von Patienten mit Osteoarthritis stimulierte Endothelzellenchemotaxis
(die Angiogenese, die bei rheumatoider Arthritis auftritt, tritt
bei Osteoarthritis nicht auf).
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Die
Endothelzellenchemotaxis wurde unter Verwendung von modifizierten
Boyden-Kammern gemäß etablierter
Verfahren getestet. Thompson et al., Cancer Res. 51: 2670 (1991);
Phillips et al., Proc. Exp. Biol. Med. 197: 458 (1991). Etwa 104 humane Nabelschnurvenenendothelzellen wurden
an gelatinebeschichteten Filtern (Porengröße 0,8 μm) in 48-Vertiefungen-Mehrfachvertiefungenmikrokammern
in Kulturmedium, das 0,1% fetales Rinderserum enthielt, anheften
gelassen. Nach etwa 2 h wurden die Kammern invertiert und Testproben
(Synovia von rheumatoider Arthritis, Synovia von Osteoarthritis,
basischer FGF (bFGF) (bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml) oder
PBS) und A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper (bis
zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml)
wurden zu den Vertiefungen gegeben. Nach 2 bis 4 h wurden Zellen,
die migriert waren, angefärbt
und gezählt.
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10 zeigt
die gemittelten Ergebnisse dieser Untersuchungen. Die in der Spalte
mit der Bezeichnung "Synovia" und am Ende der
Seite für
die Kontrollen angegebenen Werte sind die durchschnittliche Zahl von
Endothelzellen, die in Gegenwart von Synovia, bFGF oder PBS allein
migrierten. Die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung "Synovia + mAB VEGF" sind die durchschnittliche
Zahl von Endothelzellen, die in Gegenwart von Synovia plus zugesetztem
A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper migrierten.
Die Werte in der Spalte mit der Bezeichnung "% Unterdrückung" geben die prozentuale Verringerung
der Synovia-induzierten Endothelzellenmigration aufgrund der Zugabe
von Anti-hVEGF-Antikörper
an. Wie angegeben, hemmte der Anti-hVEGF-Antikörper die Fähigkeit zur Induktion von Endothelzellenmigration
von Synovia von rheumatoider Arthritis (53,40 durchschnittliche
prozentuale Hemmung), jedoch nicht von Synovia von Osteoarthritis
(13,64 durchschnittliche prozentuale Hemmung).
-
BEISPIEL 7
-
Wirkung eines
VEGF-Antagonisten auf ein Hirnödem
-
Ein
In-vivo-Assay wurde durchgeführt,
um die Wirkungen eines flt-IgG-Antagonisten auf ein Hirnödem zu bestimmen.
Der Verlust der BBB-Integrität
und die Bildung eines Hirnödems
erfolgen häufig
bei der Pathogenese eines zerebralen Infarkts. Es wird angenommen,
dass der Abbau der BBB bei einem ischämischen Schlaganfall überwiegend
nach den ersten 24 h des Einsetzens eines Schlaganfalls erfolgt.
Ferner wird angenommen, dass die vorteilhaften Wirkungen einer prompten
und adäquaten
Wiederherstellung der Durchblutung nach einem akuten ischämischen
Ereignis durch eine Reperfusionsläsion des zerebralen Mikrogefäßsystems,
das die BBB umfasst, unterminiert werden können, was zur Bildung eines
Hirnödems
beiträgt.
Klatzo et al., Hrsg., Brain Edema, Tokio, Springer (1984), S. 1–5. Der
im folgenden beschriebene In-vivo-Assay wurde gestaltet, um diese
Aspekte des klinischen Zustands zu reflektieren.
-
Eine
fokale kortikale Ischämie
wurde in Maushirn durch Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA)
unter Verwendung der zuvor von Chen et al., Stroke 17: 738–743 (1986)
beschriebenen Techniken induziert. Die Mäuse (C57BL-6J, 18–25 g) wurden
mit 1,5% Isofluran in Sauerstoff anästhesiert. Die rechte MCA wurde durch
eine Kraniotomie freigelegt und mit 11-0-Nahtmaterial ligiert. Die
ipsilaterale Carotis communis wurde ebenfalls für die ischämische Periode verschlossen.
Die Gefäße blieben
45 min verschlossen. Vor der Chirurgie wurden die Tiere willkürlich in
zwei Gruppen geteilt und entweder murines flt-IgG (gemäß der Beschreibung im
obigen Beispiel 3B, ebenfalls bei Ferrara et al., Nature Medicine
4: 336 (1998) beschrieben) oder ein irrelevanter muriner Kontrollantikörper Anti-GP120,
der zu dem gleichen Isotyp wie das Fc in dem flt-IgG gehörte [Ferrara
et al., aaO], wurde intraperitoneal mit einer Dosis von 10 mg/kg
12 h vor der Chirurgie, zum Zeitpunkt der Reperfusion und erneut
1 und 2 Tage nach der Chirurgie verabreicht. Der Grad der Ödembildung
wurde durch T2-gewichtete MR-Bildgebung 24 h nach dem Einsetzen
von Ischämie
festgestellt. Die tatsächliche
Größe des Infarkts
wurde 8–12
Wochen später
unter Verwendung von hochauflösender
anatomischer MRI festgestellt. Ein Teilsatz von Tieren (n = 12)
wurde zur Verifizierung der Infarktgröße unter Verwendung herkömmlicher
Histologietechniken verwendet.
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Wie
in 11 gezeigt ist, bewirkte die Verabreichung von
flt-IgG eine signifikante Verringerung des Volumens eines Hirnödems, das
durch die Region von Hyperintensität auf dem T2-gewichteten MRI-Scan,
das einen Tag nach dem Einsetzen von Ischämie aufgenommen wurde, definiert
ist (27% Verringerung, p = 0,01 Student-t-Test, n = 15 und 16 bei
Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen). Repräsentative T2-gewichtete MR-Bilder,
die das Auftreten eines kortikalen Ödems als Region hoher Signalintensität im Vergleich
zur kontralateralen Seite zeigen, sind in 12 angegeben.
In diesem Modell führt
das Fortschreiten einer ischämischen
Lä sion
zur Abnahme von kortikalem Gewebe und Kavitation. Das letztendliche
Infarktvolumen kann daher aus hochauflösenden anatomischen Bildern
durch Wiedergabe der Menge von nicht-betroffenem Kortex und Vergleichen desselben
mit der kontralateralen Hemisphäre
abgeschätzt
werden. Wie in 13 gezeigt ist, wird die Größe des kortikalen
Infarkts durch die Verabreichung von flt-IgG signifikant verringert,
was 8–12
Wochen später
ermittelt wurde (26% Verringerung der Infarktgröße, p = 0,009 Student-t-Test,
n = 11 und 14 bei Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen). Es gab eine
gute Korrelation zwischen dem durch MRI ermittelten und dem unter Verwendung
herkömmlicher
Histologie bestimmten Infarktvolumen (R2 =
0,633). Entsprechend zeigten die behandelten Tiere eine Verringerung
der Entwicklung eines Hirnödems,
was ferner verstärkte
Neuroprotektion ergeben kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Hemmung der biologischen Aktivität
von VEGF Hirnödem und
-läsion,
die mit ischämischer
Reperfusion in Verbindung stehen, verringern kann.
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