DE69233668T2

DE69233668T2 - HVEGF Rezeptor als VEGF Antagonist

Info

Publication number: DE69233668T2
Application number: DE1992633668
Authority: DE
Inventors: Napoleone San Francisco FERRARA; Jin Kyung San Francisco Kim
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1992-10-28
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2012-10-29
Also published as: DE69233668D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antagonisten des Gefäßendothelwachstumsfaktors (VEGF), therapeutische Zusammensetzungen, welche die Antagonisten umfassen, und Verfahren zum Einsatz der Antagonisten zu Diagnose- und Therapiezwecken.
Hintergrund der Erfindung
Die beiden Hauptzellkomponenten der Gefäße sind Endothelzellen und glatte Muskelzellen. Die Endothelzellen bilden eine Auskleidung der inneren Oberfläche aller Blutgefäße und stellen eine nicht-thrombogene Grenzfläche zwischen Blut und Gewebe dar. Zusätzlich dazu sind Endothelzellen eine wichtige Komponente für die Entwicklung neuer Kapillaren und Blutgefäße. Endothelzellen vermehren sich demnach während der Angiogenese oder Gefäßneubildung im Zusammenhang mit Tumorwachstum und -Metastasenbildung und verschiedenen nicht-neoplastischen Erkrankungen oder Störungen.
Verschiedene natürlich vorkommende Polypeptide rufen Berichten zufolge die Proliferation von Endothelzellen hervor. Zu diesen Polypeptiden gehören basische und saure Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF), Burgess und Maciag, Annual Rev. Biochem. 58, 575 (1989), der aus Blutplättchen gewonnene Endothelzellenwachstumsfaktor (PD-ECGF), Ishikawa et al., Nature 338, 557 (1989), sowie der Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), Leung et al., Science 246, 1306 (1989); Ferrara & Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1198 (1989), Ferrara et al., PCT Patentveröffentlichung Nr. WO 90/13649 (veröffentlicht am 15. November 1990); Ferrara et al., US-Patentanmeldung Nr. 07/360.229.
VEGF wurde erstmals in Medien identifiziert, die mit Rinderhypophysenfollikel- oder -follikelsternzellen konditioniert wurden. Biochemische Analysen weisen darauf hin, dass Rinder-VEGF ein dimeres Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 45.000 Dalton und einer offenbaren mitogenen Spezifizität für Gefäßendothel zellen ist. DNA, die für Rinder-VEGF kodiert, wurde durch das Screening einer cDNA-Bibliothek, die aus solchen Zellen hergestellt wurde, unter Verwendung von Oligonucleotiden basierend auf der aminoterminalen Aminosäuresequenz des Proteins als Hybridisierungssonden isoliert.
Menschlicher VEGF wurde erhalten, indem zunächst eine cDNA-Bibliothek aus menschlichen Zellen gescreent wurde, wobei Rinder-VEGF-cDNA als Hybridisierungssonde eingesetzt wurde. Eine dadurch identifizierte cDNA kodiert für ein Protein mit 165 Aminosäuren, das eine Homologie von mehr als 95 % mit Rinder-VEGF aufweist und das als menschlicher VEGF (hVEGF) bezeichnet wird. Die mitogene Aktivität von menschlichem VEGF wurde bestätigt, indem die cDNA des menschlichen VEGF in einer Säugetierwirtszelle exprimiert wurde. Medien, die mit der cDNA des menschlichen VEGF transfizierten Zellen konditioniert wurden, förderten die Proliferation von Kapillar-Endothelzellen, während Kontrollzellen das nicht taten. Leung et al., Science 246, 1306 (1989).
Mehrere zusätzliche cDNAs wurden in menschlichen cDNA-Bibliotheken, die für 121-, 189-, und 206-Aminosäureisoformen von hVEGF (auch kollektiv als hVEGF-verwandte Proteine bezeichnet) kodieren, identifiziert. Das 121-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch die Deletion der 44 Aminosäuren zwischen den Resten 116 und 159 in hVEGF. Das 189-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch die Insertion von 24 Aminosäuren bei Rest 116 in hVEGF und ist offenbar mit dem menschlichen Gefäßpermeabilitätsfaktor (hVPF) identisch. Das 206-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch die Insertion von 41 Aminosäuren bei Rest 116 in hVEGF. Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell. Biochem. 47, 211 (1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews 13, 18 (1992); Keck et al., Science 246, 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem. 264, 20017 (1989); Keck et al., EP-Patentveröffentlichung Nr. 0 370 989 (veröffentlicht am 30. Mai 1990).
VEGF stimuliert nicht nur die Proliferation von Gefäßendothelzellen, sondern induziert auch Gefäßpermeabilität und Angiogenese. Angiogenese, welche die Bildung von neuen Blutgefäßen ausgehend von bereits existierendem Endothel umfasst, ist eine wichtige Komponente von verschiedenen Erkrankungen und Störungen, wie z.B. Tumorwachstum und Metastasenbildung, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetischer Retinopathia, retrolentaler Fibroplasie, neovaskulärem Glaukom, Hämangiomen, der Immunabwehr von transplantiertem Netzhautgewebe und anderen Geweben sowie chronischen Entzündungen.
Im Fall von Tumorwachstum scheint die Angiogenese wesentlich für den Übergang von Hyperplasie zu Neoplasie und für die Bereitstellung der Ernährung des wachsenden festen Tumors zu sein. Folkman et al., Nature 339, 58 (1989). Die Angiogenese ermöglicht es Tumoren auch, mit der vaskulären Schicht des Wirts in Kontakt zu treten, was den Weg für das Metastasieren der Tumorzellen bereitstellen könnte. Studien, die einen Zusammenhang zwischen der Zahl und der Dichte von Mikrogefäßen in histologischen Sektionen von invasiven menschlichen Brustkarzinomen und dem Vorhandensein von entfernten Metastasen aufzeigen, stellen Hinweise in Bezug auf die Rolle der Angiogenese in der Tumormetastasenbildung bereit. Weidner et al., New Engl. J. Med. 324, 1 (1991).
Angesichts der Rolle des Gefäßendothelzellwachstums und der Angiogenese und der Rolle dieser Prozesse bei vielen Erkrankungen und Störungen ist es wünschenswert, Mittel zu haben, um eine oder mehrere biologische Auswirkungen von VEGF zu reduzieren oder zu hemmen. Es ist ebenfalls wünschenswert, über Mittel zu verfügen, um zu testen, ob VEGF in normalen oder pathologischen Zuständen, und insbesondere im Fall von Krebs, vorhanden ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verwendungen von VEGF-Antagonisten, wie in den Ansprüchen definiert, bereit, wobei die Antagonisten hVEGF-Rezeptoren und Varianten davon sind. Die Antagonisten hemmen die mitogene, angiogene und andere biologische Aktivitäten von hVEGF und sind demnach für die Behandlung von Tumoren, und insbesondere von festen bösartigen Tumoren, wirksam.
In anderen Aspekten sind die VEGF-Antagonisten an eine cytotoxische Gruppierung konjugiert.
Das Medikament ist dafür gedacht, einem Säugetier, vorzugsweise einem menschlichen Patienten, der eine solche Behandlung braucht, verabreicht zu werden. Wenn erwünscht, wird der VEGF-Antagonist gemeinsam, entweder gleichzeitig oder hintereinander, mit einem oder mehreren anderen VEGF-Antagonisten oder Anti-Tumor- oder Anti-Angiogenese-Wirkstoffen verabreicht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1 oder B2.6.2) oder eines irrelevanten Anti-Hepatozytenwachstumsfaktor-Antikörpers (Anti-HGF) auf die Bindung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern an hVEGF.
2 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1 oder B2.6.2) oder eines irrelevanten Anti-HGF-Antikörpers auf die biologische Aktivität von hVEGF in Kulturen von Rinder-Nebennierenrindenkapillarendothel-(ACE-)Zellen.
3 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1, B2.6.2 oder A2.6.1) auf die Bindung von hVEGF an Rinder-ACE-Zellen.
4 zeigt die Wirkung von einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf die Wachstumsgeschwindigkeit von NEG55-Tumoren bei Mäusen.
5 zeigt die Wirkung von einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf die Größe von NEG55-Tumoren bei Mäusen nach fünf Wochen Behandlung.
6 zeigt die Wirkung von einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern (VEGF-Ab) auf das Wachstum von SK-LMS-1-Tumoren bei Mäusen.
7 zeigt die Wirkung von verschiedenen Dosierungen einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern (VEGF-Ab) auf das Wachstum von A673-Tumoren bei Mäusen.
8 zeigt die Wirkung von monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf das Wachstum und das Überleben von NEG55-(G55-)Glioblastomzellen in Kultur.
9 zeigt die Wirkung von monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf das Wachstum und das Überleben von A673-Rhabdomyosarkomzellen in Kultur.
10 zeigt die Wirkung von monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf die durch menschliche Gelenksflüssigkeit hervorgerufene Chemotaxis von menschlichen Endothelzellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Bezeichnung "hVEGF" bezieht sich wie hierin verwendet auf den menschlichen Gefäßendothelwachstumsfaktor mit 165 Aminosäuren und die verwandten Gefäßendothelwachstumsfaktoren mit 121, 189 und 206 Aminosäuren, wie von Leung et al., Science 246, 1306 (1989), und Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991), beschrieben, zusammen mit den natürlich vorkommenden allelischen und verarbeiteten Formen dieser Wachstumsfaktoren.
Die vorliegende Erfindung nutzt die Antagonisten von hVEGF, wie in den Ansprüchen definiert, die in der Lage sind, eine oder mehrere biologische Aktivitäten von hVEGF, wie z.B. seine mitogene oder angiogene Aktivität, zu hemmen. Antagonisten von hVEGF wirken, indem sie die Bindung von hVEGF an einen Zellrezeptor beeinflussen, indem sie Zellen behindern oder töten, welche durch hVEGF aktiviert wurden, oder indem sie die Aktivierung von Gefäßendothelzellen, nachdem sich hVEGF an einen Zellrezeptor gebunden hat, beeinflussen. Alle diese möglichen Angriffspunkte für einen hVEGF-Antagonisten werden für die Zwecke dieser Erfindung als gleichwertig betrachtet. Der Schutzumfang der Erfindung umfasst aber hVEGF- Rezeptoren und -Fragmente sowie Aminosäuresequenzvarianten davon, welche in der Lage sind, hVEGF zu binden.
Die Bezeichnung "hVEGF-Rezeptor" oder "hVEGFr" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Zellrezeptor für hVEGF, gewöhnlicherweise einen Zelloberflächenrezeptor, der auf Gefäßendothelzellen vorhanden ist, sowie Varianten davon, die die Fähigkeit beibehalten, hVEGF zu binden. Typischerweise werden die hVEGF-Rezeptoren und deren Varianten, die hVEGF-Antagonisten darstellen, in isolierter Form verwendet und nicht in eine Zellmembran integriert oder an einer Zelloberfläche angebracht sein, wie das in der Natur der Fall sein kann. Ein Beispiel für einen hVEGF-Rezeptor ist die fms-ähnliche Tyrosinkinase (flt), ein Transmembranrezeptor der Tyrosinkinase-Familie. DeVries et al., Science 255, 989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5, 519 (1990). Der flt-Rezeptor umfasst eine extrazelluläre Domäne, eine transmembrane Domäne und eine intrazelluläre Domäne mit Tyrosinkinaseaktivität. Die extrazelluläre Domäne spielt bei der Bindung von hVEGF eine Rolle, während die intrazelluläre Domäne an der Signaltransduktion beteiligt ist.
Ein weiteres Beispiel für einen hVEGF-Rezeptor ist der flk-1-Rezeptor (auch als KDR bezeichnet). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88, 9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6, 1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1579 (1992).
Die Bindung von hVEGF an den flt-Rezeptor führt zu der Bildung von zumindest zwei hochmolekularen Komplexen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 205.000 und 300.000 Dalton. Es wird angenommen, dass der 300.000-Dalton-Komplex ein Dimer ist, welches zwei Rezeptormoleküle umfasst, die an ein einziges hVEGF-Molekül gebunden sind.
Varianten von hVEGFr sind ebenfalls in dem Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Veranschaulichende Beispiels umfassen trunkierte Formen eines Rezeptors, in welchem die transmembranen und cytoplasmatischen Domänen vom Rezeptor deletiert sind, und Fusionsproteine, in welchen nicht-hVEGFr-Polymere oder -Polypeptide an den hVEGFr konjugiert sind, oder vorzugsweise trunkierte Formen davon. Ein Immunoglobulin ist ein Beispiel für ein solches nicht-hVEGF-Polypeptid. In diesem Fall wird beispielsweise die extrazelluläre Domäne des hVEGFr für die Fv-Domäne einer Immunoglobulin-Leicht- oder (vorzugsweise) -Schwerkette substituiert, wobei der C-Terminus der extrazellulären Domäne des Rezeptors kovalent an den Amino-Terminus des CH1-, des Gelenks-, des CH2- oder eines anderen Fragments der Schwerkette gebunden ist. Solche Varianten werden auf dieselbe Weise hergestellt wie bekannte Immunoadhäsine. Siehe z.B. Gascoigne et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 2936 (1987); Capon et al., Nature 337, 525 (1989); Aruffo et al., Cell 61, 1303 (1990); Ashkenazi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88, 10535 (1991); Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060 (1991). In anderen Ausführungsformen ist der hVEGFr an ein nichtproteinartiges Polymer, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) (siehe z.B. Davis et al., US-Patent Nr. 4.179.337; Goodson et al., BioTechnology 8, 343–346 (1990); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3578 (1977), Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3582 (1977)), oder Kohlenhydrate konjugiert (siehe z.B. Marshall et al., Arch. Biochem. Biophys. 167, 77 (1975)). Das dient dazu, die biologische Halbwertszeit des hVEGFr zu verlängern, und verringert die Wahrscheinlichkeit, dass der Rezeptor in dem Säugetier, dem er verabreicht wird, eine Immunität hervorruft. Der hVEGFr wird im Wesentlichen auf dieselbe Weise wie Antikörper gegen hVEGF angewandt, wobei die Affinität des Antagonisten und seine Wertigkeit für hVEGF berücksichtigt wird.
Die extrazelluläre Domäne des hVEGF-Rezeptors ist, entweder alleine oder an ein Immunoglobulinpolypeptid oder ein anderes Trägerpolypeptid fusioniert, besonders wirksam als hVEGF-Antagonist, da sie in der Lage ist, hVEGF, der in einem Wirt vorhanden, aber nicht an einer Zelloberfläche an hVEGFr gebunden ist, zu maskieren.
Die Bezeichnung "rekombinant", die unter Bezugnahme auf hVEGF, hVEGF-Rezeptoren, monoklonale Antikörper oder andere Proteine verwendet wird, bezieht sich auf Proteine, die durch die Expression von rekombinanter DNA in einer Wirtszelle produziert werden. Die Wirtszelle kann prokaryotisch (beispielsweise eine bakteri elle Zelle, wie z.B. E. coli) oder eukaryotisch (beispielsweise eine Hefe- oder Säugetierzelle) sein.
Konjugate mit cytotoxischen Gruppierungen
In einigen Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine cytotoxische Gruppierung bereitzustellen, die an hVEGFr konjugiert ist. In diesen Ausführungsformen dient das Cytotoxin dazu, Zellen, die hVEGF exprimieren oder binden, zu behindern oder zu töten. Dieses Konjugat wird durch die Domäne, die in der Lage ist, hVEGF oder hVEGF-hVEGFr-Komplexe zu binden, auf die Zelle gerichtet. Demnach wird hVEGFr an ein Cytotoxin konjugiert. Es ist in dieser Ausführungsform nicht erforderlich, dass der Rezeptor zu mehr in der Lage ist, als hVEGF oder hVEGF-hVEGFr-Komplexe zu binden.
Typischerweise ist das Cytotoxin ein Proteincytotoxin, z.B. Diphterie-, Ricin- oder Pseudomonastoxin. Jedoch muss das Cytotoxin nicht proteinartig sein und kann Chemotherapie-Wirkstoffe umfassen, die bisher beispielsweise für die Behandlung von Tumoren eingesetzt wurden.
Die cytotoxische Gruppierung wird auf eine beliebige Domäne des Rezeptors subsituiert, welche nicht an der hVEGF-Bindung beteiligt ist; vorzugsweise wird die Gruppierung an die Stelle von oder auf die transmembranen und/oder cytoplasmatischen Domänen des Rezeptors substituiert. Die optimale Substitutionsstelle kann durch Routineversuche bestimmt werden und ist auf dem Gebiet der Erfindung hinreichend bekannt.
Konjugate, die Proteinfusionen sind, können in einer rekombinanten Zellkultur leicht hergestellt werden, indem ein Gen, das für das Konjugat kodiert, exprimiert wird. Alternativ dazu können die Konjugate hergestellt werden, indem die cytotoxische Gruppierung kovalent mit einer Aminosäurerestseitenkette oder einem C-terminalen Carboxyl des Rezeptors vernetzt wird, unter Anwendung von Verfahren, die per se bekannt sind, wie z.B. Disulfidaustausch oder Bindung durch eine Thioesterbindung unter Verwendung von z.B. Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimadat.
Konjugate mit anderen Gruppierungen
Die hVEGFr, die hVEGF-Antagonisten sind, sind auch an andere Substanzen konjugiert, die als solche nicht als eigentliche Cytotoxine klassifiziert werden können, aber die Aktivität der Zusammensetzungen hierin steigern. hVEGFr, der in der Lage ist, hVEGF oder hVEGF-hVEGFr-Komplexe zu binden, werden beispielsweise mit heterologen Polypeptiden, wie z.B. Virussequenzen; Zellrezeptoren; Cytokinen, wie z.B. TNF, Interferonen oder Interleukinen; Polypeptiden, die eine gerinnungsfördernde Aktivität aufweisen, und anderen biologisch oder immunologisch aktiven Polypeptiden fusioniert. Solche Fusionen erfolgen durch Rekombinationsverfahren. Typischerweise werden Nicht-Immunoglobulin-Polypeptide für die transmembrane und/oder intrazelluläre Domäne eines hVEGFr substituiert.
Die Erkenntnis, dass hVEGF in der Lage zu sein scheint, auf der Oberfläche einer Zelle einen Komplex mit zwei oder mehreren hVEGFr-Molekülen zu bilden, deutet darauf hin, dass hVEGF zumindest zwei diskrete Stellen für die Bindung an hVEGFr aufweist und dass er sich auf sequenzielle Weise an solche Zellrezeptoren bindet, zunächst an einer Stelle und dann an der anderen, bevor es zur Aktivierung kommt, wie das auch bei Wachstumshormon, Prolactin und dergleichen der Fall ist (siehe z.B. Cunningham et al., Science 254, 821 (1991); deVos et al., Science 255, 306 (1992); Fuh et al.,Science 256, 1677 (1992)). Dementsprechend werden hVEGF-Antagonistenvarianten ausgewählt, in welchen eine Rezeptorbindungsstelle für hVEGF (typischerweise die Stelle, die an der anfänglichen Bindung von hVEGF an hVEGFr beteiligt ist) unverändert bleibt (oder, wenn verändert, die Bindung verstärkt), während eine zweite Rezeptorbindungsstelle für hVEGF typischerweise durch nicht-konservative Aminosäurerestsubstitution(en) oder -deletion(en) modifiziert wird, um zu bewirken, dass die Bindungsstelle funktionsunfähig wird.
Rezeptorbindungsdomänen in hVEGF und hVEGF-Bindungsdomänen in hVEGFr werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren bestimmt, wie z.B. Röntgenstudien, Mutationsanalysen und Antikörperbindungsstudien. Die Mutationsansätze umfassen Techniken der zufälligen Sättigungsmutagenese gekoppelt mit der Selektion von Ausweichmutanten sowie Insertionsmutagenese. Eine andere Strategie, die geeignet ist, um Rezeptorbindungsdomänen in Liganden zu bestimmen, ist als Alanin-(Ala-)Scanning-Mutagenese bekannt. Cunningham et al., Science 244, 1081–1985 (1989). Dieses Verfahren umfasst die Identifizierung von Regionen, die geladene Aminosäureseitenketten umfassen. Die geladenen Reste in jeder identifizierten Region (d.h. Arg, Asp, His, Lys und Glu) werden durch Ala ersetzt (eine Region pro Molekülmutant), und die Rezeptorbindung der erhaltenen Liganden wird getestet, um die Bedeutung dieser bestimmten Region bei der Rezeptorbindung zu bewerten. Ein weiteres leistungsfähiges Verfahren für die Lokalisierung von Rezeptorbindungsdomänen ist die Verwendung von neutralisierenden Anti-hVEGF-Antikörpern. Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992). Gewöhnlicherweise wird eine Kombination von diesen und ähnlichen Verfahren eingesetzt, um die Domänen zu identifizieren, die an der Rezeptorbindung beteiligt sind.
Die Bezeichnung "Aminosäuresequenzvariante" bezieht sich, wenn bezogen auf hVEGF verwendet, auf Polypeptide, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die sich in gewissem Ausmaß von den Aminosäuresequenzen der nativen Formen von hVEGF unterscheiden. Gewöhnlicherweise weisen Antagonisten-Aminosäuresequenzvarianten zumindest etwa 70 % Homologie mit zumindest einer Rezeptorbindungsdomäne eines nativen hVEGF auf, und vorzugsweise sind sie zumindest zu etwa 80 %, besonders bevorzugt zumindest zu etwa 90 %, mit einer Rezeptorbindungsstelle eines nativen hVEGF homolog. Die Aminosäuresequenzvarianten weisen Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen an bestimmten Stellen innerhalb der Aminosäuresequenz von nativem hVEGF auf, so dass die Varianten weiterhin die Fähigkeit aufweisen, hVEGF-Rezeptoren zu binden (und so mit nativem hVEGF um die Bindung an einen hVEGF-Rezeptor konkurrieren können), aber eine oder mehrere der biologischen Wirkungen von hVEGF, wie z.B. Endothelzellproliferation, Angiogenese oder vaskuläre Permeabilität, nicht hervorrufen.
"Homologie" ist als der Prozentsatz von Resten in der Aminosäuresequenzvariante definiert, welche mit den Resten in der Aminosäuresequenz einer Rezeptorbindungsdomäne eines nativen hVEGF nach dem Abgleich der Sequenzen und, wenn erforderlich, dem Einführen von Lücken zur Erreichung des maximalen Homologieprozentsatzes ident sind. Verfahren und Computerprogramme für den Abgleich sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein solches Computerprogramme ist "Align 2", entwickelt von Genentech, Inc., das mit Anwenderdokumentation im United States Copyright Office, Washington, DC 20559, am 10. Dezember 1991 hinterlegt wurde. Substitutionsvarianten sind solche, in welchen zumindest ein Aminosäurerest in einer nativen Sequenz entfernt ist und stattdessen eine andere Aminosäure an derselben Stelle insertiert ist. Die Substitutionen können einzeln erfolgen, wenn nur eine Aminosäure in dem Molekül substituiert wird, oder mehrfach, wenn zwei oder mehrere Aminosäuren in demselben Molekül substituiert werden.
Insertionsvarianten sind jene, in welchen eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar neben einer Aminosäure an einer bestimmten Stelle in einer nativen Sequenz insertiert sind. Unmittelbar neben einer Aminosäure bedeutet, dass diese entweder an die α-carboxy- oder α-aminofunktionellen Gruppe gebunden sind.
Deletionsvarianten sind jene, in welchen ein oder mehrere Aminosäurereste in einer nativen Sequenz entfernt sind. Gewöhnlicherweise sind in Deletionsvarianten ein oder zwei Aminosäurereste in einer bestimmten Region des Moleküls deletiert.
Fragmente und Aminosäuresequenzvarianten von hVEGF können einfach durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt werden, wie z.B. durch die ortsgerichtete Mutagenese der DNA, die für den nativen Faktor kodiert. Die mutierte DNA wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, und dann werden Wirtszellen mit dem rekombinanten Vektor transfiziert. Die rekombinanten Wirtszellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, und das erwünschte Fragment oder die Aminosäuresequenzvariante, die in den Wirtszellen exprimiert wird, wird dann aus der rekombinanten Zellkultur durch Chromatographie- oder andere Reinigungsverfahren gewonnen.
Alternativ dazu werden Fragmente oder Aminosäurevarianten von hVEGF in vitro hergestellt, beispielsweise durch die Proteolyse von nativem hVEGF oder durch die Synthese unter Einsatz von Standard-Festphasen-Peptidsyntheseverfahren wie von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)) beschrieben, wenngleich auch andere gleichwertige chemische Syntheseverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, eingesetzt werden können. Festphasen-Syntheseverfahren gehen von dem C-Terminus eines Peptids aus, indem eine geschützte α-Aminosäure an ein geeignetes Harz gebunden wird. Die Aminosäuren werden an die Peptidkette unter Verwendung von Verfahren gebunden, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Bildung von Peptidbindungen bekannt sind.
Therapeutische Verwendungen
Bei therapeutischen Anwendungen werden die Antagonisten der Erfindung einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform verabreicht, umfassend jene, die einem Menschen intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über eine längere Zeitspanne hinweg, auf intramuskulärem, intraperitonealem, intrazerebrospinalem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem Weg oder über Inhalation, verabreicht werden können. Die Antagonisten können auch durch intratumorale, peritumorale, intraläsionale oder periläsionale Wege geeignet verabreicht werden, um sowohl lokale als auch systemische therapeutische Wirkungen zu erzielen. Es wird angenommen, dass die intraperitoneale Variante bei der Behandlung beispielsweise von Ovarialtumoren besonders wirksam ist.
Solche Dosierungsformen umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, die von Natur aus nicht toxisch und ohne therapeutische Wirkung sind. Beispiele für solche Träger umfassen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine wie menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische gesättigter pflanzlicher Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Silicium dioxid, Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose-basierte Substanzen und Polyethylenglykol. Träger topischer oder gelbasierter Antagonistenformen umfassen Polysaccharide wie Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol und Holzwachs-Alkohole. Für alle Verabreichungen sind herkömmliche Depotformen geeignet. Solche Formen umfassen beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposomen, Pflaster, Inhalationsmittel, Nasensprays, sublinguale Tabletten und Retard-Präparate. Der Antagonist wird typischerweise in solchen Trägern bei einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen fester hydrophober Polymere, die den Antagonisten enthalten, wobei diese Matrizen in Form geformter Teile vorliegen, z.B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981), und von Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben, oder Poly(vinylalkohol), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983)), nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie das Lupron-Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine nur über kürzere Zeitspannen frei. Verbleiben verkapselte Polypeptidantagonisten über eine lange Zeitspanne hinweg im Körper, können sie aufgrund von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust biologischer Aktivität und zu möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Sinnvolle Strategien zur Stabilisierung können je nach den eingebundenen Mechanismen entwickelt werden. Beispielsweise kann, sofern der Aggregationsmechanismus als eine intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch erkannt wird, Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrollieren des Feuchtigkeitsge halts, Verwendung geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrizen-Zusammensetzungen erreicht werden.
Retard-hVEGF-Antagonisten-Zusammensetzungen umfassen auch Liposomen-gefangenen hVEGFr. Liposomen, die die Antagonisten enthalten, werden mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren hergestellt, wie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); US-Patent Nr. 4.485.045; US-Patent Nr. 4.544.545 beschrieben wird. Üblicherweise sind die Liposomen solche vom kleinen (etwa 200–800 Angström) einschichtigen Typ, in dem der Lipidgehalt über etwa 30 Mol-% Cholesterin liegt, wobei der ausgewählte Abschnitt auf die optimale HRG-Therapie abgestimmt wird. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Eine andere Verwendung der vorliegenden Erfindung umfasst das Einbinden eines hVEGF-Antagonisten in gebildete Teile. Solche Teile können zum Modulieren von Endothelzellwachstum und von Angiogenese verwendet werden. Zusätzlich dazu kann die Tumorinvasion und -metastase mit diesen Teilen moduliert werden.
Zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen hängt die geeignete Dosierung des Antagonisten vom Typ der zu behandelnden Erkrankung, wie zuvor definiert, und der Schwere und des Verlaufs der Erkrankung, ob die Antikörper zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht werden, von der vorangehenden Therapie, von der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf den Antagonisten ab und liegt im Ermessen des behandelnden Arztes. Der Antagonist wird dem Patienten geeigneterweise einmal oder im Rahmen einer Reihe von Behandlungen verabreicht.
Die hVEGF-Antagonisten sind in der Behandlung von verschiedenen neoplastischen Erkrankungen und Störungen wirksam. Neoplasmen und damit zusammenhängende Erkrankungen, die so behandelt werden können, umfassen Brustkarzinome, Lungenkarzinome, Magenkarzinome, Ösphaguskarzinome, kolorektale Karzinome, Leberkarzinome, Ovarialkarzinome, Thekazelltumoren, Arrhenoblastome, Zervixkarzinome, Endometriumkarzinome, Endometriumhyperplasien, Endometriose, Firbrosarkome, Chorionkarzinome, Kopf- und Nackenkrebs, Epipharynxkarzinome, Larynxkarzinome, Hepatoblastome, Kaposisarkome, Melanome, Hautkarzionme, Hämangiome, Kavernome, Hämangioblastome, Pankreaskarzinome, Retinoblastome, Astrozytome, Glioblastome, Schwannome, Oligodendroglioma, Medulloblastome, Neuroblastome, Rhabdomyosarkome, Osteosarkome, Leiomyosarkome, Harntraktkarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Wilms-Tumoren, Hypernephrome, Prostatakarzinome, abnorme Gefäßwucherungen in Zusammenhang mit Phakomastosen, Ödeme (z.B. in Zusammenhang mit Gehirntumoren) und das Meigs-Syndrom.
Je nach Art und Schwere der Erkrankung beträgt eine vermutliche anfängliche Dosierung zur Verabreichung an den Patienten etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg des Antagonisten, die beispielsweise einmalig oder mehrere Male oder auch über kontinuierliche Infusion verabreicht wird. Eine typische tägliche Dosierung könnte je nach den zuvor genannten Faktoren im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr liegen. Bei wiederholten Verabreichungen über mehrere Tage oder länger, je nach Zustand des Patienten, wird die Behandlung wiederholt, bis eine erwünschte Unterdrückung der Erkrankungssymptome auftritt. Es können jedoch auch andere Dosierungspläne nützlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mittels herkömmlicher Verfahren und Tests, wie z.B. radiographische Tumordarstellungen, beobachtet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Wirksamkeit des Antagonisten bei der Prävention oder Behandlung der Erkrankung durch serielle Verabreichung des Antagonisten oder in Kombination mit einem anderen Mittel, das zu diesen Zwecken wirksam ist, verbessert werden. Beispiele hierfür sind Tumornekrose-Faktor (TNF), ein Antikörper, der in der Lage ist, die angiogene Aktivität von saurem oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) oder Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) zu hemmen oder zu neutralisieren, ein Antikörper, der in der Lage ist, die Koagulationsaktivitäten von Gewebefaktor, Protein C oder Protein S zu hemmen oder zu neutralisieren (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 91/01753, veröffentlicht am 21. Februar 1991), oder einer oder mehrere herkömmliche therapeutische Wirktstoffe, wie z.B. Alkylierungsmittel, Folsäureantagonisten, Antimetaboliten des Nukleinsäurestoffwechsels, Antibiotika, Pyrimidinanaloga, 5-Fluoruracil, Purinnucleoside, Amine, Aminosäuren, Triazolnucleoside oder Kortikosteroide. Diese anderen Wirkstoffe können in der Zusammensetzung, die verabreicht wird, enthalten sein oder getrennt davon verabreicht werden. Der Antagonist wird auf geeignete Weise seriell oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen, entweder durch Bestrahlung oder die Verabreichung von radioaktiven Substanzen, verabreicht.
In einer Ausführungsform wird die Gefäßbildung von Tumoren durch eine Kombinationstherapie angegriffen. Ein oder mehrere hVEGF-Antagonisten werden Patienten mit Tumoren in einer therapeutisch wirksamen Dosierung verabreicht, welche beispielsweise durch die Beobachtung der Nekrose des Tumors oder seiner Metastasenherde, wenn vorhanden, bestimmt wird. Diese Therapie wird bis zu dem Zeitpunkt fortgesetzt, zu dem keine weiteren positiven Auswirkungen mehr beobachtet werden oder klinische Untersuchungen keine Spuren des Tumors oder von Metastasenherden mehr zeigen. Dann wird TNF verabreicht, allein oder in Kombination mit einem Hilfswirkstoff, wie z.B. α-, β- oder γ-Interferon, Anti-HER2-Antikörper, Heregulin, Anti-Heregulin-Antikörper, D-Faktor, Interleukin-1 (IL-1 ), Interleukin-2 (IL-2), Granulozyten-Makrophagenkoloniestimulierender Faktor (GM-CSF) oder Wirkstoffen, die mikrovaskuläre Koagulation in Tumoren fördern, wie z.B. Anti-Protein-C-Antikörper, Anti-Protein-S-Antikörper oder C4b bindendes Protein (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 91/01753, veröffentlicht am 21. Februar 1991), oder Wärme oder Bestrahlung.
Da Hilfswirkstoffe in ihrer Wirksamkeit variieren, ist es wünschenswert, ihre Wirkung auf den Tumor mittels Matrix-Screening auf herkömmliche Weise zu vergleichen. Die Verabreichung eines hVEGF-Antagonisten und TNF wird wiederholt, bis ein erwünschter klinischer Effekt eintritt. Alternativ dazu wird der hVEGF-Antagonist/werden die hVEGF-Antagonisten gemeinsam mit TNF und, gegebenenfalls, einem Hilfswirkstoff/Hilfswirkstoffen verabreicht. In Fällen, wenn feste Tumoren in Gliedmaßen oder an anderen Stellen vorliegen, welche vom allgemeinen Blutkreislauf isoliert werden können, werden die hierin beschriebenen Wirkstoffe dem isolier ten Tumor oder Organ verabreicht. In anderen Ausführungsformen wird dem Patienten ein FGF- oder ein aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor-(PDGF-)Antagonist, wie z.B. ein neutralisierender Anti-FGF- oder Anti-PDGF-Antikörper, in Verbindung mit dem hVEGF-Antagonisten verabreicht. Die Behandlung mit hVEGF-Antagonisten kann optimal in Phasen der Wundheilung oder erwünschter Gefäßneubildung ausgesetzt werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung angeführt und sollen in keiner Weise als Einschränkung des Umfangs der Erfindung verstanden werden.
BEISPIEL 1
Herstellung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern
Um hVEGF zur Immunisierung zu erhalten, der an ein Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) konjugiert ist, wurde rekombinanter hVEGF (165 Aminosäuren), Leung et al., Science 246, 1306 (1989), mit KLH in einem Verhältnis 4:1 in Gegenwart von 0,05 % Glutaraldehyd vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Das Gemisch wurde dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) bei 4 °C über Nacht dialysiert.
BALB/c-Mäuse wurden viermal alle zwei Wochen mittels intraperitonealer Injektionen mit 5 μg hVEGF, konjugiert an 20 μg KLH, immunisiert und wurden mit derselben Dosis an hVEGF, konjugiert an KLH, vier Tage vor der Zellfusion geboostet.
Milzzellen der immunisierten Mäuse wurden mit P3X63Ag8U.1-Myelomzellen, Yelton et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1 (1978), unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol (PEG) wie beschrieben fusioniert. Yarmush et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77, 2899 (1980). Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert.
Überstände von Hybridom-Zellkulturen wurden auf Anti-hVEGF-Antikörperproduktion durch einen ELISA-Test unter Verwendung von hVEGF-beschichteten Mikrotiterplatten gescreent. Antikörper, der in jedem der Wells an hVEGF gebunden war, wurde unter Verwendung von an alkalische Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulin und dem chromogenen Substrat p-Nitrophenylphosphat bestimmt. Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Hybridomzellen, die so festgelegt wurden, dass sie Anti-hVEGF-Antikörper produzieren, wurden durch Grenzverdünnung subkloniert, und zwei dieser Klone, die als A4.6.1 und B2.6.2 bezeichnet sind, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt.
BEISPIEL 2
Charakterisierung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern
A. Antigen-Spezifität
Die Bindungsspezifitäten der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, wurden mittels ELISA bestimmt. Die monoklonalen Antikörper wurden zu den Wells der Mikrotiterplatten zugesetzt, die davor mit hVEGF, FGF, HGF oder Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) beschichtet worden waren. Gebundener Antikörper wurde mit an Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulinen nachgewiesen. Die Resultate dieser Tests bestätigten, dass sich die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildeten monoklonalen Antikörper an hVEGF binden, sich jedoch nicht nachweisbar an jene anderen Proteinwachstumsfaktoren binden.
B. Eitop-Kartierung
Ein kompetitiver Bindungs-ELISA wurde verwendet, um zu bestimmen, ob sich die monoklonalen Antikörper, die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, an dieselben oder an unterschiedliche Epitope (Stellen) innerhalb von hVEGF binden. Kim et al., Infect. Immun. 57, 944 (1989). Einzelne, nichtmarkierte monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper (A4.6.1 oder B2.6.2) oder irrelevanter Anti-HGF-Antikörper (IgG1-Isotyp) wurden zu den Wells von Mikrotiterplatten zugesetzt, die davor mit hVEGF beschichtet worden waren. Biotinylierte monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper (BIO-A4.6.1 oder BIO-B2.6.2) wurden anschließend zugesetzt. Das Verhältnis von biotinylierten Antikörpern zu nichtmarkierten Antikörpern belief sich auf 1:1000. Die Bindung der biotinylierten Antikörper wurde durch Zusatz von Avidin-konjugierter Peroxidase, gefolgt von o-Phenylendiamindihydrochlorid und Wasserstoffperoxid, sichtbar gemacht. Die Farbreaktion, die die Menge des gebundenen biotinylierten Antikörpers angibt, wurde durch Messen der optischen Dichte (O.D.) bei einer Wellenlänge von 495 nm bestimmt.
Wie in 1 gezeigt, wurde die Bindung des biotinylierten Anti-hVEGF-Antikörpers in jedem Fall durch den entsprechenden nichtmarkierten Antikörper gehemmt, jedoch nicht durch den anderen nichtmarkierten Anti-hVEGF-Antikörper oder Anti-HGF-Antikörper. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich die monoklonalen Antikörper, die durch die A4.6.1- und B2.6.2-Hybridome gebildet wurden, innerhalb von hVEGF an verschiedene Epitope binden.
C. Isotypisierung
Die Isotypen der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von den A4.6.1- und B.2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, wurden mittels ELISA bestimmt. Proben des Nährmediums (Überstand), in dem beide Hybridome gezüchtet wurden, wurden zu den Wells der Mikrotiterplatten zugesetzt, die davor mit hVEGF beschichtet worden waren. Die eingefangenen, monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurden mit verschiedenen, Isotypen-spezifischen, an alkalische Phosphatase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulinen inkubiert, und die Bindung der konjugierten Antikörper an die monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurde durch den Zusatz von p-Nitrophenylphosphat bestimmt. Die Farbreaktion wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Plattenleser gemessen.
Durch dieses Verfahren wurde der Isotyp der von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildeten monoklonalen Antikörper als IgG1 bestimmt.
D. Bindungsaffinität
Die Affinitäten der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, für hVEGF wurden durch einen kompetitiven Bindungstest bestimmt. Eine vorgegebene sub-optimale Konzentration an monoklonalen Antikörpern wurde zu den Proben zugesetzt, die 20.000 bis 40.000 cpm ¹²⁵I-hEVGF (1–2 ng) und verschiedene bekannte Mengen an nichtmarkiertem hVEGF (1–1.000 ng) enthielten. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Ig-Antiseren (Pel-Freez, Rogers, AR, USA) zugesetzt, und die Gemische wurden eine weitere Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Komplexe von Antikörpern und gebundenen Proteinen (Immun-Komplexe) wurden unter Zusatz von 500 μl von 6%igem Polyethylenglykol (PEG, Molekulargewicht 8.000) bei 4 °C gefällt und danach bei 2000 × g 20 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Die Menge an ¹²⁵I-hVEGF, die an den monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper in jeder Probe gebunden war, wurde durch Zählen des pelletierten Materials in einem Gamma-Zähler bestimmt.
Affinitätskonstanten wurden aus den Daten mittels Scatchard-Analyse berechnet. Die Affinität des monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers, der vom A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, machte Berechnungen zufolge 1,2 × 10⁹ l/mol aus. Die Affinität des monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers, der vom B2.6.2-Hybridom gebildet wurde, wurde auf 2,5 × 10⁹ l/mol berechnet.
E. Hemmung der mitogenen Aktivität von hVEGF
Rinder-Nebennierenrindenkapillarendothel-(ACE-)Zellen, Ferrara et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 5773 (1987), wurden in einer Dichte von 10⁴ Zellen/ml in 12 Multiwell-Platten gesät, und 2,5 ng/ml hVEGF wurden jedem Well in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von A4.6.1- oder B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, oder eines irrelevanten monoklonalen Anti-HGF-Antikörpers zugesetzt. Nach fünftägigem Kultivieren wurden die Zellen in jedem Well in einem Coulter-Zähler gezählt. Als Kontrolle wurden ACE-Zellen in Abwesenheit von zugesetztem hVEGF kultiviert.
Wie in 2 gezeigt hemmten beide der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper die Fähigkeit des zugesetzten hVEGF, das Wachstum oder Überleben der Rinder-ACE-Zellen zu unterstützen. Der monoklonale Antikörper, der vom A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, hemmte die mitogene Aktivität von hVEGF völlig (mehr als etwa 90 % Hemmung), während der monoklonale Antikörper, der vom B2.6.2-Hybridom gebildet wurde, die mitogene Aktivität von hVEGF nur teilweise hemmte.
F. Hemmung von hVEGF-Bindung
Rinder-ACE-Zellen wurden in einer Dichte von 2,5 × 10⁴ Zellen/0,5 ml/Well in 24-Well-Mikrotiterplatten in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), das 10 % Rinderserum, 2 mM Glutamin und 1 ng/ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor enthielt, gesät. Nach dem Kultivieren über Nacht wurden die Zellen bei 4 °C einmal in Bindungspuffer gewaschen (gleiche Volumina an DMEM und F12-Medium plus 25 mM HEPES und 1 % Rinderserumalbumin).
12.000 cpm ¹²⁵I-hVEGF (etwa 5 × 10⁴ cpm/ng/ml) wurden 30 Minuten lang mit 5 μg des monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers, der vom A4.6.1-, B2.6.2- oder A2.6.1-Hybridom (250 μl Gesamtvolumen) gebildet worden war, vorinkubiert, und danach wurden die Gemische zu den Rinder-ACE-Zellen in den Mikrotiterplatten zugesetzt. Nach dreistündigem Inkubieren der Zellen bei 4 °C wurden die Zellen dreimal mit Bindungspuffer bei 4 °C gewaschen, durch Zusatz von 0,5 ml von 0,2 N NaOH solubilisiert und in einem Gamma-Zähler gezählt.
Wie in 3 (oben) gezeigt, hemmten die von A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildeten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen. Im Gegensatz dazu hatte der vom A2.6.1-Hybridom gebildete Anti-hVEGF-Antikörper keine erkennbare Wirkung auf die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen. Im Einklang mit den im zuvor beschriebenen Zellproliferations test erhaltenen Resultaten hemmte der vom A4.6.1-Hybridom gebildete monoklonale Antikörper die Bindung von hVEGF stärker als der vom B2.6.2.-Hybridom gebildete monoklonale Antikörper.
Wie in 3 (unten) gezeigt, hemmte der vom A.4.6.1-Hybridom gebildete monoklonale Antikörper die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen bei einem Molverhältnis von hVEGF zu Antikörper von 1:250 vollständig.
G. Kreuzreaktivität mit anderen VEGF-Isoformen
Um zu bestimmen, ob der monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper, der vom A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, mit den 121- und 189-Aminosäureformen von hVEGF reaktiv ist, wurde der Antikörper auf seine Fähigkeit getestet, diese Polypeptide immunzufällen.
Menschliche 293-Zellen wurden mit Vektoren, die die kodierende Nucleotidsequenz der 121- und 189-Aminosäure-hVEGF-Polypeptide umfassten, wie beschrieben transfiziert. Leung et al., Science 246, 1306 (1989). Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in Medium transferiert, das kein Cystein und Methionin aufwies. Die Zellen wurden 30 Minuten lang in diesem Medium inkubiert, dann wurden 100 μCi/ml von ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein zu dem Medium zugesetzt, und die Zellen wurden weiter zwei Stunden lang inkubiert. Die Markierung wurde durch Transferieren der Zellen in serumfreies Medium und dreistündiges Inkubieren beobachtet. Das Zellkulturmedium wurde gesammelt, und die Zellen wurden durch 30-minütiges Inkubieren in Lysepuffer (150 mM NaCl, 1 % NP40, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris, pH 8,0) lysiert. Zelltrümmer wurden aus den Lysaten durch 30-minütige Zentrifugation bei 200 × g entfernt.
500-μl-Proben von Zellkulturmedium und Zelllysaten wurden mit 2 μl A4.6.1-Hybridomantikörper (2,4 mg/ml) 1 Stunde lang bei 4 °C und anschließend mit 5 μl Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulin 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Immunkomplexe von ³⁵S-markiertem hVEGF und monoklonalemn Anti-hVEGF-Antikörper wurden mit Protein-A-Sepharose (Pharmacia) gefällt und dann unter reduzierenden Bedingungen SDS-12%-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Das Gel wurde zur Analyse der immungefällten, radioaktiv markierten Proteine durch Autoradiographie einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Die Ergebnisse dieser Analyse gaben an, dass der monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper, der durch das A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, sowohl mit der 121- als auch der 189-Aminosäureform von hVEGF kreuzreaktiv war.
BEISPIEL 3
Herstellung von hVEGF-Rezeptor-IgG-Fusionsprotein
Die Nucleotid- und Aminosäure-Kodiersequenzen des flt-hVEGF-Rezeptors sind in Shibuya et al., Oncogene 5, 519–524 (1990), offenbart. Die Kodiersequenz der extrazellulären Domäne des flt-hVEGF-Rezeptors wurde mit der Kodiersequenz der menschlichen IgG1-Schwerkette in einem zweistufigen Verfahren fusioniert.
Ortsgerichtete Mutagenese wurde verwendet, um eine BstBI-Restriktion in die für flt kodierende DNA an der Stelle 5' zum Codon für Aminosäure 759 von flt einzuführen und um die einzige BstEII-Restriktionsstelle im Plasmid pBSSK^–FC, Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991), zu einer BstBI-Stelle umzuwandeln. Das modifizierte Plasmid wurde mit EcoRI und BstBI verdaut, und das große resultierende Fragment von Plasmid-DNA wurde mit einem EcoRI-BstBI-Fragment der flt-DNA, die für die extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1–758) des flt-hVEGF-Rezeptors kodiert, ligiert.
Das resultierende Konstrukt wurde mit ClaI und NotI verdaut, um ein etwa 3,3-kb-Fragment zu bilden, das anschließend in die multiple Klonierungsstelle des Säugetier-Expressionsvektors pHEBO2 (Leung et al., Neuron 8, 1045 (1992)) durch Ligation insertiert wurde. Die Enden des 3,3-kb-Fragments werden beispielsweise durch Hinzufügen von Linkern modifiziert, um Insertion des Fragments in den Vektor in korrekter Ausrichtung zur Expression zu erhalten.
Säugetier-Wirtszellen (beispielsweise CEN4-Zellen (Leung et al., s.o.)) werden mit dem pHEBO2-Plasmid, das das flt-Insert enthält, durch Elektroporation transfiziert. Transfizierte Zellen werden in Medium, das etwa 10 % fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika enthält, kultiviert und bei etwa 75 % Konfluenz in serumfreies Medium transferiert. Das Medium wird 3–4 Tage vor dem Sammeln konditioniert, und das flt-IgG-Fusionsprotein wird durch Chromatographie auf einer Protein-A-Affinitätsmatrix, im Wesentlichen wie in Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991), beschrieben, aus dem konditionierten Medium gereinigt.
BEISPIEL 4
Hemmen des Tumorwachstums mit hVEGF-Antagonisten
Verschiedene menschliche Tumorzelllinien, die in Kultur gezüchtet wurden, wurden mittels ELISA auf Produktion von hVEGF getestet. Für Eierstock-, Lungen-, Dickdarm-, Magen-, Brust- und Gehirntumor-Zelllinien wurde erkannt, dass sie hVEGF bilden. Drei hVEGF bildende Zelllinien, NEG 55 (auch als G55 bezeichnet) (menschliche Gliomzelllinie, erhalten von Dr. M. Westphal, Neurochirurgische Abteilung der Universitätsklinik Hamburg-Eppendorf, Deutschland, auch als G55 bezeichnet), A673 (menschliche Rhabdomyosarkomzelllinie, erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA 20852, als Zellliniennummer CRL 1598) und SK-LMS-1 (Leiomyosarkomzelllinie, erhalten von der ATCC als Zelllinien Nummer HTB 88), wurden für weitere Studien verwendet.
Sechs bis zehn Wochen alten, weiblichen Beige/Nacktmäuse (Charles River Laboratory, Wilmington, Massachusetts, USA) wurden subkutan 1–5 × 10⁶ Tumorzellen in 100–200 μl PBS injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten, nachdem Tumorwachstum nachgewiesen worden war, wurde den Mäusen intraperitoneal ein- oder zweimal pro Woche verschiedene Dosen an monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper, einem irrelevanten monoklonalen Anti-gp120-Antikörper (5B6) oder PBS injiziert. Die Tumorgröße wurde jede Woche gemessen, und zu Abschluss der Studie wurden die Tumoren herausgeschnitten und gewogen.
Die Wirkung der verschiedenen Mengen an monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf das Wachstum von NEG-55-Tumoren bei Mäusen ist in den 4 und 5 dargestellt. 4 zeigt, dass Mäuse, die mit 25 μg oder 100 μg monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper beginnend eine Woche nach Inokulation der NEG-55-Zellen behandelt wurden, im Vergleich zu Mäusen, die entweder mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden, eine wesentlich reduzierte Tumorwachstumsgeschwindigkeit aufwiesen. 5 zeigt, dass fünf Wochen nach Inokulation der NEG-55-Zellen die Größe der Tumoren bei Mäusen, die mit A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 50 % (bei Mäusen, die mit 25-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) bis 85 % (bei Mäusen, die mit 100-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) geringer war als die Größe der Tumoren bei Mäusen, die mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden.
Die Wirkung der Behandlung mit monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf das Wachstum von SK-LMS-1-Tumoren bei Mäusen ist in 6 dargestellt. Fünf Wochen nach Inokulation der SK-LMS-1-Zellen war die mittlere Tumorgröße bei Mäusen, die mit dem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 75 % geringer als die Tumorgröße bei Mäusen, die mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden.
Die Wirkung der Behandlung mit monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf das Wachstum von A673-Tumoren bei Mäusen ist in 7 dargestellt. Vier Wochen nach Inokulation der A673-Zellen war die mittlere Tumorgröße bei Mäusen, die mit dem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 60 % (bei Mäusen, die mit 10-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) bis um mehr als 90 (bei Mäusen, die mit 50- bis 400-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) geringer als die Tumorgröße bei Mäusen, die mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden.
BEISPIEL 5
Analyse der direkten Wirkung von Anti-hVEGF-Antikörper auf in Kultur wachsende Tumorzellen
Menschliche NEG55-Glioblastomzellen oder A673-Rhabdomyosarkomzellen wurden bei einer Dichte von 7 × 10³ Zellen/Well in Multiwell-Platten (12 Wells/Platte) in F12/DMEM-Medium, das 10 % fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika enthielt, gesät. Der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper wurde dann zu den Zellkulturen auf eine Endkonzentration von 0 – 20,0 μg Antikörper/ml zugesetzt. Nach fünf Tagen wurden die in den Wells wachsenden Zellen durch Aussetzung gegenüber Trypsin dissoziiert und in einem Coulter-Zähler gezählt.
Die 8 und 9 zeigen die Resultate dieser Studien. Darin ist ersichtlich, dass der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper keine signifikante Wirkung auf das Wachstum der NEG55- oder A673-Zellen in Kultur hatte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper nicht cytotoxisch ist, und lassen sehr stark darauf schließen, dass die beobachteten Anti-Tumor-Wirkungen des Antikörpers auf sein Hemmen von VEGF-vermittelter Gefäßneubildung zurückzuführen ist.
BEISPIEL 6
Wirkung des Anti-hVEGF-Antikörpers auf Endothelzellen-Chemotaxis
Chemotaxis von Endothelzellen und anderen Zellen, umfassend Monozyten und Lymphozyten, spielt in der Pathogenese von rheumatoider Arthritis eine wichtige Rolle. Endothelzellwanderungen und -proliferation begleiten die Angiogenese, die in der rheumatoiden Synovialhaut auftritt. Vaskularisiertes Gewebe (Pannus) dringt in die Gelenksknorpel ein und zerstört sie.
Um zu bestimmen, ob hVEGF-Antagonisten diesen Prozess stören, wurde die Wirkung des A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpers auf Endothelzell-Chemotaxis getestet, die durch Gelenksschmiere von Patienten, die an rheumatoider Arthritis litten, stimuliert wurde. Als Kontrolle testeten die Erfinder die Wirkung des A4.6.1-Anti-hVEGF-An tikörpers auf Endothelzell-Chemotaxis, die durch Gelenksschmiere von Patienten, die an Osteoarthritis litten, stimuliert wurde (die Angiogenese, die bei rheumatoider Arthritis auftritt, tritt bei Osteoarthritis nicht auf).
Endothelzell-Chemotaxis wurde unter Verwendung modifizierter Boyden-Kammern gemäß den bereits bekannten Verfahren getestet. Thompson et al., Cancer Res. 51, 2670 (1991); Phillips et al., Proc. Exp. Biol. Med. 197, 458 (1991). Etwa 10⁴ menschliche Nabelvenen-Endothelzellen wurden auf Gelatine-beschichteten Filtern (0,8 μm Porengröße) in 48-Well-Multiwell-Mikrokammern in Kulturmedium, das 0,1 % fötales Rinderserum enthielt, anhaften gelassen. Nach etwa zwei Stunden wurden die Kammern umgedreht, und Testproben (rheumatoide Arthritis-Gelenksschmiere, Osteoarthritis-Gelenksschmiere, basischer FGF (bFGF) (bei einer Endkonzentration von 1 μg/ml) oder PBS) und A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper (bei einer Endkonzentration von 10 μg/ml) wurden zu den Wells zugesetzt. Nach zwei bis vier Stunden wurden die Zellen, die migrierten, gefärbt und gezählt.
10 zeigt die gemittelten Ergebnisse dieser Studien. Die in der mit "Gelenksschmiere" gekennzeichneten Spalte gezeigten Werte und jene, die am Ende der Seite für die Kontrollen gezeigt sind, stellen die mittlere Anzahl an Endothelzellen dar, die in Gegenwart von Gelenksschmiere, bFGF oder PBS alleine migrierten. Die in der mit "Gelenksschmiere + mAB-VEGF" gekennzeichneten Spalte gezeigten Werte sind die mittlere Anzahl von Endothelzellen, die in Gegenwart von Gelenksschmiere plus zugesetztem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper migrierten. Die in der mit "% Unterdrückung" gekennzeichneten Spalte gezeigten Werte geben den Rückgang der durch Gelenksschmiere induzierten Zellmigration in Prozent an, der durch den Zusatz von Anti-hVEGF-Antikörper entstand. Wie angegeben hemmte der Anti-hVEGF-Antikörper die Fähigkeit der rheumatoiden Arthritis-Gelenksschmiere signifikant (53,40 % mittlere Hemmung), aber nicht jene der Osteoarthritis-Gelenksschmiere (13,64 % mittlere Hemmung), Endothelzellmigration zu induzieren.

Claims

Verwendung eines hVEGF-Antagonisten, der ein isolierter hVEGF-Rezeptor ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen aus dem Rezeptor deletiert sind.
Verwendung nach Anspruch 2, worin der isolierte hVEGF-Rezeptor aus der extrazellulären Domäne eines hVEGF-Rezeptors besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der hVEGF-Rezeptor ein flt-Rezeptor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der hVEGF-Rezeptor der KDR-Rezeptor ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der hVEGF-Antagonist in einer Menge verwendet wird, die ausreicht, um die Tumorgröße zu reduzieren.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Tumor ein fester maligner Tumor ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, worin der hVEGF-Antagonist die Tumorgröße durch Hemmen der VEGF-vermittelten Gefäßneubildung reduziert.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der hVEGF-Rezeptor an ein Trägerpolypeptid fusioniert ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin das Trägerpolypeptid ein Immunglobulinpeptid ist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das Immunglobulin IgG ist.
Verwendung nach Anspruch 11, worin der hVEGF-Antagonist ein flt-IgG-Fusionsprotein ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der hVEGF-Antagonist an eine cytotoxische Gruppierung gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 13, worin die cytotoxische Gruppierung ein Proteincytotoxin ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der hVEGF-Rezeptor an ein nichtproteinartiges Polymer konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 14, worin das Polymer Polyethylenglykol ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament so formuliert ist, dass es hintereinander oder in Kombination mit einem anderen Krebsbehandlungsmittel verabreicht werden kann.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament so formuliert ist, dass es hintereinander oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht werden kann.