DE69635565T2

DE69635565T2 - Antagonisten des vaskulären Endothelzellen-Wachstumfaktors

Info

Publication number: DE69635565T2
Application number: DE69635565T
Authority: DE
Inventors: Napoleone Ferrara; Kyung Jin Kim
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2016-03-29
Also published as: AU696487B2; IL117645A; ES2233967T3; US20070253959A1; CA2754887A1; EP1627643A2; WO1996030046A1; NZ305699A; EP1627643A3; EP0817648A1; ATE285251T1; US20100119523A1; US20100316652A1; ATE311902T1; IL117645A0; AU5378796A; EP1506787A1; DE69634079T2; ES2255027T3; US20110287024A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung von VEGF-Antagonisten für therapeutische Zwecke.
Hintergrund der Erfindung
Die zwei Hauptzellkomponenten des Gefäßsystems sind die Endothel- und Glattmuskelzellen. Die Endothelzellen bilden die Auskleidung der inneren Oberfläche aller Blutgefäße und stellen so eine nicht-thrombogene Grenzfläche zwischen Blut und Gewebe her. Darüber hinaus sind Endothelzellen eine wichtige Komponente für die Entwicklung neuer Kapillaren und Blutgefäße. So vermehren sich Endothelzellen während der Angiogenese oder Gefäßneubildung, die mit Tumorwachstum und Metastasenbildung assoziiert ist, und einer Vielzahl nicht-neoplastischer Erkrankungen oder Störungen.
Für verschiedene, natürlich auftretende Polypeptide wurde erwiesen, dass sie die Vermehrung von Endothelzellen induzieren. Unter diesen Polypeptiden finden sich die basischen und sauren Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF), Burgess & Maciag, Annual Rev. Biochem. 58, 575 (1989), aus Blutplättchen gewonnener Endothelzellen-Wachstumsfaktor (PD-ECGF), Ishikawa et al., Nature 338, 557 (1989), und vaskulärer Endothelwachstumsfaktor (VEGF), Leung et al., Science 246, 1306 (1989); Ferrara & Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1198 (1989); Ferrara et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 90/13.649 (veröffentlicht am 15. November 1990).
VEGF wurde zuerst in Medium identifiziert, das durch Rinder-Hypophysenfollikeloder -Follikelsternzellen konditioniert war. Biochemische Analysen geben an, dass Rinder-VEGF ein dimeres Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 45.000 Dalton und mit einer offensichtlichen mitogenen Spezifität für vaskuläre Endothelzellen ist. DNA, die für Rinder-VEGF kodiert, wurde durch Screenen einer cDNA-Bibliothek, die von solchen Zellen hergestellt worden war, unter Verwendung von Oligonucleotiden, basierend auf der aminoterminalen Aminosäuresequenz des Proteins als Hybridisierungssonden, isoliert.
Menschlicher VEGF wurde durch erstes Screenen einer cDNA-Bibliothek, hergestellt aus menschlichen Zellen, unter Verwendung von Rinder-VEGF-cDNA als Hybridisierungssonde erhalten. Eine hierbei identifizierte cDNA kodiert für ein 165-Aminosäureprotein mit mehr als 95 % Homologie mit Rinder-VEGF, und dieses Protein wird als menschlicher VEGF (hVEGF) bezeichnet. Die mitogene Aktivität von menschlichem VEGF wurde durch Exprimieren der menschlichen VEGF-cDNA in Säugetier-Wirtszellen bestätigt. Durch Zellen, die mit der menschlichen VEGF-cDNA transfiziert wurden, konditioniertes Medium förderte die Vermehrung von Kapillarendothelzellen, während Kontrollzellen keine Wirkung zeigten. Leung et al., Science 246, 1306 (1989).
Mehrere zusätzliche cDNA wurden in menschlichen cDNA-Bibliotheken identifiziert, die für 121-, 189- und 206-Aminosäureisoformen von hVEGF (kollektiv auch als hVEGF-verwandte Proteine bezeichnet) kodieren. Das 121-Aminosäureprotein unterscheidet sich vom hVEGF durch die Deletion der 44 Aminosäuren zwischen den Resten 116 und 159 in hVEGF. Das 189-Aminosäureprotein unterscheidet sich vom hVEGF durch die Insertion von 24 Aminosäuren am Rest 116 in hVEGF und ist offensichtlich identisch mit dem menschlichen vaskulären Permeabilitätsfaktor (hVPF). Das 206-Aminosäureprotein unterscheidet sich vom hVEGF durch die Insertion von 41 Aminosäuren am Rest 116 in hVEGF. Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell. Biochem. 47, 211 (1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews 13, 18 (1992); Keck et al., Science 246, 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem. 264, 20017 (1989); Keck et al., EP-Patent Veröffentlichungs-Nr. 0 370 989 (veröffentlicht am 30. Mai 1990).
VEGF stimuliert nicht nur die Vermehrung von vaskulären Endothelzellen, sondern induziert auch vaskuläre Permeabilität und Angiogenese. Angiogenese, die die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierendem Endothel einbindet, ist eine wichti ge Komponente für zahlreiche Erkrankungen und Störungen, umfassend altersbedingte Makuladegeneration (AMD).
Ein Übersichtsartikel von D'Amore in Investigative Ophthalmology & Visual Science 35(12), 3974-3979 (1994), erörtert mögliche Mechanismen retinaler und choroidaler Gefäßneubildung.
Im Abstract von Smith et al. in Investigative Ophthalmology & Visual Science 36(4), 5871 (15. März 1995), wird offenbart, dass Antisense-VEGF retinale Gefäßneubildung reduziert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines hVEGF-Antagonisten, der die extrazelluläre Domäne eines hVEGF-Rezeptors umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von AMD bereit. Der Antagonist inhibiert die mitogene, angiogene oder andere biologische Aktivität von hVEGF und ist somit zur Behandlung von AMD nützlich, die durch unerwünschte exzessive Neovaskularisation gekennzeichnet ist.
Der VEGF-Antagonist kann mit einer zytotoxischen Gruppierung konjugiert sein.
Sofern erwünscht, wird der VEGF-Antagonist, entweder gleichzeitig oder nacheinander, mit einem oder mehreren anderen VEGF-Antagonisten oder anti-angiogenen Substanzen zusammen verabreicht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1 oder B2.6.2) oder eines irrelevanten Anti-Hepatozytenwachstumsfaktor-Antikörpers (Anti-HGF) auf die Bindung der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper an hVEGF.
2 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1 oder B2.6.2) oder eines irrelevanten Anti-HGF-Antikörpers auf die biologische Aktivität von hVEGF in Kulturen von Rinder-Nebennierenrindenkapillarendothel- (ACE-) Zellen.
3 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1, B2.6.2 oder A2.6.1) auf die Bindung von hVEGF an Rinder-ACE-Zellen.
4 zeigt die Wirkung der Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf die Wachstumsgeschwindigkeit des Wachstums von NEG55-Tumoren bei Mäusen.
5 zeigt die Wirkung der Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf die Größe der NEG55-Tumoren bei Mäusen nach fünf Wochen Behandlung.
6 zeigt die Wirkung der Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern (VEGF-Ab) auf das Wachstum von SK-LMS-1-Tumoren bei Mäusen.
7 zeigt die Wirkung von Behandlungen mit unterschiedlichen Dosen an monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern (VEGF-Ab) auf das Wachstum von A673-Tumoren bei Mäusen.
8 zeigt die Wirkung von monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf Wachstum und Überleben von NEG55- (G55-) Glioblastomzellen in Kultur.
9 zeigt die Wirkung von monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf Wachstum und Überleben von A673-Rhabdomyosarkomzellen in Kultur.
10 zeigt die Wirkung von monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf menschliche, über Gelenksschmiere induzierte Chemotaxis menschlicher Endothelzellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Bezeichnung "hVEGF", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf den menschlichen 165-Aminosäuren-Vaskulärendothelzellwachstumsfaktor sowie auf verwandte 121-, 189- und 206-Aminosäuren-Vaskulärendothelzellwachstumsfaktoren, wie in Leung et al., Science 246, 1306 (1989), und Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991), beschrieben, zusammen mit den natürlich vorkommenden allelischen und verarbeiteten Formen dieser Wachstumsfaktoren.
Die vorliegende Erfindung betrifft Antagonisten von hVEGF, die in der Lage sind, eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten von hVEGF, beispielsweise seine mitogene oder angiogene Aktivität, zu hemmen. Antagonisten von hVEGF wirken durch Stören der Bindung von hVEGF an einen Zellrezeptor durch Behindern oder Töten von Zellen, die durch hVEGF aktiviert wurden, oder durch Stören vaskulärer Endothelzellaktivierung, nachdem sich hVEGF an einen Zellrezeptor gebunden hat. Somit sind in den Schutzumfang der Erfindung hVEGF-Rezeptor und Fragmente und Aminosäuresequenzvarianten davon, wie in den Ansprüchen definiert, die in der Lage sind, sich an hVEGF zu binden, eingebunden.
Die Bezeichnung "hVEGF-Rezeptor" oder "hVEGFr", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Zellrezeptor für hVEGF, üblicherweise einen Zelloberflächenrezeptor, der in vaskulären Endothelzellen zu finden ist, sowie Varianten davon, die die Fähigkeit beibehalten, sich an hVEGF zu binden. Die hVEGF-Rezeptoren und Varianten davon, die hVEGF-Antagonisten sind, liegen in isolierter Form vor, und nicht integriert in eine Zellmembran oder fixiert an eine Zelloberfläche, wie dies in der Natur der Fall sein kann. Ein Beispiel für einen hVEGF-Rezeptor ist die fms-ähnliche Tyrosinkinase (flt), ein Transmembranrezeptor in der Familie der Tyrosinkinasen. DeVries et al., Science 255, 989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5, 519 (1990). Der flt-Rezeptor umfasst eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre Domäne mit Tyrosinkinaseaktivität. Die extrazelluläre Domäne ist in die Bindung von hVEGF eingebunden, während die intrazelluläre Domäne in die Signaltransduktion eingebunden ist.
Ein anderes Beispiel für einen hVEGF-Rezeptor ist der flk-1-Rezeptor (auch bezeichnet als KDR). Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6, 1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1579 (1992).
Das Binden von hVEGF an den flt-Rezeptor resultiert in der Bildung von zumindest zwei hochmolekularen Komplexen, die ein scheinbares Molekulargewicht von 205.000 und 300.000 Dalton aufweisen. Der 300.000-Dalton-Komplex wird als ein Dimer erachtet, das zwei Rezeptormoleküle aufweist, die an ein einzelnes Molekül von hVEGF gebunden sind.
Varianten von hVEGFr, die die extrazelluläre Domäne enthalten, sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingebunden. Repräsentative Beispiele umfassen trunkierte Formen eines Rezeptors, in dem die Transmembran und zytoplasmatische Domänen aus dem Rezeptor deletiert sind, und Fusionsproteine, in denen Nicht-hVEGFr-Polymere oder -Polypeptid an den hVEGFr konjugiert sind, oder vorzugsweise trunkierte Formen davon. Ein Beispiel für solch ein Nicht-hVEGF-Polypeptid ist ein Immunglobulin. In diesem Fall ist beispielsweise die Fv-Domäne einer Immunglobulin-Leicht- oder (vorzugsweise) -Schwerkette durch die extrazelluläre Domäne des hVEGFr substituiert, wobei der C-Terminus der extrazellulären Rezeptordomäne kovalent an den Amino-Terminus des CH1-, Gelenks-, CH2- oder eines anderen Fragments der Schwerkette gebunden ist. Solche Varianten werden auf dieselbe Weise hergestellt wie bekannte Immunoadhäsine. Siehe z.B. Gascoigne et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 2936 (1987); Capon et al., Nature 337, 525 (1989); Aruffo et al., Cell 61, 1303 (1990); Ashkenazi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88, 10535 (1991); Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060 (1991). In anderen Ausführungsformen ist der hVEGFr an ein nicht-proteinhältiges Polymer wie beispielsweise Polyethylenglykol (PEG) (siehe z.B. Davis et al., US-Patent Nr. 4.179.337; Goodson et al., BioTechnology 8, 343-346 (1990); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3578 (1977); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3582 (1977)) oder Kohlenhydrate (siehe z.B. Marshall et al., Arch. Biochem. Biophys. 167, 77 (1975)) konjugiert. Dies dient dazu, die biologische Halbwertszeit des hVEGFr zu verlängern, und reduziert die Möglichkeit, dass der Rezeptor im Säugetier, dem er verabreicht wird, immunogen ist. Der hVEGFr wird, unter Berücksichtigung der Affinität des Antagonisten und seiner Valenz für hVEGF, auf im Wesentlichen dieselbe Weise verwendet wie Antikörper gegen hVEGF.
Die extrazelluläre Domäne von hVEGF-Rezeptor, entweder selbst oder fusioniert an ein Immunglobulin-Polypeptid oder ein anderes Träger-Polypeptid, ist durch ihre Fähigkeit, hVEGF zu maskieren, der in einem Wirt vorhanden, jedoch nicht an hVEGFr an einer Zelloberfläche gebunden ist, besonders nützlich als ein Antagonist von hVEGF.
Der Begriff "rekombinant", der in Bezug auf hVEGF, hVEGF-Rezeptor, monoklonale Antikörper oder andere Proteine verwendet wird, bezieht sich auf Proteine, die durch Expression von rekombinanter DNA in einer Wirtszelle hergestellt werden. Die Wirtszelle kann prokaryotisch (z.B. eine Bakterienzelle wie beispielsweise E. coli) oder eukaryotisch (z.B. eine Hefe oder eine Säugetierzelle) sein.
Konjugate mit zytotoxischen Gruppierungen
In manchen Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine zytotoxische Gruppierung bereitzustellen, die an hVEGFr konjugiert ist. In diesen Ausführungsformen dient das Zytotoxin dazu, Zellen zu hemmen oder zu töten, die hVEGF exprimieren oder binden. Das Konjugat ist auf die Zelle durch die Domäne gerichtet, die in der Lage ist, sich an hVEGF zu binden.
Typischerweise ist das Zytotoxin ein Proteinzytotoxin, z.B. Diphtherie-, Ricin- oder Pseudomonas-Toxin, obwohl im Fall bestimmter Klassen an Immunglobulinen die Fc-Domäne des monoklonalen Antikörpers selbst dazu dienen kann, das Zytotoxin bereitzustellen (z.B. im Fall von IgG2-Antikörpern, die in der Lage sind, ein Komplement zu fixieren und an antikörperabhängiger zellulärer Zytotoxizität (ADCC) teilzunehmen). Das Zytotoxin muss jedoch nicht proteinisch sein und kann chemotherapeutische Wirkstoffe, die bisher beispielsweise zur Behandlung von Tumoren verwendet wurden, umfassen.
Wird die Targeting-Funktion durch hVEGFr bereitgestellt, so wird die zytotoxische Gruppierung an jeder beliebigen Domäne des Rezeptors eingesetzt, die nicht an hVEGF-Bindung teilnimmt; vorzugsweise wird die Gruppierung anstelle der oder an der Transmembran und/oder anstelle der oder an den zytoplasmatischen Domänen des Rezeptors eingesetzt. Die optimale Substitutionsstelle wird mittels Routineexperimenten bestimmt und fällt auf alle Fälle in den Bereich durchschnittlichen Fachwissens.
Konjugate, die Proteinfusionen sind, werden leicht in rekombinanten Zellkulturen durch Exprimieren eines Gens, das für das Konjugat kodiert, gebildet. Alternativ dazu werden die Konjugate mittels kovalenten Vernetzens der zytotoxischen Gruppierung mit einer Aminosäurenrest-Seitenkette oder einem C-terminalen Carboxyl des Rezeptors unter Verwendung von an sich bekannten Verfahren wie Disulfid-Austausch oder Bindung über eine Thioesterbindung unter Verwendung von beispielsweise Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimadat gebildet.
Konjugate mit anderen Gruppierungen
Die hVEGFr, die Antagonisten von hVEGF sind, werden auch an Substanzen konjugiert, die nicht einfach als Zytotoxine als eigenständige Einheit klassifiziert werden können, die jedoch die Aktivität der hierin beschriebenen Zusammensetzung erhöhen. hVEGFr beispielsweise, die in der Lage sind, sich an hVEGF zu binden, werden mit heterologen Polypeptiden wie Virussequenzen, mit Zellrezeptoren, mit Zytokinen wie TNF, Interferonen oder Interleukinen, mit Polypeptiden, die Koagulationsfördernde Aktivität aufweisen, und mit anderen biologisch oder immunologisch aktiven Polypeptiden fusioniert. Solche Fusionen können leicht durch Rekombinationsverfahren gebildet werden. Typischerweise werden solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide anstelle der Transmembran und/oder intrazellulären Domäne eines hVEGFr eingesetzt.
hVEGF-Bindungsdomänen in hVEGFr werden mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren bestimmt, umfassend Röntgenuntersuchungen, Mutationsanaly sen und Antikörperbindungs-Untersuchungen. Die auf Mutationen basierenden Ansätze umfassen die Verfahren der Zufalls-Sättigungsmutagenese in Verbindung mit der Auswahl von Ausweichmutanten und der Insertionsmutagenese. Ein anderes Verfahren, das zur Identifikation Rezeptor-bindender Domänen in Liganden geeignet ist, ist bekannt als Alanin- (Ala-) Scanning-Mutagenese. Cunningham et al., Science 244, 1081-1985 (1989). Dieses Verfahren umfasst die Identifikation von Regionen, die geladene Aminosäuren-Seitenketten enthalten. Die geladenen Reste in jeder identifizierten Region (d.h. Arg, Asp, His, Lys und Glu) werden ersetzt (eine Region pro mutiertes Molekül) mit Ala, und die Rezeptorenbindung der erhaltenen Liganden wird getestet, um die Bedeutung der bestimmten Region bei Rezeptorenbindung zu bewerten. Ein weiteres wirksames Verfahren zur Lokalisierung von Rezeptorbindungs-Domänen erfolgt über die Verwendung neutralisierender Anti-hVEGF-Antikörper. Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992). Üblicherweise wird eine Kombination dieser und ähnlicher Verfahren zum Lokalisieren der Domänen, die in Rezeptorenbindung eingebunden sind, verwendet.
Fragmente und Aminosäuresequenz-Varianten von hVEGF können mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie beispielsweise mittels ortsgerichteter Mutagenese der für den nativen Faktor kodierenden DNA, leicht hergestellt werden. Die mutierte DNA wird in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert, und Wirtszellen werden dann mit dem rekombinanten Vektor transfiziert. Die rekombinanten Wirtszellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, und das erwünschte Fragment oder die gewünschte Aminosäuresequenz-Variante, die in den Wirtszellen exprimiert wird, werden dann mittels Chromatographie- oder anderen Reinigungsverfahren aus der rekombinanten Zellkultur gewonnen.
Alternativ dazu werden Fragmente und Aminosäurevarianten von hVEGF in vitro hergestellt, beispielsweise durch Proteolyse von nativem hVEGF oder durch Synthese unter Verwendung von Standard-Festphasen-Peptidsyntheseverfahren, wie von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)) beschrieben wird, obwohl andere äquivalente chemische Synthesen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden können. Festphasen-Synthese geht vom C-Terminus des Peptids durch Binden einer geschützten α-Aminosäure an ein geeignetes Harz aus. Die Aminosäuren werden an die Peptidkette unter Verwendung von Verfahren gebunden, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Bildung von Peptidbindungen bekannt sind.
Therapeutische Verwendungen
Bei therapeutischen Anwendungen werden die Antagonisten der Erfindung einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform verabreicht, umfassend jene, die einem Menschen intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über eine längere Zeitspanne hinweg, auf intramuskulärem, intraperitonealem, intrazerebrospinalem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem Weg oder über Inhalation, verabreicht werden. Die Antagonisten können auch intraläsional oder periläsional geeignet verabreicht werden, um sowohl lokale als auch systemische therapeutische Wirkungen zu erzielen.
Solche Dosierungsformen umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, die von Natur aus nicht toxisch und ohne therapeutische Wirkung sind. Beispiele für solche Träger umfassen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine wie menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische gesättigter pflanzlicher Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid, Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose-basierte Substanzen und Polyethylenglykol. Träger topischer oder gelbasierter Antagonistenformen umfassen Polysaccharide wie Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol und Holzwachs-Alkohole. Für alle Verabreichungen sind herkömmliche Depotformen geeignet. Solche Formen umfassen beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposomen, Pflaster, Inhalationsmittel, Nasensprays, sublinguale Tabletten und Retard-Präparate. Der Antagonist wird typischerweise in solchen Trägern bei einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen fester hydrophober Polymere, die den Antagonisten enthalten, wobei diese Matrizen in Form geformter Teile vorliegen, z.B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981), und von Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982), beschrieben, oder Poly(vinylalkohol), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983), nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie das Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxy-buttersäure. Während Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine nur für kürzere Zeitspannen frei. Verbleiben verkapselte Polypeptidantagonisten über eine lange Zeitspanne hinweg im Körper, können sie aufgrund von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Sinnvolle Strategien zur Stabilisierung können je nach den eingebundenen Mechanismen entwickelt werden. Beispielsweise kann, sofern der Aggregationsmechanismus als eine intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch erkannt wird, Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrollieren des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrizen-Zusammensetzungen erreicht werden.
Retard-hVEGF-Antagonisten-Zusammensetzungen umfassen auch Liposomen-gefangene Antagonisten-hVEGFr. Liposomen, die die Antagonisten enthalten, werden mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren hergestellt, wie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); US-Patent Nr. 4.485.045; US-Patent Nr. 4.544.545 beschrieben wird. Üblicherweise sind die Liposomen solche vom kleinen (etwa 200-800 Ångström) einschichtigen Typ, in dem der Lipidgehalt über etwa 30 Mol-% Cholesterin liegt, wobei der ausgewählte Abschnitt auf die optimale HRG-Therapie abgestimmt wird. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Eine andere Verwendung umfasst das Einbinden eines hVEGF-Antagonisten in gebildete Teile. Solche Teile können zum Modulieren von Endothelzellwachstum und von Angiogenese verwendet werden.
Zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen hängt die geeignete Dosierung des Antagonisten vom Typ der zu behandelnden Erkrankung, wie zuvor definiert, und der Schwere und des Verlaufs der Erkrankung, ob die Antikörper zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht werden, von der vorangehenden Therapie, von der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf den Antagonisten ab und liegt im Ermessen des behandelnden Arztes. Der Antagonist wird dem Patienten geeigneterweise einmal oder im Rahmen einer Reihe von Behandlungen verabreicht.
Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für schwere Einschränkungen des Sehvermögens bei älteren Menschen. Die exsudative Form von AMD ist durch Gefäßneubildung in der Aderhaut und Netzhautpigment-Epithelzellenablösung gekennzeichnet. Da Gefäßneubildung in der Aderhaut mit einer drastischen Verschlechterung der Prognose einhergeht, wird von den VEGF-Antagonisten der vorliegenden Erfindung angenommen, dass sie zur Einschränkung der Schwere von AMD besonders nützlich sind.
Je nach Art und Schwere der Erkrankung beträgt eine vermutliche anfängliche Dosierung zur Verabreichung an den Patienten etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg des Antagonisten, die beispielsweise einmalig oder mehrere Male oder auch über kontinuierliche Infusion verabreicht wird. Eine typische tägliche Dosierung könnte je nach den zuvor genannten Faktoren im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr liegen. Bei wiederholten Verabreichungen über mehrere Tage oder länger, je nach Zustand des Patienten, wird die Behandlung wiederholt, bis eine erwünschte Unterdrückung der Erkrankungssymptome auftritt. Es können jedoch auch andere Dosierungspläne nützlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mittels herkömmlicher Verfahren und Tests beobachtet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Wirksamkeit des Antagonisten bei der Prävention oder Behandlung der Erkrankung durch serielle Verabreichung des Antagonisten oder in Kombination mit einem anderen Mittel, das zu diesen Zwecken wirksam ist, verbessert werden. Beispiele hierfür sind Tumornekrose-Faktor (TNF), ein Antikörper, der in der Lage ist, die angiogene Aktivität von saurem oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) oder Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) zu hemmen oder zu neutralisieren, ein Antikörper, der in der Lage ist, die Koagulationsaktivitäten von Gewebefaktor, Protein C oder Protein S zu hemmen oder zu neutralisieren (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 91/01753, veröffentlicht am 21. Februar 1991), ein Antikörper, der in der Lage ist, sich an HER2-Rezeptor zu binden (siehe Hudziak et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 89/06692, veröffentlicht am 27. Juli 1989), oder ein oder mehrere herkömmliche therapeutische Mittel wie beispielsweise Alkylierungsmittel, Folsäure-Antagonisten, Anti-Metabolite aus Nucleinsäuremetabolismus, Antibiotika, Pyrimidinanaloga, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Purinnucleoside, Amine, Aminosäuren, Triazolnucleoside oder Corticosteroide. Solche andere Mittel können in der zu verabreichenden Zusammensetzung vorhanden sein oder können getrennt verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele werden nur zur Veranschaulichung bereitgestellt und sind in keiner Weise als Einschränkung der Erfindung zu betrachten.
BEISPIEL 1
(STAND DER TECHNIK)
Herstellung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern
Um hVEGF zur Immunisierung zu erhalten, der an ein Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) konjugiert ist, wurde rekombinanter hVEGF (165 Aminosäuren), Leung et al., Science 246, 1306 (1989), mit KLH in einem Verhältnis 4:1 in Gegenwart von 0,05 % Glutaraldehyd vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtem peratur 3 Stunden lang unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Das Gemisch wurde dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) bei 4 °C über Nacht dialysiert.
BALB/c-Mäuse wurden viermal alle zwei Wochen mittels intraperitonealer Injektionen mit 5 μg hVEGF, konjugiert an 20 μg KLH, immunisiert und wurden mit derselben Dosis an hVEGF, konjugiert an KLH, vier Tage vor der Zellfusion geboostet.
Milzzellen der immunisierten Mäuse wurden mit P3X63Ag8U.1-Myelomzellen, Yelton et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1 (1978), unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol (PEG) wie beschrieben fusioniert. Yarmush et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77, 2899 (1980). Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert.
Überstände von Hybridom-Zellkulturen wurden auf Anti-hVEGF-Antikörperproduktion durch einen ELISA-Test unter Verwendung von hVEGF-beschichteten Mikrotiterplatten gescreent. Antikörper, der in jedem der Wells an hVEGF gebunden war, wurde unter Verwendung von an alkalische Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulin und dem chromogenen Substrat p-Nitrophenylphosphat bestimmt. Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Hybridomzellen, die so festgelegt wurden, dass sie Anti-hVEGF-Antikörper produzieren, wurden durch Grenzverdünnung subkloniert, und zwei dieser Klone, die als A4.6.1 und B2.6.2 bezeichnet sind, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt.
BEISPIEL 2
(STAND DER TECHNIK)
Charakterisierung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern
A. Antigen-Spezifität
Die Bindungsspezifitäten der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, wurden mittels ELISA bestimmt. Die monoklonalen Antikörper wurden den Wells der Mikrotiterplatten zugesetzt, die davor mit hVEGF, FGF, HGF oder Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) beschichtet worden waren. Gebundener Antikörper wurde mit an Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulinen nachgewiesen. Die Resultate dieser Tests bestätigten, dass sich die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildeten monoklonalen Antikörper an hVEGF binden, sich jedoch nicht nachweisbar an jene anderen Proteinwachstumsfaktoren binden.
B. Epitop-Kartierung
Ein kompetitiver Bindungs-ELISA wurde verwendet, um zu bestimmen, ob sich die monoklonalen Antikörper, die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, an dieselben oder an unterschiedliche Epitope (Stellen) innerhalb von hVEGF binden. Kim et al., Infect. Immun. 57, 944 (1989). Einzelne, nichtmarkierte monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper (A4.6.1 oder B2.6.2) oder irrelevanter Anti-HGF-Antikörper (IgG1-Isotyp) wurden den Wells von Mikrotiterplatten zugesetzt, die davor mit hVEGF beschichtet worden waren. Biotinylierte monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper (BIO-A4.6.1 oder BIO-B2.6.2) wurden anschließend zugesetzt. Das Verhältnis von biotinylierten Antikörpern zu nichtmarkierten Antikörpern belief sich auf 1:1000. Die Bindung der biotinylierten Antikörper wurde durch Zusatz von Avidin-konjugierter Peroxidase, gefolgt von o-Phenylendiamindihydrochlorid und Wasserstoffperoxid, sichtbar gemacht. Die Farbreaktion, die die Menge des gebundenen biotinylierten Antikörpers angibt, wurde durch Messen der optischen Dichte (O.D.) bei einer Wellenlänge von 495 nm bestimmt.
Wie in 1 gezeigt, wurde die Bindung des biotinylierten Anti-hVEGF-Antikörpers in jedem Fall durch den entsprechenden nichtmarkierten Antikörper gehemmt, jedoch nicht durch den anderen nichtmarkierten Anti-hVEGF-Antikörper oder den Anti-HGF-Antikörper. Diese Ergebnisse geben an, dass sich die monoklonalen Antikörper, die durch die A4.6.1- und B2.6.2-Hybridome gebildet wurden, innerhalb von hVEGF an verschiedene Epitope binden.
C. Isotypisierung
Die Isotype der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von den A4.6.1- und B.2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, wurden mittels ELISA bestimmt. Proben des Nährmediums (Überstand), in dem beide Hybridome gezüchtet wurden, wurden den Wells der Mikrotiterplatten zugesetzt, die davor mit hVEGF beschichtet worden waren. Die eingefangenen, monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurden mit verschiedenen, Isotypen-spezifischen, an alkalische Phosphatase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulinen inkubiert, und die Bindung der konjugierten Antikörper an die monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurde durch den Zusatz von p-Nitrophenylphosphat bestimmt. Die Farbreaktion wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Plattenleser gemessen.
Durch dieses Verfahren wurde der Isotyp der von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildeten monoklonalen Antikörper als IgG1 bestimmt.
D. Bindungsaffinität
Die Affinitäten der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, für hVEGF wurden durch einen kompetitiven Bindungstest bestimmt. Eine vorgegebene sub-optimale Konzentration an monoklonalen Antikörpern wurde den Proben zugesetzt, die 20.000 bis 40.000 cpm ¹²⁵IhEVGF (1 – 2 ng) und verschiedene bekannte Mengen an nichtmarkiertem hVEGF (1 – 1.000 ng) enthielten. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur, wurden 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Ig-Antiseren (Pel-Freez, Rogers, AR, USA) zugesetzt, und die Gemische wurden eine weitere Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Komplexe von Antikörpern und gebundenen Proteinen (Immun-Komplexe) wurden unter Zusatz von 500 μl von 6%igem Polyethylenglykol (PEG, Molekulargewicht 8.000) bei 4 °C gefällt und danach bei 2000 × g 20 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Die Menge an ¹²⁵I-hVEGF, die an den monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper in jeder Probe gebunden war, wurde durch Zählen des pelletierten Materials in einem Gamma-Zähler bestimmt.
Affinitätskonstanten wurden aus den Daten mittels Scatchard-Analyse berechnet. Die Affinität des monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers, der vom A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, wurde auf 1,2 × 10⁹ l/mol berechnet. Die Affinität des monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers, der vom B2.6.2-Hybridom gebildet wurde, wurde auf 2,5 × 10⁹ l/mol berechnet.
E. Hemmung der mitogenen Aktivität von hVEGF
Rinder-Nebennierenrindenkapillarendothel- (ACE-) Zellen, Ferrara et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 5773 (1987), wurden in einer Dichte von 10⁴ Zellen/ml in 12 Multiwell-Platten gesät, und 2,5 ng/ml hVEGF wurden jedem Well in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper, die von A4.6.1- oder B2.6.2-Hybridomen gebildet wurden, oder eines irrelevanten monoklonalen Anti-HGF-Antikörpers zugesetzt. Nach fünftägigem Kultivieren wurden die Zellen in jedem Well in einem Coulter-Zähler gezählt. Als Kontrolle wurden ACE-Zellen in Abwesenheit von zugesetztem hVEGF kultiviert.
Wie in 2 gezeigt hemmten beide der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper die Fähigkeit des zugesetzten hVEGF, das Wachstum oder Überleben der Rinder-ACE-Zellen zu unterstützen. Der monoklonale Antikörper, der vom A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, hemmte die mitogene Aktivität von hVEGF völlig (mehr als etwa 90 % Hemmung), während der monoklonale Antikörper, der vom B2.6.2-Hybridom gebildet wurde, die mitogene Aktivität von hVEGF nur teilweise hemmte.
F. Hemmung von hVEGF-Bindung
Rinder-ACE-Zellen wurden in einer Dichte von 2,5 × 10⁴ Zellen/0,5 ml/Well in 24-Well-Mikrotiterplatten in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), das 10 % Rinderserum, 2 mM Glutamin und 1 ng/ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor enthielt, gesät. Nach dem Kultivieren über Nacht wurden die Zellen bei 4 °C einmal in Bindungspuffer gewaschen (gleiche Volumina an DMEM und F12-Medium plus 25 mM HEPES und 1 % Rinderserumalbumin).
12.000 cpm ¹²⁵I-hVEGF (etwa 5 × 10⁴ cpm/ng/ml) wurden 30 Minuten lang mit 5 μg des monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers, der vom A4.6.1-, B2.6.2- oder A2.6.1-Hybridom (250 μl Gesamtvolumen) gebildet worden war, vorinkubiert, und danach wurden die Gemische den Rinder-ACE-Zellen in den Mikrotiterplatten zugesetzt. Nach dreistündigem Inkubieren der Zellen bei 4 °C wurden die Zellen dreimal mit Bindungspuffer bei 4 °C gewaschen, durch Zusatz von 0,5 ml von 0,2 N NaOH löslich gemacht und in einem Gamma-Zähler gezählt.
Wie in 3 (oben) gezeigt, hemmten die von A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen gebildeten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen. Im Gegensatz dazu hatte der vom A2.6.1-Hybridom- gebildete Anti-hVEGF-Antikörper keine erkennbare Wirkung auf die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen. Im Einklang mit den im zuvor beschriebenen Zellvermehrungstest erhaltenen Resultaten hemmte der vom A4.6.1-Hybridom gebildete monoklonale Antikörper die Bindung von hVEGF stärker als der vom B2.6.2.-Hybridom gebildete monoklonale Antikörper.
Wie in 3 (unten) gezeigt, hemmte der vom A.4.6.1-Hybridom gebildete monoklonale Antikörper die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen bei einem Molverhältnis von hVEGF zu Antikörper von 1:250 vollständig.
G. Kreuzreaktivität mit anderen VEGF-Isoformen
Um zu bestimmen, ob der monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper, der vom A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, mit den 121- und 189-Aminosäureformen von hVEGF reaktiv ist, wurde der Antikörper auf seine Fähigkeit getestet, diese Polypeptide immunzufällen.
Menschliche 293-Zellen wurden mit Vektoren, die die kodierende Nucleotidsequenz der 121- und 189-Aminosäure-hVEGF-Polypeptide umfassten, wie beschrieben transfiziert. Leung et al., Science 246, 1306 (1989). Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in Medium transferiert, das kein Cystein und Methionin aufwies.
Die Zellen wurden 30 Minuten lang in diesem Medium inkubiert, dann wurden 100 μCi/ml von ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein dem Medium zugesetzt, und die Zellen wurden weiter zwei Stunden lang inkubiert. Die Markierung wurde durch Transferieren der Zellen in serumfreies Medium und dreistündiges Inkubieren beobachtet. Das Zellnährmedium wurde gesammelt, und die Zellen wurden durch 30-minütiges Inkubieren in Lysepuffer (150 mM NaCl, 1 % NP40, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris, pH 8,0) lysiert. Zelltrümmer wurden aus den Lysaten durch 30-minütige Zentrifugation bei 200 × g entfernt.
500 μl Proben von Zellnährmedium und Zelllysaten wurden mit 2 μl A4.6.1-Hybridomantikörper (2,4 mg/ml) 1 Stunde lang bei 4 °C und anschließend mit 5 μl Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Immunglobulin 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Immunkomplexe von ³⁵S-markiertem und monoklonalemn Anti-hVEGF-Antikörper wurden mit Protein-A-Sepharose (Pharmacia) gefällt und dann unter reduzierenden Bedingungen SDS-12%-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Das Gel wurde zur Analyse der immungefällten, radioaktiv markierten Proteine durch Autoradiographie einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Die Ergebnisse dieser Analyse gaben an, dass der monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper, der durch das A4.6.1-Hybridom gebildet wurde, sowohl mit der 121- als auch der 189-Aminosäureform von hVEGF kreuzreaktiv war.
BEISPIEL 3
Herstellung von hVEGF-Rezeptor-IgG-Fusionsprotein
Die Nucleotid- und Aminosäure-Codiersequenzen des flt-hVEGF-Rezeptors sind in Shibuya et al., Oncogene 5, 519-524 (1990), offenbart. Die Codiersequenz der extrazellulären Domäne des flt-hVEGF-Rezeptors wurde mit der Codiersequenz der menschlichen IgG1-Schwerkette in einem zweistufigen Verfahren fusioniert.
Ortsgerichtete Mutagenese wurde verwendet, um eine BstBI-Restriktion in die für flt kodierende DNA an der Stelle 5' zum Codon für Aminosäure 759 von flt einzuführen und um die einzige BstEII-Restriktionsstelle im Plasmid pBSSK^–FC, Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991), zu einer BstBI-Stelle umzuwandeln. Das modifizierte Plasmid wurde mit EcoRI und BstBI verdaut, und das große resultierende Fragment von Plasmid-DNA wurde mit einem EcoRI-BstBI-Fragment der flt-DNA, die für die extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1-758) des flt-hVEGF-Rezeptors kodiert, ligiert.
Das resultierende Konstrukt wurde mit ClaI und NotI verdaut, um ein etwa 3,3-kb-Fragment zu bilden, das anschließend in die multiple Klonierungsstelle des Säugetier-Expressionsvektors pHEBO2 (Leung et al., Neuron 8, 1045 (1992)) durch Ligation insertiert wurde. Die Enden des 3,3-kb-Fragments werden beispielsweise durch Hinzufügen von Linkern modifiziert, um Insertion des Fragments in den Vektor in korrekter Ausrichtung zur Expression zu erhalten.
Säugetier-Wirtszellen (beispielsweise CEN4-Zellen (Leung et al., s.o.) werden mit dem pHEBO2-Plasmid, das das flt-Insert enthält, durch Elektroporation transfiziert. Transfizierte Zellen werden in Medium, das etwa 10 % fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika enthält, kultiviert und bei etwa 75 % Konfluenz in serumfreies Medium transferiert. Das Medium wird 3-4 Tage vor dem Sammeln konditioniert, und das flt-IgG-Fusionsprotein wird durch Chromatographie auf einer Protein-A-Affinitätsmatrix, im Wesentlichen wie in Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991), beschrieben, aus dem konditionierten Medium gereinigt.
BEISPIEL 4
(STAND DER TECHNIK)
Hemmen des Tumorwachstums mit hVEGF-Antagonisten
Verschiedene menschliche Tumorzelllinien, die in Kultur gezüchtet wurden, wurden mittels ELISA auf Produktion von hVEGF getestet. Für Eierstock-, Lungen-, Dickdarm-, Magen-, Brust- und Gehirntumor-Zelllinien wurde erkannt, dass sie hVEGF bilden. Drei hVEGF bildende Zelllinien, NEG 55 (auch als G55 bezeichnet) (menschliche Gliomzelllinie, erhalten von Dr. M. Westphal, Neurochirurgische Abteilung der Universitätsklinik Hamburg-Eppendorf, Deutschland, auch als G55 bezeichnet), A-673 (menschliche Rhabdomyosarkomzelllinie, erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA 20852, als Zellliniennummer CRL 1598) und SK-LMS-1 (Leiomyosarkomzelllinie, erhalten von der ATCC als Zellliniennummer HTB 88), wurden für weitere Studien verwendet.
Sechs bis zehn Wochen alten, weiblichen Beige/Nacktmäuse (Charles River Laboraton, Wilmington, Massachusetts, USA) wurden subkutan 1 – 5 × 10⁶ Tumorzellen in 100-200 μl PBS injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten, nachdem Tumorwachstum nachgewiesen worden war, wurde den Mäusen intraperitoneal ein- oder zweimal pro Woche verschiedene Dosen an monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper, einem irrelevanten monoklonalen Anti-gp120-Antikörper (5B6) oder PBS injiziert. Die Tumorgröße wurde jede Woche gemessen, und zu Abschluss der Studie wurden die Tumoren herausgeschnitten und gewogen.
Die Wirkung der verschiedenen Mengen an monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf das Wachstum von NEG-55-Tumoren bei Mäusen ist in den 4 und 5 dargestellt. 4 zeigt, dass Mäuse, die mit 25 μg oder 100 μg monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper beginnend eine Woche nach Inokulation der NEG-55-Zellen behandelt wurden, im Vergleich zu Mäusen, die entweder mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden, eine wesentlich reduzierte Tumorwachstumsgeschwindigkeit aufwiesen. 5 zeigt, dass fünf Wochen nach Inokulation der NEG-55-Zellen die Größe der Tumoren bei Mäusen, die mit A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 50 % (bei Mäusen, die mit 25-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) bis 85 % (bei Mäusen, die mit 100-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) geringer war als die Größe der Tumoren bei Mäusen, die mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden.
Die Wirkung der Behandlung mit monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf das Wachstum von SK-LMS-1-Tumoren bei Mäusen ist in 6 dargestellt. Fünf Wochen nach Inokulation der SK-LMS-1-Zellen war die mittlere Tumorgröße bei Mäusen, die mit dem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 75 % geringer als die Tumorgröße bei Mäusen, die mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden.
Die Wirkung der Behandlung mit monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf das Wachstum von A673-Tumoren bei Mäusen ist in 7 dargestellt. Vier Wochen nach Inokulation der A673-Zellen war die mittlere Tumorgröße bei Mäusen, die mit dem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 60 % (bei Mäusen, die mit 10-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) bis um mehr als 90 % (bei Mäusen, die mit 50- bis 400-μg-Dosierungen des Antikörpers behandelt wurden) geringer als die Tumorgröße bei Mäusen, die mit irrelevantem Antikörper oder PBS behandelt wurden.
BEISPIEL 5
(STAND DER TECHNIK)
Analyse der direkten Wirkung von Anti-hVEGF-Antikörper auf in Kultur wachsende Tumorzellen
Menschliche NEG55-Glioblastomzellen oder A673-Rhabdomyosarkomzellen wurden bei einer Dichte von 7 × 10³ Zellen/Well in Multiwell-Platten (12 Wells/Platte) in F12/DMEM-Medium, das 10 % fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika enthielt, gesät. Der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper wurde dann den Zellkulturen auf eine Endkonzentration von 0 – 20,0 μg Antikörper/ml zugesetzt. Nach fünf Tagen wurden die in den Wells wachsenden Zellen durch Aussetzung gegenüber Trypsin dissoziiert und in einem Coulter-Zähler gezählt.
Die 8 und 9 zeigen die Resultate dieser Studien. Darin ist ersichtlich, dass der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper keine signifikante Wirkung auf das Wachstum der NEG55- oder A673-Zellen in Kultur hatte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper nicht zytotoxisch ist, und lassen sehr stark darauf schließen, dass die beobachteten Anti-Tumor-Wirkungen des Antikörpers auf sein Hemmen von VEGF-vermittelter Gefäßneubildung zurückzuführen ist.
BEISPIEL 6
(STAND DER TECHNIK)
Wirkung des Anti-hVEGF-Antikörpers auf Endothelzellen-Chemotaxis
Chemotaxis von Endothelzellen und anderen Zellen, umfassend Monozyten und Lymphozyten, spielt in der Pathogenese von rheumatoider Arthritis eine wichtige Rolle. Endothelzellwanderungen und -vermehrung begleiten die Angiogenese, die in der rheumatoiden Synovialhaut auftritt. Vaskularisiertes Gewebe (Pannus) dringt in die Gelenksknorpel ein und zerstört sie.
Um zu bestimmen, ob hVEGF-Antagonisten diesen Prozess stören, -wurde die Wirkung des A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpers auf Endothelzell-Chemotaxis getestet, die durch Gelenksschmiere von Patienten, die an rheumatoider Arthritis litten, stimuliert wurde. Als Kontrolle testeten die Erfinder auf die Wirkung des A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpers auf Endothelzell-Chemotaxis, die durch Gelenksschmiere von Patienten, die an Osteoarthritis litten, stimuliert wurde (die Angiogenese, die bei rheumatoider Arthritis auftritt, tritt bei Osteoarthritis nicht auf).
Endothelzell-Chemotaxis wurde unter Verwendung modifizierter Boyden-Kammern gemäß den bereits bekannten Verfahren getestet. Thompson et al., Cancer Res. 51, 2670 (1991); Phillips et al., Proc. Exp. Biol. Med. 197, 458 (1991). Etwa 104 menschliche Nabelvenen-Endothelzellen wurden auf Gelatine-beschichteten Filtern (0,8 μm Porengröße) in 48-Well-Multiwell-Mikrokammern in Kulturmedium, das 0,1 % fötales Rinderserum enthielt, anhaften gelassen. Nach etwa zwei Stunden wurden die Kammern umgedreht, und Testproben (rheumatoide Arthritis-Gelenksschmiere, Osteoarthritis-Gelenksschmiere, basischer FGF (bFGF) (bei einer Endkonzentration von 1 μg/ml) oder PBS) und A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper (bei einer Endkonzentraiton von 10 μg/ml) wurden den Wells zugesetzt. Nach zwei bis vier Stunden wurden die Zellen, die migrierten, gefärbt und gezählt.
10 zeigt die gemittelten Ergebnisse dieser Studien. Die in der mit "Gelenksschmiere" gekennzeichnete Spalte gezeigten Werte und jene, die am Ende der Seite für die Kontrollen gezeigt sind, stellen die mittlere Anzahl an Endothelzellen dar, die in Gegenwart von Gelenksschmiere, bFGF oder PBS alleine migrierten. Die in der mit "Gelenksschmiere + mAB VEGF" gekennzeichneten Spalte gezeigten Werte sind die mittlere Anzahl von Endothelzellen, die in Gegenwart von Gelenksschmiere plus zugesetztem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper migrierten. Die in der mit "% Unterdrückung" gekennzeichneten Spalte gezeigten Werte geben den Rückgang der durch Gelenksschmiere induzierten Zellmigration in Prozent an, der durch den Zusatz von Anti-hVEGF-Antikörper entstand. Wie angegeben hemmte der Anti-hVEGF-Antikörper die Fähigkeit der rheumatoiden Arthritis-Gelenksschmiere signifikant (53,40 % mittlere Hemmung), aber nicht jene der Osteoarthritis-Gelenksschmiere (13,64 % mittlere Hemmung), um Endothelzellmigration zu induzieren.

Claims

Verwendung eines hVEGF-Antagonisten bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von altersbedingter Makuladegeneration bei einem menschlichen Patienten, worin der hVEGF-Antagonist die Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne eines hVEGFr umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin hVEGFr der flt-Rezeptor oder der flk-1-
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Transmembran- und die Cytoplasmadomäne des hVEGFr zerstört sind.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der hVEGF-Antagonist ein Fusionsprotein ist, das weiters ein Nicht-hVEGFr-Polymer oder -Polypeptid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, worin das Nicht-hVEGFr-Polypeptid ein Immunglobulin ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die Fv-Domäne einer Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkette durch die extrazelluläre Domäne des hVEGFr ersetzt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, worin die Fv-Domäne von einer Immunglobulin-Schwerkette stammt.
Verwendung nach Anspruch 7, worin der C-Terminus der extrazellulären Domäne des Rezeptors kovalent an den Amino-Terminus von C_H1, Gelenk oder C_H2 der schweren Kette gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin der hVEGFr an ein nichtproteinartiges Polymer konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin das nichtproteinartige Polymer Polyethylenglykol ist.