ES2710543T3 - Método para preparar una disolución acuosa que contiene medio de cultivo y agente quelante - Google Patents

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Abstract

Método para preparar una disolución acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que comprende un medio de cultivo y un agente quelante, en el que el método comprende añadir el agente quelante a la disolución acuosa antes del ajuste de pH final de la disolución acuosa, y en el que el agente quelante se añade antes de la adición del medio de cultivo en polvo.

Description

DESCRIPCION
Metodo para preparar una disolucion acuosa que contiene medio de cultivo y agente quelante.
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo para preparar una disolucion acuosa que incluye un medio de cultivo y un agente quelante, un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa utilizando el metodo de cultivo, un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa, o un metodo para producir la sustancia fisiologicamente activa mediante la preparacion de la disolucion acuosa, llevando a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa y cultivando despues las celulas utilizando la disolucion acuosa.
Antecedentes de la tecnica
Las sustancias fisiologicamente activas, en particular las glucoprotemas o anticuerpos, se han aprobado recientemente como diversos tipos de biofarmaceuticos, y actualmente se encuentran en desarrollo mas sustancias candidatas (literatura no de patentes n° 1). Por este motivo, se espera que la produccion de sustancias fisiologicamente activas, tales como glucoprotemas, anticuerpos o similares utilizando celulas se llevara a cabo mas activamente.
Con respecto a la preparacion de una disolucion acuosa para el cultivo celular que resulta esencial para la produccion de estas sustancias fisiologicamente activas utilizando celulas, se requiere la esterilizacion del medio de cultivo para garantizar la seguridad de producto y procedimiento. Hasta el momento, se ha utilizado ampliamente un procedimiento de filtracion a traves de membrana de 0,2 pm para eliminar los microorganismos en la preparacion de la disolucion acuosa para el cultivo celular. En los ultimos anos se ha propuesto un procedimiento de preparacion mediante de filtracion a traves de una membrana de 0,1 pm (literatura no de patentes n° 2). Por lo tanto, se requiere crecientemente una filtrabilidad de membrana excelente de la disolucion acuosa para el cultivo celular y constituye un problema.
En comparacion con los farmacos de molecula pequena, los productos biofarmaceuticos requieren elevados costes de produccion, lo que tambien constituye un problema al que se enfrentan las industrias farmaceuticas (literatura no de patente n° 3). Hasta la fecha se han realizado esfuerzos para reducir el coste mediante mejoras de la productividad que resultan de la potenciacion de algunos componentes y la adicion o enriquecimiento en nuevos componentes de la disolucion acuosa para el cultivo celular, aunque, por otra parte, ha crecido la dificultad para conseguir una filtrabilidad de membrana excelente de la disolucion acuosa. Debido a las restricciones de las instalaciones y el escalado de los equipos de produccion para satisfacer las necesidades del mercado, tambien existe una necesidad de disoluciones acuosas altamente versatiles para el cultivo celular que puedan filtrarse a traves de membrana mas establemente en un tiempo corto.
La alteracion de los equipos de filtracion, la adicion de una membrana de filtracion o la sustitucion del material de la membrana de filtracion, o la mejora de las condiciones de disolucion, tales como la temperatura, durante la preparacion de la disolucion acuosa para el cultivo celular, se han intentado con el fin de mejorar la cantidad de filtrado de la membrana o la filtrabilidad a traves de la membrana de la disolucion acuosa (literatura de patentes n° 1, literaturas no de patente n° 4 y n° 5). Sin embargo, la mejora de la filtrabilidad a traves de la membrana de la disolucion acuosa para el cultivo celular mediante el incremento de superficie de membrana no resulta industrialmente preferente en terminos de restricciones de costes e instalaciones. Ademas, la mejora de las condiciones de disolucion no ha comportado una mejora notable de la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa para el cultivo celular.
Son ampliamente conocidos agentes quelantes tales como acido cftrico, acido malico, acido etilendiaminotetraacetico o similares, como uno de los componentes contenidos en la disolucion acuosa para el cultivo celular (literaturas de patente n° 2 y 3). El acido sialico tambien es conocido como una sustancia que presenta una funcion quelante (literatura no de patente n° 6). Sin embargo, no existen informes de un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa para el cultivo celular mediante la utilizacion de agentes quelantes.
Literaturas de la tecnica anterior
Literaturas de patente
[Literatura de patente n° 1] publicacion de patente japonesa n° Hei-07-506492
[Literatura de patente n° 2] publicacion de patente japonesa n° 2003-250533
[Literatura de patente n° 3] publicacion de patente japonesa n° 2000-217455
[Literatura de patente n° 4] patente US n° 5.772.646, referida a una estructura absorbente que comprende un polisacarido microbiano y un procedimiento de preparacion del mismo.
Literaturas no de patente
[Literatura no de patente n° 1] Nature Reviews Drug Discovery, mayo de 2004, vol.3, p.383
[Literatura no de patente n° 2 ] Nature, junio de 1989, vol.339, p.487-488
[Literatura no de patente n° 3 ] The Journal of Rheumatology, noviembre de 2006, vol.33, p.2124-2131
[Literatura no de patente n° 4] Pall Corporation, "Filter Sterilization of Samples (1-100 mL) in Sterile Acrodisc (marca comercial registrada) Syringe Filters.5.3", [online], [busqueda el 15 de noviembre de 2010], internet <http://www.pall.com/variants/pdf/pdf/laboratory-49533.pdf>
[Literatura no de patente n° 5] Libro de resumen del The 23rd Annual and International Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology, septiembre de 2010, p. 127
[Literatura no de patente n° 6] Journal of Dental Research, May 1967, vol.46, n° 3, p.514-521
Divulgacion de la invencion
Problemas que debe resolver la invencion
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, a partir de los problemas anteriormente indicados, la presente exposicion proporciona un metodo de preparacion para una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad notablemente mejorada, una disolucion acuosa preparada mediante el metodo de preparacion, un metodo para cultivar celulas utilizando la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion, un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa utilizando el metodo de cultivo, una sustancia fisiologicamente activa producida mediante el metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa, un metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion de la disolucion acuosa, un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa, o un metodo para producir la sustancia fisiologicamente activa mediante la preparacion de la disolucion acuosa llevando a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa, seguido del cultivo de las celulas utilizando la disolucion acuosa.
Medios para resolver los problemas
Es decir, la presente invencion es como se expone a continuacion:
[1] Un metodo para preparar una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que comprende un medio de cultivo y un agente quelante, en donde el metodo comprende anadir el agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa, y en donde el agente quelante se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
[2] El metodo para preparar una disolucion acuosa segun [1], en la que el agente quelante es uno o mas seleccionado de acido cftrico, acido malico, acido etilendiaminotetraacetico, sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III), acido sialico, y sales o hidratos de los mismos.
[3] El metodo para preparar una disolucion acuosa segun [1] o [2], en el que el medio de cultivo en polvo incluye ademas uno o mas seleccionados de sales metalicas, azucares y vitaminas.
[4] El metodo para preparar una disolucion acuosa segun cualquiera de [1] a [3], en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para el cultivo celular.
[5] El metodo para preparar una disolucion acuosa segun cualquiera de [1] a [4], en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas animales.
[6] El metodo para preparar una disolucion acuosa segun [5], en el que le medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino.
[7] Un metodo para preparar una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que comprende un medio de cultivo y un agente quelante, en donde el metodo comprende anadir el agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa, y en donde el agente quelante se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
[8] El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana segun [7], en el que el agente quelante es uno o mas seleccionados de acido cftrico, acido malico, acido etilendiaminotetraacetico, sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III), acido sialico, y sales o hidratos de los mismos.
[9] El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana segun [7] o [8], en el que el medio de cultivo en polvo incluye ademas uno o mas seleccionados de sales metalicas, azucares y vitaminas.
[10] El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana segun cualquiera de [7] a [9], en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para el cultivo celular.
[11] El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana segun cualquiera de [7] a [10], en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas animales.
[12] El metodo para llevar a cabo una filtracion a traves de membrana segun [11], en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino.
[13] El metodo para llevar a cabo una filtracion a traves de membrana segun cualquiera de [7] a [12], en el que el filtro de membrana utilizado en la filtracion a traves de membrana presenta un tamano de poro de 1 nm a 100 pm.
[14] Un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de una disolucion acuosa, en donde el metodo comprende anadir un agente quelante y un medio de cultivo a la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, y llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa, en la que se anade el agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa, y se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
[15] Un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa, en el que el metodo comprende anadir un agente quelante, antes del ajuste del pH final, a una disolucion acuosa para preparar una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que incluye un medio de cultivo y el agente quelante, llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa, y despues cultivar las celulas utilizando la disolucion acuosa resultante, en la que el agente quelante se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
Tambien se proporciona en la presente memoria:
1. Un metodo para preparar una disolucion acuosa que comprende un medio de cultivo y un agente quelante, en el que el agente quelante se anade a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
2. El metodo para preparar una disolucion acuosa descrito en 1, anteriormente, en el que el agente quelante es uno o mas seleccionado de acido cftrico, acido malico, acido etilendiaminotetraacetico, sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III), acido sialico, y sales o hidratos de los mismos.
3. El metodo para preparar una disolucion acuosa descrito en 1 o 2, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo en polvo, un medio de cultivo lfquido o un medio de cultivo de suspension.
4. El metodo para preparar una disolucion acuosa descrito en 3, en el que el medio de cultivo en polvo incluye ademas uno o mas seleccionados de sales metalicas, azucares y vitaminas.
5. El metodo para preparar una disolucion acuosa descrito en cualquiera de 1 a 4, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para el cultivo celular.
6. El metodo para preparar una disolucion acuosa descrito en 5, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas animales.
7. El metodo para preparar una disolucion acuosa descrito en 6, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino.
8. Una disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo descrito en cualquiera de 1 a 7, anteriormente.
9. Un metodo para cultivar celulas utilizando la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo descrito en cualquiera de 1 a 7, anteriormente.
10. El metodo para cultivar celulas descrito en 9, anteriormente, en el que las celulas son celulas animales.
11. El metodo para cultivar celulas descrito en 10, anteriormente, en el que las celulas son celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino.
12. Un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa utilizando el metodo de cultivo de celulas descrito en cualquiera de 9 a 11, anteriormente.
13. El metodo de produccion descrito en 12, anteriormente, en el que la sustancia fisiologicamente activa es un peptido o una protema.
14. El metodo de produccion descrito en 13, anteriormente, en el que la protema es una glucoprotema o un anticuerpo.
15. Una sustancia fisiologicamente activa que se produce mediante el metodo de produccion descrito en cualquiera de 12 a 14, anteriormente.
16. Un metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de una disolucion acuosa que comprende un medio de cultivo y un agente quelante, en el que la disolucion acuosa se prepara mediante la adicion de un agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
17. El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana descrito en 16, anteriormente, en el que el agente quelante es uno o mas seleccionado de acido cftrico, acido malico, acido etilendiaminotetraacetico, sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III), acido sialico, y sales o hidratos de los mismos.
18. El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana descrito en 16 o 17, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo en polvo, un medio de cultivo lfquido o un medio de cultivo de suspension.
19. El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana descrito en 18, anteriormente, en el que el medio de cultivo en polvo incluye ademas uno o mas seleccionados de sales metalicas, azucares y vitaminas.
20. El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana descrito en 18 o 19, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para el cultivo celular.
21. El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana descrito en 20, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas animales.
22. El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana descrito en 21, anteriormente, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino.
23. El metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana descrita en cualquiera de 16 a 22, en el que el filtro de membrana utilizado en la filtracion a traves de membrana presenta un tamano de poro de 1 nm a 100 pm.
24. Un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de una disolucion acuosa, que comprende anadir un agente quelante a la disolucion acuosa para preparar la disolucion acuosa que incluye el agente quelante, y llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa.
25. El metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de una disolucion acuosa descrito en 24, anteriormente, que comprende ademas anadir un medio de cultivo a la disolucion acuosa para preparar la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, y llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa.
26. El metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de una disolucion acuosa descrito en 24 o 25, anteriormente, en el que el agente quelante se anade a la disolucion acuosa para preparar la disolucion acuosa que incluye el agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
27. El metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de una disolucion acuosa descrito en cualquiera de 24 a 26, anteriormente, en el que el agente quelante se anade a la disolucion acuosa antes de la adicion del medio de cultivo, o junto con el medio de cultivo simultaneamente.
28. Un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa, que comprende anadir un agente quelante a una disolucion acuosa para preparar la disolucion acuosa que incluye un medio de cultivo y el agente quelante antes del ajuste del pH final, llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa y despues cultivar las celulas utilizando la disolucion acuosa resultante.
Efecto de la invencion
Inesperadamente, en el contexto de la presente invencion se ha descubierto por primera vez que la filtrabilidad de membrana de una disolucion acuosa puede mejorarse en gran medida mediante la adicion de un agente quelante en un metodo de preparacion de la disolucion acuosa. En el contexto de la presente invencion se ha descubierto asimismo que el agente quelante mejora la filtrabilidad de membrana de una manera dependiente de la concentracion en el metodo de preparacion de la disolucion acuosa.
Ademas, en el contexto de la presente invencion se ha descubierto que la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa puede mejorarse en gran medida mediante la adicion del agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa en el metodo de preparacion de la disolucion acuosa. Ademas, en el contexto de la presente invencion se ha descubierto que puede producirse una sustancia fisiologicamente activa mediante el cultivo de celulas utilizando la disolucion acuosa que se prepara mediante la adicion del agente quelantes antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
Basandose en estos resultados, se ha demostrado que puede proporcionarse un metodo para preparar una disolucion acuosa que incluye un medio de cultivo y un agente quelante. Ademas, se ha demostrado que puede proporcionarse una disolucion acuosa preparada mediante el metodo de preparacion, un metodo para cultivar celulas utilizando la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion, un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa utilizando el metodo para cultivar celulas y una sustancia fisiologicamente activa producida mediante el metodo para producir la sustancia fisiologicamente activa.
Ademas, se ha demostrado que puede proporcionarse un metodo para llevar a cabo una filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion de la disolucion acuosa y un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa, caracterizado porque la disolucion acuosa se prepara utilizando un agente quelante. Se ha demostrado ademas que puede proporcionarse un metodo para producir la sustancia fisiologicamente activa mediante la realizacion de una filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion, seguido del cultivo de las celulas utilizando la disolucion acuosa resultante.
Breve descripcion de los dibujos
[Figura 1]. La figura 1 muestra que la filtrabilidad de una disolucion acuosa se mejora mediante la adicion de un agente quelante, en la que el eje vertical representa la cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana [Vmax (L/m2)] y el eje horizontal representa el agente quelante utilizado.
[Figura 2]. La figura 2 muestra que la filtrabilidad de la disolucion acuosa resulta notablemente mejorada mediante la adicion del agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa, en la que el eje vertical representa la cantidad de procesamiento maximo por unidad de superficie de membrana [Vmax (L/m2)] y el eje horizontal representa el punto temporal de adicion del agente quelante.
[Figura 3]. La figura 3 muestra que el agente quelante mejora la filtrabilidad de una manera dependiente de la concentracion, en la que el eje vertical representa la cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana [Vmax (L/m2)] y el eje horizontal representa la concentracion (g/l) del agente quelante.
[Figura 4]. La figura 4 muestra que el efecto de mejora de la filtrabilidad del agente quelante no depende de los materiales de la membrana y de las estructuras de la membrana, en la que el eje vertical representa la cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana [Vmax (L/m2)] y el eje horizontal representa el material de la membrana de filtracion.
[Figura 5]. La figura 5 muestra que la filtrabilidad de una disolucion acuosa resulta notablemente mejorada por la adicion de un agente quelante, en la que el eje vertical representa la cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana [Vmax (L/m2)] y el eje horizontal representa el tipo de disolucion.
Formas de realizacion para poner en practica la invencion
A continuacion en la presente memoria se describe en detalle la presente invencion.
La presente exposicion se refiere a un metodo para preparar una disolucion acuosa que incluye un medio de cultivo y un agente quelante, en el que se anade el agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
La disolucion acuosa es, aunque sin limitacion particular, preferentemente una disolucion acuosa que permite el cultivo de celulas o similar (tambien denominada disolucion acuosa para el cultivo celular).
El medio de cultivo puede ejemplificarse mediante un medio de cultivo en polvo, un medio de cultivo lfquido o un medio de cultivo de suspension. El medio de cultivo puede seleccionarse apropiadamente a partir de medios de cultivos disponibles comercialmente o puede utilizarse una mezcla de dos o mas de los mismos. Ademas, puede seleccionarse el medio de cultivo conocido descrito en las literaturas.
Ademas, el medio de cultivo puede ejemplificarse mediante un medio de cultivo para cultivar celulas bacterianas, un medio de cultivo para cultivar celulas de levadura, un medio de cultivo para cultivar celulas vegetales, un medio de cultivo para cultivar celulas animales o similares. Entre ellos, el medio de cultivo para cultivar celulas animales resulta preferente. Ademas, el medio de cultivo puede ser, aunque sin limitacion particular, por ejemplo, un medio de cultivo de expansion, un medio de cultivo basal (inicial), un medio de cultivo de alimentacion o similar.
Ademas, el medio de cultivo puede ser cualquiera de un medio de cultivo sintetico, un medio semisintetico o un medio de cultivo natural. Por ejemplo, puede incluir un medio de cultivo basal, un medio de cultivo que contiene suero, un medio de cultivo sin suero, un medio de cultivo que no contiene componentes de origen animal, un medio de cultivo libre de protemas o similares. Entre ellas, el medio de cultivo libre de suero, el medio de cultivo libre de protemas o el medio de cultivo totalmente sintetico resultan preferentes.
El medio de cultivo para el cultivo celular preferentemente es un medio de cultivo para cultivar celulas animales, y mas preferentemente un medio de cultivo para cultivar celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino.
Entre los ejemplos del medio de cultivo basal puede incluirse medio de cultivo disponible comercialmente de cada comparMa, tal como medio de cultivo RPMM640 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], un medio de cultivo MEM de Eagle [Science, 122, 501(1952)], un medio de cultivo MEM modificado por Dulbecco (DMEM) [Virology, 8, 396(1959)], un medio de cultivo 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], un medio de cultivo F12 (fabricado por LTI) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965)], un medio de Dulbecco modificado por Iscove (medio de cultivo IMDM) [J. Experimental Medicine, 147,923 (1978)], un medio de cultivo EX-CELL (marca comercial registrada) 302, un medio de cultivo EX-CELL (marca comercial registrada) 325 (fabricado por SAFC Bioscience) o un medio de cultivo CHO-S-SFMII (fabricado por Invitrogen), o medio de cultivo modificado de los mismos, o mezclas de los mismos, o similares. De entre ellos, el medio de cultivo RPMI1640, el medio de cultivo DMEM, el medio de cultivo F12, los medios de cultivo IMDM y EX-CELL (marca comercial registrada) 302, o el medio de cultivo SFM de hibridomas (fabricado por Invitrogen) resultan preferentes.
El medio de cultivo que contiene suero puede incluir, por ejemplo, los preparados mediante adicion de uno o mas sueros o fracciones de suero seleccionados de sueros de mairnferos, tales como vacas, caballos o similares, sueros de aves, tales como pollos o similares, sueros de peces, tales como la seriola o similares, y fracciones de los mismos, al medio de cultivo basal.
Entre los ejemplos del medio de cultivo libre de suero pueden incluirse los preparados mediante la adicion al medio basal de factores nutricionales, sustancias fisiologicamente activas o similares como alternativas al suero. En el medio de cultivo que no contiene ingredientes de origen animal, pueden anadirse sustancias en lugar de ingredientes de origen animal. Entre los ejemplos de las sustancias pueden incluirse sustancias fisiologicamente activas preparadas mediante recombinacion genetica, hidrolizados, lfpidos que no contienen materias primas de origen animal y similares.
Entre los ejemplos del medio de cultivo libre de protemas puede incluirse un medio ADPF (medio libre de protemas de origen animal, fabricado por HyClone), un medio de cultivo CD-hibridoma (fabricado por Invitrogen), un medio de cultivo CD-CHO (fabricado por Invitrogen), un medio de cultivo IS-CD-CHO (fabricado por Irvine Scientific), un medio de cultivo CD-CHO EX-CELL (marca comercial registrada) (fabricado por SAFC Bioscience) y similares.
El metodo de preparacion del medio de cultivo en polvo es, aunque sin limitacion particular, preferentemente un metodo de preparacion mediante un procedimiento de mezcla de ingredientes secos utilizando un molino de discos, un molino de bolas, un molino de puas o similar, o un metodo de preparacion mediante liofilizacion de la disolucion acuosa preparada previamente.
El medio de cultivo en polvo incluye un medio de cultivo presente en una forma granular.
El metodo de preparacion del medio de cultivo en polvo presente en forma granular puede incluir, aunque no se encuentra particularmente limitado, por ejemplo, la tecnologfa avanzada de granulacion Advanced granulation Technology (marca comercial registrada) o similar. Ademas, el metodo puede incluir un procedimiento de pulverizacion de una disolucion en la que por lo menos un material seleccionado del grupo que consiste en un agente espesante natural, un agente espesante sintetico, un azucar y una grasa se disuelven sobre ingredientes granulados, y el secado de la misma.
Pueden seleccionarse apropiadamente factores nutricionales deseados y anadirse al medio de cultivo. Ademas, los factores nutricionales deseados pueden seleccionarse y utilizarse apropiadamente para constituir el medio de cultivo. Entre los ejemplos de factores nutricionales pueden incluirse fuentes de carbono, tales como azucares o fuentes nitrogeno, tales como aminoacidos. Entre los ejemplos espedficos pueden incluirse aminoacidos, metales, vitaminas, azucares, sales, lfpidos, acidos nucleicos, sustancias fisiologicamente activas, acidos grasos, acidos organicos, protemas, hidrolizados o similares. Estos compuestos pueden formar sales, tales como sales hidrocloruro, sales sodicas, sales potasicas, sales amonicas o similares, y/o solvatos, tales como hidratos o similares.
Entre los ejemplos de aminoacidos pueden incluirse, aunque sin limitarse particularmente a ellos, por ejemplo, L-alanina (Ala), L-arginina (Arg), L-asparagina (Asn), acido L-aspartico (Asp), L-cistema (Cys), L-cistina, acido L-glutamico (Glu), L-glutamina (Gln), glicina (Gly), L-histidina (His), L-isoleucina (Ile), L-leucina (Leu), L-lisina (Lys), L-metionina (Met), L-fenilalanina (Phe), L-prolina (Pro), L-serina (Ser), L-treonina (Thr), L-triptofano (Trp), L-valina (Val) y similares, y se utilizan solos o en combinaciones de dos o mas de los mismos. Ademas, pueden utilizarse sales, tales como sales hidrocloruro de los mismos y sales sodicas de los mismos y/o solvatos, tales como hidratos de los mismos. Pueden anadirse como peptido, y por ejemplo, se proporcionan a tftulo ejemplar, L-alanil-L-glutamina, L-alanil-L-cistema, o similares.
Entre los ejemplos de las sustancias fisiologicamente activas pueden incluirse insulina, transferrina, albumina serica, una fraccion serica que contiene factores de crecimiento y similares.
Entre los ejemplos de los lfpidos pueden incluirse colesterol, acido linoleico, acido linolenico y similares. Ademas, pueden utilizarse sales, tales como sales hidrocloruro de los mismos y sales sodicas de los mismos y/o solvatos, tales como hidratos de los mismos.
Entre los metales puede incluirse, aunque sin limitarse particularmente a ellos, por ejemplo, hierro, manganeso, cinc, molibdeno, vanadio, cobre, cadmio, rubidio, cobalto, circonio, germanio, mquel, estano, cromo, silicio o similares, y pueden utilizarse solos o en combinacion de dos o mas de los mismos. Estos metales pueden formar sales, tales como sales hidrocloruro, sales sulfato, sales sodicas, sales potasicas, sales amonicas o similares, y/o solvatos, tales como hidratos o similares.
El azucar puede ser, aunque sin limitarse particularmente a ellos, cualquiera de monosacaridos, oligosacaridos o polisacaridos. El azucar puede incluir ademas derivados de azucar, tales como desoxiazucares, acidos uronicos, aminoazucares, alcoholes de azucar o similares. Entre los ejemplos de los mismos puede incluirse glucosa, manosa, galactosa, fructosa, ribosa, arabinosa, ribulosa, eritrosa, eritrulosa, gliceraldetudo, dihidroxiacetona, sedoheptulosa, maltosa, lactosa, sacarosa o similares, y pueden utilizarse solos o en combinacion de dos o mas de los mismos. Tambien pueden utilizarse sales de los mismos, tales como sales hidrocloruro, sales sodicas o similares, y/o solvatos de los mismos, tales como hidratos o similares.
Entre los ejemplos de las vitaminas pueden incluirse, aunque sin limitarse particularmente a ellos, por ejemplo, dbiotina, acido D-pantotenico, colina, folato, mioinositol, niacinamida, piridoxal, riboflavina, tiamina, cianocobalamina, DL-a-tocoferol y similares, y pueden utilizarse solos o en combinaciones de dos o mas de los mismos. Ademas, pueden utilizarse sales, tales como sales hidrocloruro de los mismos y sales sodicas de los mismos y/o solvatos, tales como hidratos de los mismos.
El hidrolizado puede ejemplificarse mediante hidrolizados de soja, trigo, arroz, guisantes, semilla de algodon, pescado o extracto de levadura, o extractos de los mismos. Un ejemplo espedfico del mismo puede incluir SOY HYDROLYSATE UF (fabricado por SAFC Bioscience, n° de catalogo 91052-1K3986 o 91052-5K3986).
El agente quelante no se encuentra particularmente limitado, con la condicion de que cumpla el uso pretendido de la disolucion acuosa preparada mediante la adicion del agente quelante. Ademas, el agente quelante que debe utilizarse de acuerdo con la presente invencion puede utilizarse solo o puede utilizarse una pluralidad de tipos de agente quelante.
Como agente quelante, resulta particularmente preferente un agente quelante soluble en agua, y entre los ejemplos del mismo se incluyen agentes quelantes basados en acido aminocarboxflico, basados en acido oxicarboxflico, basados en acido carboxflico dibasico inferior, polioles o compuestos inorganicos. Ademas, el agente quelante que debe utilizarse de acuerdo con la presente invencion puede formar sales o similares con la condicion de que mantenga el efecto quelante, y por ejemplo, puede formar sales, tales como sales hidrocloruro, sales sodicas, sales potasicas, sales amonicas o similares, y/o solvatos, tales como hidratos o similares.
Entre los ejemplos espedficos del agente quelante a base de acido aminocarboxflico puede incluirse acido nitrilotriacetico (NTA), acido N-hidroxietiliminodiacetico (NIMDA), acido etilendiaminodiacetico (EDDA), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III) (sal sodica de EDTA-hierro (III)), acido N-hidroxietiletilendiaminotetraacetico (HEDTA), acido dietilentriaminapentaacetico (DTPA), acido 1,2-ciclohexanodiamm-tetraacetico (CyDTA), acido trimetilendiaminotetraacetico (TMTA), eter dietflico de etilenglicol-acido diamino-tetraacetico (GEDTA), acido etilendiamino-tetrapropionico (EDTP), acido glutamicoacido N,N-diacetico, acido aspartico-acido N,N-diacetico, glicina, alanina, sales de los mismos y/o solvatos de los mismos, tales como hidratos o similares.
Entre los ejemplos espedficos del agente quelante a base de acido oxicarbox^lico pueden incluirse acido lactico, acido glicolico, acido dtrico, acido malico, acido tartarico, acido gluconico, acido mandelico, sales de los mismos, y/o solvatos de los mismos, tales como hidratos o similares. Entre los ejemplos del agente quelante a base de acido carboxflico dibasico inferior pueden incluirse acido oxalico, acido malonico, sales de los mismos, y/o solvatos de los mismos, tales como hidratos o similares.
Entre los ejemplos del poliol pueden incluirse glicoles, tales como etilenglicol, dietilenglicol, trietilenglicol o similares, o alcoholes de azucar. Entre los ejemplos espedficos de los mismos pueden incluirse otros inositoles, tales como glicerina, eritrina, arabita, xilita, sorbita, mannita, galactita o similares.
Entre los ejemplos del agente quelante a base de compuesto inorganico pueden incluirse acido pirofosforico, acido trifosforico, acido fosforico condensado, sales de los mismos, y/o solvatos de los mismos, tales como hidratos o similares. En particular, el agente quelante preferente es dihidrato de citrato trisodico, acido L-malico o sal sodica de acido etilendiamino-tetraacetico y hierro (III).
Ademas, puede utilizarse acido sialico como el agente quelante. Acido sialico significa acido 2-ceto-3-desoxinonico con un esqueleto carboxilato de 9 carbonos y tambien se conoce como acido neurammico.
El acido sialico incluye acido N-acetilneurammico, acido N-glicolilneurammico, acido O-acetilneurammico, o acido deaminoneurammico, o sales, hidratos y/o derivados de los mismos.
Acido sialico incluye los acidos que presentan el acido 5-N-acetil o 5-N-glucolilneurammico como esqueleto y varios grupos hidroxilo O-acetilados. En particular, el acido sialico preferente que debe utilizarse de acuerdo con la presente invencion es dihidrato de acido N-acetilneurammico.
El agente quelante puede prepararse mediante un metodo sintetico qrnmico conocido publicamente.
El agente quelante se anade durante la preparacion de la disolucion acuosa y, en particular, se anade preferentemente a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final. En el metodo de preparacion de la disolucion acuosa de la presente exposicion, el orden de adicion del agente quelante a la disolucion acuosa (tiempos de adicion) puede determinarse apropiadamente dependiendo de la composicion del medio de cultivo que debe anadirse, el tipo de agente quelante o similar, en caso de anadirse antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa. La filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa preparada puede mejorarse mediante la adicion del agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
En el metodo de preparacion de la disolucion acuosa de la presente exposicion, el agente quelante puede anadirse a la disolucion acuosa junto con cualquier medio de cultivo simultaneamente, o antes o despues de la adicion del medio de cultivo. Preferentemente, el agente quelante puede anadirse a la disolucion acuosa antes de la adicion del medio de cultivo, o junto con el medio de cultivo, simultaneamente. El agente quelante tambien puede anadirse al medio de cultivo anticipadamente. La filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa preparada puede mejorarse adicionalmente mediante la adicion del agente quelante a la disolucion acuosa antes de la adicion del medio de cultivo, o junto con el medio de cultivo, simultaneamente.
En la presente invencion, el ajuste del pH final se refiere a un procedimiento de ajuste del pH de la disolucion acuosa en un pH predeterminado. El pH final se ajusta dependiendo del uso pretendido de la disolucion acuosa. En el caso de que la disolucion acuosa sea la disolucion acuosa para el cultivo celular, el valor del pH puede ser cualquier valor, con la condicion de que las celulas puedan cultivarse en el valor del pH. En el caso de que no se requiera el ajuste del pH, la adicion final de las sustancias a la disolucion acuosa que debe estar contenida en la disolucion acuosa se considera el ajuste del pH final.
El ajuste del pH final puede llevarse a cabo utilizando cualquier acido o alcali. Entre los ejemplos espedficos de los mismos puede incluirse bicarbonato sodico, acido clorhndrico, hidroxido sodico o similares.
Un ejemplo de consideracion de la adicion final de la sustancia a la disolucion acuosa que debe encontrarse contenida en la disolucion acuosa como ajuste del pH final es un agente tamponador, tal como Na2CO3, acido 4-(2-hidxoxietil)-1-piperazm-etanosulfonico (HEPES), o acido 3-(N-morfolino) propano sulfonico (MOPS) ya contenido en el medio de cultivo para ajustar el pH.
La cantidad de adicion del agente quelante no se encuentra particularmente limitada, aunque resulta preferente que tal cantidad se anada de manera que la concentracion del agente quelante anadido a la disolucion acuosa despues de la preparacion de la disolucion acuosa sea preferentemente de 0,001 mmoles/l o superior, mas preferentemente de 0,01 mmoles/l o superior, mucho mas preferentemente de 0,1 mmoles/l o superior, y particularmente preferentemente de 0,34 mmoles/l o superior.
Ademas, la cantidad anadida del agente quelante a la disolucion acuosa puede ser apropiadamente seleccionada por el experto en la materia dentro del intervalo de 0,001 a 1.000 mmoles/l, de 0,01 a 100 mmoles/l, de 0,1 a 100 mmoles/l, y de 0,1 a 50 mmoles/l, y tambien puede anadirse una cantidad para que el agente quelante preferentemente se encuentre a una concentracion de 0,34 a 89 mmoles/l, mas preferentemente de 0,34 a 15 mmoles/l, y particularmente preferente de 0,34 a 6,8 mmoles/l. La concentracion del agente quelante en la disolucion acuosa preparada puede incrementarse adicionalmente con un complejo de quelato de metal (tal como hierro) que se anade al medio como fuente metalica de hierro o similar.
En la preparacion de la disolucion acuosa de la presente invencion, pueden anadirse hidrolizados, sales metalicas, azucares, vitaminas, aminoacidos, agentes de ajuste del pH, acidos organicos, acidos grasos, peptidos, sustancias fisiologicamente activas, lfpidos, acidos nucleicos o similares, o pueden anadirse en parte despues de la mezcla con el medio de cultivo. Puede anadirse una mezcla de sales metalicas, azucares o vitaminas con el medio de cultivo.
Las celulas pueden ser cualesquiera de celulas eucarioticas y celulas procarioticas, y entre los ejemplos de las mismas pueden incluirse celulas derivadas de mairnferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos, plantas o similares; microorganismos, tales como bacterias, E. coli, Bacillus subtilis o similares; celulas derivadas de microorganismos, tales como bacterias, E. coli, Bacillus subtilis o similares, o levaduras o celulas derivadas de levaduras, o similares.
Entre ellas, las celulas de animales pertenecientes a los mamnferos resultan preferentes; las celulas animales derivadas de primates, tales como seres humanos o monos, o las celulas animales derivadas de roedores, tales como ratones, ratas o hamsters, resultan mas preferentes, o las celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino son las mas preferentes.
Las celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino para la utilizacion de acuerdo con la presente invencion pueden ser cualquier estirpe celular establecida a partir de tejido ovarico de hamster chino (Cricetulus griseus).
Espedficamente, por ejemplo, celulas CHO descritas en documentos tales como Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968), Chromosoma, 41, 129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,4216 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968), Cell, 6, 121 (1975), Molecular Cell Genetics, apendices I y II, 883-900.
Entre los ejemplos adicionales de los mismos pueden incluirse la lmea CHO-K1 (ATCC n° CCL-61), la lmea DUXB11 (ATCC n° CRL-9096), la lmea Pro-5 (ATCC n° CRL-1781), CHO/dhfr' (ATCC n° CRL-9096) registrada en la ATCC (The American Type Culture Collection), la estirpe celular CHO-S disponible comercialmente (Life Technologies Inc., n° de cat. 11619) o CHO/DG44 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)], o subcepas obtenidas mediante la adaptacion de estas cepas a diversos medios.
Entre los ejemplos de celulas pertenecientes a mamfferos pueden incluirse celulas de mieloma, celulas ovaricas, celulas renales, celulas sangumeas, celulas uterinas, celulas de tejido conectivo, celulas de mamffero, celulas de retinoblastoma embrionario o celulas derivadas de las mismas. De entre ellas, celulas seleccionadas de celulas de mieloma, celulas derivadas de celulas de mieloma, celulas ovaricas y celulas derivadas de celulas ovaricas. Entre los ejemplos de las mismas pueden incluirse estirpes celulares humanas, tales como HL-60 (ATCC n° CCL-240), HT-1080 (ATCC n° CCL-121), HeLa (ATCC n° CCL-2), 293 (ECACC n° 85120602), Namalwa (ATCC n° CRL-1432), Namalwa KJM-1 [Cytotechnology, 1, 151(1988)], NM-F9 (DSM ACC2605, publicacion internacional n° WO 2005/017130) y PER.C6 (ECa Cc n° 96022940, patente n° US 6855544); estirpes celulares de mono, tales como VERO (At CC n° CCL-1651) y COS-7 (ATCC n° CRL-1651); estirpes celulares de raton, tales como C127I (ATCC n° CRL-1616), Sp2/0-Ag14 (ATCC n° CRL-1581) y NIH3T3 (ATCC n° CRL-1658), NS0 (ATCC n° CRL-1827); estirpes celulares de rata, tales como Y3 Ag 1.2.3 (ATCC n° CRL-1631), YO (ECACC n° 85110501) y YB2/0 (ATCC n° CRL-1662); estirpes celulares de hamster, tales como celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino descritas anteriormente y BH-K21 (ATCC n° CRL-10); celulas de perro, tales como MDCK (ATCC n° CCL-34) y similares.
Entre los ejemplos de celulas pertenecientes a aves pueden incluirse la estirpe celular de pollo SL-29 (ATCC n° CRL-29) y similares. Entre los ejemplos de celulas pertenecientes a peces pueden incluirse la estirpe celular de pez cebra ZF4 (ATCC n° CRL-2050) y similares.
Entre los ejemplos de celulas pertenecientes a insectos puede incluirse la estirpe celular de polilla (Spodoptera frugiperda) Sf9 (ATCC n° CRL-1711) y similares. Entre los ejemplos de celulas de cultivo primario utilizadas en la produccion de vacunas pueden incluirse celulas renales de mono primarias, celulas renales de conejo primarias, celulas embrionarias de pollo primarias, celulas embrionarias de codorniz primarias y similares.
Entre los ejemplos de celula de mieloma o de celulas derivadas de celulas de mieloma pueden incluirse Sp2/0-Ag14, NS0, Y3 Ag 1.2.3., YO o YB2/0 y similares. Entre los ejemplos de celulas ovaricas o celulas derivadas de celulas ovaricas pueden incluirse las celulas CHO derivadas de tejido ovarico de hamster chino indicadas anteriormente y similares. Ademas, entre los ejemplos de celulas renales pueden incluirse 293, VERO, COS-7, BHK21, MDCK y similares.
Entre los ejemplos de celulas sangumeas pueden incluirse HL-60, Namalwa, Namalwa KJM-1, NM-F9 y similares. Entre los ejemplos de celulas uterinas pueden incluirse HeLa y similares. Entre los ejemplos de celulas del tejido conectivo pueden incluirse HT-1080, NIH3T3 y similares. Entre los ejemplos de celulas de mairnfero pueden incluirse C127II y similares. Entre los ejemplos de celulas de retinoblastoma embrionario puede incluirse PER.C6 y similares, respectivamente.
Las celulas pueden ser, aunque la presencia o ausencia de su capacidad de producir la sustancia no se encuentra particularmente limitada, por ejemplo, celulas iPS obtenidas mediante la introduccion de varios genes en celulas somaticas, celulas espermaticas u ovulos recogidos de un mamffero donante, incluyendo seres humanos, celulas productoras de sustancias y celulas de fusion productoras de sustancias, o similares.
Entre ellas, las celulas productoras de sustancias o las celulas de fusion productoras de sustancias resultan preferentes. Las celulas animales productoras de sustancias, las celulas de fusion derivadas de animales productoras de sustancias, o similares, resultan mas preferentes. Por ejemplo, en el caso de que la sustancia deseada sea un anticuerpo, puede proporcionarse a modo de ejemplo un hibridoma, que es una celula de fusion de celulas de mieloma y celulas productoras de anticuerpos, tales como celulas B o similares. Ademas, las celulas animales productoras de sustancias mediante un tratamiento de mutacion, las celulas animales tratadas con mutaciones para incrementar el nivel de expresion de las sustancias o similares, se encuentran incluidas en la expresion celulas animales.
Entre los ejemplos de celulas animales que se mutan para producir la sustancia pueden incluirse celulas en las que se introducen mutaciones en enzimas de modificacion de las protemas con el fin de producir la sustancia deseada o similar. Por ejemplo, en el caso de que la sustancia deseada sea una glucoprotema, se proporcionan como ejemplo celulas en las que se introducen mutaciones en una diversidad de enzimas de modificacion de cadenas sacaridas con el fin de cambiar la estructura de las cadenas sacaridas, o similares.
Ademas, las celulas animales productoras de la sustancia pueden ser cualesquiera celulas animales, con la condicion de que sean capaces de producir la sustancia deseada. Por ejemplo, estan incluidas las celulas animales que se transforman con un vector recombinante que contiene un gen que participa en la produccion de sustancias. Las celulas transformantes pueden obtenerse mediante la introduccion de un vector recombinante que contiene ADN y un promotor que participan en la produccion de la sustancia en celulas pertenecientes a los mamfferos anteriormente indicados.
Para el ADN implicado en la produccion de la sustancia, por ejemplo, puede utilizarse cualquiera ADN codificante de una sustancia, tal como peptidos o similares, y ADN codificante de un enzima o una protema que participa en la biosmtesis de la sustancia y similar.
Como promotor, puede utilizarse cualquiera de los promotores que funcionan en las celulas animales utilizadas en la presente invencion, y entre los ejemplos de las mismas puede incluirse un promotor del gen temprano inmediato (IE) del citomegalovirus (CMV), un promotor temprano de SV40, un promotor retrovmco, un promotor de metalotionema, un promotor de choque termico, un promotor SRa y similares. Tambien puede utilizarse un intensificador del gen lE del CMV humano o similar, junto con el promotor.
El vector recombinante puede prepararse utilizando el vector deseado. Para el vector utilizado para la preparacion del vector recombinante, puede utilizarse cualquiera de los vectores que funcionan en las celulas animales utilizadas en la presente invencion. Entre los ejemplos de los mismos pueden incluirse pcDNAI, pcDM8 (fabricado por Funakoshi), pAGE107 [publicacion de patente n° JP H3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (publicacion de patente n° JP H2-227075), pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen), pREP4 (fabricado por Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987), pAGE210 y similares. Como metodo de introduccion de vector recombinante en las celulas hospedadoras, puede utilizarse cualquier metodo, con la condicion de que sea capaz de introducir ADN en las celulas hospedadoras, y entre los ejemplos de las mismas pueden incluirse la electroporacion [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], un metodo de fosfato de calcio [publicacion de patente n° JP H2-227075], la lipofeccion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987), Virology, 52, 456 (1973)] y similares.
Entre los ejemplos espedficos de celulas transformadas pueden incluirse la celula transformada productora de anticuerpos quimericos humanos anti-GD37-9-51 (FERM n° BP-6691), las celulas transformadas productoras de anticuerpos quimericos anti-CCR4 KM2760 (FERM n° BP-7054), las celulas transformadas productoras de anticuerpo humanizado anti-CCR4 KM8759 (FERM n° BP-8129) y KM8760 (FERM n° BP-8130) y 709 LCA-500D (FERM n° BP-8239), y las celulas transformadas productoras del anticuerpo quimerico anti-cadena a de receptor de IL-5 KM7399 (FERm N° BP-5649), las celulas transformadas productoras de anticuerpos anti-cadena a de receptor de IL-5 injertado con CDR KM8399 (FERM n° BP-5648) y KM9399 (FERM n° BP-5647), las celulas transformadas productoras de anticuerpo anti-GM2 injertado con CDR humano KM8966 (FERM n° BP-5105), KM8967 (FERM n° BP-5106), KM8969 (FERM n° BP-5527), KM8970 (FERM n° BP-5528), la lmea de celulas transformadas productoras de anticuerpo anti-CD20 Ms704-CD20 (FERM n° BP-10092), las celulas transformadas productoras de antitrombina III Ms705-pKAN-ATIII (FERM n° BP-8472) y similares.
La presente exposicion se refiere a una disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo para preparar la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, caracterizado porque se anade el agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
Ademas, la presente exposicion se refiere a un metodo de cultivo de celulas utilizando la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion de la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, caracterizado porque el agente quelante se anade antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
Entre los ejemplos del metodo de cultivo celular puede incluirse el cultivo por lotes, el cultivo por lotes repetidos, el cultivo alimentado por lotes, el cultivo de perfusion o similares. El metodo de cultivo de celulas puede ser cualquier metodo, con la condicion de que resulta adecuado para las celulas utilizadas y resulta preferente el cultivo alimentado por lotes.
Espedficamente, el cultivo tfpicamente se lleva a cabo, por ejemplo, bajo las condiciones de pH 6 a 8, de 30°C a 40°C, por ejemplo, durante 3 a 20 dfas en cultivo alimentado por lotes o durante 3 a 60 dfas en cultivo de perfusion. Durante el cultivo, en caso necesario, tambien pueden anadirse al medio de cultivo antibioticos tales como la estreptomicina o la penicilina. Ademas, para el control de la concentracion de oxfgeno disuelto, el control del pH, el control de la temperatura, la agitacion, o similares, puede utilizarse el metodo tfpicamente utilizado en el cultivo celular.
El metodo de almacenamiento de la disolucion acuosa no se encuentra particularmente limitado, con la condicion de que sea un metodo de mantenimiento de la disolucion acuosa bajo condiciones asepticas, por ejemplo un metodo que utiliza un tanque de acero inoxidable, una bolsa desechable, o similares.
El metodo de cultivo puede llevarse a cabo en cualquier volumen de cultivo, por ejemplo en un volumen de cultivo diminuto, de 0,1 a 10 ml, tfpicamente utilizando una placa de cultivo celular, en un volumen de cultivo pequeno, de 10 a 1.000 ml, tfpicamente utilizando un matraz Erlenmeyer, o en incluso un volumen de cultivo grande, de 1 a 20.000 l, para la produccion comercial, tfpicamente utilizando un recipiente de cultivo o similar, tal como frascos.
Ademas, la presente exposicion se refiere a un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa, que comprende cultivar las celulas utilizando la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, que se prepara mediante la adicion del agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
En el caso de que la sustancia fisiologicamente activa que se produce mediante el metodo para producir la sustancia fisiologicamente activa de la presente invencion sea un peptido o una protema, puede utilizarse un metodo de expresion directa de produccion del peptido o la protema en una celula hospedadora, el metodo de produccion y secrecion del peptido o la protema fuera de las celulas hospedadoras o similares (Molecular Cloning, segunda edicion).
El peptido o protema puede secretarse activamente hacia el exterior de las celulas hospedadoras mediante la utilizacion del metodo de Paulson et al. [J.Biol.Chem., 264, 17619(1989)], el metodo de Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)], o el metodo descrito en la publicacion de patente japonesa n° Hei-05-336963, o la publicacion de patente internacional n° 94/23021. En otras palabras, el peptido o protema deseado puede secretarse activamente hacia el exterior de las celulas hospedadoras mediante su expresion en forma de combinacion del peptido de senal en el extremo N-terminal del peptido o protema deseado utilizando un metodo de recombinacion genetica.
Ademas, la cantidad producida del peptido o protema deseado puede incrementarse mediante la utilizacion de un sistema de amplificacion genica utilizando un gen de dihidrofolato reductasa descrito en la publicacion de patente japonesa n° Hei-02-227075 o similar.
El peptido o protema deseado producido mediante el metodo de la presente invencion puede aislarse y purificarse, por ejemplo, utilizando un metodo tfpico de aislamiento y purificacion de un peptido o protema.
Tras completar el cultivo, en el caso de que el peptido o protema deseado se expresa en un estado disuelto dentro de las celulas, estas se recolectan mediante centrifugacion, se suspenden en un tampon acuosa y se rompen utilizando un sonicador, una prensa francesa, un homogeneizador de Manton-Gaulin o un molino Dynomill, de manera que se obtiene un extracto libre de celulas.
Resulta posible obtener un producto purificado en bruto o un producto purificado a partir del sobrenadante que puede obtenerse mediante centrifugacion del extracto libre de celulas utilizando un metodo tfpico de aislamiento y purificacion de peptidos o protemas, es decir, una extraccion con solvente, la precipitacion con elevada concentracion salina con sulfato amonico, o similares, la desalacion, la precipitacion con solventes organicos, la cromatograffa de intercambio anionico utilizando resinas, tales como dietilaminoetil-sefarosa o DIAION HPA-75 (fabricado por Mitsubishi Chemical Corp.), la cromatograffa de intercambio cationico utilizando resinas tales como S-sepharose FF (fabricada por Pharmacia), la cromatograffa hidrofobica utilizando resinas tales como butilsefarosa o fenil-sefarosa, la filtracion en gel utilizando un tamiz molecular, la cromatograffa de afinidad utilizando resinas que contiene protema A, protema G o similar, el cromatoenfoque y la electroforesis, tal como el enfoque isoelectrico, solos o en combinacion.
En el caso de que el peptido o protema deseado se secrete hacia el exterior de la celula, el peptido o protema puede recuperarse a partir del sobrenadante de cultivo. Es decir, se obtiene el sobrenadante de cultivo mediante tratamiento del cultivo mediante un metodo tal como la centrifugacion tal como se ha indicado anteriormente, y puede obtenerse un producto purificado en bruto o un producto purificado a partir del sobrenadante de cultivo mediante el metodo de aislamiento y purificacion descrito anteriormente.
La sustancia fisiologicamente activa puede ser cualquier sustancia con la condicion de que pueda ser producida por celulas, preferentemente celulas animales. Resulta preferente una sustancia producida por celulas de un animal perteneciente a los mairnferos. Entre los ejemplos de la sustancia pueden incluirse aminoacidos, peptidos, protemas o moleculas de catalizador biologico, tales como ribozimas, moleculas de formacion/retencion estructural, tales como queratina, colageno, elastina, resilina o fibroma; vacunas, tales como la vacuna de la viruela, la vacuna de la polio, la vacuna del sarampion, la vacuna de la rubeola, la vacuna de la parotiditis, la vacuna de la rabia, la vacuna de la varicela, la vacuna de la fiebre effmera bovina, la vacuna de la enfermedad de Ibaraki o la vacuna de la traqueftis bovina infecciosa, o virus, tales como adenovirus o baculovirus, o similares.
El peptido preferentemente es un peptido derivado de celulas eucarioticas, mas preferentemente un peptido derivado de celulas animales, y entre los ejemplos del mismo puede incluirse un peptido derivado de celulas de mam êra. Ademas, el peptido puede encontrarse en cualquier forma, con la condicion de que incluya el peptido deseado y presente la actividad, y el peptido puede ser, por ejemplo, un peptido modificado artificialmente, tal como un peptido de fusion preparado mediante fusion con otros peptidos y similares, o un peptido compuesto de fragmentos parciales de peptido.
Entre los ejemplos del peptido puede incluirse un peptido de los fragmentos parciales de glucoprotema que mantenga la actividad de la glucoprotema. En el caso de que la glucoprotema sea un enzima, tambien se encuentran incluidos un peptido que modula la actividad enzimatica y un peptido que mantenga la estructura del enzima o similar. Entre los ejemplos espedficos del peptido que modula la actividad enzimatica puede incluirse un peptido que actua como un agonista o antagonista de glucoprotema o similar.
Puede utilizarse cualquier agonista como el agonista con la condicion de que sea un peptido con una actividad de potenciacion de la actividad de glucoprotema, y un ejemplo espedfico de la misma puede incluir derivados de somatostatina, somatropina, peptido natriuretico atrial, glucagon, insulina, factor de crecimiento similar a insulina, gonadotropina y similares.
Como antagonista puede utilizarse cualquier antagonista, con la condicion de que sea un peptido con una actividad de inhibicion de la actividad de glucoprotema, y un ejemplo espedfico de la misma puede incluir pegvisomant y similares.
La protema puede ser preferentemente una protema derivada de una celula eucariotica, y mas preferentemente, una protema derivada de una celula animal, por ejemplo una protema derivada de una celula de mamffero. Ademas, la protema puede presentar cualquier estructura con la condicion de que incluya la protema deseada y presente la actividad de la misma. Por ejemplo, la protema puede ser una protema modificada artificialmente, tal como una protema de fusion fusionada con otra protema, o una protema que consiste en un fragmento parcial. Entre los ejemplos espedficos de la protema pueden incluirse glucoprotemas, anticuerpos o similares.
Entre los ejemplos espedficos de la glucoprotema puede incluirse eritropoyetina (EPO) [J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977)], trombopoyetina (TPO) [Nature, 369 533 (1994)], un activador del plasminogeno de tipo tisular, prourocinasa, trombomodulina, antitrombina III, protema C, protema S, factor VII de coagulacion sangumea, factor VIII de coagulacion sangumea, factor IX de coagulacion sangumea, factor X de coagulacion sangumea, factor XI de coagulacion sangumea, factor XII de coagulacion sangumea, un complejo de protrombina, fibrinogeno, albumina, hormona gonadotropica, hormona estimulante del tiroides, factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de queratinocitos, activina, factor osteogenico, factor de celulas madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) [J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983)], factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF) [J. Exp. Med., 173, 269 (1992)], factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) [J. Biol. Chem., 252, 1998 (1977)], interferon a, interferon p, interferon y, interleucina-2 (IL-2) [Science, 193, 1007 (1976)], interleucina 6, interleucina 10, interleucina 11, interleucina-12 (IL-12) [J. Leuc. Biol., 55, 280 (1994)], receptor soluble de interleuqina-4, factor a de necrosis tumoral, ADNasal, galactosidasa, glucosidasa a, glucocerebrosidasa, hemoglobina o transferrina, derivados de los mismos, fragmentos parciales de glucoprotema de los mismos y similares.
Puede utilizarse cualquier anticuerpo, con la condicion de que presenta una actividad de union a antfgeno, y entre los ejemplos del mismo pueden incluirse anticuerpos que reconocen antfgenos asociados a tumor o fragmentos de anticuerpo de los mismos, anticuerpos que reconocen antfgenos asociados a alergia o inflamacion o fragmentos de anticuerpo de los mismos, anticuerpos que reconocen antfgenos asociados a enfermedad cardiovascular o fragmentos de anticuerpo de los mismos, anticuerpos que reconocen antfgenos asociados a enfermedad autoinmunitaria o fragmentos de anticuerpo de los mismos, anticuerpos que reconocen antfgenos asociados a infeccion vmca o bacteriana o fragmentos de anticuerpo de los mismos, y similares.
Entre los ejemplos de antfgenos asociados a tumor pueden incluirse CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD9, CD10, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD30, CD32, CD33, CD38, CD40, ligando de CD40 (CD40L), CD44, CD45, CD46, CD47, CD52, CD54, CD55, CD56, CD59, CD63, CD64, CD66b, CD69, CD70, CD74, CD80, CD89, CD95, CD98, CD105, CD134, CD137, CD138, CD147, CD158, CD160, CD162, CD164, CD200, CD227, adrenomedulina, protema-4 relacionada con angiopoyetina (ARP4), aurora, B7-H1, B7-DC, integlina, antfgeno-2 estromal de medula osea (BST2), CA125, CA19.9, anhidrasa carbonica 9 (CA9), cadherina, receptor de quimiocina cc (CCR) 4, CCR7, antfgeno carcinoembrionario (CEA), receptor-1 del factor de crecimiento fibroblastico rico en cistemas (CFR-1), c-Met, c-Myc, colageno, CTA, factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), CTLA-4, citoqueratina-18, DF3, cadherina-E, receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR), EGFRvlll, EGFR2 (HER2), EGFR3 (HER3), EGFR4 (HER4), endoglina, molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM), receptor de protema-C endotelial (EPCR), efrina, receptor de efrina (Eph), EphA2, endoteliasa-2 (ET2), FAM3D, protema activadora de fibroblastos (FAP), homologo-1 de receptor de Fc (FcRH1), ferritina, factor-8 de crecimiento fibroblastico (FGF8), receptor de FGF8, FGF basico (bFGF), receptor de bFGF, receptor de FGF (FGFR) 3, FGFR4, FLT1, FLT3, receptor de folato, homologo de Frizzled-10 (FZD10), receptor de Frizzled-4 (Fz D-4), G250, receptor de G-CSF, gangliosido (por ejemplo, GD2, GD3, GM2, GM3 o similar), globo H, gp75, gp88, GPR-9-6, heparanasa I, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), receptor de HGF, antfgeno HLA (por ejemplo, HLA-DR o similar), HM1.24, globulos de grasa de leche humana (HMFG), hRS7, protema de choque termico 90 (hsp90), epftopo idiotipo, factor de crecimiento similar a insulina (IGF), receptor de IGF (IGFR), interleucina (por ejemplo, IL-6, IL-15 o similar), receptor de interleucina (por ejemplo, IL-6R, IL-15R o similar), integrina, protema-4 asociada a traslocacion de receptor inmunologico (IRTA-4), calicrema 1, KDR, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KS1/4, lamp-1, lamp-2, laminina-5, Lewis-Y, sialil Lewis-X, receptor de linfotoxina-beta (LTBR), LUNX, proteoglicano condroitm-sulfato asociado a melanoma (MCSP), mesotelina, MICA, receptor de sustancia inhibidora mulleriana de tipo II (MISIIR), mucina, molecula de adhesion a celulas neurales (NCAM), Necl-5, Notch1, osteopontina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), receptor de PDGF, factor plaquetario 4 (PF-4), fosfatidilserina, antfgeno espedfico prostatico (PSA), antfgeno de celulas madre prostaticas (PSCA), antfgeno membranario espedfico de prostata (PSMA), protema/peptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP), receptor activador de ligando NF-kappaB (RANKL), receptor de motilidad mediada por acido hialuronico (RhAm M), ROBO1, SART3, semaforina 4B (SEMA4B), inhibidor de proteasas secretado por leucocitos (SLPI), SM5-1, esfingosina-1-fosfato, glucoprotema-72 asociada a tumor (TAG-72), receptor de transferrina (TfR), TGF-beta, Thy-1, Tie-1, receptor de Tie2, dominio de inmunoglobulina de celulas T y dominio de mucina 1 (TIM-1), factor tisular humano (hTF), antfgeno Tn, factor de necrosis tumoral (TNF), antfgeno de Thomsen-Friedenreich (antfgeno TF), receptor de TNF, ligando inductor de apoptosis relacionado con factor de necrosis tumoral (TRAIL), receptor de TRAIL (por ejemplo, DR4, DR5 o similares), transportador de aminoacidos 2 del sistema As C (ASCT2), trkC, TROP-2, receptor TWEAK Fn14, colagenasa de tipo IV, receptor de urocinasa, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor de VEGF (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 o similar), vimentina, VLA-4, y similares.
El anticuerpo puede ser cualquiera de anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal. Entre los ejemplos de la clase de anticuerpo puede incluirse inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina E (IgE) e inmunoglobulina M (IgM) e IgG resulta preferente. Ademas, entre los ejemplos de la subclase de IgG puede incluirse IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
El anticuerpo puede incluir ademas un fragmento que incluye una parte del anticuerpo, o similar, y entre los ejemplos del mismo puede incluirse Fab (fragmento de union a antfgeno), Fab', F(ab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv estabilizado por disulfuro (dsFv), una protema de fusion que incluye una region Fc de anticuerpo y similares.
Entre los ejemplos del anticuerpo pueden incluirse anticuerpos preparados mediante la tecnica de recombinacion genetica, o similares, es dedr, anticuerpos obtenidos mediante introduccion de un vector que expresa anticuerpo con gen de anticuerpo insertado, en una celula hospedadora, ademas de anticuerpos producidos por celulas de hibridoma que se preparan a partir de celulas de bazo de un animal inmunizado despues de la inmunizacion del animal con un antigeno. Entre los ejemplos espedficos de los mismos puede incluir un anticuerpo producido por un hibridoma, anticuerpo quimerico humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano y similares.
El anticuerpo quimerico humano se refiere a un anticuerpo que esta compuesto de una region variable de cadena pesada (en lo sucesivo, la cadena pesada se denomina cadena H, y la region variable se denomina region V, es decir, HV o VH) y una region variable de cadena ligera (en lo sucesivo, la cadena ligera se denomina cadena L, es decir, LV o VL) de un anticuerpo de un animal no humano, y la region constante de cadena pesada (en lo sucesivo, la region constante se denomina region C, es decir, CH) y la region constante de cadena ligera (en lo sucesivo, denominada CL) de un anticuerpo humano. Como animal no humano, puede utilizarse cualquier animal, por ejemplo, ratones, ratas, hamsters, conejos o similares, con la condicion de que puedan utilizarse para producir un hibridoma.
El anticuerpo quimerico humano puede producirse mediante la obtencion de ADNc codificantes de VH y VL de un hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal, la construccion de un vector de expresion de anticuerpo quimerico humano mediante la insercion de los mismos en un vector de expresion para celulas hospedadoras que presenta genes codificantes de CH de anticuerpo humano y de CL de anticuerpo humano, y la introduccion de los mismos en celulas hospedadoras para expresarlos.
La CH del anticuerpo quimerico humano puede ser cualquiera perteneciente a las inmunoglobulinas humanas (en adelante denominadas hIg) y resultan preferentes las de la clase hIgG. Ademas, puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase hIgG, tal como hIgGI, hIgG2, hIgG3 o hIgG4. Ademas, la CL del anticuerpo quimerico humano puede ser cualquiera perteneciente a hIg, y pueden utilizarse las de clase k o A. Entre los ejemplos del anticuerpo humanizado puede incluirse una region determinante de complementariedad de tipo humano (en adelante denominados anticuerpos injertados con CDR que se preparan mediante injerto de una secuencia de aminoacidos de CDR de VH y VL del anticuerpo del animal no humano en una region apropiada de VH y VL del anticuerpo humano.
El anticuerpo con injerto de CDR puede producirse mediante la construccion de ADNc codificantes de regiones V en las que secuencias de CDR de VH y VL del anticuerpo del animal no humano se han injertado en secuencias de CDR de VH y VL de cualquier anticuerpo humano, construyendo un vector de expresion de anticuerpo con injerto de CDR mediante la insercion de las mismas en un vector de expresion para celulas hospedadoras que presenta genes codificantes de CH de anticuerpo humano y de CL de anticuerpo humano y la expresion del anticuerpo con injerto de CDR humano mediante la introduccion del vector de expresion en las celulas hospedadoras.
La CH del anticuerpo con injerto de CDR humano puede ser cualquiera perteneciente a hIg. Resultan preferentes los de la clase hIgG. Ademas, puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase hIgG, tal como hIgGI, hIgG2, hIgG3 o hIgG4. Ademas, la CL del anticuerpo con injerto de CDR puede ser cualquiera perteneciente a hIg, y pueden utilizarse las de clase k o A.
El anticuerpo humano, por ejemplo, puede obtenerse mediante aislamiento de un linfocito de sangre periferica humana, infeccion del mismo con virus de EB o similar para inmortalizarlo, seguido de la clonacion, cultivo del linfocito capaz de producir el anticuerpo, seguido de la purificacion del anticuerpo a partir del caldo de cultivo. El anticuerpo humano puede prepararse a partir de la biblioteca fagica de anticuerpos humanos. La biblioteca fagica de anticuerpos humanos en la que se expresan fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, scFv y similares sobre la superficie fagica mediante la insercion de un gen de anticuerpo preparado a partir de celulas B humanas en un gen fagico. A partir de la biblioteca, puede recuperarse un fago que expresa un fragmento de anticuerpo que presenta una actividad de union a anrtgeno, utilizando su actividad para unirse a un anrtgeno en fase solida como marcador. El fragmento de anticuerpo puede convertirse adicionalmente en una molecula de anticuerpo humano compuesta de dos cadenas H completas y dos cadenas L completas.
El anticuerpo humano puede producirse mediante la obtencion de ADNc codificantes de VL y VH a partir de un hibridoma productor de anticuerpo humano, insertandolo en un vector de expresion para celulas animales que incluye ADN codificantes de CL y CH de un anticuerpo humano en el que se han sustituido uno o mas residuos aminoacidos de tipo salvaje (en adelante denominados WT) por residuos de Cys mediante el metodo adecuado anteriormente descrito, introduciendo seguidamente el vector en una celula animal para expresar el anticuerpo. El hibridoma producto de anticuerpo humano puede obtenerse a partir del animal transgenico productor de anticuerpo humano siguiendo un metodo de produccion de hibridoma habitualmente utilizado en mairnferos no humanos. El animal transgenico productor de anticuerpo humano es un animal en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano en las celulas. Espedficamente, el animal transgenico productor de anticuerpo humano puede producirse mediante la introduccion de un gen de anticuerpo humano en una celula ES de raton, trasplantando la celula ES en un embrion de estadio temprano de raton y seguidamente generandolo [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722(2000)].
Alternativamente, el anticuerpo humano puede producirse mediante la obtencion de ADNc codificantes de VL y VH de un hibridoma productor de anticuerpo humano, insercion de los mismos en un vector de expresion para celulas animales que incluye ADN codificantes de CL y CH de un anticuerpo humano, la sustitucion de uno o mas residuos aminoacidos de WT por residuos de Cys mediante el metodo adecuado anteriormente descrito para construir un vector de expresion de anticuerpo humano, seguido de la introduccion del vector de expresion de anticuerpo humano en una celula animal para expresar el anticuerpo.
La CH de WT utilizada en el anticuerpo humano puede ser cualquiera perteneciente a hIg. Resultan preferentes los de la clase hIgG. Ademas, puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase hIgG, tal como hIgGI, hIgG2, hIgG3 o hIgG4. Ademas, la CL de anticuerpo humano puede ser cualquiera perteneciente a hIg, y pueden utilizarse las de clase k o A.
Entre los ejemplos espedficos de los anticuerpos producidos mediante el metodo de la presente invencion pueden incluirse, aunque sin limitacion particular, los anticuerpos siguientes.
Entre los ejemplos de los anticuerpos que reconocen antfgenos asociados a tumor pueden incluirse el anticuerpo anti-GD2 [Anticancer Res., 13, 331 (1993)], el anticuerpo anti-GD3 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 260 (1993)], el anticuerpo anti-GM2 [Cancer Res., 54, 1511 (1994)], el anticuerpo anti-HER2 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992), US5725856], el anticuerpo anti-CD52 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992)], el anticuerpo anti-MAGE [British J. Cancer, 83, 493 (2000)], el anticuerpo anti-HM 1.24 [Molecular Immunol., 36, 387 (1999)], el anticuerpo del peptido relacionado con la hormona antiparatiroidea [Cancer, 88, 2909 (2000)], el anticuerpo anti-bFGF, el anticuerpo anti-FGF-8 [Proc. Natl. Acad. Sci. UsA, 86, 9911 (1989)], el anticuerpo antibFGFR, el anticuerpo anti-FGF-8R [J. Biol. Chem., 265, 16455 (1990)], el anticuerpo anti-IGF [J. Neurosci. Res., 40, 647 (1995)], el anticuerpo anti-IGF-IR [J. Neurosci. Res., 40, 647 (1995)], el anticuerpo anti-PSMA [J. Urology, 160, 2396 (1998)], el anticuerpo anti-VEGF [Cancer Res., 57, 4593 (1997)], el anticuerpo anti-VEGFR [Oncogene, 19, 2138 (2000), la publicacion de patente internacional n° WO 96/30046], el anticuerpo anti-CD20 [Curr. Opin. Oncol., 10, 548 (1998), patente n° US 5736137], el anticuerpo anti-CD10, el anticuerpo anti-EGFR (publicacion de patente internacional n° WO 96/402010), el anticuerpo anti-Apo-2R (publicacion de patente internacional n° WO 98/51793), el anticuerpo anti-ASCT2 (publicacion de patente internacional n° WO 2010/008075), el anticuerpo anti-CEA [Cancer Res., 55 (23 supl.):5935s-5945s, (1995)], el anticuerpo anti-CD38, el anticuerpo anti-CD33, el anticuerpo anti-CD22, el anticuerpo anti-EpCAM, el anticuerpo anti-A33 y similares. Entre los ejemplos de anticuerpos que reconocen antfgenos asociado a alergia o a inflamacion pueden incluirse el anticuerpo anti-interleucina-6 [Immunol. Rev., 127, 5 (1992)], el anticuerpo anti-receptor de interleucina-6 [Molecular Immunol., 31, 371 (1994)], el anticuerpo anti-interlecina-5 [Immunol. Rev., 127, 5 (1992)], el anticuerpo anti-receptor de interleucina-5, el anticuerpo anti-interleucina-4 [Cytokine, 3, 562 (1991)], el anticuerpo anti­ receptor de interleucina-4 [J. Immunol. Methods, 217, 41 (1998)], anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral [Hybridoma, 13, 183 (1994)], anticuerpo anti-receptor de factor de necrosis tumoral [Molecular Pharmacol., 58, 237 (2000)], anticuerpo anti-CCR4 [Nature, 400, 776 (1999)], anticuerpo anti-quimiocina (Peri et al., J. Immunol. Meth., 174, 249, 1994) o anticuerpo anti-receptor de quimiocina [J. Exp. Med., 186,1373 (1997)] y similares. Entre los ejemplos de los anticuerpos que reconocen los antfgenos asociados a enfermedad cardiovascular pueden incluirse anticuerpo anti-GPIIb/IIIa [J. Immunol., 152, 2968 (1994)], anticuerpo anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas [Science, 253, 1129 (1991)], anticuerpo anti-receptor de crecimiento derivado de plaquetas [J. Biol. Chem., 272, 17400 (1997)], anticuerpo anti-factor de coagulacion sangumea [Circulation, 101, 1158 (2000)], anticuerpo anti-IgE, anticuerpo anti-aVp3, anticuerpo de a4p7 y similares.
Entre los ejemplos de los anticuerpos que reconocen antfgenos asociados a infeccion vmca o bacteriana pueden incluirse el anticuerpo anti-gp120 [Structure, 8, 385 (2000)], el anticuerpo anti-CD4 [J. Rheumatology, 25, 2065 (1998)], el anticuerpo anti-CCR5 y el anticuerpo anti-verotoxina [J. Clin. Microbiol., 37, 396 (1999)] y similares. Ademas, la presente exposicion se refiere a una sustancia fisiologicamente activa producida mediante el cultivo de celulas utilizando la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion de disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, caracterizado por la adicion del agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, y un metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa que se prepara mediante la adicion del agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
Con la condicion de que el metodo de filtracion a traves de membrana sea un metodo de pasar la disolucion acuosa para el tratamiento a traves de una membrana porosa mediante presion para eliminar componentes, pardculas, impurezas o similares en la solucion, el metodo no se encuentra particularmente limitado. El metodo es preferentemente microfiltracion, ultrafiltracion, dialisis, electrodialisis u osmosis inversa, mas preferentemente microfiltracion, ultrafiltracion o dialisis, y particularmente preferentemente microfiltracion.
Una membrana de filtracion utilizada en la filtracion de membrana incluye, aunque sin limitacion particular, y preferentemente una membrana de microfiltracion, una membrana de ultrafiltracion, una membrana de dialisis, una membrana de electrodialisis o una membrana de osmosis inversa, mas preferentemente una membrana de microfiltracion, una membrana de ultrafiltracion, una membrana de dialisis y particularmente preferentemente una membrana de microfiltracion.
El material de la membrana de filtracion incluye, aunque sin limitacion particular, por ejemplo, acetato de celulosa, poliamida aromatica, poliacrilonitrilo, cloruro de polivinilo, copolfmero de cloruro de polivinilopoliacrilonitrilo, polisulfona, polieter sulfona (PES), fluoruro de polivinilideno (PVDF), ceramica, alcohol polivimlico, difluoruro de polivinilideno, ester mixto de acetato de celulosa y nitrato de celulosa, politetrafluoroetileno, alumina, copolfmero de estireno-divinilbenceno, TEFRON (marca comercial registrada) o similares, o derivados de los mismos o similares. Entre ellos, resulta preferente la polietersulfona, el fluoruro de polivinilideno o similares.
Entre los ejemplos espedficos de la membrana de filtracion utilizando polieter sulfona o derivado de la misma puede incluirse, por ejemplo, filtros de membrana Millipore Express (marca comercial registrada) PLUs (tamano de poro: 0,22 o 0,45 pm) (fabricados por Millipore), filtros de cartucho SHC Millipore Express (marca comercial registrada) (fabricados por Millipore), filtros de cartucho SHR Millipore Express (marca comercial registrada) (fabricados por Millipore), Supor (marca comercial registrada) EBV (fabricado por Pall Corp.), Supor (marca comercial registrada) EKV (fabricado por Pall Corp., n° de catalogo: AB3EKV7PH4), Supor (marca comercial registrada) EBV (fabricado por Pall Corp.), Supor (marca comercial registrada) Life 200 (fabricado por Pall Corp.), Zarutopoa (marca comercial registrada) 2 (estructura de la membrana: membrana bicapa, tamano de poro: 0,2+0,1, 0,45+0,2 o 0,8+0,45 pm) (Fabricada por Sartorius Stedim Biotech), Zarutopoa (marca comercial registrada) 2 XLG (estructura de la membrana: membrana bicapa, tamano de poro: 0,8+0,2 pm) (fabricada por Sartorius Stedim Biotech), Zarutopoa (marca comercial registrada) 2 XLI (estructura de la membrana: membrana bicapa, tamano de poro: 0,35+0,2 pm) (fabricada por Sartorius Stedim Biotech), Zarutopoa (marca comercial registrada) 2 High Flow (fabricada por Sartorius Stedim Biotech), filtros de cartucho de membrana PES TCS (tamano de poro: 0,20 o 0,45 pm) (fabricada por ADVANTEC) o similares.
Entre los ejemplos espedficos de la membrana de filtracion utilizando fluoruro de polivinilideno o derivado del mismo pueden incluirse, por ejemplo filtros de membrana Millipore Express (marca comercial registrada) (tamano de poro: 0,10, 0,22, 0,45, 0,65 o 5,0 pm) (fabricados por Millipore), cartucho de filtro hidrofflico gV Durapore (marca comercial registrada) II (fabricado por Millipore), cartucho de filtro hidrofilo VV Durapore (marca comercial registrada) II (fabricado por Millipore), Furorodain (marca comercial registrada) II-DFLP (fabricado por Pall Corp.), Furorodain (marca comercial registrada) II-DBLP (fabricado por Pall Corp.), Furorodain (marca comercial registrada) II-DJLP (fabricado por Pall Corp.), Ultipor (marca comercial registrada) VF-DV 20 (fabricado por Pall Corp.), Ultipor (marca comercial registrada) VF-DV 50 (fabricado por Pall Corp.), o similares.
Ademas, entre los ejemplos espedficos de la membrana de filtracion en combinacion con polieter sulfona o derivado del mismo y fluoruro de polivinilideno o derivado del mismo puede incluirse, por ejemplo, Fluorodyne (marca comercial registrada) Exgrade EDF.
Cartucho de filtro de membrana (fabricado por Pall Corp., n° de catalogo: AB3UEDF7PH4) o similar.
Ademas, entre los ejemplos espedficos de la membrana de filtracion utilizando materiales de membrana diferentes de polieter sulfona o fluoruro de polivinilideno pueden incluirse, por ejemplo, filtros de membrana Omnipore (marca comercial registrada) (tamano de poro: 0,1, 0,2, 0,45, 1,0, 5,0 o 10 pm) (fabricados por Millipore), MF-Millipore (marca comercial registrada) (tamano de poro: 0,025, 0,05, 0,1, 0,22, 0,3, 0,45, 0,65, 0,8, 1,2, 3, 5 o 8 pm) (fabricado por Millipore), filtros de membrana de nilon (tamano de poro: 0,20 o 5,0 pm) (fabricados por Millipore), Ultipor (marca comercial registrada) N66 (tamano de poro: 0,2 o 0,45 pm) (fabricado por Pall Corp.), Pojidain (marca comercial registrada) (tamano de poro: 0,10, 0, 20, 0,3 o 0,45 pm) (fabricado por Pall Corp.), Varafine (marca comercial registrada) VFSP (tamano de poro: 0,2 o 0,45 pm) (fabricado por Pall Corp.), Varafine (marca comercial registrada) VFSP (tamano de poro: 0,02, 0,1 o 0,2 pm) (fabricado por Pall Corp.), Varafine (marca comercial registrada) VFSG (tamano de poro: 0,02, 0,1 o 0,2 pm) (fabricado por Pall Corp.), Zarutoron (fabricado por Sartorius Stedim Biotech), filtros de cartucho de membrana de acetato TCR (tamano de poro: 0,20, 0,45 o 8,0 pm (fabricado por Advantec), filtros de cartucho Yumicron (marca comercial registrada) (tamano de poro: 0,2, 0, 4, 0,6, 0,9 o 2,5 pm) (fabricado por Yuasa Membrane Systems Co., Ltd.) o similares.
El tamano de poro de la membrana de filtracion es, aunque sin limitacion particular, preferentemente de 1 nm a 100 pm, mas preferentemente de 5 nm a 10 pm, preferentemente de 10 nm a 1 pm, y particularmente preferente de 0,1 pm a 0,5 pm. Un ejemplo espedfico del tamano de poro de membrana puede ser el tamano de poro del ejemplo espedfico de membrana de filtracion indicado anteriormente.
La membrana de filtracion puede presentar una estructura que consiste en una unica membrana de filtracion, tal como una unidad de filtracion Millex (marca comercial registrada) (fabricada por Millipore, numero de catalogo: SLGV033RS), o una estructura de dos o mas capas que incluye uno o mas prefiltros, tal como 0,5/0,2 pm Express (marca comercial registrada) SHC Disk W/Typar (fabricado por Millipore, numero de catalogo: HGEP02550).
Un metodo para evaluar la filtrabilidad de la disolucion acuosa puede incluir, aunque sin limitacion particular, por ejemplo, una prueba de Vmax o similar. Vmax (L/m2) es la cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie membranaria que puede obtenerse tras un tiempo infinito despues del inicio de la filtracion, y puede medirse mediante el metodo descrito en BioPharm, 46, septiembre de 1995.
Ademas, la presente exposicion se refiere a un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa en la que se prepara la disolucion acuosa que incluye el agente quelante, mediante la adicion del agente quelante a la disolucion acuosa para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa. Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa en la que la disolucion acuosa que incluye el agente quelante y el medio de cultivo se preparan mediante adicion del agente quelante y el medio de cultivo a la disolucion acuosa para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa.
Ademas, la presente exposicion se refiere a un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa mediante la preparacion de la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, mediante adicion del agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa, y llevando a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa y despues cultivando las celulas con la disolucion acuosa resultante.
Ejemplos
A continuacion en la presente memoria, la presente invencion se describira con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos siguientes. Sin embargo, estos ejemplos se proporcionan unicamente a tftulo ilustrativo y no limitativo de la invencion.
[Ejemplo 1] Efecto del agente quelante sobre la mejora de la filtrabilidad
Los efectos de diversos agentes quelantes sobre la filtrabilidad de una disolucion acuosa al anadirla durante la preparacion de la disolucion acuosa que incluye un medio de cultivo en polvo, se examinaron a fin de demostrar la mejora del valor de Vmax (cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana).
La preparacion de la disolucion acuosa se llevo a cabo mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, cada 2,0 g de dihidrato de citrato trisodico (fabricado por Kozakai Pharmaceutical Co.), acido L-malico (fabricado por Wako, numero de catalogo: 138-07512) o sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III) (en adelante denominada sal sodica de EDTA-hierro (III)) (fabricada por Sigma-Aldrich, numero de catalogo: EDFS-100G) se anadio como agente quelante a 900 ml de agua pura (en adelante denominada AP), seguido de agitacion. Cada pH tras la disolucion completa del agente quelante era de 8,41 para la disolucion con adicion de dihidrato de citrato trisodico, 2,57 para la disolucion con adicion de acido L-malico y 5,11 para la disolucion con adicion de sal sodica de EDTA-hierro (III).
A continuacion, se anadieron 6,7 g de SOY HYDROLYSATE UF (fabricado por SAFC Bioscience, numero de catalogo: 91052-1K3986), seguido de la agitacion durante aproximadamente 15 minutos. Se anadieron 22,6 g de medio de cultivo en polvo mejorado EX-CELl 302 (fabricado por SAFC Bioscience) que contema aminoacidos, sales metalicas y vitaminas, y 0,5 ml de disolucion de metotrexato 1 mmol/l (fabricada por Sigma Aldrich, numero de catalogo: M8407-500MG) disuelta en PBS (fabricada por Invitrogen, numero de catalogo: 14190-250), seguido de la agitacion durante aproximadamente 30 minutos.
Ademas, se anadieron 1,6 g de bicarbonato sodico (fabricado por Kanto Chemical Co., Inc., numero de catalogo: 37116-00) para el ajuste del pH final. Tras agitar durante aproximadamente 5 minutos, se ajusto el volumen a 1 l con AP seguido de agitacion durante aproximadamente 10 minutos.
Cada concentracion de los agentes quelantes anadidos que se han indicado anteriormente, despues de la preparacion de la disolucion acuosa era de 6,8 mmoles/l para el dihidrato de citrato trisodico, 15 mmoles/l para el acido L-malico y 5,4 mmoles/l para la sal sodica de EDTA-hierro (III).
A continuacion, se llevo a cabo un ensayo de Vmax de la disolucion acuosa preparada, de la manera siguiente. Se introdujo 1 l de la disolucion acuosa de ensayo en un tanque presurizado (fabricado por Millipore). Como filtro de ensayo se utilizo una unidad de filtracion Millex (marca comercial registrada) GV (fabricada por Millipore, numero de catalogo: SLGV033RS) con un tamano de poro de 0,22 pm. El filtro se conecto a un tanque y se aplicaron 100 kPa de presion mediante aire comprimido.
Antes de iniciar el ensayo se abrio ligeramente la valvula en el tanque y se humecto el filtro con la disolucion acuosa. Tras humectar el filtro, se inicio el ensayo abriendo la valvula por completo. El punto temporal de apertura completa de la valvula se fijo en 0 y se midio el tiempo necesario para incrementar en 5 g la cantidad procesada en la filtracion. Se considero que la densidad de la disolucion acuosa era de 1 g/ml y se calculo la cantidad de filtracion (V) como el peso medido. La medicion se llevo a cabo durante mas de tres minutos. Se dibujo un grafico mediante representacion de los valores medidos con el tiempo (t) en el eje horizontal y t/V en el eje vertical a fin de calcular la Vmax a partir del inverso de la pendiente de la lmea recta obtenida.
Se muestran los resultados en la fig. 1. El valor de Vmax (L/m2) era de 452 para la disolucion acuosa a la que no se habfa anadido agente quelante, pero se incremento a 1.931 para la disolucion acuosa a la que se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico como agente quelante; a 2.483 para la disolucion acuosa a la que se habfa anadido acido L-malico como agente quelante, y 1.834 para la disolucion acuosa a la que se habfa anadido sal sodica de EDTA-hierro (III) como agente quelante.
Estos resultados muestran que el valor de Vmax de la disolucion acuosa puede incrementarse mediante la adicion del agente quelante durante la preparacion de la disolucion acuosa.
[Ejemplo 2] Temporizacion de la adicion y efecto de mejora de la filtrabilidad del dihidrato de citrato trisodico
La temporizacion de la adicion y efecto de mejora de la filtrabilidad del dihidrato de citrato trisodico durante la preparacion de la disolucion acuosa que incluye un medio de cultivo en polvo se examinaron a fin de demostrar que la Vmax (cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana) podfa incrementarse en gran medida mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico junto con o antes del medio de cultivo en polvo que contema aminoacidos, sales metalicas, vitaminas o similares. Tambien se demostro que la Vmax (cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana) puede incrementarse mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico antes del ajuste del pH final.
La preparacion de la disolucion acuosa se llevo a cabo mediante el procedimiento siguiente, excepto la adicion de dihidrato de citrato trisodico. En primer lugar, se anadieron 6,7 g de HYDROLYSATE UF (fabricado por SAFC Bioscience, numero de catalogo: 91052-5K3986) a 900 ml de agua pura (en adelante denominada AP), seguido de agitacion durante aproximadamente 15 minutos.
Se disolvieron 22,6 g de EX-CELL 302 mejorado (fabricado por SAFC Bioscience) que contema aminoacidos, sales metalicas y vitaminas, y 0,5 ml de disolucion de metotrexato 1 mmol/l (fabricada por Sigma Aldrich, numero de catalogo: M8407-500MG) disuelta en PBS (fabricada por Invitrogen, numero de catalogo: 14190-250), seguido de la agitacion durante aproximadamente 30 minutos.
Ademas, se anadieron 1,6 g de bicarbonato sodico (fabricado por Kanto Chemical Co., Inc., numero de catalogo: 37116-00) para el ajuste del pH final. Tras agitar durante aproximadamente 5 minutos, se ajusto el volumen a 1 l con AP y la mezcla se agito adicionalmente durante aproximadamente 10 minutos.
Durante el procedimiento de preparacion de la disolucion acuosa, se anadio dihidrato de citrato trisodico (fabricado por Kozakai Pharmaceutical Co.) en los puntos temporales de las condiciones A a H siguientes para preparar las disoluciones acuosas. La concentracion del dihidrato de citrato trisodico anadido tras la preparacion de la disolucion acuosa indicada anteriormente era 0,1 g/l (0,34 mmoles/l).
Condicion A: ninguna adicion
Condicion B: 10 minutos antes de la adicion de SOY HYDROLYSATE UF
Condicion C: 1 minuto antes de la adicion de SOY HYDROLYSATE UF
Condicion D: adicion concurrente de SOY HYDROLYSATE UF
Condicion E: 10 minutos antes de la adicion de EX-CELL 302 mejorado
Condicion F: adicion concurrente de EX-CELL 302 mejorado
Condicion G: 15 minutos antes de la adicion de bicarbonato sodico
Condicion H. inmediatamente despues de la preparacion de 1 l de disolucion con AP
A continuacion, se llevo a cabo un ensayo de Vmax de la disolucion acuosa preparada, de la manera siguiente. Se introdujo 1 l de la disolucion acuosa de ensayo en un tanque presurizado (fabricado por Millipore), unidad de filtracion GV Millex (marca comercial registrada) (fabricada por Millipore, numero de catalogo: SLGV033RS) con un tamano de poro de 0,22 pm. El filtro se conecto a un tanque y se aplicaron 100 kPa de presion mediante aire comprimido. Antes de iniciar el ensayo se abrio ligeramente la valvula en el tanque y se humecto el filtro con la disolucion acuosa. Tras humectar el filtro, se inicio el ensayo abriendo la valvula por completo.
El punto temporal de apertura completa de la valvula se fijo en 0 y se midio el tiempo necesario para incrementar en 5 g la cantidad procesada en la filtracion. Se considero que la densidad de la disolucion acuosa era de 1 g/ml y se calculo la cantidad de filtracion (V) como el peso medido. La medicion se llevo a cabo durante mas de tres minutos. Se dibujo un grafico mediante representacion de los valores medidos con el tiempo (t) en el eje horizontal y t/V en el eje vertical a fin de calcular la Vmax a partir del inverso de la pendiente de la lmea recta obtenida.
Se muestran los resultados en la figura 2. El valor de Vmax (L/m2) era de 1.163 bajo la Condicion A, de 3.199 bajo la Condicion B, de 3.652 bajo la Condicion C, 3.783 bajo la Condicion D, 3.060 bajo la Condicion E y 3.581 bajo la Condicion F, indicando que la filtrabilidad de la disolucion acuosa podfa mejorarse en gran medida mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico junto con o antes del EX-CELL 302 mejorado.
Ademas, el valor de Vmax (L/m2) era de 2.502 bajo la Condicion G, indicando que la filtrabilidad de la disolucion acuosa puede mejorarse mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico antes de la adicion de bicarbonato sodico como procedimiento de ajuste del pH. Por otra parte, el valor de Vmax era de 1.441 bajo la Condicion H de adicion de dihidrato de citrato trisodico tras el ajuste del pH, indicando que la mejora de la filtrabilidad de la disolucion acuosa era equivalente o ligeramente superior a la de la Condicion A.
Estos resultados demostraron que la Vmax (cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana) de la disolucion acuosa puede incrementarse mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico antes del procedimiento de ajuste del pH final. Ademas, en particular, puede incrementarse la Vmax mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico junto con o antes del medio de cultivo en polvo que contiene aminoacidos, sales metalicas, vitaminas o similares.
[Ejemplo 3] Correlacion entre la concentracion de dihidrato de citrato trisodico anadido y la filtrabilidad de la disolucion acuosa
La correlacion entre filtrabilidad y concentracion del dihidrato de citrato trisodico anadido durante la preparacion de la disolucion acuosa se examino con el fin de demostrar que la Vmax (cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana) se incrementaba de una manera dependiene de la concentracion.
La preparacion de la disolucion acuosa se llevo a cabo mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se anadieron 0 g (ninguna adicion), 0,1 g o 1,0 g de dihidrato de citrato trisodico (fabricado por Kozakai Pharmaceutical Co.) a 900 ml de agua pura (en adelante denominada AP) y se agito. Tras disolver por completo el dihidrato de citrato trisodico, se anadieron 6,7 de SOY HYDROLYSATE UF (fabricado por SAFC Bioscience, numero de catalogo: 91052-1K3986), seguido de la agitacion durante aproximadamente 15 minutos.
Se anadieron 22,6 g de EX-CELL 302 mejorado (fabricado por SAFC Bioscience) que contema aminoacidos, sales metalicas y vitaminas, y similares, y 0,5 ml de disolucion de metotrexato 1 mmol/l (fabricada por Sigma Aldrich, numero de catalogo: M8407-500MG) disueltos PBS (fabricado por Invitrogen, numero de catalogo: 14190-250), seguido de la agitacion durante aproximadamente 30 minutos.
Ademas, se anadieron 1,6 g de bicarbonato sodico (fabricado por Kanto Chemical Co., Inc., numero de catalogo: 37116-00) para el ajuste del pH final. Tras agitar durante aproximadamente 5 minutos, se ajusto el volumen a 1 l con AP seguido de agitacion durante aproximadamente 10 minutos. La concentracion del dihidrato de citrato trisodico anadido indicada anteriormente tras la preparacion de la disolucion acuosa era 0 g/l (ninguna adicion), 0,1 g/l (0,34 mmoles/l o 1,0 g/l (3,4 mmoles/l).
A continuacion, se llevo a cabo un ensayo de Vmax de la disolucion acuosa preparada, de la manera siguiente. Se introdujo 1 l de la disolucion acuosa de ensayo en un tanque presurizado (fabricado por Millipore). Como filtro de ensayo se utilizo una unidad de filtracion Millex (marca comercial registrada) GV (fabricada por Millipore, numero de catalogo: SLGV033RS) con un tamano de poro de 0,22 pm. El filtro se conecto a un tanque y se aplicaron 100 kPa de presion mediante aire comprimido.
Antes de iniciar el ensayo se abrio ligeramente la valvula en el tanque y se humecto el filtro con la disolucion acuosa. Tras humectar el filtro, se inicio el ensayo abriendo la valvula por completo. El punto temporal de apertura completa de la valvula se fijo en 0 y se midio el tiempo necesario para incrementar en 5 g la cantidad procesada en la filtracion. Se considero que la densidad de la disolucion acuosa era de 1 g/ml y se calculo la cantidad de filtracion (V) como el peso medido. La medicion se llevo a cabo durante mas de tres minutos. Se dibujo un grafico mediante representacion de los valores medidos con el tiempo (t) en el eje horizontal y t/V en el eje vertical a fin de calcular la Vmax a partir del inverso de la pendiente de la lmea recta obtenida.
Se muestran los resultados en la figura 3. El valor de Vmax (L/m2) era de 452 para la disolucion acuosa a la que no se habfa anadido ningun agente quelante, pero se incremento a 1.706 para la disolucion acuosa a la que se habfan anadido 0,1 g/l de dihidrato de citrato trisodico y de 2.588 para la disolucion acuosa a la que se habfa anadido 1,0 g/l de dihidrato de citrato trisodico.
Estos resultados demostraron que el valor de Vmax de la disolucion acuosa puede incrementarse segun la concentracion de dihidrato de citrato trisodico mediante la adicion del mismo como agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa.
[Ejemplo 4] Efecto de mejora de la filtrabilidad independiente del material de membrana/estructura de la membrana utilizando agente quelante
En la preparacion de la disolucion acuosa que contema el medio de cultivo en polvo, se examinaron los efectos de mejora de la filtrabilidad de los agentes quelantes mediante la utilizacion de una pluralidad de membranas de filtracion. Como resultado, se revelo que el valor de la Vmax (cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana) puede mejorarse con una membrana de fluoruro de polivinilideno (en adelante denominado PVDF) con un tamano de poro de 0,22 pm, o con una membrana de PES con un tamano de poro de 0,2 pm (en adelante denominada membrana PES de 0,5/0,2 pm de tamano de poro) en combinacion con membranas de polieter sulfona (en adelante denominada PES) con un tamano de poro de 0,5 pm como prefiltro. La preparacion de la disolucion acuosa se llevo a cabo mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se anadieron 0 g (ninguna adicion), 0,1 g de dihidrato de citrato trisodico (fabricado por Kozakai Pharmaceutical Co.) a 900 ml de agua pura (en adelante denominada AP) y se agito. Tras disolver por completo el dihidrato de citrato trisodico, se anadieron 6,7 de SOY HYDROLYSATE UF (fabricado por SAFC Bioscience, numero de catalogo: 91052-1K3986 o 91052-5K3986), seguido de agitacion durante aproximadamente 15 minutos.
Se anadieron 22,6 g de medio de cultivo en polvo EX-CELL 302 (fabricado por SAFC Bioscience) que contema aminoacidos, sales metalicas, vitaminas y similares, y 0,5 ml de disolucion de metotrexato 1 mmol/l (fabricada por Sigma Aldrich, numero de catalogo: M8407-500MG) disuelta en PBS (fabricada por Invitrogen, numero de catalogo: 14190-250), seguido de la agitacion durante aproximadamente 30 minutos. Ademas, se anadieron 1,6 g de bicarbonato sodico (fabricado por Kanto Chemical Co., Inc., numero de catalogo: 37116-00) para el ajuste del pH final. Tras agitar durante aproximadamente 5 minutos, se ajusto el volumen a 1 l con AP seguido de agitacion adicional durante aproximadamente 10 minutos. La concentracion del dihidrato de citrato trisodico anadido indicada anteriormente tras la preparacion de la disolucion acuosa era 0 g/l (ninguna adicion) o 0,1 g/l (0,34 mmoles/l).
A continuacion, se llevo a cabo el ensayo de Vmax de la disolucion acuosa preparada mediante el procedimiento siguiente utilizando la unidad de filtracion GV de membrana de PVDF Millex (marca comercial registrada) (fabricada por Millipore, numero de catalogo: SLGV033RS) con un tamano de poro de 0,22 pm como filtro de ensayo. Se introdujo 1 l de la disolucion acuosa de ensayo en un tanque presurizado (fabricado por Millipore). El filtro se conecto a un tanque y se aplicaron 100 kPa de presion mediante aire comprimido.
Antes de iniciar el ensayo se abrio ligeramente la valvula en el tanque y se humecto el filtro con la disolucion acuosa. Tras humectar el filtro, se inicio el ensayo abriendo la valvula por completo. El punto temporal de apertura completa de la valvula se fijo en 0 y se midio el tiempo necesario para incrementar en 5 g la cantidad procesada en la filtracion. Se considero que la densidad de la disolucion acuosa era de 1 g/ml y se calculo la cantidad de filtracion (V) como el peso medido. La medicion se llevo a cabo durante mas de tres minutos. Se dibujo un grafico mediante representacion de los valores medidos con el tiempo (t) en el eje horizontal y t/V en el eje vertical a fin de calcular la Vmax a partir del inverso de la pendiente de la lmea recta obtenida.
Ademas, se llevo a cabo un ensayo de Vmax de la disolucion acuosa preparada mediante el procedimiento siguiente, utilizando Express SHC Disk W/Typar 0,5/0,2 pm (fabricado por Millipore, numero de catalogo: HGEP02550), que es una membrana de PES con un tamano de poro de 0,5/0,2 pm como filtro de ensayo. Se introdujo 1 l de la disolucion acuosa de ensayo en un tanque presurizado (fabricado por Millipore).
El filtro de ensayo humectado suficientemente con AP se unio a un soporte (fabricado por Millipore) y el soporte se conecto a un tanque de presion. Se extrajo por completo el aire por la valvula de ventilacion mediante la apertura de la valvula incluida en el soporte. Tras aplicar 120 kPa de presion con aire comprimido en el tanque presurizado, se inicio el ensayo mediante la apertura completa de la valvula.
El punto temporal de apertura completa de la valvula se fijo en 0 y se midio el tiempo necesario para incrementar en 5 g la cantidad procesada en la filtracion. Se considero que la densidad de la disolucion acuosa era de 1 g/ml y se calculo la cantidad de filtracion (V) como el peso medido. La medicion se llevo a cabo durante mas de tres minutos. Se dibujo un grafico mediante representacion de los valores medidos con el tiempo (t) en el eje horizontal y t/V en el eje vertical a fin de calcular la Vmax a partir del inverso de la pendiente de la lmea recta obtenida.
Se muestran los resultados en la fig. 4. Con respecto a la filtracion utilizando la membrana de PVDF con un tamano de poro de 0,22 pm, el valor de Vmax (L/m2) era de 957 para la disolucion acuosa a la que no se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico, pero se incremento a 3.199 para la disolucion acuosa a la que se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico. Ademas, con respecto a la filtracion utilizando la membrana de PES con un tamano de poro de 0,5/0,2 pm, el valor de Vmax (L/m2) era de 1511 para la disolucion acuosa a la que no se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico, pero se incremento a 3.922 para la disolucion acuosa a la que se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico.
Estos resultados demuestran que la filtrabilidad de la disolucion acuosa puede mejorarse mediante la adicion del agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa, con independencia del material de membrana utilizado, tal como PVDF o PES. Tambien se revelo que la filtrabilidad de la disolucion acuosa puede mejorarse mediante la adicion del agente quelante antes del ajuste del pH final de la disolucion acuosa, con independencia de la estructura de la membrana que se utiliza, tal como de una sola capa o de una pluralidad de capas, preparada en combinacion con el prefiltro.
[Ejemplo 5] Cultivo de celulas animales y produccion de sustancia fisiologicamente activa utilizando la disolucion acuosa preparada mediante la adicion de agente quelante antes del ajuste del pH final Se llevo a cabo el cultivo de celulas animales utilizando la disolucion acuosa preparada mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico antes del ajuste del pH final. Como resultado, en la disolucion acuosa a la que se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico, el crecimiento y tttulos celulares eran equivalentes o superiores a los observados en la disolucion acuosa a la que no se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico.
El procedimiento de preparacion de 1 l de disolucion acuosa de produccion se describe a continuacion.
En primer lugar, se anadieron 0 g (ninguna adicion), 0,1 g de dihidrato de citrato trisodico (fabricado por Kozakai Pharmaceutical Co.) a aproximadamente 900 ml de agua pura (en adelante denominada AP) y se agito. Tras disolver por completo el dihidrato de citrato trisodico, se anadieron 6,7 de SOY HYDROLYSATE UF (fabricado por SAFC Bioscience, numero de catalogo: 91052-1K3986 o 91052-5K3986), seguido de agitacion durante aproximadamente 15 minutos.
Se anadieron 22,6 g de medio de cultivo en polvo mejorado EX-CELL 302 (fabricado por SAFC Bioscience) que contema aminoacidos, sales metalicas, vitaminas y similares, y 0,5 ml de disolucion de metotrexato 1 mmol/l (fabricada por Sigma Aldrich, numero de catalogo: M8407-500MG) disuelta en PBS (fabricada por Invitrogen, numero de catalogo: 14190-250), seguido de la agitacion durante aproximadamente 30 minutos.
Ademas, se anadieron 1,6 g de bicarbonato sodico (fabricado por Kanto Chemical Co., Inc., numero de catalogo: 37116-00) para el ajuste del pH final. Tras agitar durante aproximadamente 5 minutos, se ajusto el volumen a 1 l con AP seguido de agitacion durante aproximadamente 10 minutos para preparar la disolucion acuosa de produccion. La concentracion del dihidrato de citrato trisodico anadido indicada anteriormente tras la preparacion de la disolucion acuosa era 0 g/l (ninguna adicion) o 0,1 g/l (0,34 mmoles/l).
Se cultivaron por lotes alimentados celulas CHO que expresan anticuerpo monoclonal utilizando la disolucion acuosa de produccion preparada mediante el procedimiento anteriormente descrito, en un reactor de 3 l durante 14 dfas. La densidad de siembra en el estadio inicial de cultivo fue de aproximadamente 3,0x106 celulas/ml y la temperatura y pH de la disolucion acuosa para el cultivo durante el periodo de cultivo se controlo en 35°C y 7,10, respectivamente.
La disolucion acuosa de alimentacion consistfa en aminoacidos [L-alanina, monohidrocloruro de L-arginina, monohidrato de L-asparagina, dihidrocloruro de L-cistina, acido L-glutamico, dihidrato de monohidrocloruro de L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, monohidrocloruro de L-lisina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, dihidrato disodico de L-tirosina, L-valina (todos fabricados por Sigma Aldrich), acido L-aspartico, glicina (todos fabricados por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-alanil-L-glutamina (fabricada por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) y L-metionina (fabricada por Junsei Chemical Co.)], vitaminas [D-biotina, pantotenato de D-calcio, cloruro de colina, acido folico, mioinositol, niacinamida, hidrocloruro de piridoxal, riboflavina, hidrocloruro de tiamina, cianocobalamina (todos fabricados por Sigma Aldrich)], insulina humana recombinante (fabricada por JRH Bioscience), etanolamina (fabricada por Sigma Aldrich), SOY HYDROLYSATE UF (fabricado por SAFC Bioscience), disolucion concentrada lipfdica de colesterol (solucion acuosa 250x, fabricada por Invitrogen), sal sodica de etilendiaminotetraacetico-hierro (II) (fabricado por Sigma Aldrich) y glucosa (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). La disolucion acuosa de alimentacion se anadio en una cantidad de aproximadamente 6,3% de la disolucion acuosa de produccion inicial los dfas 3, 6, 9 y 12 despues del cultivo.
Como resultado, en el cultivo con la disolucion acuosa a la que no se habfa anadido dihidrato de citrato trisodico, la densidad maxima de celulas viables alcanzo 5,4x106 celulas/ml y el tttulo del anticuerpo monoclonal al final del cultivo era de 1,8 g/l, mientras que en el cultivo con la disolucion acuosa a la que se habfan anadido 0,1 g/l de dihidrato de citrato trisodico, la densidad maxima de celulas viables alcanzo 5,8x106 celulas/ml y el tftulo de anticuerpo monoclonal al final del cultivo era de 1,9 g/l.
Estos resultados indican que en la disolucion acuosa preparada mediante la adicion de dihidrato de citrato trisodico antes del ajuste del pH final, el crecimiento y tttulos celulares eran equivalentes o superiores a los observados en la disolucion acuosa preparada sin adicion de dihidrato de citrato trisodico.
[Ejemplo 6] Efecto de mejora de la filtrabilidad mediante la adicion de dihidrato de acido N-acetilneuramrnico
El efecto de la adicion de dihidrato de acido N-acetilneurammico como agente quelante durante la preparacion de la disolucion acuosa que contema un medio de cultivo en polvo sobre la filtrabilidad de la disolucion acuosa se examino a fin de demostrar que podfa mejorarse la Vmax (cantidad de procesamiento maxima por unidad de superficie de membrana) de la disolucion acuosa.
La preparacion de la disolucion acuosa se llevo a cabo mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se anadieron 4,0 g de hidroxido sodico (fabricado por Junsei Chemical Co., numero de catalogo 39155-0301), 4,5 g de sal disodica de L-tirosina (fabricada por Sigma, numero de catalogo: T1145-100G) y 6,16 g de dihidrocloruro de L-(-)-cistina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., numero de catalogo: 034-05322) a 160 ml de agua pura (en adelante abreviada como AP), seguido de la agitacion durante aproximadamente 30 minutos y el volumen se ajusto a 200 ml con AP para preparar la disolucion acuosa (en adelante abreviada como disolucion Cys-Tyr).
A continuacion, se anadieron 32,6 g de un medio de cultivo en polvo, Efficient Feed A, que contema aminoacidos, sales metalicas, vitaminas y similares (fabricado por Life Technologies, numero de catalogo: A12870SB), 0,5 ml de un aditivo lfquido de disolucion de poliamina (fabricado por Life Technologies, numero de catalogo: A12872SA), 27.1 g de un medio de cultivo en polvo, Efficient Feed B , que contema aminoacidos, sales metalicas, vitaminas y similares (fabricado por Life Technologies, numero de catalogo: A11498SA) y 5,0 g de L(+)-glutamina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., numero de catalogo: 078-00525), 30,0 g de peptona SE50MAF-UF (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd, numero de catalogo: P42474) y 70,0 g de D(+)-glucosa (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd, numero de catalogo: 041-00595) y 30,9 g de dihidrato de acido N-acetilneurammico (fabricado por Kyowahakko Bio Co., Ltd.) como el agente quelante, a 800 ml de AP, seguido de agitacion durante aproximadamente 30 minutos.
El pH despues de la agitacion era de 4,05. A continuacion, se anadieron 50 ml de disolucion Cys-Tyr, seguido de agitacion durante aproximadamente 20 minutos. El pH despues de la adicion de disolucion Cys-Tyr era de 4,37. Despues, se anadieron 17 ml de disolucion de hidroxido sodico 5 moles/l (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., numero de catalogo: 196-05375) para el ajuste del pH final, seguido de agitacion durante aproximadamente 20 minutos; despues, el volumen se ajusto a 1 l con AP para preparar la disolucion A. El pH final de la disolucion A era de 8,1. La concentracion del dihidrato de acido N-acetilneurammico anadido que se ha indicado anteriormente despues de la preparacion de la disolucion acuosa era de 30,9 g/l (89 mmoles/l).
Por otra parte, a 800 ml de AP, se anadieron 32,6 g de un medio de cultivo en polvo, Efficient Feed A, que contema aminoacidos, sales metalicas, vitaminas y similares (fabricado por Life Technologies, numero de catalogo: A12870SB), 0,5 ml de un aditivo lfquido de disolucion de poliamina (fabricado por Life Technologies, numero de catalogo: A12872SA), 27.1 g de un medio de cultivo en polvo, Efficient Feed B , que contema aminoacidos, sales metalicas, vitaminas y similares (fabricado por Life Technologies, numero de catalogo: A11498SA) y 5,0 g de L(+)-glutamina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., numero de catalogo: 078-00525), 30,0 g de peptona SE50MAF-UF (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd, numero de catalogo: P42474) y 70,0 g de D(+)-glucosa (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd, numero de catalogo: 041-00595) y se anadieron 28 ml de acido clorhudrico 5 moles/l (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., n° de cat. 081-05435) no como agente quelante sino como acido, seguido de la agitacion durante aproximadamente 30 minutos. El pH despues de la agitacion era de 3,09. A continuacion, se anadieron 50 ml de disolucion Cys-Tyr, seguido de agitacion durante aproximadamente 20 minutos. El pH despues de la adicion de disolucion Cys-Tyr era de 3,39.
Despues, se anadieron 28 ml de disolucion de hidroxido sodico 5 moles/l (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., numero de catalogo: 196-05375) para el ajuste del pH final, seguido de agitacion durante aproximadamente 20 minutos; despues, el volumen se ajusto a 1 l con AP para preparar la disolucion B. El pH final de la disolucion B era de 8,1.
A continuacion, se llevo a cabo el ensayo de Vmax de la disolucion acuosa preparada, mediante el procedimiento siguiente. Se introdujo 1 l de la disolucion acuosa de ensayo en un tanque presurizado (fabricado por Millipore). Como filtro de ensayo se utilizo una unidad de filtracion Millex (marca comercial registrada) GV (fabricada por Millipore, numero de catalogo: SLGV033RS) con un tamano de poro de 0,22 pm.
El filtro se conecto al tanque y se aplicaron 100 kPa de presion mediante aire comprimido. Antes de iniciar el ensayo se abrio ligeramente la valvula en el tanque y se humecto el filtro con la disolucion acuosa. Tras humectar el filtro, se inicio el ensayo abriendo la valvula por completo.
El punto temporal de apertura completa de la valvula se fijo en 0 y se midio el tiempo necesario para incrementar en 5 g la cantidad procesada en la filtracion. Se considero que la densidad de la disolucion acuosa era de 1 g/ml y se calculo la cantidad de filtracion (V) como el peso medido. La medicion se llevo a cabo durante mas de tres minutos. Se dibujo un grafico mediante representacion de los valores medidos con el tiempo (t) en el eje horizontal y t/V en el eje vertical a fin de calcular la Vmax a partir del inverso de la pendiente de la lmea recta obtenida.
Se muestran los resultados en la fig. 5. El valor de Vmax (L/m2) era de 190 para la disolucion B, al que no se habfa anadido ningun quelante, pero se incremento a 2.025 para la disolucion A, a la que se habfa anadido dihidrato de acido N-acetilneurammico como el agente quelante.
Estos resultados muestran que el valor de Vmax de la disolucion acuosa puede incrementarse mediante la adicion de dihidrato de N-acetilneurammico como el agente quelante durante la preparacion de la disolucion acuosa que contiene el medio de cultivo en polvo.
La presente solicitud se basa en la solicitud de patente japonesa n° 2010-290444, presentada el 27 de diciembre de 2010.
Aplicabilidad industrial
La presente invencion proporciona un metodo para preparar una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad notablemente mejorada. Se proporciona una disolucion acuosa altamente versatil que puede filtrarse a traves de membrana establemente en un corto tiempo, mediante la utilizacion del metodo de preparacion. Ademas, se proporciona una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad notablemente mejorada que se prepara mediante el metodo de preparacion; un metodo para el cultivo de celulas utilizando la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion; un metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa utilizando el metodo de cultivo; una sustancia fisiologicamente activa producida mediante el metodo para producir la sustancia fisiologicamente activa; un metodo para llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa que se prepara mediante el metodo de preparacion; un metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de la disolucion acuosa, caracterizado porque la disolucion acuosa se prepara mediante la adicion de un agente quelante, o un metodo para producir la sustancia fisiologicamente activa mediante la preparacion de la disolucion acuosa, llevar a cabo la filtracion a traves de membrana de la disolucion acuosa y despues cultivar las celulas utilizando la disolucion acuosa.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Metodo para preparar una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que comprende un medio de cultivo y un agente quelante, en el que el metodo comprende anadir el agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste de pH final de la disolucion acuosa, y en el que el agente quelante se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
2. Metodo para preparar una disolucion acuosa segun la reivindicacion 1, en el que el agente quelante es uno o mas seleccionados de entre acido cftrico, acido malico, acido etilendiaminotetraacetico, sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III), acido sialico, y sales o hidratos de los mismos.
3. Metodo para preparar una disolucion acuosa segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el medio de cultivo en polvo incluye ademas una o mas seleccionadas de entre sales metalicas, azucares y vitaminas.
4. Metodo para preparar una disolucion acuosa segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para el cultivo celular.
5. Metodo para preparar una disolucion acuosa segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas animales.
6. Metodo para preparar una disolucion acuosa segun la reivindicacion 5, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas CHO derivadas de tejido de ovario de hamster chino.
7. Metodo para llevar a cabo la filtracion de membrana de una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que comprende un medio de cultivo y un agente quelante, en el que el metodo comprende anadir el agente quelante a la disolucion acuosa antes del ajuste de pH final de la disolucion acuosa, y en el que el agente quelante se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
8. Metodo para llevar a cabo la filtracion de membrana segun la reivindicacion 7, en el que el agente quelante es uno o mas seleccionados de entre acido cftrico, acido malico, acido etilendiaminotetraacetico, sal sodica de acido etilendiaminotetraacetico y hierro (III), acido sialico, y sales o hidratos de los mismos.
9. Metodo para llevar a cabo la filtracion de membrana segun la reivindicacion 7 o 8, en el que el medio de cultivo en polvo incluye ademas una o mas seleccionadas de entre sales metalicas, azucares y vitaminas.
10. Metodo para llevar a cabo la filtracion de membrana segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para el cultivo celular.
11. Metodo para llevar a cabo la filtracion de membrana segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas animales.
12. Metodo para llevar a cabo una filtracion de membrana segun la reivindicacion 11, en el que el medio de cultivo es un medio de cultivo para celulas CHO derivadas de tejido de ovario de hamster chino.
13. Metodo para llevar a cabo una filtracion de membrana segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que el filtro de membrana utilizado en la filtracion de membrana presenta un tamano de poro de 1 nm a 100 pm.
14. Metodo para mejorar la filtrabilidad de membrana de una disolucion acuosa, comprendiendo dicho metodo anadir un agente quelante y un medio de cultivo a la disolucion acuosa para preparar la disolucion acuosa que incluye el medio de cultivo y el agente quelante, y llevar a cabo la filtracion de membrana de la disolucion acuosa, en el que se anade el agente quelante antes del ajuste de pH final de la disolucion acuosa, y se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
15. Metodo para producir una sustancia fisiologicamente activa, en el que el metodo comprende anadir un agente quelante, antes del ajuste de pH final, a una disolucion acuosa para preparar una disolucion acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que incluye un medio de cultivo y el agente quelante, llevar a cabo la filtracion de membrana de la disolucion acuosa, y cultivar a continuacion las celulas utilizando la disolucion acuosa resultante, en el que el agente quelante se anade antes de la adicion del medio de cultivo en polvo.
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