JP2007522817A - タンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

抗体のようなタンパク質の細胞分泌速度を改変するための方法ならびに該方法により生産される改変された細胞を開示する。該方法及び改変された細胞は、治療、診断又は研究目的で高いレベルのタンパク質を生産するのに有用である。

Description

発明の分野
本発明はタンパク質の細胞分泌速度の改変方法に関する。

発明の背景
抗体のようなタンパク質の大規模生産は、典型的には培養された生産細胞系からのタンパク質の分泌に頼っている。培養細胞により生産される分泌タンパク質は、回りの細胞培養培地から容易に回収され且つ精製され得る。

タンパク質の細胞発現速度は、分泌タンパク質の生産及びバイオリアクター又は他の系からの精製に影響する重要なパラメーターである。一般に、細胞発現速度が比較的高い場合に、より高い精製タンパク質収率を達成することができる。逆に、細胞発現速度が低すぎると、タンパク質精製は不可能であり得る。

低発現性細胞の問題を攻略するための１つの方法は、低発現性細胞の集団から高発現性のサブクローニングされた細胞を単離することであった。典型的には、これは、時間がかかり、且つ労働−集中的な数回の制限連続希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）、スクリーニング及び高発現性細胞系の選択を必要とする。あるいはまた、問題のタンパク質を生産する全く新規な細胞系を、新規な細胞系が高発現性の系であることを望んで形成する。

高発現性細胞系を形成するための前記の方法のそれぞれは、制限を有する。例えば低発現性細胞の集団からのサブクローニングによる高発現性細胞系の同定は、集団中で高発現性細胞が比較的希少であることならびに高発現性細胞の同定に必要な非常に多量な時間及び労働により制限される。

さらに、問題の抗体又はタンパク質を生産する新規な細胞系の形成は、新規な細胞系が高発現性でない可能性及び抗体生産性細胞を再形成し、高発現性の系を同定するのに必要であろう努力の実質的な量により制限される。いくつかの場合には、高発現性細胞系を得るための努力にかかわらず、低発現性細胞系しか得ることができない。

かくして、タンパク質の細胞分泌速度を変える有効な方法に対する要求がある。

図面の簡単な記述
図１は、Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルを示す。

図２は、Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞におけるＣＤ５３遺伝子転写産物レベルを示す。

図３は、Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に対して増加した高発現性細胞におけるトランスフェリン−１生産を示す。

図４は、Ｃ４６３ａ親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞系におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルを示す。

図５は、Ｃ４６３ａ由来サブクローンにおける抗体生産が増加する場合に、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが向上する傾向を示す。

図６は、Ｃ４６３ａ親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞系におけるトランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルを示す。

図７は、Ｃ４６３ａ由来サブクローンにおける抗体生産が増加する場合に、トランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルが向上する傾向を示す。

発明の概略
本発明の１つの側面は、細胞中の分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ
ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＳＬＰＩ）、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−１）より成る群から選ばれる少なくとも１つの分子の活性を調節し、そして細胞を培養する段階を含んでなる、タンパク質の細胞分泌速度の改変方法である。

本発明の他の側面は、細胞中の分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１より成る群から選ばれる少なくとも１つの分子の活性を調節し；そして細胞を培養する段階により形成される、改変された細胞分泌速度を有する骨髄腫細胞である。

発明の詳細な記述
本明細書中で引用される特許及び特許出願を含むがそれらに限られないすべての公開文献は、引用することにより、その記載事項が完全に示されるように本明細書の内容となる。

本明細書で用いられる「抗体」という用語は広い意味を有し、ポリクローナル抗体、ネズミ、ヒト、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体ならびに抗体フラグメントもしくは変異体を含む免疫グロブリン又は抗体分子を含む。抗体は、構成的に発現され、プラズマ細胞により分泌される分泌タンパク質である。ハイブリドーマ形成のような標準的な方法により、あるいは骨髄腫細胞又は他の細胞型、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞及び昆虫細胞のような不朽化Ｂ細胞中への抗体重及び／又は軽鎖遺伝子のトランスフェクションにより不朽化されたプラズマ細胞を用いて抗体を生産することもできる。

抗体フラグメント又は変異体にはミメティボディー（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｃフラグメント、重鎖フラグメント、軽鎖フラグメント及び少なくとも１個の抗体ペプチド鎖の一部を含有する分子が含まれる。そのような部分は、抗体可変、ヒンジ又は不変領域ペプチド鎖に相当することができる。

本明細書で用いられる「ミメティボディー」という用語は、一般式（Ｉ）：
（Ｖ１（ｎ）−Ｐｅｐ（ｎ）−Ｆｌｅｘ（ｎ）−Ｖ２（ｎ）−ｐＨｉｎｇｅ（ｎ）−ＣＨ２（ｎ）−ＣＨ３（ｎ））（ｍ）
を有するタンパク質を意味し、ここでＶ１は免疫グロブリン可変領域のＮ−末端の少なくとも一部であり、Ｐｅｐはエピトープに結合する少なくとも１個の生物活性ペプチドであり、Ｆｌｅｘはミメティボディーが二者択一的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）配向及び結合性を有することを可能にすることにより構造的な柔軟性を与えるポリペプチドであり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ−末端の少なくとも一部であり、ｐＨｉｎｇｅは免疫
グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２不変領域の少なくとも一部であり、ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３不変領域の少なくとも一部であり、ここでｎ及びｍは１〜１０の整数であることができる。ミメティボディーは、構築物中に存在する重鎖不変ドメインアミノ酸配列に依存して、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥのような種々の型の免疫グロブリン分子の性質及び機能を模することができる。

本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、典型的には１個の抗原決定基に対して指向されている（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な性質を示し、特定の方法による抗体の生産を必要としない。例えばネズミｍＡｂｓを、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：１９７５年，４９５のハイブリドーマ法により作ることができる。受容抗体（典型的にはヒトのような他の哺乳類種）に由来する軽及び重鎖不変領域と一緒に供与抗体（典型的にはネズミ）に由来する軽鎖及び重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂｓを、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に開示されている方法により調製することができる。ヒト以下の供与免疫グロブリン（典型的にはネズミ）に由来するＣＤＲｓ及び１つもしくはそれより多いヒト免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン−由来部分を有し、場合により結合親和性を保存するための改変されたフレームワーク支持残基を有することができるヒト化ｍＡｂｓを、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：１９８９年，１００２９−１００３２及びＨｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９９１年，４２１に開示されている方法により得ることができる。

ヒト以下の配列のない完全なヒトｍＡｂｓを、例えばＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：１９９４年，８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１９９６年，８４５−８５１及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１９９７年，１４６−１５６で言及されている方法により、ヒト免疫グロブリン形質転換マウスから調製することができる。例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：２０００年，５７−８６及びＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：２００１年，６７−８４で言及されている方法により、ヒトｍＡｂｓをファージディスプレーライブラリから調製し、最適化することもできる。

本明細書で用いられる「細胞発現レベル」という用語は、細胞がその寿命に及んで発現することができる与えられるタンパク質の量を意味する。そのような量を時間の変化当たりの培地中に存在するタンパク質の量における変化（すなわち「容量生産性」）として記述することができるか、あるいは細胞数に標準化することができる（すなわち「比生産性」）。「容量生産性」は、単位「ｍｇ／ｍｌ／日」を用いて表すことができ、「比生産性」は、単位「ｐｇ／細胞／日」を用いて表すことができる。

本発明は、細胞によるタンパク質の細胞発現の量を改変するのに有用な方法を提供する。本発明の方法の代表的な用途は、治療、診断又は研究目的に有用なタンパク質、例えば抗体に関する発現量の増強である。

高処理量ｃＤＮＡマイクロアレー分析（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｅｓ）は、種々の高発現性抗体生産細胞系において通常調節される遺伝子の同定のための方法を与える。そのような分析は、高い分泌速度を有する種々のＳＰ２／０及びＣ４６３ａ由来ネズミ骨髄腫細胞系において、すべての既知のネズミ遺伝子の０．１％未満が通常調節されることを明らかにした。分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）（Ｇｅｎｂａｎｋ
受託番号 ＮＭ０１１４１４）、ＣＤ５３（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号 ＮＭ００７６５１）及びトランスフェリン−１（Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号 Ｊ０３２９９）タンパク質をコードする遺伝子は、この通常調節される遺伝子の選択セット（ｓｅｌｅｃｔ ｓｅｔ）に属する。ｃＤＮＡマイクロアレー分析において、これらの遺伝子は、調べられたＳＰ２／０及びＣ４６３ａ由来の高発現性細胞系において上方調節されることが見出された。これらの遺伝子はすべて、調べられた高発現性細胞系において、親ネズミ骨髄腫細胞系に対して少なくとも１．５倍上方−調節された。

ＳＬＰＩタンパク質は、サイクリン Ｄを誘導し、ＴＧＦ−ベータを下方調節し、且つリシルオキシダーゼをコードする遺伝子の抑制によりＲａｓシグナル伝達経路を介するシグナリングを誘導することにより、細胞増殖を増強する。ＣＤ５３タンパク質は、タンパク質のテトラスパニン群の細胞表面発現メンバーであり、生存反応を開始させ且つアポトーシスに入る細胞の数を減少させることができると思われる。細胞活性化、イオンチャンネル形成及び小分子の輸送のようなＣＤ５３に関する他の機能も示唆された。トランスフェリン−１は主要な鉄輸送タンパク質であり、それは細胞増殖を支持するのに必要な鉄を与える。特定の理論に縛られることは望まないが、出願人らは、ＳＬＰＩ、ＣＤ５３及びトランスフェリン−１遺伝子の１つもしくはそれより多くの上方調節が、生存できる細胞数を増加させることにより抗体発現を増加させると信じる。

本発明の方法において、細胞中のＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１より成る群から選ばれる少なくとも１つの分子の活性を調節し、そして細胞を培養することにより、タンパク質の細胞発現速度を改変する。本発明の方法は、抗体のようなタンパク質の細胞発現速度の向上又は低下を与える。

本発明の１つの態様において、ＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクションすることにより、タンパク質の細胞発現速度を向上させる。例えばリポフェクション又はエレクトロポレーションのような標準的な方法あるいは当該技術分野における熟練者に既知のウイルス形質転換により、トランスフェクションを行なうことができる。そのような方法は、安定に又は一過的にトランスフェクションされた細胞を与えることができる。

ＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１親分子と類似の活性を生ずるＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１タンパク質あるいは核酸配列の変異体も本発明の方法において有用であろう。例えば親分子又は関連するタンパク質の群に少なくとも８０％の同一性を有する変異体分子は、類似の活性を有することが予測される。２つのタンパク質配列の間のパーセント同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用い、フィルタリングを止め、すべての他のデフォールト設定を変えずに決定することができる。ポリペプチドの種々のイソ型、ポリペプチドの優性のネガティブバージョン（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｖｅｒｓｉｏｎｓ）又はポリペプチドの共有結合的に修飾された形態は、親分子の変異体のいくつかの例である。

本発明の他の態様において、ＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１分子の発現又は活性を減少させることにより、タンパク質の細胞分泌速度を低下させることができる。干渉性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子を細胞に投与することにより、これらの分子の発現又は活性を減少させることができる。ｉＲＮＡ分子は、例えば短い干渉性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）又はアンチセンス分子であることができる。ｉＲＮＡ分子の投与のためのトランスフェクション法のような方法は当該技術分野における熟練者に周知である。

本発明の方法において、代表的な細胞は、抗体を発現できるプラズマ細胞、すなわち分化したＢ−細胞である。典型的には、プラズマ細胞は、エプスタイン−バールウイルスを
用いるウイルス感染のような標準的な方法あるいは放射線学的又は化学的突然変異誘発のような他の方法により、不朽化される。不朽化プラズマ細胞はガン性であることもでき、動物の腹膜腔内に鉱油又は他の化合物を注入することにより得ることができる。

本発明の１つの態様において、プラズマ細胞は当該技術分野において「骨髄腫細胞」として既知のものである。当該技術分野において、「骨髄腫細胞」という用語は、複数の骨髄腫を有する生物から得られるかもしくは誘導されるガン性プラズマ細胞ならびにそのようなガン性プラズマ細胞と他の細胞（例えば抗体生産性ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞又は抗体をコードする核酸を用いて安定にトランスフェクションされた真核細胞）の融合から形成されるハイブリドーマ細胞の両方を指す。骨髄腫細胞系の例にはＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳＯ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）細胞系が含まれ、それらはマウスから得られた。ヒトから得られる骨髄腫細胞系の例はＵ２６６細胞系（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞系は、化学的に規定される培地中で生育できるＳＰ２／０由来細胞系の例である。当該技術分野における熟練者は、他の骨髄腫細胞系を認識するであろう。

骨髄腫細胞を用い、抗体のようなタンパク質を生産できるサブクローン又はハイブリドーマを作ることができる。制限連続希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）又は当該技術分野において周知の他の方法により、サブクローニングを行なうことができる。ハイブリドーマは、例えばＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：１９７５年，４９５の方法により、又は当該技術分野において既知の他の方法により得ることができる。抗体をコードする核酸配列を含んでなるサブクローン又はハイブリドーマにより、抗体を生産することができる。そのような核酸配列は染色体ＤＮＡ中に組み込まれているか、あるいは抗体生産性サブクローン又はハイブリドーマ中に染色体外的に存在することができる。

本発明の１つの態様において、骨髄腫細胞は、ＤＮＡ配列のような核酸を用いて安定にトランスフェクションされる。当該技術分野における通常の熟練者に周知のトランスフェクション、スクリーニング及び選択の方法により、安定にトランスフェクションされた骨髄腫細胞を形成することができる。細胞を安定にトランスフェクションするために用いられるＤＮＡ配列を、骨髄腫細胞のＤＮＡ中に無作為に組み込むことができるか、あるいは部位−特異的な方法で組み込むことができる。そのようなＤＮＡ配列はＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１分子あるいはＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１活性を低下させることができるｉＲＮＡをコードすることができる。

本発明の方法において、細胞は培養される。細胞を懸濁液中で、又は付着培養物（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）として培養することができる。例えばバイオリアクター、細胞バッグ（ｃｅｌｌ ｂａｇｓ）、培養板（ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ）、フラスコ及び当該技術分野における通常の熟練者に周知の他の容器を含む多様な容器中で細胞を培養することができる。ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号 １２４４０−５３）あるいは化学的に規定される培地調製物を含む他のいずれかの適した培地中で細胞を培養することができる。細胞培養に適した周囲条件、例えば温度及び大気組成も当該技術分野における熟練者に周知である。細胞の培養のための方法も当該技術分野における熟練者に周知である。

本発明は、本発明の方法により作られる細胞分泌速度が変化した骨髄腫細胞も提供する。

ここで、以下の制限ではない特定の実施例に言及して本発明を記述する。

高発現性ＳＰ２／０由来細胞系におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベル
ｃＤＮＡマイクロアレー分析は、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが親ＳＰ２／０骨髄腫細胞系に対してＳＰ２／０由来高発現性細胞において向上することを示した。この発見を確証するために、高発現性細胞系及び親ＳＰ２／０骨髄腫細胞におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルを、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を介して評価した。調べられた高発現性細胞系は、ネズミＳＰ２／０骨髄腫細胞系に由来する抗体発現性Ｃ１２８Ｄ、Ｃ６２、Ｃ３７９Ｂ、Ｃ４６６Ｄ及びＣ５２４細胞系を含んだ。細胞は血清を含有する培地中で、標準的な条件下で培養された。

図１中の結果は、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが親ＳＰ２／０骨髄腫細胞に対してＳＰ２／０由来高発現性細胞系においてより高いことを示す。

高発現性ＳＰ２／０由来細胞系におけるＣＤ５３遺伝子転写産物レベル
ｃＤＮＡマイクロアレー分析は、ＣＤ５３遺伝子転写産物レベルが親ＳＰ２／０骨髄腫細胞系に対してＳＰ２／０由来高発現性細胞において向上することを示した。この発見を確証するために、高発現性細胞系及び親ＳＰ２／０骨髄腫細胞におけるＣＤ５３遺伝子転写産物レベルを、Ｑ−ＰＣＲを介して評価した。調べられた高発現性細胞系は、抗体生産の増加する順に、それぞれ７日間の培養中に１２ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ及び１１０ｍｇ／Ｌの抗体を発現する１７５ａ、１７５−８８及び１７５Ｇを含んだ。これらの細胞系はネズミＳＰ２／０骨髄腫細胞系に由来した。

図２中の結果は、ＣＤ５３遺伝子転写産物レベルが親ＳＰ２／０骨髄腫細胞に対してＳＰ２／０由来高発現性細胞系においてより高いことを示す。さらにこれらの結果は、図２のＳＰ２／０由来細胞系において抗体生産が増加する場合に、ＣＤ５３遺伝子転写産物レベルが増加する傾向を示す。

高発現性ＳＰ２／０由来細胞系における抗体分泌の増加
高発現性ＳＰ２／０由来細胞系において、ＳＰ２／０親骨髄腫細胞系に対して増加した抗体生産が起こる（図３）。図１及び３の比較は、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルにおける倍増加がＣ１２８Ｄ、Ｃ６２、Ｃ３７９Ｂ、Ｃ４６６Ｄ及びＣ５２４細胞系の場合に観察される抗体分泌の速度と関連すると思われることを示す。

容量生産性決定のために、細胞を新しい培地中に播種し、振盪フラスコ中で７日間培養した。７日に、標準的なアッセイ法により培地中の抗体濃度を決定した。図３中の結果は抗体生産に関する容量生産性を示し、それは一部には７日の培養期間に及ぶ抗体分泌速度の尺度である。

高発現性Ｃ４６３ａ由来細胞系におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベル
ｃＤＮＡマイクロアレー分析は、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞系に対してＣ４６３ａ由来高発現性細胞において向上することを示した。この発見を確証するために、高発現性細胞系及び親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルを、Ｑ−ＰＣＲを介して評価した。調べられた高発現性細胞系は、ネズミＣ４６３ａ骨髄腫細胞系に由来する抗体発現性Ｃ７４３ｂ、Ｃ７４４ｂ、Ｃ５２４、Ｃ５２
６、Ｃ８９３ａ及びＣ８９３ｃ細胞系を含んだ。Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞系は、化学的に規定される培地中で生育できるＳＰ２／０由来細胞系である。細胞は血清を含まない化学的に規定される培地中で、標準的な条件下で培養された。

図４中の結果は、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞に対して大部分のＣ４６３ａ由来高発現性細胞系においてより高いことを示す。

Ｃ４６３ａ由来細胞系におけるサブクローン抗体生産が増加する場合にＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが向上する傾向
図５中の結果は、それぞれのＣ４６３ａ由来細胞系において抗体生産が増加する場合に、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが向上する傾向を示す。高発現性細胞系及び親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞（宿主）におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルをＱ−ＰＣＲを介して評価した。調べられた高発現性細胞系は、抗体生産の増加する順に、第１抗体（抗体１）発現性「初期」細胞系、「最終的」第１抗体生産性細胞系及び「最終的」第２抗体（抗体２）生産性細胞系を含んだ。これらの細胞系のすべては、ネズミＣ４６３ａ骨髄腫細胞系に由来した。細胞は血清を含まない化学的に規定される培地中で、標準的条件下で培養された。

高発現性Ｃ４６３ａ由来細胞系におけるトランスフェリン−１遺伝子転写産物レベル
ｃＤＮＡマイクロアレー分析は、トランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルが親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞系に対してＣ４６３ａ由来高発現性細胞において向上することを示した。この発見を確証するために、高発現性細胞系及び親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞におけるトランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルを、Ｑ−ＰＣＲを介して評価した。調べられた高発現性細胞系は、ネズミＣ４６３ａ骨髄腫細胞系に由来する抗体発現性Ｃ７４３ｂ、Ｃ７４４ｂ、Ｃ５２４、Ｃ５２６、Ｃ８９３ａ及びＣ８９３ｃ細胞系を含んだ。細胞は血清を含まない化学的に規定される培地中で、標準的な条件下で培養された。

図４中の結果は、トランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルが親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞に対してＣ４６３ａ由来高発現性細胞系においてより高いことを示す。

Ｃ４６３ａ由来細胞系におけるサブクローン抗体生産が増加する場合に、トランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルが向上する傾向
図７中の結果は、それぞれのＣ４６３ａ由来細胞系において抗体生産が増加する場合に、トランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルが向上する傾向を示す。高発現性細胞系及び親Ｃ４６３ａ骨髄腫細胞（「宿主」と標識された棒）におけるトランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルを、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を介して評価した。調べられた高発現性細胞系は、抗体生産の増加する順に、抗体１及び第３抗体（抗体３）発現性「初期」細胞系ならびに「最終的」抗体１及び抗体３生産性細胞系を含んだ。これらの細胞系のすべては、ネズミＣ４６３ａ骨髄腫細胞系（「宿主」と標識された棒）に由来した。細胞は血清を含まない化学的に規定される培地中で、標準的条件下で培養された。

抗体発現レベルへのＳＬＰＩ、ＣＤ５３及びトランスフェリン−１特異的干渉性ＲＮＡｓの影響
ＳＬＰＩ、ＣＤ５３及びトランスフェリン−１遺伝子転写産物を標的とする干渉性ＲＮＡ分子は、抗体発現レベルを改変するであろう。Ａｍｂｉｏｎのインターネットに基づくｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／
ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）を用いて干渉性ＲＮＡ分子を設計することができ、且つ商業的に合成することができる。あるいはまた、ｓｉＲＮＡ転写産物を発現する永久クローンを、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ^ＴＭ ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ，ＴＸ）を用いて単離することができる。干渉性ＲＮＡｓをコードする核酸分子を用いる細胞のトランスフェクション又は干渉性ＲＮＡの直接の投与により、干渉性ＲＮＡｓを投与することができる。いずれの方法にも標準的なトランスフェクション法を用いることができる。

ＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１遺伝子転写産物及び発現レベルの増加による抗体分泌速度の向上
細胞中のＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１の活性を向上させるための過剰−発現又は他の方法は、細胞によるｍＡｂｓのようなタンパク質の分泌速度を向上させるであろう。ＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１をコードする発現ベクター構築物を用いてｍＡｂ発現細胞系のようなタンパク質発現細胞系をトランスフェクションし、これらのタンパク質の過剰−発現を生ぜしめることができる。個別に又は組み合わせて、これらの発現ベクター構築物を用いて細胞をトランスフェクションすることができる。トランスフェクションの後、標準的な方法を用いて適したタンパク質及び抗体発現レベルを決定することができる。次いでトランスフェクションされた細胞におけるタンパク質分泌速度を、トランスフェクションされない標準細胞の分泌速度と比較することができる。タンパク質分泌速度は、ＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１より成る群からの１つもしくはそれより多い分子を過剰−発現する細胞においてより高いことが予測される。

今や本発明を十分に記述したが、添付の請求項の精神又は範囲から逸脱することなくそれに多くの変更及び修正を成し得ることは、当該技術分野における通常の熟練者に明らかであろう。

Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルを示すグラフ。 Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞におけるＣＤ５３遺伝子転写産物レベルを示すグラフ。 Ｓｐ２／０親骨髄腫細胞系に対して増加した高発現性細胞におけるトランスフェリン−１生産を示すグラフ。 Ｃ４６３ａ親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞系におけるＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルを示すグラフ。 Ｃ４６３ａ由来サブクローンにおける抗体生産が増加する場合に、ＳＬＰＩ遺伝子転写産物レベルが向上する傾向を示すグラフ。 Ｃ４６３ａ親骨髄腫細胞系に対して向上した高発現性細胞系におけるトランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルを示すグラフ。 Ｃ４６３ａ由来サブクローンにおける抗体生産が増加する場合に、トランスフェリン−１遺伝子転写産物レベルが向上する傾向を示すグラフ。

Claims (12)

1. ａ）細胞中の分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１より成る群から選ばれる少なくとも１つの分子の活性を調節し；そして
   ｂ）細胞を培養する
   段階を含んでなるタンパク質の発現レベルの改変方法。
2. タンパク質発現レベルを向上させる請求項１の方法。
3. ＳＬＰＩ、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１をコードする核酸を用いる細胞のトランスフェクションにより分子を調節する請求項２の方法。
4. 核酸がマウスＳＬＰＩ、マウスＣＤ５３又はマウストランスフェリン−１のアミノ酸配列を有する分子をコードする請求項３の方法。
5. 核酸がマウスＳＬＰＩ、マウスＣＤ５３又はマウストランスフェリン−１のヌクレオチド配列を有する請求項４の方法。
6. 細胞が骨髄腫細胞である請求項１の方法。
7. 骨髄腫細胞がＳｐ２／０、ＮＳ０、Ａｇ６５３又はＣ４６３ａである請求項６の方法。
8. 骨髄腫細胞がＳｐ２／０、ＮＳ０、Ａｇ６５３又はＣ４６３ａに由来するサブクローン又はハイブリドーマである請求項６の方法。
9. タンパク質が抗体である請求項１の方法。
10. 細胞分泌速度を低下させる請求項１の方法。
11. 干渉性ＲＮＡ又は干渉性ＲＮＡをコードする核酸を細胞に投与することにより分子を調節する請求項１０の方法。
12. ａ）細胞中の分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、ＣＤ５３又はトランスフェリン−１より成る群から選ばれる少なくとも１つの分子の活性を調節し；そして
    ｂ）細胞を培養する
    段階により創製される改変されたタンパク質発現レベルを有する骨髄腫細胞。

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