JP5432117B2 - 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素(rEVE) - Google Patents
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Description
目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
rEVEまたはその発現増進性部分と、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子と、
を含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、
目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するためにメトトレキセートの存在下で宿主細胞を増殖させる段階と、
メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と、
を含み、単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセート感受性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現すること、および、該メトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセートの存在下または非存在下で増殖したときに組換えタンパク質を高レベルで安定に発現することを特徴とする。好ましくはrEVEが配列1、配列2またはそれらの発現増進性部分を含む。より好ましくはrEVEが配列2を含む。
目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
配列1、配列2、配列1の一部分、配列2の一部分およびそれらの組合せから成るグループから選択された配列を含む組換え発現ベクター要素(rEVE)ポリヌクレオチド分子と、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子と、
を含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階を含み、メトトレキセートの存在下で増殖させたときに、発現ベクターを含有している宿主細胞集団が該rEVEポリヌクレオチド分子の欠如した発現ベクターを担持している宿主細胞集団に比較してより高い生存率および/またはより高い増殖速度を有していることを特徴とする。
目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
配列1、配列2、配列1の一部分、配列2の一部分およびそれらの組合せから成るグループから選択された配列を含むrEVEポリヌクレオチド分子と、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子と、
を含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、
目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するために宿主細胞をメトトレキセートの存在下で増殖させる段階と、
メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と、
を含み、単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセートの存在下で該rEVEポリヌクレオチド分子の欠如した発現ベクターを含有するメトトレキセート耐性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現することを特徴とする。
宿主CHO細胞にトランスフェクトした発現ベクターにコードされている組換え抗−IL−12抗体の極めて高い発現レベルの根拠を確かめるために、安定に組込まれた発現ベクターを担持するDUXB11 CHO細胞系を試験した。この試験では、組込まれた発現ベクターに隣接するゲノムDNAの領域をクローニングし配列決定した。簡単に説明すると、宿主細胞から得られたゲノムDNAをXbaIで消化し、基本的にReynaudら(J.Mol.Biol.,140:481−504(1980))によって記載された方法でBioGel A−50カラムを使用して平均サイズ約5キロ塩基(kb)のフラグメントを精製した。精製したゲノムフラグメントのライブラリーはフラグメントをラムダ(λ)DASH(R)クローニングベクター(Stratagene,La Jolla,California)にクローニングすることによって調製した。ライブラリーを増幅し、GIGAPACK(R)パッケージングエキストラクト(Stratagene)を使用してパッケージし、製造業者のプロトコルに従ってXL1−Blue MRAまたはXL1−Blue MRA(P2) Escherichia coli細胞に形質導入した。次にStratageneプロトコルに従って抗−IL−12抗体のH鎖可変領域(VH)のコーディング配列に対するプローブでライブラリーをスクリーニングした。λDASHクローン#21中の14.5kbのXbaIフラグメントは抗体発現ベクター挿入部位をフラクキングゲノム配列と共に含有していた。これらのフランキングゲノム領域をARM1およびARM2と命名した。AMR1領域およびARM2領域の配列はそれぞれ配列1および配列2の配列であることが判定された。CHO細胞ゲノム中の抗体発現ベクター挿入部位に関しては、ARM1は挿入部位の上流で抗体H鎖ベクター遺伝子の転写方向に対して5’側に局在し、ARM2は挿入部位の下流で抗体L鎖ベクター遺伝子の転写方向に対して3’側に局在する。
発現試験用細胞
DUXB11 CHO細胞系は、ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現が欠失している(DHFR−)CHO細胞系である(参照:Urlaub,G.and Chasin,L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4216−4220(1980))。この細胞系のDHFR−表現型は、これらの細胞にトランスフェクトされた発現ベクターのコピー数を増幅するために標準ジヒドロ葉酸レダクターゼ−メトトレキセート系(DHFR−MTX)プロトコルを使用できる(参照:たとえばKaufman,R.J., In Genetic Engineering:Principles and Methods(ed.J.K.Setlow),volume 9,page 155(Plenum Publishing,New York,1987))。
図1は、プラスミド発現ベクターpA205の概略図を提示する。図2は、ARM1配列がアダリムマブのH鎖の遺伝子の上流に局在しARM2配列がアダリムマブのL鎖の遺伝子の下流に局在するようにARM1およびARM2配列がアダリムマブのH鎖およびL鎖をコードする遺伝子に隣接しているプラスミド発現ベクターpA205Genomicの概略図を提示する。図3は、ARM1配列がアダリムマブのH鎖の上流に局在するプラスミド発現ベクターpA205A1の概略図を提示する。図4は、ARM2配列がアダリムマブのL鎖の遺伝子の下流に局在するプラスミド発現ベクターpA205A2の概略図を提示する。
αMEMは最小必須培地、α培地(GIBCO(R),Invitrogen,Carlsbad,California)である。
トランスフェクションあたり3つの10cm組織培養プレートのおのおのに5%の透析FBSおよびH/T(GIBCO)を補充した10mlのαMEM中の1×106のB3.2親DUXB11 CHO細胞を播種した。以下に示すいくつかの変更を加えたCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.V.,Brent,R.,Moore,D.M.,Kingston,R.E.,Seidman,J.G.,Smith, .A.およびK.Struhl編),(Wiley Interscience,New York,1990))に記載のリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコルに従って、これらの細胞をその後18時間トランスフェクトした。増殖培地を吸引によって培養プレートから除去し、9mlのHam F12倍地(Invitrogen)を各プレートに加えた。トランスフェクションの前にプレートを37℃で2時間インキュベートした。
50ml容の円錐管で75マイクログラム(75μg)のDNAを1.35mlの水に溶解した。150マイクロリットル(150μl)の2.5MのCaCl2を添加し、このDNA−カルシウム混合物を、50ml容の円錐管に入れた1.5mlの2×HeBES(HEPES緩衝生理食塩水)に滴下した。HeBESをピペットで吹込みながらDNA−カルシウム混合物をパスツールピペットで添加した。混合物を5秒間渦流混合し、室温で20分間インキュベートした。1ミリリットル(1ml)のDNA−カルシウム混合物を付着細胞の培養皿のおのおのに均等に分配し、増殖させ、上述のようなF12培地中のトランスフェクション用に調製し、次いで培養物を37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを吸引し、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む2mlのF12倍地を各プレートに添加した(DMSOショック処理)。DMSOショックを1分間続けた後、5mlのPBS(リン酸塩緩衝生理食塩水)を各プレートに加えてDMSOを希釈した。プレートを吸引し、PBSでさらに2回洗浄した。10mlのαMEM/5%のFBS/HTを添加し、プレートを37℃で一夜インキュベートした。
翌日、以下の手順で細胞を96−ウェルプレートに播種した。全部の10cmプレートからトリプシン消化によって細胞を採取し、2000細胞/mlの密度でαMEM/5%FBSに再浮遊させた。96個の96−ウェルプレートに10ml/プレート、100μl/ウェルで播種した。1週後、2週後、およびそれから5週後に96−ウェルプレートの培地を交換した。使用した培地αMEM/5%FBSはDHFR発現細胞選択的であった。
この試験では、安定にトランスフェクトされたCHO細胞中の抗−TNF−α抗体(アダリムマブ)の発現に対するARM1およびARM2配列の効果を試験した。発現ベクターpA205(ARM配列非含有)、pA205Genomic(ARM1およびARM2配列の双方を含有)、pA205A1(ARM1含有)またはpA205A2(ARM2含有)で安定にトランスフェクトされたCHO細胞中のアダリムマブの発現レベルを比較した。表3は、指示された増幅レベルの各ベクタートランスフェクションから得られた上位3つの生産性クローンの付着培養物中のアダリムマブの平均産生レベルを示す(メトトレキセート濃度、“MTX”)。
この試験では、安定にトランスフェクトされたCHO細胞中のヒト−EL−セレクチン抗体(E−およびL−セレクチンに結合する)の発現に対するARM1およびARM2配列の効果を試験した。この抗−セレクチン抗体の発現レベルを、発現ベクターpCHOEL246GGhum(ARM配列非含有)または発現ベクターpA−Gen−EL−セレクチン(ARM1およびARM2の双方を含有)で安定にトランスフェクトされたCHO細胞中で比較した。表5は、指示された増幅レベルの各ベクタートランスフェクションから得られた上位3つの生産性クローンの付着培養物中の抗−セレクチン抗体の平均産生レベルを示す(メトトレキセート濃度、“MTX”)。
安定なトランスフェクタントの選択可能マーカーすなわちヒグロマイシン耐性を与えるpcDNA3.1−hygroと細胞とをコトランスフェクトした以外は上記と同様にして、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子を含有する構築物をCHO細胞にトランスフェクトした。発現ベクターpeGFPは、CMVプロモーターの転写コントロール下のeGFPの発現の陽性対照を提供する。プラスミドpA205−eGFPはARM1またはARM2配列のないpA205発現ベクター上にeGFP遺伝子を含有している(図7)。プラスミドpA205Gen−eGFP(図8)は、eGFPをコードする遺伝子に隣接するARM1およびARM2の双方を含有している。これらのプラスミドのいずれにもDHFR選択遺伝子は存在しない。従って、DHFR−メトトレキセート増幅段階は行わなかった。400μg/mlの濃度のヒグロマイシンでトランスフェクタントを2週間選択し、必要ならば分割し、次にFACSによって選別して発現レベルを決定した。最初に細胞を各種ベクター用プールに選別し、発現性の細胞をさらに2週間増殖させ、次いで再度選別した。
pA205A2ベクター中のARM2配列(配列2)の3’末端領域をSpeI開裂部位(配列2の塩基1086)またはSwaI開裂部位(配列2の塩基461)まで欠失させてそれぞれpA205A2−Spe−trunc(配列2の塩基1−1086含有)およびpA205A2−Swa−trunc(配列2の塩基1−461含有)を作製した。得られたプラスミドを上述のようにCHO細胞にトランスフェクトし、20nM MTXに増幅した。表7は各増幅レベルで各トランスフェクションから得られた上位3つの生産性クローンの付着培養物中の平均発現レベルを示す。
以下に示す表は上述の試験で生成された個々のトランスフェクトクローンによって産生された組換えタンパク質の発現レベルを示す。
この試験は、安定にトランスフェクトされた哺乳類の培養細胞中のヒト化抗−IL−13抗体のrEVE媒介性発現増進をrEVEの欠如した発現ベクターでトランスフェクトされた細胞に比較して示す。
この試験は、rEVEポリヌクレオチド分子が一過性発現系中で組換えタンパク質の発現レベルを増進するか否かを判定するように設計した。
Claims (35)
- 配列番号1のヌクレオチド塩基配列、
配列番号2のヌクレオチド塩基配列、
配列番号2の塩基1−1086の配列、
前記配列のいずれかに相補的な配列および
それらの組合せ
から成るグループから選択されるヌクレオチド塩基配列を含む組換え発現ベクター要素(rEVE)を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。 - 請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
- 組換えベクターが組換え発現ベクターである請求項2に記載の組換えベクター。
- 組換えプラスミド発現ベクター、組換え真核性ウイルス発現ベクター、組換えバクテリオファージ発現ベクター、組換え酵母ミニ染色体発現ベクター、組換え細菌性人工染色体発現ベクターおよび組換え酵母発現プラスミドベクターから成るグループから選択される請求項3に記載の組換え発現ベクター。
- 組換え発現ベクターが1つ以上の組換えタンパク質をコードする1つ以上の機能性組換え遺伝子を含む請求項3に記載の組換え発現ベクター。
- 前記1つ以上の組換えタンパク質が、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、酵素、チモーゲン、抗体分子、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Gタンパク質、神経作動性ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンゲートタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、抗生物質耐性タンパク質、上記タンパク質のいずれかの機能フラグメント、上記タンパク質のいずれか一項のエピトープ含有フラグメントおよびそれらの組合せから成るグループから選択される請求項5に記載の組換え発現ベクター。
- 抗体分子が、抗TNF−α抗体、抗EL−セレクチン抗体、抗IL−13抗体および二元可変ドメイン免疫グロブリン分子から成るグループから選択される請求項6に記載の組換え発現ベクター。
- 抗TNF−α抗体がアダリムマブである請求項7に記載の組換え発現ベクター。
- 前記組換え発現ベクターがジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子の少なくとも1つのコピーを含む請求項3〜8のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項2〜9のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 宿主細胞が真核性宿主細胞または原核性宿主細胞である請求項10に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が、哺乳類宿主細胞、昆虫類宿主細胞、植物宿主細胞、真菌類宿主細胞、真核性藻類宿主細胞、線虫類宿主細胞、原生動物宿主細胞および魚類宿主細胞から成るグループから選択された真核性宿主細胞である請求項11に記載の宿主細胞。
- 真核性宿主細胞が哺乳類宿主細胞である請求項12に記載の真核性宿主細胞。
- 哺乳類宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胚性腎(HEK293)細胞、幼若ハムスター腎(BHK)細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV−1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞およびMDCK細胞から成るグループから選択される請求項13に記載の哺乳類宿主細胞。
- 哺乳類宿主細胞がCHO細胞である請求項14に記載の哺乳類宿主細胞。
- 真核性宿主細胞が真菌類宿主細胞である請求項12に記載の真核性宿主細胞。
- 真菌類宿主細胞が、Aspergillus、Neurospora、Saccharomyces、Pichia、Hansenula、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、YarrowiaおよびCandidaから成るグループから選択される請求項16に記載の真菌類宿主細胞。
- S.cerevisiae宿主細胞である請求項17に記載のSaccharomyces宿主細胞。
- 真核性宿主細胞が原生動物宿主細胞である請求項12に記載の真核性宿主細胞。
- 原生動物宿主細胞がLeishmania tarentolae宿主細胞である請求項19に記載の原生動物宿主細胞。
- 請求項3〜9のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター上に存在する目的の組換えタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を転写することおよび翻訳することを含む、目的の組換えタンパク質の産生方法。
- 前記転写および翻訳が無細胞転写/翻訳系または宿主細胞中で生じる請求項21に記載の方法。
- 前記転写および翻訳が宿主細胞中で生じる請求項22に記載の方法。
- 前記宿主細胞がCHO宿主細胞である請求項23に記載の方法。
- 請求項9に記載の組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、
目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するためにメトトレキセートの存在下で前記宿主細胞を増殖させる段階と、
前記メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と
を含み、
前記単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセート感受性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現すること、および、前記メトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセートの存在下または非存在下で増殖したときに組換えタンパク質を高レベルで安定に発現することを特徴とする、目的の組換えタンパク質を高レベルで安定に発現する宿主細胞の製造方法。 - 前記メトトレキセートが5nMから10μMの範囲の濃度で存在する請求項25に記載の方法。
- 前記宿主細胞がCHO宿主細胞である請求項25に記載の方法。
- 組換えタンパク質を発現する宿主細胞集団のメトトレキセート存在下の増殖適応能力を改善または増進する方法であって、
目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
配列番号1、配列番号2、配列番号2の塩基1−1086の配列およびそれらの組合せから成るグループから選択されるヌクレオチド塩基配列を含む組換え発現ベクター要素(rEVE)ポリヌクレオチドと、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子と
を含む組換え発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクトする段階と、
メトトレキセートの存在下でトランスフェクトされた宿主細胞を培養する段階と、
メトトレキセートの存在下で増殖したときに、組換え発現ベクターを含有している宿主細胞集団がrEVEポリヌクレオチドの欠如した同じ組換え発現ベクターを担持している宿主細胞集団に比較して、より高い生存率および/またはより高い増殖速度を有するトランスフェクトされた宿主細胞集団を選択する段階と
を含む、方法。 - 前記メトトレキセートが5nMから10μMの範囲の濃度で存在する請求項28に記載の方法。
- 前記宿主細胞がCHO宿主細胞である請求項28に記載の方法。
- 目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
配列番号1、配列番号2、配列番号2の塩基1−1086の配列およびそれらの組合せから成るグループから選択されるヌクレオチド塩基配列を含む組換え発現ベクター要素(rEVE)ポリヌクレオチドと、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子と
を含む組換え発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクトする段階と、
目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するために宿主細胞をメトトレキセートの存在下で増殖させる段階と、
前記メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と
を含み、
前記単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞はメトトレキセートの存在下で目的の組換えタンパク質をrEVE配列の欠如した発現ベクターを含有するメトトレキセート耐性宿主細胞よりも高いレベルで発現することを特徴とする、組換えタンパク質を高レベルで発現するメトトレキセート耐性宿主細胞の製造方法。 - 前記メトトレキセートが5nMから10μMの範囲の濃度で存在する請求項31に記載の方法。
- 前記宿主細胞がCHO宿主細胞である請求項31に記載の方法。
- 1つ以上の組換えタンパク質をコードする1つ以上の組換え遺伝子を含む発現ベクターに、配列番号2の塩基1−461のヌクレオチド塩基配列を含む核酸分子を挿入する段階を含む、発現ベクターからの組換えタンパク質の発現を低下させる、発現を実質的に抑制する、または、発現を実質的にサイレンシングさせる方法。
- 前記発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階をさらに含む請求項34に記載の方法。
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