BRPI0809361A2

BRPI0809361A2 - Elementos de vetor de expressão recombinante (reves) para melhorar a expressão de proteínas recombinantes em células hospedeiras

Info

Publication number: BRPI0809361A2
Application number: BRPI0809361-0A
Authority: BR
Inventors: Weny R Gion; Gerald R Carson; Hong Gao; Yune Z Kunes
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2014-09-02
Also published as: US8410259B2; TW200907059A; EP2142560A2; WO2008121324A3; ZA200906433B; JP2010523082A; CN101652379A; IL201231A0; KR20140001229A; AU2008233196A1; US20110201053A1; WO2008121324A2; CN101652379B; US20080241883A1; RU2009140146A; JP2014012014A; JP5432117B2; KR20100014724A; RU2518340C2; AU2008233196B2

Description

“ELEMENTOS DE VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE (REVES) PARA MELHORAR A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS”

Referência Cruzada para Pedidos Relacionados O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisional U.S. No.

60/921,141, depositado em 30 de Março de 2007.

Fundamentos

Uma variedade de sistemas que empregam moléculas de vetor de ácido nucléico para a expressão de proteínas recombinantes está disponível em uma variedade ampla e diversificada de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. A decisão de qual par célula hospedeira/vetor usar depende tipicamente de qual o sistema que proporciona o maior rendimento de produto de gene recombinante desejado em uma forma mais bem adequada para seu uso pretendido. Por exemplo, se uma modificação pós-translacional, tal como glicosilação, é crítica para as necessidades da proteína recombinante (por exemplo, para antigenicidade, atividade, conformação, etc.), então um sistema de célula hospedeira será desejado uma vez que células procarióticas caracteristicamente desprovidas de atividade de glicosilação pós-translacional. Também é importante que um par célula hospedeira/vetor não produza apenas um produto de gene expresso na forma desejada, mas também que moléculas do produto de gene expresso desejado possam ser prontamente isoladas a partir das células que as produzem.

Devido aos custos crescentes envolvidos no desenvolvimento de proteínas recombinantes direcionadas para a terapia humana, ainda permanece um esforço contínuo para melhorar o nível de expressão de tais proteínas recombinantes, especialmen25 te em sistemas que empregam células hospedeiras eucarióticas. Vários elementos reguladores de ação trans- e cis foram caracterizados por possuírem seqüências de nucleotídeos (DNA e RNA) que podem melhorar a eficiência da expressão e/ou rendimento global do produto de gene recombinante desejado. Tais elementos reguladores incluem, mas não estão limitados a, promotores altamente eficientes, seqüências trans30 cricionais otimizadas (vide, por exemplo, a resenha de Dillon e Grosveld, Trends Genet., 9: 134 (1993), regiões de controle de lócus (LCRs; vide, por exemplo, Grosveld et al., Cell, 51: 975 (1987)), regiões de interação com o eixo protéico ou com a matriz ( MARs, SARs; vide, por exemplo, Patente U.S. No. 7.129.062; Bode et al., Int. Ver. Cytol., 162A: 389-454 (1995); Bode et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 6: 115- 35 138 (1996)); elementos insuladores (vide, por exemplo, Kellum et al., Cell, 64: 941 (1991); e sítios de entrada de ribossomo interno (IRES; vide, por exemplo, revisão de McBratney et al., Curr. Opin. Cell Biol., 5: 961 (1993)). Foi verificado subsequentemente que algumas seqüências de ácido nucléico de tais elementos possuem subsequências específicas que podem afetar a expressão.

Apesar dos avanços no entendimento de várias seqüências e outros fatores que podem afetar a expressão de proteínas recombinantes em vários tipos de células hospedeiras, permanece a necessidade de melhorar o rendimento de proteínas recombinantes, particularmente quando tais proteínas recombinantes são direcionadas para aplicações terapêuticas ou outras aplicações especializadas.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona moléculas de ácido nucléico isoladas (molécuias de polinucleotídeos) compreendendo seqüências a base de nucleotídeos que melhoram a expressão de proteínas recombinantes. Tais moléculas de ácido nucléico são referidas aqui como elementos de vetor de expressão recombinante (rEVEs). A presença de um rEVE em um vetor de expressão melhora o nível de expressão de uma ou mais proteínas codificadas por um ou mais genes funcionais que residem no vetor de expressão quando comparado ao nível de expressão na ausência do rEVE. Tal melhoramento mediado por rEVE do nível da expressão de uma proteína recombinante é possível se um rEVE está localizado 5’ a, 3’ a ou 5’ e 3’ a (por exemplo) um gene que codifica uma proteína(s) recombínante(s) de interesse. Um rEVE presente em um vetor de expressão pode melhorar a expressão de uma ou mais proteínas recombinantes se codificado em genes correspondentes separados ou codificado em um gene policistrônico único presente na expressão de vetor. O rEVE pode ser usado para melhorar o nível da expressão de uma proteína recombinante usando tanto sistemas de expressão estáveis quanto sistemas de expressão transiente.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma molécula de polinucleotídeo 25 de rEVE que compreende uma seqüência de base de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste das seqüências de base de SEQ ID NO: 1 (“ARM1”), da seqüência de bases de SEQ ID NO: 2 (“ARM2”), e uma porção de melhoramento de expressão de qualquer uma das seqüências antecedentes, em que quando o polinucleotídeo de rEVE está presente na mesma expressão de vetor como um gene recombinante que 30 codifica uma proteína recombinante de interesse, o nível de expressão da proteína recombinante será melhorada quando comparada com o nível de expressão na ausência do rEVE.

As moléculas de rEVE preferidas da invenção incluem uma molécula de ácido nucléico de rEVE com 2329 pares de base (pb) que possui a seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e uma molécula de ácido nucléico de rEVE com 2422 pb que possui uma seqüência de base de SEQ ID NO: 2.

A região terminal 3’ da seqüência SEQ ID NO: 2 contém seqüências que são críticas para o melhoramento mediado por rEVE da expressão de proteína. Tais seqüências de região terminal 3’ preferidas da SEQ ID NO: 2 incluem a seqüência de bases 462-2422 da SEQ ID NO: 2 e a seqüência de bases 1087-2422 da SEQ ID NO: 2.

Uma molécula de ácido nucléico de rEVE isolada compreendendo uma ou mais seqüências de base descritas aqui podem possuir qualquer uma de uma variedade de formas incluindo, sem limitação, uma molécula de ácido nucléico linear, um plasmídeo, uma molécula viral eucariótica, uma molécula viral procariótica (bacteriófago), um cromossomo artificial, e um cromossomo recombinante.

Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um vetor de expressão que compreende pelo menos um rEVE descrito aqui. Tal vetor de expressão contendo rEVE proporciona níveis melhorados (elevados) de expressão em uma célula hospedeira apropriada de pelo menos uma proteína recombinante codificada no vetor de expressão comparado com o nível de expressão na célula hospedeira que carrega o mesmo vetor de expressão sem o rEVE. Os vetores de expressão úteis na invenção incluem qualquer molécula de vetor de ácido nucléico que pode ser construída para codificar e expressar uma ou mais proteínas recombinantes em uma célula hospedeira apropriada (homóloga). Tais vetores de expressão incluem, sem limitação, vetores de plasmídeos eucarióticos, vetores virais eucarióticos, plasmídeos procarióticos, vetores bacteriófagos, vetores shuttle (por exemplo, um vetor que pode replicar em células procarióticas e eucarióticas), mini-cromossomos e vários cromossomos artificiais. Preferencialmente, um vetor de expressão é um vetor de expressão de plasmídeo, mais preferencialmente, um vetor de expressão de plasmídeo que se integra de forma estável em um genoma de célula hospedeira eucariótica, e ainda mais preferencialmente, um vetor de expressão de plasmídeo que se integra de forma estável em um genoma de célula hospedeira por recombinação não homóloga.

Em outra modalidade a invenção proporciona uma célula hospedeira que contém um vetor de expressão que compreende um rEVE descrito aqui e um gene recombinante que conduz a expressão de pelo menos uma proteína recombinante na célula hospedeira. Uma célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. As células hospedeiras eucarióticas preferidas para uso na invenção incluem, sem limitação, células hospedeiras de mamífero, células hospedeiras de planta, células hospedeiras de fungo, células hospedeiras algáceas eucarióticas, células hospedeiras de protozoários, células hospedeiras de insetos e células hospedeiras de peixe. Mais preferencialmente, uma célula hospedeira útil na invenção é uma célula hospedeira de mamífero, incluindo, mas não limitada a, uma célula de ovário de hamster Chinês, (CHO), uma célula COS, uma célula Vero, uma célula SP2/0, uma célula de mieloma NS/0, uma célula embriônica de rim humano (HEK 293), uma célula de rim de filhote de hamster (BHK), uma célula HeLa1 uma célula B de humano, uma célula CV1/EBNA, uma célula L, uma célula 3T3, uma célula HEPG2, uma célula PerC6 e uma célula MDCK. É particularmente preferida uma célula CHO que pode ser tratada com um protocolo de tratamento de metotrexato padrão para ampliar o número de cópia de genes recombinantes em um vetor de expressão inserido na célula hospedeira. Células de fungo que podem servir de células hospedeiras da invenção incluem, sem limitação, células de ascomicetos, tais como Aspergillus, Neurospora e células de levedura, particularmente leveduras de um gênero selecionado do grupo que consiste de Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, kluyveromyces, Yarrowia e Candida. Espécies de leveduras preferidas que podem servir de células hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitadas a, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. As células hospedeiras procarióticas que podem ser usadas para a expressão de proteínas recombinantes de acordo com a invenção incluem, sem limitação, Escherichia coli, sorotipo de Salmonella entérica, Shigella species, Wollinella succinogenes, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Edwardsiella tarda, Citrobacter freundii, Pasteurella species, Haemophilus species, Pseudomonas species, Bacillus species, Staphyloccocus species e Streptococcus species. Outras células que podem ser usadas como células hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes de acordo com a invenção incluem células de protozoários, tais como Leishmania tarentolae hospedeira de tripanosomatide e células de nematóide Caenorhaditis elegans.

Os polinucleotídeos de rEVE como descritos aqui, vetores compreendendo células hospedeiras que compreendem um ou mais rEVE como descrito aqui podem ser usados em uma variedade de métodos relacionados com a expressão de proteínas recombinantes de interesse.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para melhorar a expressão de uma proteína recombinante de interesse em uma célula hospedeira compreendendo a etapa de inserir em uma célula hospedeira um vetor de expressão recombinante que compreende um rEVE descrito aqui e um gene recombinante que codifica e conduz a síntese da proteína recombinante de interesse na célula hospedeira e cultivar a célula hospedeira sob condições de que promovem a expressão da proteína recombinante.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para produzir células hospedeiras resistentes a metotrexato que expressam de forma estável (no sentido de oposto a forma transiente) uma proteína recombinante em um nível elevado de na ausência de metotrexato (‘MTX”), isto é, na ausência de pressão seletiva para expressão elevada de proteína recombinante proporcionada pela presença de metotrexato. Tal método compreende a etapa de inserir na célula hospedeira um vetor de expressão que compreende um gene recombinante que codifica uma proteína recombinante de interesse, um rEVE descrito aqui, e um gene que codifica uma redutase dihidrofolato 5 (“DHFR”); cultivar as células hospedeiras na presença de metotrexato para selecionar uma célula hospedeira resistente a metotrexato que expressa à proteína recombinante de interesse; e isolar a célula hospedeira resistente a metotrexato, em que a célula hospedeira resistente a metotrexato expressa a proteína recombinante de interesse em um nível que aquele de uma célula hospedeira sensitiva a metotrexato, e em que a 10 célula hospedeira resistente a metotrexato expressa de forma estável um nível elevado de proteína recombinante de interesse quando crescida na presença de metotrexato. Em uma modalidade particularmente preferida, o rEVE usado neste método compreende a seqüência de SEQ ID: 2 ou uma porção de melhoramento de expressão do mesmo que, quando presente no mesmo vetor de expressão como um gene que codifica 15 uma proteína recombinante de interesse, melhora o nível de expressão da proteína recombinante em uma célula hospedeira.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para produzir uma população de células hospedeiras com adaptação aperfeiçoada ou melhorada para a presença de metotrexato em um procedimento de metotrexato-DHFR para ampliar a 20 expressão de proteína recombinante compreendendo a etapa de inserir em uma célula hospedeira um vetor de expressão compreendendo um gene que codifica uma proteína recombinante de interesse, um rEVE descrito aqui, e um gene DHFR, em que uma população de células hospedeiras contendo o vetor de expressão se adapta melhor, isto é, possua uma maior taxa de crescimento e/ou uma maior taxa de capacidade de so25 brevivência, na presença de metotrexato comparado com uma população de células hospedeiras que carregam o vetor de expressão sem a seqüência de rEVE.

Ainda em uma outra modalidade, a invenção proporciona um método para melhorar a ampliação (elevação) da expressão de uma proteína recombinante em células hospedeiras obtida usando um procedimento de metotrexato-DHFR compreendendo a 30 etapa de inserir em células hospedeiras um vetor de expressão compreendendo um gene recombinante que codifica uma proteína recombinante de interesse, um rEVE descrito aqui, e um gene DHFR; cultivar as células hospedeiras na presença de metotrexato para selecionar uma célula hospedeira resistente a metotrexato que expressa a proteína recombinante de interesse; e isolar a célula hospedeira resistente a metotre35 xato, em que a célula hospedeira resistente a metotrexato isolada expressa a proteína recombinante de interesse na presença de metotrexato em um nível que é maior que aquele de uma célula hospedeira resistente a metotrexato contendo o mesmo vetor de expressão sem um rEVE.

0 metotrexato pode ser convenientemente empregado em métodos descritos aqui em uma faixa de 20 nM a 500 nM, embora concentrações maiores e inferiores, tais como de 5 nM a 10 μΜ, possam também ser empregadas com sucesso em tais métodos para selecionar uma expressão ampliada de proteínas recombinantes de interesse.

Ainda em uma outra modalidade, a invenção proporciona um método para reduzir, suprimir substancialmente, ou silenciar essencialmente a expressão de uma proteína recombinante a partir de um vetor de expressão. Tais métodos empregam veto10 res de expressão que compreendem um ou mais fragmentos de um rEVE que proporciona níveis inferiores de expressão de um produto de gene recombinante particular do que quando proporcionado usando um rEVE compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Tais fragmentos possuem uma variante particular truncada de SEQ ID NO: 2, incluindo uma seqüência de base de nucleotídeo de bases 1-1086 de SEQ ID NO: 2 ou 15 de bases 1-461 de SEQ ID NO: 2. Uma molécula de ácido nucléico que possui uma seqüência ARM2 truncada consistindo de bases 1-461 de SEQ ID NO: 2 é particularmente útil para suprimir ou substancialmente silenciar a expressão de uma proteína recombinante a partir de uma molécula de vetor em uma célula hospedeira. Estas verificações também indicam que a seqüência de nucleotídeos de bases 462-2422 de SEQ 20 ID NO: 2 e a seqüência de bases de nucleotídeos 1087-2422 de SEQ ID NO: 2 são mais preferíveis para o máximo melhoramento mediado por rEVE da expressão de proteínas recombinantes.

Uma proteína recombinante cuja expressão pode ser melhorada por uma ou mais moléculas descritas aqui pode ser qualquer proteína (incluindo peptídeos, polipeptídeos e proteínas oligoméricas) para a qual um gene(s) funcional pode ser construído em uma molécula de vetor de ácido nucléico para a expressão em uma célula hospedeira apropriada. Tais proteínas incluem, sem limitação, proteínas solúveis, proteínas de membranas, proteínas estruturais (isto é, proteínas que proporcionam suporte ou estrutura para células, tecidos ou órgãos), proteínas ribossômicas, enzimas, zimogênios, moléculas de anticorpos, proteínas receptoras de superfície celular, proteínas reguladoras de transcrição, proteínas reguladoras de translação, proteínas de cromatina (por exemplo, histonas), hormônios, proteínas reguladoras de ciclo celular, proteínas G, peptídeos neuroativos, proteínas imunoreguladoras (por exemplo, interleucinas, citocinas), proteínas componentes do sangue, proteínas porta íons, proteínas de choque térmico, redutase dihidrofolato, uma proteína de resistência a antibiótico, fragmentos funcionais das mesmas, fragmentos contendo epítope das mesmas e combinações das mesmas. Moléculas de ácido nucléico contendo uma seqüência de um rEVE descrita aqui ou porção da mesma também podem ser usadas como sondas de ácido nucléico para identificar a presença de seqüências de revêem outras moléculas de ácido nucléico pela hibridização de ácido nucléico ou como uma fonte de iniciadores para uso em 5 vários procedimentos de reação em cadeia de polimerise (PCR), por exemplo, como pode ser empregado pela manipulação, identificação, produção ou ampliação das seqüências de rEVE descritas aqui.

As seqüências de rEVE, tais como aquelas para ARM1 (SEQ ID NO: 1) e para ARM2 (SEQ ID NO: 2), podem conter uma ou mais seqüências de regiões de interação 10 com a matriz (MAR). As seqüências de MAR podem ocorrer em clusters dentro de uma seqüência de rEVE, incluindo em clusters nas regiões terminais 3’ e/ou 5’ de uma seqüência rEVE. Os polinucleotídeos rEVE como descrito aqui são uma fonte útil de seqüências de MAR. Consequentemente, a invenção proporciona composições e métodos que são úteis para aumentar seqüências de MAR em uma molécula de ácido nu15 cléico compreendendo inserir na molécula de ácido nucléico um rEVE descrito aqui ou uma porção de um rEVE descrito aqui contendo uma ou mais seqüências de MAR.

As seqüências de bases de nucleotídeos descritas aqui também servem para proporcionar seqüências complementares das mesmas. As moléculas de DNA e as seqüências de bases de nucleotídeos descritas aqui também proporcionam moléculas de RNA correspondentes e seqüências de bases, em que a timina (T) é substituída por uracil (U), e seqüências de ácido nucléico complementares para a mesma.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático de um vetor de expressão de plasmídeo pA205 usado para expressar as cadeias leve kappa e pesada de imunoglobulina que formam uma molécula anti-TNF-σ IgGI humana ativa (“adalimumab”) em transfectantes estáveis de células de ovários de hamster chinês (CHO). Abreviações: “MELHORADOR” se refere ao melhorador de gene inicial intermediário de citomegalovirus (CMV); “PROMOTOR ADENO” se refere ao promotor tardio principal de adenovirus; “CADEIA PESADA DE ADALIMUMAB” se refere à região de codificação para cadeia pesada de IgGI de adalimumab; ‘SV40 Poly A” se refere ao sítio de poliadenilação de simian vírus 40; “TERMINADOR DE GASTRINA” se refere ao sinal de terminação transcricional de um gene da gastrina de humano; “PROMOTOR SV40” é o promotor de simian vírus 40; “DHFR” se refere ao gene de redutase dihidrofolato de rato; “TK Poly A” se refere ao sítio de poliadenilação do gene quinase timidino de vírus de herpes simplex; “ADALIMUMAB LIGHT CHAIN” se refere à região de codificação para cadeia leve kappa de adalimumab; “ORI” se refere à origem da replicação do plasmídeo Co1E1 procariótico que age na Escherichia coir, “P(BLA)” se refere ao promotor procariótico do gene da /?-lactamase (gene de resistência a ampicilina) e a seta pequena indicação da transcrição; “APr” (“resistência a ampicilina”) se refere à região de codificação para a /Mactamase. As setas indicam a direção de transcrição (5’ a 3’).

A Figura 2 é um diagrama esquemático de vetor um vetor de expressão de 5 plasmídeo pA205 genômico em que o ácido nucléico ARM1 ("A1”) que possui a seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 é inserida no vetor de expressão pA205 (Figura 1) a montante do promotor tardio principal de adenovirus e região de codificação de cadeia pesada de IgGI de adalimumab, e ácido nucléico AMR2 (“A2”) que possui uma seqüência de base de SEQ ID NO: 2 é inserida a jusante da cadeia 10 leve kappa de adalimumab. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

A Figura 3 é um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205 no qual o ácido nucléico ARM1 (”A1”) que possui a seqüência de SEQ ID NO: 1 é inserido no vetor de expressão pA205 (Figura 1) a montante do promotor adeno e da região de codificação de cadeia pesada de IgGI. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

A Figura 4 é um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205A2 no qual o ácido nucléico ARM2 (”A2”) que possui a seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é inserido a jusante da região de codificação de cadeia leve kappa. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

A Figura 5 é um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pCHOEL246GGhum usado para expressar as cadeias leve kappa e pesada de imunoglobulina que formam uma molécula IgGI de anti-EL-selectina humana ativa em transfectantes estáveis de células de ovário de hamster Chinês (CHO). O termo “CADEIA 25 PESADA DE ANTI-SELECTINA” se refere a região de codificação para a cadeia pesada de um anticorpo IgGI de anti-EL-selectina humano; o termo “CADEIA LEVEDE ANTI-EL-SELECTINA” se refere a região de codificação para a cadeia leve kappa de um anticorpo IgGI de anti-EL-selectina humano. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

A Figura 6 é um diagrama esquemático do vetor de expressão de PA-Gen-EL

selectina no qual o ácido nucléico ARM1 (”A1”) que possui a seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 é inserido no vetor de expressão pCHOEL246GGhum (Figura 5) a montante da região de codificação de cadeia pesada IgGI, e ácido nucléico ARM2 (“A2”) possuindo a seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é in35 serido a jusante da região de codificação de cadeia leve kappa de anti-EL-selectina. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

A Figura 7 é um diagrama esquemático de vetor de expressão de plasmídeo pA205-eGFP usado para expressar proteína fluorescente verde melhorada (eGFP) nos transfectantes estáveis de células de CHO. A região de codificação eGFP (“EGFP”) é inserida a jusante do promotor tardio principal de adenovirus (“PROMOTOR ADENO”) no pA205 (Figura 1) a partir do qual a região de codificação de cadeia leve, promotor 5 proximal e melhorador proximal, e a região de codificação de cadeia pesada foram deletados. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

A Figura 8 é um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205G-eGFP no qual o ácido nucléico ARM1 (”A1”) que possui a seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 é inserido no vetor de expressão pA205-eGFP (Figu10 ra 7) a montante da região de codificação eGFP (“EGFP”), e ácido nucléico ARM2 (“A2”) possuindo a seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 é inserido a jusante da seqüência de codificação eGFP. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

A Figura 9 é um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo 15 pA205A2-Spe-trunc, que é essencialmente idêntico ao vetor de expressão pA205A2 mostrado na Figura 4, exceto que a AMR2 (SEQ ID NO: 2) foi substituída por uma variante ARM2 truncado, “A2(bp 1-1086)”, que possui a seqüência de base de nucleotídeo de bases 1-1086 de SEQ ID NO: 2 como resultado da digestão de ácido nucléico ARM2 com a endonuclease Spel de restrição. Para outras abreviações, veja a descri20 ção da Figura 1, acima.

A Figura 10 é um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205A2-Swa-trunc, que é essencialmente idêntico ao vetor de expressão pA205A2 mostrado na Figura 4, exceto que AMR2 (SEQ ID NO: 2) foi substituída por uma variante ARM2 truncado, “A2(bp 1-461)”, que possui a seqüência de base de nucleotídeo 25 de bases 1-461 de SEQ ID NO: 2 como resultado da digestão de ácido nucléico ARM2 com a endonuclease Swal de restrição. Para outras abreviações, veja a descrição da Figura 1, acima.

Descrição detalhada da Invenção

A invenção é baseada na verificação de que uma ou mais moléculas de ácido nucléico isoladas (moléculas de polinucleotídeos) compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1:

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cacagagaatccctgtttcaaaaaaccaaaaaaaaaaaaataaaaaataaaaaataaaaagtagggtacagatctaaatagacaat tctcaatagaggaatctaaaatgcctgaaagacaaataagaaagtgttcaacatccttagccatcagggaaatgcaaatcaaaaca

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ou uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2: aagaatatgctcaatgtaatacccatggcaggcattcaatgtttgtctgtcttcatattgaagataaacagatgtatatcatatacaaaa atatttaatgtgaagttgtccatgtgttcaggatctatatactttcaaaaatctttttccatattcttttcttaatcctcctgaagtgtagacca ttatactggaaaaccgtcactattgtacaggataggagcctttgactctgagaggatcccatacattgattgtattttcaaatatattttg gctgcttttctccatgtgatatttggcaatctggagaggcatttgctcctggaaatttatcaatgttgacaatgttgtttacatgttttaagt aactattttgctaccaaggaaactgcttcactccctttcacatataaaactcataaaatattgaaaggctccaataagtttaaatcattct gtattgctcatggagatttaaatttcagtgctaattttttattagcactttaatttagaaggcaccaggtttctacaagatttaaaattattgg agcatttcaaaattttataagctttccagtaaggttgtggctatgattctttgcttgtaaagtaaagtgcaatttaaagttaatttaaataatt

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pode ser construído em moléculas de vetor de expressão para melhorar a expressão de uma ou mais proteínas recombinantes a partir de um ou mais genes presentes nas moléculas de vetor de expressão.

Uma molécula de polinucleotídeo isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 é referida aqui como um elemento de vetor de expressão recombinante (rEVE). Os rEVEs da invenção também incluem, mas não estão limitados a, uma molécula de polinucleotídeo que compreende uma porção 10 de melhoramento de expressão da seqüência mostrada na SEQ ID NO:1 (“ARM1”) ou SEQ ID NO: 2 (“ARM2”). As seqüências da região terminal 3’ da SEQ ID NO: 2 ARM2, tais como aquelas que possuem as seqüências de bases 462-2422 da SEQ ID NO: 2 e de bases 1087-2422 da SEQ ID NO: 2 são particularmente úteis para proporcionar expressão melhorada de uma proteína recombinante de interesse. Um rEVE descrito aqui 15 pode ser usado em combinação com outras seqüências de controle, reguladores e procedimentos correntemente disponíveis para aumentar a produção de proteínas recombinantes em células hospedeiras.

Para descrever mais claramente a invenção os seguintes termos são definidos: O termo “anticorpo” ou “molécula de anticorpo”, como usado e entendido aqui, referem-se amplamente a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) de quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L)1 ou qualquer fragmento funcional, mutante, variante ou derivação dos mesmos, que retém as carac5 terísticas de ligação de epítope essencial de uma molécula Ig. Tais mutantes variantes ou anticorpos derivativos são conhecidos na técnica e incluem modalidades não Iimitantes discutidas abaixo.

Em um anticorpo de comprimento completo, cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio (CL). As regiões de VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), transponíveis com regiões que são mais conservadas, conhecidas como regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composto de três CDRs e quatro FRs, arranjados de amino terminal para carbóxi terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD1 IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI, e lgA2), ou subclasse.

O termo “anticorpo” e “molécula de anticorpo” também envolve um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a habilidade de se ligar especificamente a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Tais moda25 Iidades de anticorpos também podem ser formas biespecíficas, duplo-específicas ou multiespecíficas; especificamente ligando dois ou mais antígenos. Exemplos de fragmentos de ligação relacionados com o termo “anticorpo” incluem o fragmento Fab, isto é, um fragmento monovalente (um sítio de ligação) consistindo de domínios VL1 VH, CL e CH1; um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente (dois sítios de ligação) compre30 endendo dois fragmentos Fab unidos por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; um fragmento Fd consistindo de domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo de domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; um anticorpo de domínio único (dAb) (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989); Winter et al., Publicação PCT No. W090/05144A1, incorporado aqui como referência), que compreendem domí35 nios vaiáveis únicos, anticorpos de domínio variável duplo (DVD) (vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 2007/024715); e regiões de determinação de complementaridade isoladas (CDRs). Além disso, apesar dos dois domínios de fragmento Fv, VL e VH1 serem codificados por genes separados, eles podem ser juntos, usando métodos recombinantes por um Iigante sintético que possibilita que eles sejam feitos como uma cadeia de proteína única na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv), vide, por exemplo, 5 Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 85: 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única são conhecidos pelos termos “anticorpo” e “molécula de anticorpo”. Diacorpos são também conhecidos pelos termos “anticorpo” e “molécula de anticorpo”. Diacorpos são anticorpos biespecíficos, bivalentes, nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo úni10 ca, mas usando um Iigante que é tão curto que permite o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, por meio disso forçando os domínios a se emparelhar com domínios complementares de uma outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (vide, por exemplo, Holliger ET AL., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 6444- 6448 (1993); Poljak ET AL., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Os termos “anticorpo” e 15 “molécula de anticorpo” também envolvem moléculas de imunoglobulina de domínio variável duplo, tais como moléculas de imunoglobulina de domínio variável duplo DVDIG™ (Abbott Laboratories) (vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 2007/024715).

Como usado aqui, “vetor” se refere a qualquer elemento genético capaz de servir como um veículo de transferência genética, expressão ou replicação para um polinucleotídeo estrangeiro em uma célula hospedeira. Por exemplo, um vetor pode ser um cromossomo artificial ou um plasmídeo, e pode ser capaz de integração estável em um genoma de célula hospedeira, ou pode existir como um elemento genético independente (por exemplo, epissomo, plasmídeo). Um vetor pode existir como um polinucleotídeo único ou como dois ou mais polinucleotídeos separados. Vetores podem ser vetores de cópia única ou vetores multicópias quando presentes em uma célula hospedeira. Os vetores preferidos para uso na presente invenção são moléculas de vetor de expressão, nas quais um ou mais genes funcionais podem ser inseridos na molécula de vetor, em orientação própria ou em proximidade com os elementos de controle de expressão residentes na molécula de vetor de expressão, de modo a conduzir a expressão de uma ou mais proteínas quando a molécula de vetor reside em uma célula hospedeira (homóloga) apropriada.

Vetores de expressão podem incluir, sem limitação, vetores de plasmídeos eucarióticos, vetores virais eucarióticos, plasmídeos procarióticos, vetores bacteriófagos, vetores bifuncionais (por exemplo, um vetor que pode replicar em células procarióticas e eucarióticas), mini-cromossomos e vários cromossomos artificiais (por exemplo, cromossomos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais de leveduras (YACs)). Preferencialmente, um vetor de expressão usado na invenção é um plasmídeo, mais preferencialmente, um vetor de expressão de plasmídeo que se integra de forma estável em um genoma de célula hospedeira, e ainda mais preferencialmente, um vetor de expressão de plasmídeo que se integra de forma estável em um genoma 5 de célula hospedeira por recombinação não homóloga. Um “vetor shuttle” (ou vetor bifuncional) se refere a qualquer vetor que possa se replicar em mais de uma espécie de organismos. Por exemplo, um vetor shuttle que pode se replicar tanto em Escherichia coli (E. coli) quanto em Saccharomyces eerevisiae (S. eerevisiae) pode ser construído pelas seqüências de ligação a partir de um plasmídeo de E. coli com seqüências 10 a partir de plasmídeo de levedura 2μ.

Os sistemas de expressão compreendem um vetor de expressão e célula hospedeira (homóloga) apropriada que expressará a(s) proteína(s) recombinante(s) codificada(s) no vetor de expressão. Um sistema de expressão pode ser um sistema de expressão estável ou um sistema de expressão transiente. Em um sistema de expressão 15 estável, um vetor de expressão se integra de forma estável no genoma da célula hospedeira ou é replicado de forma contínua e passado fielmente em ambas células filhas de modo que as células hospedeiras sejam capazes de continuar a expressar a(s) proteína(s) recombinante(s) quando cultivadas sob condições apropriadas. Em um sistema de expressão transiente, as moléculas dos vetores de expressão não são retidas em 20 ambas as células filhas que eventualmente são perdidas ou tão diminuídas em uma cultura de célula de crescimento que a expressão de proteína(s) recombinante(s) a partir da cultura eventualmente cessará ou será tão baixa ao ponto de não ser útil para a maioria dos propósitos de produção. Os vetores e expressão usados nos exemplos abaixo são tipos de vetores de shuttle que podem se replicar relativamente em altos 25 números de cópias quando inseridos (por exemplo, transformação) em células de E. coli e que também podem ser inseridos (por exemplo, transfecção) em, e mantidos de forma estável em células de ovário de hamster Chinês (CHO) para obter expressão estável dos seus produtos de genes codificados de interesse (Kaufman et al., Molec. Cell. Biol., 5: 1750-1759 (1980)) ou que podem ser mantidos de forma transiente em 30 células HEK 293 (Durocher et al., Nucleic Acids Res., 30: E9). Desse modo, uma molécula de polinucleotídeo rEVE descrita aqui pode ser usada para melhorar a expressão da proteína(s) recombinante(s) de interesse em ambos os sistemas de expressão transiente e estável.

Vetores eucarióticos exemplares que podem ser usados na invenção incluem, mas não estão limitados, a vetores virais e não virais. Os vetores virais incluem, sem limitação, vetores retrovirais (incluindo vetores lentivirais); vetores adenovirais incluindo formas competentes de replicação, deficientes de replicação e desencorajada dos mesmos, vetores de vírus adeno associado (AAV), vetores de simian vírus 40 (SV-40); vetores de vírus papiloma bovino, vetores de vírus Epstein-Barr, vetores de vírus de herpes, vetores de vírus vaccinia, vetores de vírus da leucemia murina de Moloney; vetores de vírus do sarcoma de murino de Moloney; vetores de vírus do sarcoma muri5 no de Harvey; vetores de vírus de tumores mamários murinos; e vetores de vírus do sarcoma de Rous. Vetores de baculovirus são bem conhecidos e são adequados para a expressão em células de inseto.

Uma variedade de vetores adequados para expressão em células procarióticas e eucarióticas é bem conhecida na arte, muitos estão comercialmente disponíveis. Fon10 tes comerciais incluem, sem limitação, Stratagen (La Jolla, Califórnia), Invitrogen (CarIsbad, Califórnia), Promega (Madison, Wisconsin) e Sigma Aldrish (St. Loius, Missouri). Muitas seqüências de vetores estão disponíveis em banco de genes e informação adicional relacionada a vetores está disponível na internet por meio do Riken BioSource Center.

Uma molécula de vetor compreende tipicamente pelo menos uma origem de

replicação e também pode compreender um gene para um “marcador” ou “marcador selecionável” pelo qual o vetor pode ser identificado ou selecionado quando inserido em uma célula hospedeira. Tais marcadores úteis podem, sem limitação, conferir resistência a antibióticos, proporcionar funções que geram uma vantagem de crescimento 20 seletivo diante de células que não apresentam tais funções, ou proporcionar um meio para identificar facilmente células que possuem o vetor (por exemplo, sistema colorigênico). Tais marcadores são bem conhecidos na arte, e a escolha do(s) marcador(es) seletivo(s) próprio(s) para uso em uma molécula de vetor dependerá de qual célula hospedeira será usada e quais propriedades são desejadas para a célula hospedeira 25 que contém o vetor.

Os termos “construto de gene funcional” “gene funcional” e “gene” se referem a polinucleotídeos que contém uma seqüência de codificação para uma ou mais proteínas que estão ligadas de forma operacional a uma seqüência de promotor e possivelmente a outras seqüências reguladoras transcricionais para conduzir a transcrição pró30 pria da seqüência de codificação do RNA mensageiro (mRNA) e que também compreende qualquer de uma variedade de seqüências reguladoras de translação que podem ser necessárias ou desejadas para conduzir a translação própria de um mRNA na proteína desejada na célula hospedeira pretendida. Um códon de partida translacional (por exemplo, ATG) e um sítio de ligação de ribossomo são tipicamente requeridos no mR35 NA para que a translação ocorra em células eucarióticas e procarióticas. Outras seqüências reguladoras de translação que também podem ser empregadas, dependendo da célula hospedeira, incluem, mas estão limitadas a, um sítio de encaixe de RNA e um sítio de poliadenilação. O termo “recombinante” é usado aqui para descrever ácidos nucléicos manipulados ou alterados, ácidos nucléicos isolados a partir de um ambiente no qual eles ocorrem naturalmente, células hospedeiras transfectadas com ou, de outro modo, manipuladas para conterem ácidos nucléicos exógenos, ou proteínas expressas de forma não natural através da manipulação de DNA isolado e transformação de células hospedeiras. “Recombinante” é um termo que engloba especificamente moléculas de DNA que foram construídas in vitro usando técnicas de engenharia genética, e o uso do termo “recombinante” como um adjetivo para descrever uma molécula, construto, vetor, célula, proteína, polipeptídeo ou polinucleotídeo especificamente exclui a ocorrência de forma natural de tais moléculas, construtos, vetores, células, proteínas, polipeptídeos ou polinucleotídeos. Em particular, uma “proteína recombinante” para o propósito da presente invenção é uma proteína que é expressa por uma célula hospedeira que tenha sido manipulada pela incorporação de pelo menos um elemento genético que não era de ocorrência de forma natural na célula hospedeira antes da expressão de proteína. Uma proteína, em que seqüência de codificação para a qual foi incorporada artificialmente em uma célula hospedeira torna-se capaz de expressar a proteína, por exemplo, por ser transfectada com um vetor de expressão que inclui a seqüência de codificação da proteína, é uma “proteína recombinante” uma vez que é expressa pela célula hospedeira.

Uma “célula hospedeira” se refere a qualquer célula, ou seja, qualquer célula procariótica ou eucariótica, na qual uma molécula de vetor pode ser inserida. De acordo com a presente invenção, as células hospedeiras preferidas são as células procarióticas ou eucarióticas, mas não limitadas a, células de animais (por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, pássaros e peixes), células de plantas (por exemplo, incluindo células eucarióticas de alga), células de fungos, células de bactérias e células de protozoários. As células hospedeiras úteis na invenção podem ser de qualquer construto genético, mas são preferencialmente células haplóides ou diplóides. As células hospedeiras de mamíferos preferidas úteis na invenção incluem, sem limitação, uma célula de ovário de hamster Chinês (CHO), uma célula Vero, uma célula SP2/0, uma célula de mieloma NS/O, uma célula embriônica de rim humano (HEK 293), uma célula de rim de filhote de hamster (BHK), uma célula HeLa1 uma célula B de humano, uma célula CV-1/EBNA, uma célula L, uma célula 3T3, uma célula HEPG2, uma célula PerC6 e uma célula MDCK. Uma célula de inseto preferida é a Sf9. Células de fungo que podem servir como células hospedeiras da invenção incluem, sem limitação, células de Ascomycetos, tais como Aspergillus, Neurospora e células de levedura, particularmente levedura do gênero Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia e Candida. Espécies fúngicas de levedura particularmente preferidas que podem servir como células hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes são Saccharomyces eerevisiae, Hansenula polymorpha, kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. As 5 células procarióticas preferidas que podem servir como células hospedeiras da invenção incluem, sem limitação, Escherichia coli, sorotipo de Salmonella entérica, Shigella species, Wollinella suecinogenes, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Edwardsiella tarda, Citrobacter freundii, Pasteurella species, Haemophilus species, Pseudomonas species, Bacillus species, Staphyloccocus species e Streptococcus species. Outras célu10 Ias que podem ser células hospedeiras úteis para a expressão de proteínas recombinantes de acordo com a invenção incluem protozoários, tais como, Leishmania tarentoIae hospedeira de tripanosomatide e células de nematóide Caenorhaditis elegans. Vários vetores de expressão estão disponíveis para uso nas células mencionadas anteriormente.

Existem vários meios e protocolos para a inserção de moléculas de vetor em

células incluindo, mas não limitados a, transformação, transfecção, fusão protoplástica ou celular, uso de um tratamento químico, (por exemplo, tratamento de protoplásticas com polietileno glicol, tratamento com cálcio, agentes de transfecção, tais como, reagentes de transfecção LIPOFECTIN e LIPOFECTAMINE disponibilizados por Invitrogen 20 (Carlsbad, Califórnia), uso de vários tipos de lipossomos, uso de um dispositivo mecânico (por exemplo, microesferas revestidas com ácido nucléico), uso de carga elétrica (por exemplo, eletroporação) e combinações dos mesmos. Faz parte da habilidade de um praticante da técnica determinar o protocolo e/ou meio particular a usar para inserir uma molécula de vetor particular descrita aqui em uma célula hospedeira desejada.

Métodos para “transferir informação de seqüência de ácido nucléico” de uma

molécula de ácido nucléico ou vetor para outra não estão limitadas na presente invenção e incluem qualquer dentre uma variedade de técnicas de ácido nucléico recombinante ou engenharia genética conhecidas na arte. As técnicas de transferência particularmente preferidas incluem, mas não estão limitadas a, técnicas de ligação e de diges30 tão com restrição, protocolos de reação em cadeia de polimerase (PCR) (utilizando iniciadores de seqüência aleatória e específica), técnicas de recombinação homóloga (utilizando regiões de polinucleotídeos de homologia) e técnicas de recombinação não homóloga (por exemplo, inserção aleatória). As moléculas de ácido nucléico que contém uma seqüência específica também podem ser sintetizadas, por exemplo, usando 35 um sintetizador de ácido nucléico automatizada, e o produto de ácido nucléico resultante é então incorporado em outra molécula de ácido nucléico por qualquer uma das metodologias mencionadas anteriormente. O emprego de tecnologia de engenharia genética necessariamente exige o crescimento de células hospedeiras recombinantes (por exemplo, transfectantes, transformantes) sob uma variedade de condições especificadas como determinadas pelas exigências das células e o estado celular particular desejado pelo praticante. Por e5 xemplo, uma célula hospedeira pode possuir (como determinado por sua disposição genética) certas exigências nutricionais, ou uma resistência particular ou sensibilidade a condições físicas (por exemplo, temperatura) ou químicas (por exemplo, antibióticos). Além disso, condições de cultura específica podem ser necessárias para regular a expressão de um gene desejado (por exemplo, o uso de promotores induzíveis), ou para 10 iniciar um estado celular particular (por exemplo, esporulação ou manipulação reprodutiva celular de leveduras). Estas condições variadas e exigências para satisfazer tais condições são entendidas e apreciadas pelos praticantes da arte.

No contexto de ampliar (elevar) a expressão de proteína recombinante em uma célula hospedeira usando um procedimento de amplificação padrão de redutase dihi15 drofolato (DHFR)-metrotexato (MTX), os termos “estabilidade” e “expressão estável” se referem a habilidade de uma cultura de células continuar a expressar a proteína recombinante em um nível ampliado (elevado) quando cultivada na ausência de metotrexato, isto é, na ausência de pressão seletiva para a expressão elevada proporcionada pela presença de metotrexato usado no procedimento de amplificação. Desse modo, 20 uma vez isolada, a célula hospedeira transfectada de forma estável, pode expressar uma proteína recombinante de interesse na presença ou ausência de metotrexato.

No contexto de ampliar a expressão de proteína recombinante em uma célula hospedeira usando um procedimento de amplificação padrão de redutase dihídrofolato (DHFR)-metrotexato (MTX), “adaptação melhorada” ou “adaptação aperfeiçoada” na 25 presença de metotrexato se refere a maior taxa de crescimento e/ou maior taxa de capacidade de sobrevivência na presença de metotrexato de uma cultura de células hospedeiras carregando vetores de expressão que compreendem um rEVE descrito aqui quando comparado com a taxa de crescimento e/ou capacidade de sobrevivência na presença de metotrexato de uma cultura de células hospedeiras carregando vetores de 30 expressão que não apresentam o rEVE. “Capacidade de sobrevivência” de uma população de células hospedeiras se referem a habilidade de uma população de células hospedeiras de crescer e se reproduzir na presença de uma pressão seletiva (por exemplo, metotrexato).

“Homologia de seqüência” é um conceito familiar para praticantes neste campo. Para determinar a homologia percentual de duas seqüências de aminoácidos ou de dois ácidos nucléicos, as seqüências são alinhadas para propósito de comparação ótima (por exemplo, aberturas podem ser introduzidas na seqüência de uma primeira sequência de ácido nucléico ou aminoácido para alinhamento ótimo com uma segunda seqüência de ácido nucléico ou aminoácido de comparação). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando a posição na primeira seqüência está 5 ocupada pelo mesmo nucleotídeo ou resíduo de aminoácido como a posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas são homólogas naquela posição (isto é, como usado aqui “homologia” de ácido nucléico ou aminoácido é equivalente a “identidade” de ácido nucléico ou aminoácido). A homologia da seqüência de ácido nucléico pode ser determinada como o grau de identidade entre duas seqüências. A ho10 mologia pode ser determinada usando-se programas de computadores conhecidos na arte, tais como, software GAP fornecido no pacote de programa. Vide, Needleman e Wunsch, J. MoL Biol., 48: 443-453 (1970).

Uma composição ou método descrito aqui como “compreendendo” um ou mais elementos ou etapas é um significado aberto de que etapas ou elementos designados são essenciais, mas outras etapas ou elementos podem ser adicionados dentro do escopo da composição ou método. Para evitar redundância, também é entendido que qualquer composição ou método descrito aqui como “compreendendo” (ou “que compreende”) uma ou mais etapas ou elementos designados também descrevem o método ou composição, mais limitado, correspondente “consistindo essencialmente de” (ou “que consiste essencialmente de”) mesmas etapas ou elementos designados, significando que a composição ou método inclui as etapas ou elementos essenciais designados e também pode incluir etapas ou elementos adicionais que não afetam materialmente a(s) característica(s) nova(s) e básica(s) da composição ou método. Também é entendido que qualquer composição ou método descrito aqui como “compreendendo” ou “consistindo essencialmente de” uma ou mais etapas ou elementos também descrevem a composição ou método fechado, mais limitado, correspondente “consistindo de” (ou “que consiste de”) elementos ou etapas para a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento não designado. Em qualquer composição ou método revelado aqui, equivalentes revelados ou conhecidos de qualquer etapa ou elemento essencial designado pode ser substituído por aquela etapa ou elemento.

É também entendido que um elemento ou etapa “selecionado a partir do grupo consistindo de” se refere a um ou mais elementos ou etapas na lista que segue, incluindo combinações de qualquer um dentre dois ou mais dos elementos ou etapas listados.

A menos que indicado de outro modo, o significado dos outros termos será cla

ro para o contexto ou será entendido como sendo o mesmo entendido e usado por pessoas versadas na técnica. As pessoas versadas na técnica também entendem que a seqüência de ácido nucléico (seqüência de base de nucleotídeo) como descrita aqui proporciona as seqüências de DNA1 RNA e complementares dos mesmos.

Os Elementos de expressão de vetor recombinante (rEVEs) da invenção foram primeiro isolados a partir de regiões de DNA genômico que também flanqueiam o lado do sítio de integração de um vetor de expressão presente nas células de uma linhagem celular de DUXB11 CHO transfectada que expressou excepcionalmente níveis elevados de moléculas de anticorpo anti-IL-12 a partir dos genes presentes na expressão de vetor. A clonagem e sequenciamento destas regiões de flaqueamento de DNA genômico de DUXB11 CHO exibiram a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. A seqüência de base 2329 de SEQ ID NO: 1 é também referida aqui como “ARM1”, e a seqüência de base 2422 da SEQ ID NO: 2 é referida como “ARM2”. A seqüência que flanqueia o DNA ARM1 demonstrou estar localizada a montante da direção de transcrição do gene de cadeia pesada do vetor de expressão integrado, e a seqüência que flanqueia DNA ARM2 demonstrou estar localizada a jusante da direção de transcrição do gene de cadeia leve do vetor de expressão integrado (vide, seções de Exemplos abaixo).

Moléculas de DNA contendo ARM1- e ARM2- foram inseridas individualmente e em combinação nos vetores de expressão para determinar se suas presenças poderiam afetar o nível de expressão de várias proteínas recombinantes em células hospe20 deiras contendo os vetores de expressão. O DNA contendo ARM1- e o DNA contendo ARM2- proporcionam níveis melhorados de expressão de proteínas recombinantes em células hospedeiras comparadas com os níveis de produção obtidos na ausência destas seqüências (vide, Exemplos, abaixo). Consequentemente, as moléculas de ácido nucléico contendo ARM1- e ARM2- são exemplos de elementos de vetor de expressão 25 recombinante (rEVEs). Tipicamente, o nível melhorado de produção obtido com um polinucleotídeo de ARM1 é um pouco menor que o obtido com polinucleotídeo ARM2 ou com uma combinação de polinucleotídeos de ARM1 e ARM2.

Em todos os exemplos onde uma ou outra ou ambas a ARM1 e a ARM2 foram empregadas na construção dos vetores de expressão para a produção de uma proteína 30 recombinante de interesse de acordo com a invenção, o nível de expressão da proteína foi maior usando-se os elementos melhoradores de expressão ARM1 e/ou ARM2. Níveis de expressão comparativos aumentados para o produto de proteína recombinante maior que 2-vezes, maior que 3-vezes, maior que 4-vezes, maior que 5-vezes, maior que 6-vezes, maior que 9-vezes, maior que 10-vezes, maior que 13-vezes, maior que 35 16-vezes, maior que 18-vezes diante se sistemas de expressão de controle possuindo nenhum melhorador de ARM foram observados diretamente (vide, Exemplos, abaixo). Além disso, o alto nível de expressão obtido usando vetores de expressão carregando ARM1 ou ARM2, ou ambas ARM1 e ARM2, é mantido além do tempo nas células hospedeiras transfectadas.

As seqüências ARM1 e ARM2 possuem regiões que são relativamente ricas em regiões de interação com o eixo protéico/ matriz (MARs/SARs; vide, por exemplo, 5 Michalowski et al., Biochemistry, 38: 12795-12804 (1999); Tikhonov et al., The Plant Cell, 12: 2490-264 (2000) Patente U.S. No. 7.129.062; Bode et al., Int. Ver. Cytol., 162A: 389-454 (1995); Bode et al., Crit. Rev. Eukariotic Gene Expression, 6: 115-138 (1996)). No caso de motivos de seqüência MAR, ARM1 estarem particularmente concentrados na região terminal 3’ da seqüência, considerando o caso de ARM2, clusters 10 de motivos de MAR aparecem em ambas as regiões terminais 3’e 5’ da seqüência com poucos motivos de MAR situados na região intermediária da seqüência. A análise de deleção indica que aproximadamente um par de base 1260 de região terminal 3’ do ácido nucléico ARM2 contém seqüências que são críticas para atividade de expressão de proteína melhorada ARM2 (vide, Exemplo 6, abaixo).

As moléculas de rEVE da invenção incluem aquelas moléculas de ácido nu

cléico que compreendem porções de melhoramento de expressão ou fragmentos de seqüências ARM1 e ARM2. Tais porções de melhoramento de expressão de seqüências ARM1 e ARM2 são aquelas que, quando presentes no mesmo vetor de expressão como um gene que codifica uma proteína recombinante de interesse, melhoram o nível 20 de expressão de proteína recombinante em uma célula hospedeira contendo o vetor de expressão quando comparado com aquele nível de expressão obtido na ausência de tais porções ou fragmentos de seqüências de ARM1 ou ARM2.

Um rEVE descrito aqui pode ser usado individualmente ou em combinação com qualquer outro elemento regulador ou sistema de melhoramento de expressão para elevar o nível de produção de proteína(s) recombinante(s) desejada(s) em uma célula hospedeira. Tais outras seqüências e sistemas podem incluir, sem limitação, o uso de promotores regulados para controlar ou otimizar a transcrição de gene(s) que codifica uma proteína(s) recombinante de interesse, o uso de uma seqüência de sinalização que conduz a secreção de proteína(s) recombinantes a partir de células hospedeiras e o uso de métodos de ampliação de gene, tais como, um protocolo de ampliação de redutase dihidrofolato (DHFR)-metotrexato (MTX) ou um protocolo glutamina sintetase. Em um procedimento de amplificação DHFR-MTX, as células hospedeiras carregando um vetor de expressão que compreendem um gene para DHFR são selecionadas para resistência a concentrações aumentadas de metotrexato (vide, por exemplo, Kaufman, R.J., In Genetic Enqineerinq: Principies and Method (Ed. J.K. Setlow) volume 9, página 155 (Plenum Publishing, New York, 1987)). Tipicamente, como o nível de resistência a ao metotrexato aumenta, existe uma ampliação de acompanhamento do número de cópia de gene(s) recombinante(s) junto com uma ampliação correspondente (elevação) no nível de expressão de proteína recombinante a partir de tal(is) gene(s) ampliados.

As seqüências de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 foram identificadas a partir de moléculas de DNA obtidas a partir de uma linhagem celular de DUXB11 CHO. Qualquer de uma variedade de métodos pode ser usado para produzir moléculas de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ou porções de uma ou outra destas seqüências. Tais métodos incluem, sem limitação, a clonagem de uma ou mais moléculas de DNA de rEVE que compreendem tais seqüências fora das células de DNA genômico de DUXB11 CHO, protocolos de síntese de ácido nucléico de fase sólida para produzir um polinucleotídeo compreendendo tais seqüências, técnicas de ácido nucléico recombinante, protocolos de reação de cadeia de polimerase (PCR), sintetizadores de ácido nucléico automatizado e combinações dos mesmos. Uma molécula de polinucleotídeo de rEVE descrita aqui também pode ser adquirida de fornecedores comerciais de moléculas de ácido nucléico destinadas de costume. O método pelo qual um rEVE é produzido ou sintetizado não é limitante, e o praticante versado pode decidir qual método ou combinação de métodos é mais apropriado para produzir um rEVE particular descrito aqui.

Um rEVE particular descrito aqui pode ser inserido em um vetor de expressão para melhorar a expressão de qualquer dentre uma variedade de proteínas (incluindo peptídeos, polipeptídeos e proteínas oligoméricas) a partir de um vetor de expressão de células hospedeiras. Uma sequência(s) que codifica nucleotídeo proporcionado é conhecida ou disponível em uma molécula de ácido nucléico (DNA ou RNA), a(s) sequência(s) de codificação ou o gene funcional inteiro para uma proteína de interesse pode ser inserido em um vetor de expressão usando qualquer dentre uma variedade de métodos disponíveis na técnica. Seqüências de codificação são ligadas de forma operacional a um promotor que funcionará com o tipo de célula hospedeira para a qual a expressão é desejada. Seqüências translacionais e transcricionais adicionais podem também ser construídas no vetor para a expressão própria de proteína(s) desejada(s) na célula hospedeira.

A expressão de qualquer de uma vasta variedade de proteínas (incluindo peptídeos, polipeptídeos e proteínas oligoméricas) a partir de um vetor de expressão em uma célula hospedeira apropriada pode ser melhorada por um ou mais rEVEs descritos aqui, incluindo, mas não limitado a, proteínas solúveis, proteínas de membranas, prote35 ínas estruturais (isto é, proteínas que proporcionam estrutura ou suporte para células, tecidos ou órgãos), proteínas ribossômicas, enzimas, zimogênios, moléculas de anticorpos variados (incluindo, mas não limitado a, anticorpos para TNF-α, tais como, adalimumab, anticorpos para selectina, anticorpos para proteínas imunoreguladoras, tais como, anticorpos para IL-13; moléculas de imunoglobulina de domínio variável duplo, tais como, moléculas de imunoglobulina de domínio variável duplo DVD-IG™, anticorpos para receptores de superfície celular), proteínas receptoras de superfície celular, 5 proteínas reguladoras de transcrição, proteínas reguladoras de translação, proteínas de cromatina, hormônios, proteínas reguladoras de ciclo celular, proteínas G, peptídeos neuroativos, proteínas imunoreguladoras (por exemplo, interleucinas, citocinas, linfocinas), proteínas componentes do sangue, proteínas porta íons, proteínas de choque térmico, redutase dihidrofolato, uma proteína de resistência a antibiótico, um frag10 mento funcional dentre qualquer uma das proteínas precedentes, um fragmento contendo epítope dentre qualquer uma das proteínas precedentes, e combinações dos mesmos.

Uma proteína recombinante de interesse pode ser produzida por transcrição ou translação do gene ou genes que codificam a proteína recombinante e estão presentes 15 em uma molécula de vetor de expressão descrita aqui. Tais transcrição e translação do gene ou genes em um vetor de expressão, incluindo aqueles descritos aqui, podem ser realizadas usando um sistema transcrição/translação sem célula ou usando uma célula hospedeira apropriada que contém a molécula de vetor expressão e que possui o maquinário de translação e transcrição celular próprio necessário para produzir a proteína 20 recombinante de interesse a partir do gene ou genes presentes na molécula de vetor de expressão.

As regiões de interação com a matriz (MARs), também referidas como regiões de interação com o eixo protéico (SARs), foram originalmente identificadas como fragmentos de DNA cromossomal que se ligam a preparações de proteínas nucleares que 25 aparentam formar uma matriz ou eixo protéico no núcleo eucariótico. Acredita-se que as MARs residem em Ioops de cromatina que se integram a matriz nuclear e definem ou delimitam unidades estruturais individuais de cromatina. As MARs foram associadas com algumas seqüências melhoradoras e/ou ligadas a um número de processos que podem ocorrer na cromatina, incluindo transcrição, expressão transgênica, rearranjo 30 transgênico, recombinação, replicação e estabilização de transfecções (vide, por exemplo, Michalowski et al., Biochemistry, 38: 12795-12804 (1999); Zhong et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 96(21): 11970-11975 (1999); Tikhonov et al., The Plant Cell, 12: 249-264 (2000); Zhou et al., Gene, 277: 139-144 (2001); Summer et al., Genome Research, 13: 1737-1743 (2003); Patente U.S. No. 7.129.062; Bode et al., Int. Ver. Cytoi, 35 162A: 389-454 (1995); Bode et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 6: 115-138 (1996)). ARM1 (SEQ ID NO: 1) e ARM2 (SEQ ID NO: 2) possuem uma variedade de elementos de MAR, que aparentam estar localizados predominantemente em clusters nas regiões terminais 3’ e/ou 5’. A AMR1 contém um cluster de elementos de MAR na região terminal 3’. No caso do ARM2 os elementos de MAR podem ser encontrados em todo o comprimento desta seqüência de rEVE com clusters de motivos de MAR localizados em ambos os terminais 5’ e 3’. Claramente, vetores e outras moléculas de ácido 5 nucléico que carregam seqüências ARM1 e ARM2 são fontes convenientes de elementos de MAR e clusters de elementos de MAR. Consequentemente, as porções contendo ARM1, ARM2 e MAR- dos mesmos podem ser usadas para aumentar o número de elementos de MAR em uma molécula de ácido nucléico de interesse usando qualquer dentre os vários métodos disponíveis na técnica para recombinar ou de outro modo 10 transferir informação de seqüência de ácido nucléico para uma molécula de ácido nucléico.

As moléculas de ácido nucléico que compreendem uma seqüência de um rEVE descrita aqui ou uma porção da mesma também podem ser usadas em uma variedade de procedimentos bem conhecidos na arte para manipular, identificar, produzir ou am15 pliar seqüências de rEVE em outras moléculas de ácido nucléico. Tais procedimentos podem incluir, sem limitação, o uso de um rEVE ou porção do mesmo como uma sonda em qualquer dos vários métodos de hibridização de ácido nucléico conhecidos na arte ou como um iniciador em qualquer um dos vários procedimentos de reações em cadeia de polimerase (PCR) conhecidos na arte.

Uma molécula de polinucleotídeo de rEVE descrita aqui pode ser usada em

métodos para produzir uma proteína recombinante de interesse. Preferencialmente, tal método para produzir uma proteína recombinante de interesse compreende um vetor de expressão recombinante como descrito aqui que compreende um ou mais genes recombinantes que codificam a proteína recombinante de interesse e pelo menos uma 25 molécula de polinucleotídeo de rEVE descrita aqui, e transcrever e transladar os um ou mais genes recombinantes presentes no vetor de expressão recombinante para produzir as proteínas recombinantes de interesse. A transcrição e translação de um ou mais genes recombinantes a partir do vetor de expressão é preferencialmente realizada em uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão e é cultivada sob condi30 ções que promovem a expressão da proteína recombinante de interesse. Uma molécula de polinucleotídeo de rEVE pode ser usada para melhorar o nível de expressão de uma ou mais proteínas recombinantes de interesse a partir de um vetor de expressão em uma célula hospedeira, se expresso de forma transiente (por exemplo, em uma célula hospedeira COS ou HEK 293 transfectada) ou expressa de forma estável (por e35 xemplo, em uma célula hospedeira CHO transfectada). A transcrição ou translação de um ou mais genes recombinantes a partir de um vetor de expressão que carrega um rEVE, como descrito aqui, também pode ser realizada usando um sistema transcrição/translação sem célula in vitro disponível na arte.

Uma molécula de polinucleotídeo de rEVE descrita aqui pode ser usada para preparar uma célula hospedeira que expressa de forma estável (no sentido oposto ao de forma transiente) níveis elevados de uma proteína recombinante quando o nível de 5 expressão foi ampliado (elevado) usando um procedimento de amplificação metotrexato-DHFR. Tais células hospedeiras são células resistentes a metotrexato (resistente a MTX) que continuarão a expressar níveis elevados de uma proteína recombinante não apenas quando cultivadas na presença de metotrexato, mas também quando cultivadas na ausência de metotrexato, isto é, quando cultivada na ausência de pressão sele10 tiva para expressão elevada proporcionada pela presença de metotrexato. Em uma modalidade preferida, um tal método para produzir uma célula hospedeira resistente a metotrexato compreende as etapas de :

inserir nas células hospedeiras um vetor de expressão compreendendo: uma codificação de gene recombinante para uma proteína recombinante de in

teresse,

um rEVE ou uma porção de melhoramento de expressão do mesmo, e um gene de redutase dihidrofolato (DHFR)

cultivar as células hospedeiras na presença de metotrexato para selecionar uma célula hospedeira resistente a metotrexato que expressa a proteína recombinante de interesse, e

isolar uma célula hospedeira resistente a metotrexato;

em que a célula hospedeira resistente a metotrexato expressa a proteína recombinante de interesse em um nível que é maior que aquele de uma célula hospedeira sensível a metotrexato, e em que a célula hospedeira resistente a metotrexato ex25 pressa de forma estável um nível elevado de proteína recombinante quando cultivada na presença ou na ausência de metotrexato. Preferencialmente, o rEVE compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou uma expressão de melhoramento de expressão das mesmas. Mais preferencialmente, o rEVE compreende a SEQ ID NO: 2.

As moléculas de polinucleotídeos de rEVE descritas aqui também podem ser usadas em um método para aperfeiçoar a habilidade de uma população de células hospedeiras que expressam uma proteína recombinante para se adaptar ao crescimento na presença de metotrexato. Em uma modalidade preferida, tal método compreende: Inserir nas células hospedeiras um vetor de expressão compreendendo: um gene recombinante que codifica uma proteína recombinante de interesse,

uma molécula de polinucleotídeo de elemento de vetor de expressão recombi

nante (rEVE) compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, uma porção de SEQ ID NO: 1, uma porção de SEQ ID NO: 2 e combinações das mesmas, e

um gene de redutase dihidrofolato (DHFR);

em que uma população de células hospedeiras contendo o vetor de expressão possui uma taxa de crescimento maior e/ou de sobrevivência maior quando cultivada na presença de metotrexato quando comparada com uma população de células hospedeiras que carregam o vetor de expressão sem a molécula de polinucleotídeo de rEVE.

Uma molécula de polinucleotídeo de rEVE descrita aqui também pode ser empregada para melhorar a ampliação (elevação) da expressão de uma proteína recombinante em células hospedeiras usando um procedimento de amplificação metotrexatoDHFR. Em uma modalidade preferida, tal método compreende:

Inserir nas células hospedeiras um vetor de expressão compreendendo: uma codificação de gene recombinante para uma proteína recombinante de interesse,

uma molécula de polinucleotídeo de rEVE compreendendo uma seqüência de selecionada a partir de um grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, uma porção de SEQ ID NO: 1, uma porção de SEQ ID NO: 2 e combinações das mesmas, e um gene de redutase dihidrofolato (DHFR)

isolar uma célula hospedeira resistente a metotrexato;

em que a célula hospedeira resistente a metotrexato isolada expressa a proteína recombinante de interesse na presença de metotrexato em um nível que é maior que aquele de uma célula hospedeira resistente a metotrexato contendo um vetor de expressão sem a molécula de polinucleotídeo de rEVE.

Nos métodos descritos aqui que empregam uma seleção de metotrexato para expressão ampliada de uma proteína(s) recombinante(s) desejada(s), o metotrexato pode ser usado em uma faixa de 20 nM a 500 nM. Entretanto, vantajosamente pessoas versadas na técnica reconhecem que concentrações de metotrexato maiores ou meno30 res, tais como, 5 nM a 10 μΜ, também podem ser empregadas com sucesso nas seleções de metotrexato para ampliar a expressão (vide, por exemplo, Kaufman, R.J., Methods in Enzvmoloav. Vol. 185: 537-566 (1990)).

A invenção também proporciona um método para reduzir, suprimir substancialmente, ou silenciar essencialmente a expressão de uma proteína recombinante a partir de um vetor de expressão. Tal método pode empregar um vetor de expressão que compreende um ou mais fragmentos de uma seqüência de rEVE descritos aqui que proporcionam níveis inferiores de expressão de um produto de gene recombinante particular do que quando proporcionado usando uma seqüência de rEVE de comprimento completo. Tais seqüências derivadas de rEVE que suprimem a expressão ou reduzem a expressão incluem uma variante truncada da seqüência de ARM2 que possui uma seqüência de base de bases 1-1086 de SEQ ID NO: 2 ou bases 1-461 de SEQ ID NO:2. Claramente, a presença da região de seqüência terminal 3’ deletada a partir dessas duas variantes é altamente desejável para a expressão melhorada expressa por rEVE de proteínas recombinantes. Uma molécula de ácido nucléico que possui a seqüência truncada ARM2 de bases 1-461 de SEQ ID NO: 2 é particularmente útil para suprimir ou substancialmente silenciar a expressão de uma proteína recombinante a partir de uma molécula de vetor de expressão em uma célula hospedeira. Tais métodos podem encontrar uso em várias situações, incluindo, sem limitação, quando existe um entendimento de que a expressão de uma proteína recombinante pode ser tóxica para as células hospedeiras ou quando algum nível de expressão pode apresentar problemas para a purificação e isolamento da proteína desejada, tal como agregação de proteína.

Desse modo, a seqüência de bases 462-2422 de SEQ ID NO: 2 e a seqüência de bases 1087-2422 de SEQ ID NO: 2 são mais preferidas para a máxima expressão de melhoramento mediada por rEVE ARM2 de proteínas recombinantes. Consequentemente, polinucleotídeos de rEVE que são particularmente úteis para a expressão de 20 melhoramento de proteínas recombinantes compreendem a seqüência de bases 462- 2422 de SEQ ID NO: 2 e/ou a seqüência de bases 1087-2422 de SEQ ID NO: 2.

Modalidades adicionais e aspectos da invenção serão evidentes a partir dos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos

Exemplo 1. Análise de seqüência e clonagem dos elementos de vetor de ex

pressão recombinante (rEVEs) ARM1 e ARM2.

Uma produção de linhagem celular de DUX B11 CHO carregando um vetor de expressão integrado de forma estável foi estudado para determinar o fundamento possível para o nível elevado de forma excepcional de expressão do anticorpo anti-IL-12 30 codificado no vetor de expressão com o qual as células hospedeiras CHO foram transfectadas. No estudo, as regiões do DNA genômico que flanqueiam o vetor de expressão integrado foram clonados e seqüenciados. Resumidamente, o DNA genômico da célula hospedeira foi digerido com Xbal, e fragmentos de um tamanho médio de aproximadamente 5 kilobases (Kb) foram purificados usando-se uma coluna de BioGeI A-50 35 basicamente como descrito por Reynaud et al. (J. Mol. Biol., 140: 481-504 (1980)). Uma biblioteca de fragmentos genômicos purificados foi preparada pela clonagem de fragmentos no vetor de clonagem DASH® Iambda (λ) (Stratagene, La Jolla, Califórnia). A biblioteca foi ampliada e empacotada usando extrato de empacotamento GIGAPACK® (Stratagene) e transduzido em células de Escherichia coli XLI-BIue MRA ou XLI-BIue MRA(P2) de acordo com os protocolos de fabricação. A biblioteca foi então blindado com sondas para a seqüência de codificação da região variável de cadeia 5 pesada (Vh) do anticorpo anti-IL-12 de acordo com os protocolos da Stratagene. Um fragmento Xbal com 14,5 kb em clone#21 ADASH contém o sítio de inserção para o vetor de expressão de anticorpo junto com seqüências genômicas de flanqueamento. Estas regiões genômicas de flanqueamento foram designadas ARM1 e ARM2. As seqüências das regiões ARM1 e ARN2 foram determinadas para serem aquelas da SEQ 10 ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. Com respeito ao sítio de inserção de vetor de expressão de anticorpo no genoma celular CHO, a ARM1 está localizada a montante do sítio de inserção e a 5’ da direção de transcrição do gene do vetor para a cadeia pesada do anticorpo, e a ARM2 está localizada a jusante do sítio de inserção e a 3’ da direção de transcrição do gene do vetor para a cadeia leve do anticorpo.

Uma análise de BLAST da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 contra uma base de

dados seqüência tag expressa em CHO (EST) não revelou qualquer seqüência de códigos relatada, sugerindo que as seqüências ARM1 e ARM2 rEVE não contém quaisquer seqüências que codificam a CHO. Uma análise de BLAST de seqüências de rEVE também foi conduzida contra a seqüência de genoma de rato. Nenhuma seqüência 20 genômica de rato foi identificada como sendo homóloga a seqüência AMR1. Entretanto, a seqüência ARM2 parece estar relacionada com uma área conservada de forma elevada em cromossomo 14 de rato que não contém seqüências de codificação conhecidas.

Usando o programa de análise de seqüência de vetor NTI (Invitrogen), as se25 quências ARM1 (SEQ ID NO: 1) e ARM2 (SEQ ID NO: 2) também foram blindadas para a presença de uma amostra de vários motivos de seqüências de nucleotídeos representativos (isto é, não em todos) para elemento de região de interação com matriz (MAR) (vide, por exemplo, Michalowski et al., Biochemistry, 38: 12795-12804 (1999)). Os motivos de seqüência de DNA MAR específicos blindados pelo programa de com30 putador são mostrados na Tabela 1 (seqüências de filamentos complementares não listadas).

Tabela 1. Motivos de Seqüências de Nucleotídeos para Elementos representa

tivos da Região de Interação com a Matriz (MAR)

Elemento da Motivo* de Seqüência da MAR Blindado MAR Caixa-A AATAAAYAA (SEQ ID NO: 3) (2 desemparelhamentos permitidos) Caixa-T TTWTWTTWTT (SEQ ID NO: 4) (1 desemparelhamento permitido) MRS TAWAWWWNNAWWRTAANNWWG (SEQ ID NO: 5) (2 desemparelhamentos permitidos, mas o terminal 3’ é G) ou TAWAWWW (base 1-7 de SEQ ID NO: 5) (primeiro par de MRS, nenhum desemparelhamento) + AWWRTAANNWWWG (bases 10-21 de SEQ ID NO: 5) (segundo par de MRS, 1 desemparelhamento permitido, mas o terminal 3’ é G), onde as primeira e segunda partes de MRS contaram com até 4 bases de interposição e até 3 bases de sobre¬ posição. ARS WTTTATRTTTW (SEQ ID NO: 6) (1 desemparelhamento permitido) BUR AATATATTT (SEQ ID NO: 7) (1 desemparelhamento permitido) Encurvado AAAANNNNNNNAAAANNNNNNNAAAA (SEQ ID NO: 8) OU TTTAAA (SEQ ID NO: 9) 90% AT W2O (SEQ ID NO: 10) (2 desemparelhamentos permitidos) Torcido TANNNTGNNNCA (SEQ ID NO: 11) ou TANNNCANNNTG (SEQ ID NO: 12) ou TGNNNTANNNCA (SEQ ID NO: 13) ou CANNNTANNNTG (SEQ ID NO: 14) (nenhum desemparelhamento permitido) Sítio de Liga¬ GTNWAYATTNATNNR (SEQ ID NO: 15) ção de (2 desemparelhamentos permitidos, mas não nas posições 4-9, Topoisomerase isto é, WAYATT (bases 4 - 9) de (SEQ ID NO: 15 conservada) Il Rico em TG CAAAACA (SEQ ID NO: 16) Motivo dispen- AATATT (SEQ ID NO: 17) ou AATATATT (SEQ ID NO: 18) sador de DNA *seqüências de filamentos complementares não listadas, abreviações: Y=T ou C; W = A ou T; N = A, T, G ou C; R = G ou A

Como mostrado na Tabela 2 abaixo, pelo menos 41 seqüências de MAR foram identificadas na seqüência de DNA ARM1 (SEQ ID NO: 1) ou sua seqüência de filamentos complementar, e pelo menos 114 seqüências de elementos MAR foram identificadas na seqüência de DNA ARM2 (SEQ ID NO: 2) sua seqüência de filamentos complementar.

Tabela 2. Localização das Seqüências de MAR nas Seqüências de DNA ARM1

e AMR2

Elemento Localização Localização da MAR na Seqüência na Seqüência ARM1 ARM2 (bases de SEQ ID (bases de SEQ ID NO: 2)* NO: 1 )* Box -A 1756-1764, 1939- 52-60, 69-77, 79-87, 244-252 1947, (complementar), 340-348, 1975-1983, 2062- (complementar), 446-454 2070, (complementar), 481-489 2072-2080, 2079- (complementar), 484-492 2087, (complementar), 627-635, 631-639, 2216-2224, 2280- 664-672 (complementar), 734-742, 737- 2288 745, 741-749, 811-819 (complementar), 821-829, 833-841, 840-848, 907-915 (complementar), 925-933 (complemen¬ tar), 942-950 (complementar), 1104- 1112 (complementar), 1186-1194 (complementar), 1186-1213 (cluster, complementar), 1262-1270 (comple¬ mentar),1391-1399, 1409-1417, 1413- 1421, 1421-1429, 1441-1449 (comple¬ mentar), 1531-1539 (complementar), 1711-1719 (complementar), 1715-1723 (complementar), 1740-1748, 181 Ο¬ Ι 818, 1817-1825, 1844-1852, 1848- 1856, 1862-1870, 2036-2044 (comple¬ mentar), 2040-2048 (complementar), 2052-2060, 2100-2108 (complementar), 2107-2115 (complementar), 2113-2121, 2118-2126, 2122-2130, 2191-2199 (complementar), 2261-2269 (comple¬ mentar), 287-2295 Box-T 114-145 (cluster), 483-492, 631-640, 734-743, 806-815, 1740-1752(cluster), 925-934, 1198-1207, 1843-1852 200-2011 (cluster), 2062-2087 (clus¬ ter), MRS 130-151, 77-97, 401-421, 752-772, 1197-1213 1969-1989, 2054-2074, 2266-2286 ARS 121-131, 2062- 1443-1453 2072, 2079-2089, 2126-2136, 2257- 2267 BUR 1877-1885, 2005- 77-85, 255-263, 723-731, 1412-1420 2013, 2063-2071, 2098-2106 (com¬ plementar), 2281- 2289 Encurvado 106-131, 2011- 437-442, 466-471, 530-535, 616-621, 2016, 2293-2298 627-632, 2151-2156 90% AT 106-125, 126-145 64-83, 64-90 (cluster), 243-263 (clus¬ ter), 400-420, 613-645 (cluster), 698- 717, 722-774 (clusters), 805-845 (clus¬ ters), 1185-1214 (cluster), 1407-1431 (cluster), 2104-2136 (cluster) Torcido 860-871, 1761- 439-450, 671-682, 1124-1135, 1503- 1772 1514, 1967-1978, 2029-2031, 2058- 2069 Sítio 598-612, 1365- 720-734, 819-833 (complementar), de Ligação de 1382, 2042-2056 1251-1265, 1407-1421 (complementar), Topoisomerase (complementar) 1415-1429 (complementar), 1418-1432, Il 1434-1448 (complementar), 1758-1775, 1981-1995, 2202-2216 (complementar) Rico em TG 252-258 (comple¬ 928-936, 1842-1848 (complementar) mentar) Motivo dispen- 1880-1885, 2021- 284-289, 415-420, 788-793, 789-794, sador 2026, 2064-2069, 825-830, 826-831, 909-914, 1121-1126, de DNA 2066-2071 1421-1426, 1440-1446, 2208-2213, 2209-2214 *Sequência ARM1 (SEQ ID NO: 1) ou seqüência ARM2 (SEQ ID NO: 2); “complementar” = seqüência de filamento complementar; “cluster” = mais do que uma cópia de elemento de MAR indicada em seqüência especificada.

Os resultados da análise de seqüência de MAR (que incluiu análise de na filamento complementar) de ARM1 e ARM2 na Tabela 2 indica que as várias MARs são predominantemente clusterizadas na porção terminal 3’ de ARM1 (SEQ ID NO:1) e na porção 5’ e porção 3’ (ARM2 (SEQ ID NO: 2). A ARM1 possui menos destes sítios de MAR do que a ARM2. Além disso, a maioria das seqüências MAR em ARM1 estão na região 3’ da seqüência, apesar de ambas as regiões 3’ e 5’ de ARM2 serem habitadas por seqüências MAR.

Exemplo 2. Protocolos gerais para estudos da influência dos rEVEs de ARM1 e ARM2 nos níveis de expressão de proteínas recombinantes.

Células para estudos de expressão

A linhagem celular CHO DUXB11 é uma linhagem celular CHO que é deficiente 10 na expressão de redutase dihidrofolato (DHFR ) (vide, Urlaub, G. e Chasin, L.A., proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.,77: 4216-4222 (1980)). O fenótipo DHFR" desta linhagem celular permite o uso de um protocolo do sistema metotrexato- redutase dihidrofolato (DHFRMTX) padrão para ampliar o número de cópias de um vetor de expressão que foi transfectado nessas células (vide, por exemplo, Kaufman1 R.J., In Genetic Enoineerinq: 15 Principies and Methods (Ed. J.K. Setlow), volume 9, página 155 (Plenum Publishing, New York, 1987)).

Vetores de expressão contendo seqüências de rEVE de ARM1 e ARM2

A Figura 1 proporciona um diagrama esquemático de vetor de expressão de plasmídeo pA205. A Figura 2 proporciona um diagrama esquemático de vetor de ex20 pressão de plasmídeo pA205 genômico no qual os genes que codificam as cadeias leve e pesada para adalimumab são flaqueados pelas ARM1 e AMR2 tal que uma seqüência de ARM1 está localizada a montante do gene para cadeia pesada de adalimumab e uma seqüência de ARM2 está localizada a jusante do gene para a cadeia leve de adalimumab. A Figura 3 proporciona um diagrama esquemático do vetor de 25 expressão de plasmídeo pA205 A1 no qual a seqüência ARM1 está localizada a montante do gene para a cadeia pesada de adalimumab. A Figura 4 proporciona um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205 A2 no qual a seqüência ARM2 está localizada a jusante do gene para a cadeia leve de adalimumab.

A Figura 5 proporciona um diagrama esquemático do vetor de expressão de 30 plasmídeo pCHOEL246GGhum, que contém os genes para as cadeias leve e pesada de um anticorpo anti-EL-selectina de humano. A Figura 6 proporciona um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo PA-Gen-EL-SeIectina no qual os genes que codificam as cadeias leve e pesada para o anticorpo anti-EL-selectina são flaqueados pelas seqüências ARM1 e AMR2 tal que uma seqüência de ARM1 está Iocali35 zada a montante do gene para cadeia pesada de anticorpo e uma seqüência de ARM2 está localizada a jusante do gene para a cadeia leve de anticorpo.

A Figura 7 proporciona um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205-eGFP, que contém o gene para a Proteína Verde Fluorescente Melhorada (eGFP). A Figura 8 proporciona um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205G-eGFP no qual o gene que codifica a Proteína Verde Fluorescente melhorada é flanqueado pelas seqüências ARM1 e ARM2 tal que a se5 quência de ARM1 está localizada a montante do gene de eGFP e a seqüência de ARM2 está localizada a jusante dò gene eGFP.

A Figura 9 proporciona um diagrama esquemático do vetor de expressão de plasmídeo pA205A2-Spe-trunc, que é essencialmente idêntico ao vetor de expressão pA205A2 mostrado na Figura 4, exceto que a seqüência ARM2 foi substituída com uma 10 variante ARM2 truncada, “A2 (bp 1-1086)”, que possui a seqüência de base de ácido nucléico de bases 1-1086 de SEQ ID NO: 2 como resultado da digestão de DNA ARM2 com endonuclease de restrição Spel. A Figura 10 proporciona um diagrama esquemático de vetor de expressão de plasmídeo pA205A2-Swa-trunc que é essencialmente idêntico ao vetor de expressão pA205A2 mostrado na Figura 4 que a seqüência ARM2 15 foi substituída por uma variante ARM2 truncada, “A2 (BP 1-461)”, que possui a seqüência de base de ácido nucléico de bases 1-461 de SEQ ID NO: 2 como resultado da digestão de DNA ARM2 com endonuclease de restrição Swal.

Meios de Cultura

O σΜΕΜ é o meio mínimo essencial, α meio (GIBCO®, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia).

Cultivo de células e transfeccões

Três placas com cultura de tecido com 10 cm por transfecção foram semeadas com 1 x 106 B3.2 de células parenterais de CHO DUXB11 cada uma em 10 ml_ de aMEM suplementado com 5% de FBS dializado e H/T (GIBCO). Estas células foram 25 transfectadas dezoito horas (18 h) depois de acordo com o protocolo de transfecção por fosfato de cálcio descrito em Currebt protocols in Molecular Biology, (Ausubel, F.V.,Brent, R., Moore, D.M., Kingston, R.E., Seidman, J.G., Smith, J.A., e K. Struhl Eds), (Wiley Interscience, New York, 1990)) com várias modificações como indicado abaixo. O meio de cultivo foi removido das placas de cultura por aspiração e 9 mL de 30 meio Ham’s F12 (Invitrogen) foi adicionado a cada placa. As placas foram incubadas a 37°C por duas horas antes da transfecção

Protocolo de transfecção por fosfato de cálcio

Setenta e cinco microgramas (75 Mg) de DNA foram dissolvidos em 1,35 mL de água em um tubo cônico de 50 mL. Cento e cinqüenta microlitros (150 pL) de CaCI2 2,5 M foram adicionados, e esta mistura de DNA-cálcio foi adicionada gota a gota a 1,5 mL de HeBES 2X (salina tamponada de HEPES) em um tubo cônico de 50 mL. O HeBES foi borbulhado com uma pipeta enquanto a mistura DNA-cálcio era adicionada com uma pipeta Pasteur. A mistura foi misturada em vortex por 5 segundos e incubada a temperatura ambiente por 20 minutos. Um milímetro de mistura (1 mL) DNA-cálcio foi distribuída uniformemente sobre cada prato de cultura de células aderentes, cultivada e preparada para a transfecção em meio F12 como descrito acima, e as culturas foram 5 então incubadas a 37°C por quatro horas. Após a incubação, as placas foram aspiradas, e 2 mL de dimetilssulfóxido a 10% (DMSO) em meio F12 foram adicionados em cada placa (tratamento de choque com DMSO). O choque com DMSO continuou por um minuto após o que o DMSO foi diluído pela adição de 5 mL de PBS (salina tamponada de fosfato) a cada placa. As placas foram aspiradas e lavadas mais duas vezes 10 em PBS. Dez (10) mL de aMEM/5% FBS/HT foi adicionado, e as placas foram incubadas a 37°C durante a noite.

Semeadura de células transfectadas em placas 96-pocos e amplificação com metotrexato (MTX^

No dia seguinte as placas foram semeadas em placas de 96-poços como se15 guem: As células de todas as placas de 10 cm foram colhidas pela digestão de tripsina e ressuspendidas em uma densidade de 2000 células /mL em ctMEM/5%FBS. Placas de noventa e seis 96-poços foram semeadas a 10 mL/placa, 100 μί/ροςο. O meio foi mudado nas placas de 96-poços uma semana depois, duas semanas depois e novamente cinco dias após aquela. O meio de aMEM/5%FBS usado foi seletivo para células 20 que expressam DHFR.

Dois dias depois da última mudança do meio, os sobrenadantes da cultura foram diluídos de 1:40 e testados usando um ELISA específico para cadeia IgG gama de humano para detectar a expressão de adalimumab ou anticorpo anti-EL-selectina. Os clones que geraram os sinais mais altos de ELISA foram transferidos das placas de 96- 25 poços para placas de 12-poços em 2 mL/poço de aMEM/5%FBS. Quando confluentes (aproximadamente 2-5 dias depois), estes foram testados novamente e os clones foram divididos no mesmo meio + MTX 20 nM para amplificação. As células foram inicialmente selecionadas em c/MEM/5%FBS e 20 nM de MTX em um placa de cultura de tecido de 12-poços. Estas células, após seleção inicial neste nível de MTX foram passadas 30 pelo menos mais duas vezes em meio de cultivo contendo MTX 20 nM por um período médio de dezoito dias. As linhagens celulares foram ampliadas então para MTX 100 nM. Durante este período de cultura, a produtividade de adalimumab (anticorpo antiTNF-σ humano) ou anti-EL-selectina das culturas aumentou. Após a seleção no nível de MTX 100 nM, as linhagens celulares foram passadas pelo menos mais duas mais 35 duas vezes em meio de cultivo contendo MTX 100 nM por um período médio de dezoito (18) dias. Onde indicado, as linhagens celulares foram adicionalmente ampliadas para MTX 500 nM. Após seleção no nível de MTX 500 nM, as linhagens celulares foram passadas pelo menos mais duas vezes no meio de cultivo contendo MTX 500 nM por um período médio de dezoito (18) dias.

Culturas de células de CHO transfectadas carregando vetores de expressão que compreendem uma seqüência de ácido nucléico ARM1 (SEQ ID NO: 1), uma se5 quência de ácido nucléico ARM2 (SEQ ID NO: 2), ou uma combinação de seqüências ARM1 e ARM2, se adaptam melhor, isto é, possuem maior taxa de crescimento e/ou sobrevivência, na presença de metotrexato comparado com células de CHO transfectadas com os mesmos vetores de expressão que não apresentam estas seqüências rEVE.

Exemplo 3. Efeito das seqüências ARM1 e ARM2 nos níveis de expressão de

anti-TNF-σ em células de CHO transfectadas.

Neste estudo, o efeito das seqüências ARM1 e ARM2 na expressão de um anticorpo anti-TNF-σ humano (adalimumab) em células de CHO transfectadas de forma estável foi examinado. Os níveis de expressão de adalimumab foram comparados em 15 células de CHO transfectadas de forma estável com vetor de expressão pA205 (nenhuma seqüência ARM), pA205 Genômico (contendo a ARM1 e a ARM2), pA205A1 (contendo ARM1) ou pA205A2 (contendo ARM2). A Tabela 3 mostra o nível médio de produção de adalimumab em culturas aderentes dos três principais produtores de clones a partir de cada transfecção de vetor no nível de amplificação indicado (concentra20 ção de metotrexato, “MTX”).

Tabela 3. Nível de Expressão de Adalimumab em Células de CHO Transfectadas de Forma Estável

Vetor MTX 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM pA205 1,57 pg/mL 4,20 pg/mL 5,53 pg/mL pA205Genômico 4,60 pg/mL 14,80 pg/mL 21,03 pg/mL pA205A1 3,13 pg/mL 9,90 pg/mL 17,3 pg/mL pA205A2 4,53 pg/mL 24,23 pg/mL 20,8 pg/mL ados da Tabela 3 indicam que as seqüências ARM1 e ARM mente ou em combinação, melhoraram o nível de expressão de adalimumab compara25 do com aquele visto nas células transfectadas com um vetor sem seqüências ARM (pA205). Em toda aparte, a ARM2 individualmente (pA205A2) proporcionou o maior nível de expressão melhorada com relação a todos os outros transfectantes, ao passo que a ARM1 individualmente (pA205A1) proporcionou o menor dos níveis melhorados de expressão. Os dados mostram que uma molécula de ácido nucléico isolada que 30 possui a seqüência ARM1 (SEQ ID NO: 1) ou a seqüência ARM2 (SEQ ID NO: 2) é um elemento de vetor de expressão recombinante representativo (rEVE), que quando inserido em um vetor de expressão pode melhorar a expressão de uma proteína recombinante codificada pelo, e expressa a partir do, vetor de expressão.

Os níveis de expressão de adalimumab por clones individuais das transfecções dos vetores mencionados acima também foram comparados após 1 semana e 4 semanas em culturas de suspensão na ausência de amplificação com metotrexato. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Nível de Expressão de Adalimumab em Culturas de Suspensão de Clones Individuais de Células de CHO transfectadas após a semana 1 e 4 na Ausência de metotrexato

Vetor Clone # Semana 1 Semana 4 (pg/mL) (pg/mL) pA205 19-3 10,8 8,1 pA205Genômico 7-5 52,6 46,0 14-6 19,9 16,8 pA205A1 1-4 15,5 6,9 4-2 27,8 15,3 6-3 76,8 43,6 3-7 17,3 12,6 pA205A2 13-1 97,7 107,8 9-7 63,3 64,9 7-2 42,3 60,2 5-3 180,3 153,0 Os dados da Tabela 4 mostram que a incorporação de ARM2 em pA205 sem a ARM1 (pA205A2) aumenta a estabilidade dos níveis de expressão de adalimumab com o passar do tempo. Em particular, com a ARM1 e a ARM2 presentes (pA205Genômico) ou ARM1 individualmente (pA205A1), um nível melhorado de expressão de adalimumab foi inicialmente observado nas culturas, mas aquele nível pode cair rapidamente em questão de semanas para níveis muito baixos (vide, Tabela 4). Por outro lado, nas culturas de células que expressam adalimumab na presença de ARM2 individualmente (pA205A2), o nível melhorado de expressão de adalimumab foi mantido de forma estável em três das quatro culturas no curso de um período de quatro semanas. Desse modo, a ARM2 pode manter de forma estável uma elevação significante no nível de expressão de adalimumab em culturas de suspensão de células de CHO transfectadas.

Exemplo 4. Efeito das seqüências ARM1 e ARM2 nos níveis de expressão de anticorpo anti-EL-selectina em células de CHO transfectadas.

Neste estudo, o efeito das seqüências ARM1 e ARM2 nos níveis de expressão de um anticorpo anti-EL-selectina de humano (que liga selectinas L- e E-) em células de CHO transfectadas de forma estável foi examinado. Os níveis de expressão destes anticorpos anti-selectina foram comparados em células de CHO transfectadas de forma estável com vetor de expressão pCHOEL246GGhum (nenhuma seqüência ARM) ou com vetor de expressão pA-Gen-EL-Selectina (contendo a ARM1 e a ARM2). A Tabela 5 mostra o nível médio de produção de anticorpo anti-selectina em culturas aderentes dos três principais produtores de clones a partir de cada transfecção de vetor no nível de amplificação indicado (concentração de metotrexato, “MTX”).

Vetor MTX O nM MTX 20 nM MTX100 nM MTX 500 nM pCHOEL246GGhum 7,93 pg/mL 15,47 pg/mL 17,27 pg/mL 22,30 pg/mL pA-Gen-EL-Selectina 6,27 pg/mL 19,87 pg/mL 26,63 pg/mL 44,13 pg/mL Os dados da Tabela 5 mostram que as seqüências ARM1 e ARM2, (pA-GenEL-Selectina) foram efetivas na elevação do nível de expressão de anticorpo anti-ELselectina em culturas ampliadas com metotrexato de células de CHO transfectadas de forma estável.

Exemplo 5. Efeito das seqüências ARM1 e ARM2 nos níveis de expressão de Proteína Verde Fluorescente melhorada (eGFP) em células de CHO transfectadas.

Construtos contendo um gene que codifica Proteína Verde Fluorescente me15 Ihorada (eGFP) foram transfectados em células de CHO como descrito acima com a exceção de que as células foram co-transfectadas com pcDNA3,1-hygro para proporcionar um marcador selecionável, isto é, resistência a higromicina, para transfecções estáveis. A expressão de vetor peGFP proporciona um controle positivo para a expressão de eGFP sobre o controle transcricional de um promotor CMV. O plasmídeo 20 pA205-eGFP contém o gene eGFP no vetor de expressão pA205 sem as seqüências ARM1 ou ARM2 (Figura 7). O plasmídeo pA205Gen-eGFP (Figura 8) contém tanto a ARM1 quanto a ARM2 flanqueando o gene que codifica eGFP. Não existe nenhum gene de seleção DHFR em qualquer destes plasmídeos. Consequentemente, nenhuma etapa de amplificação com metotrexato-DHFR foi realizada. Os transfectantes foram 25 selecionados com higromicina em uma concentração de 400 pg/mL por 2 semanas, dividindo quando necessário e,a seguir, classificados por FACS para determinar níveis de os expressão. As células foram classificadas em pools de forma original, e as células de expressão foram cultivadas por mais duas semanas e, a seguir, foram reclassificadas.

Tabela 6. Nível de Expressão de eGFP em Células CHO Transfectadas de

forma Estável

Vetor Unidades de Fluorescência do Meio peGFP (controle positivo) 239,03 pA205-eGFP 17,36 pA205Gen-EGFP

104,86

Os dados da Tabela 6 indica que as seqüências ARM1 e ARM2 foram efetivas no melhoramento de forma significante do nível de expressão de eGFP nas células de CHO transfectadas comparados com o nível de expressão em células transfectadas com o mesmo vetor de expressão eGFP, mas sem seqüências ARM (pA205-eGFP).

Exemplo 6. Efeito dos mutantes e deleção de ARM2 nos níveis de expressão

de Adalimumab em células de CHO transfectadas.

A região terminal 3’ da seqüência ARM2 (SEQ ID NO: 2) foi truncada em vetor pA205A2 para qualquer sítio de clivagem Spel (na base 1086 de SEQ ID NO: 2) ou sítio de clivagem Swal (na base 461 de SEQ ID NO: 2) para criar, respectivamente, 10 pA205A2-Spe-trunc (contendo a seqüência de bases 1-1086 de SEQ ID NO: 2) e A205A2-Swa-trunc (contendo a seqüência de bases 1-461 de SEQ ID NO: 2). Os plasmídeos resultantes foram transfectados em células CHO como descrito acima e ampliados a MTX 20nM. A Tabela 7 mostra o nível médio de expressão em culturas aderentes dos três principais clones produtores de clones a partir de cada transfecção em 15 cada nível de transfecção.

Tabela 7. Nível de Expressão Adalimumab em Células de CHO Transfectadas de forma estável

Vetor MTX 0 nM MTX 20 nM pA205 1.80 pg/mL 1,57 pg/mL pA205A2 6,10 pg/mL 15,73 pg/mL pA205A2-Spe-trunc 3,57 pg/mL 3,00 pg/mL pA205A2-Swa-trunc 0,83 pg/mL 0,90 pg/mL Os dados da Tabela 7 mostram que as células de CHO transfectadas com vetor de expressão pA205A2-Spe-trunc, que contém os pares de base 1086 do terminal 5’ de DNA ARM2, produziram adalimumab em um nível menor de expressão melhorada comparadas com as células de CHO transfectada com o vetor pA205A2. Surpreendentemente, as células transfectadas com vetor de expressão pA205A2-Swa-trunc, que contém os pares de base 461 do terminal 5’ do DNA ARM2, produziram adalimumab com os mesmos níveis menores de expressão do que em células transfectadas com pA205, que não contém seqüências ARM. Os dados da Tabela 7 indicam que as regiões deletadas a partir do terminal 3’ do DNA ARM2 são de especial interesse para a expressão melhorada de proteínas recombinantes em células hospedeiras. Além disso, a presença de um par de bases relativamente pequeno, isto é, par de base 461, fragmento de terminal 5’ de DNA ARM2, individualmente, realmente aparenta reduzir a expressão de produto de gene recombinante nas células hospedeiras transfectadas e podem ser particularmente úteis para reduzir ou silenciar substancialmente a expressão de um produto de gene recombinante. Tal aplicação pode ser desejada quando a expressão de um produto de gene pode ser tóxico ou, de outro modo, indesejado em uma célula hospedeira, por exemplo, sob certas condições de cultura.

Exemplo 7. Níveis dè Expressão de transfectantes individuais a partir de estudos precedentes.

As tabelas mostradas abaixo fornecem o nível de expressão de proteínas recombinantes produzidas por clones individuais transfectados gerados nos estudos precedentes.

Tabela 8. Níveis de expressão de Adalimumab em Células de CHO Transfectadas com pA205

Clone# pA205 MTX 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX 500 nM 1 3,9 10,4 15,4 14.1 2 2,8 6,2 12,9 8,2 3 2,50 4,2 10,1 2,9 4 2,1 3,8 4,2 1,5 5 1,7 2,7 2,9 0,3 6 1,4 2,2 2,6 7 1,4 1,7 2 8 1,3 1,6 1,7 9 1,3 1,6 1,4 10 1,2 1,6 1,4 11 1,10 1,4 1 12 1,10 1,3 0,8 13 1 1,3 0,5 14 1,00 1,3 0 15 0.9 1,2 16 0,90 1,2 17 0,9 1,1 18 0,9 1,1 19 0,9 1,01 20 0,9 0,9 21 0,80 0,80 22 0,8 0,8 23 0,8 0,7 24 0,70 0,70 25 0,70 0,60 26 0,70 0,60 27 0,7 0,3 28 0,5 0,1 29 0.5 0,09 0,5 0,08 31 0,5 0,07 32 0,5 0 33 0,5 0 34 0,4 0 0,4 0 36 0,40 0 37 0,40 0 38 0,40 0 39 0,40 0 40 0,4 0 41 0,4 0 42 0,3 0 43 0,3 44 0,3 45 0,3 46 0,3 47 0,2 48 0,20 49 0,2 50 0,2 51 0,1 52 0,1 53 0,1 54 0,1 55 0,10 56 0,10 57 0,10 58 0,1 59 0,08 60 0,05 61 0,05 62 0,03 63 0,03 64 0,03 65 0,02 66 0,01 67 0,01 68 0,01 69 0,01 70 0,01 71 0,009 72 0,007 73 0,007 74 0,007 75 0,006 76 0 77 0 78 0 Tabela 9. Níveis de expressão de Adalimumab em Células de CHO Transfec

tadas com pA205Genômico

Clone# pA205Genômico MTX 0 nM MTX 20 n M MTX 100 nM MTX 500 nM 1 9,3 19,1 61,0 40,6 2 6,9 16,5 59,7 40,2 3 6,5 15,1 52,0 28,6 4 5,70 13,6 36,0 23,9 5 5,6 13,2 25,9 6 4,6 10,7 20,7 7 4,3 10,3 19,6 8 4,1 9,8 17,6 9 4,10 9,7 16,3 10 4,00 9,5 15,6 11 3,9 8,9 11,4 12 3,6 7,6 9,3 13 3,5 6,9 8,1 14 3,4 6,4 8 15 3,3 6 5,9 16 2,9 4,5 0,1 17 2,9 3,1 0,04 18 2,70 2,5 19 2,60 2,4 2,5 1,6 21 2,4 1,4 22 2,2 1,1 23 2,2 0,05 24 2,2 0 2,2 0 26 2 27 2 28 1,9 29 1,9 1,8 31 1,8 32 1,7 33 1,7 34 1,6 1,6 36 1,6 37 1,50 38 1,4 39 1,4 40 1,4 41 1,3 42 1,3 43 1,30 44 1,30 45 1,2 46 1,1 47 1,1 48 1,1 49 1 50 1,00 51 0,80 52 0,7 53 0,7 54 0,7 55 0,6 56 0,6 57 0,5 58 0,5 59 0,5 60 0,5 61 0,5 62 0,5 63 0,4 64 0,4 65 0,4 66 0,3 67 0,3 68 0,3 69 0,3 70 0,2 71 0,2 72 0,2 73 0,2 74 0,20 75 0,1 76 0,1 77 0,04 78 0 Tabela 10. Níveis de expressão c e Adalimuma b em Células c e CHO Transfe tadas com dA205A1

Clone# pA205A1 MTX 0 nM MTX 20 nM MTX 100 nM MTX 500 nM 1 4,50 11,5 18,9 2 2,50 9,2 17,4 3 2,40 9 15,6 4 2,10 7,4 11,4 5 2,00 6,9 10,8 6 2,00 5,8 10,6 7 1,90 5,6 8,6 8 1,40 5,4 7,8 9 1,40 5,3 7,1 1,20 4,8 5,9 11 1,20 4,2 5,5 12 0,90 3,6 3,2 13 0,80 2,7 0,6 14 0,70 1,8 0,5 0,50 1,3 16 0,40 0,60 17 0,30 0,60 18 0,07 0,05 19 0,00 0,03 0,00 0 Tabela 11. Níveis de expressão de Adalimumab erri Células de CHO Transfectadas com pA205A2

Clone# pA205A2 MTX 0 nM MTX 20 n M MTX 100 nM MTX 500 nM 1 9,4 32,4 26,8 2 6,0 21,5 17,9 3 4,80 21,2 17,1 4 4,60 19,1 15 5 4,20 18,6 13,2 6 3,70 16,6 12 7 3,50 13,9 7,6 8 3,50 13,4 6,5 9 3,20 12,3 5,2 10 3,0 11,4 4,8 11 2,8 11,2 4,6 12 2,7 10,4 4,2 13 2,60 9,6 2,6 14 2,60 9,4 2 15 2,50 9,2 1,6 16 2,5 8,5 0,01 17 2,40 7,5 18 2,4 6,7 19 2,30 5,3 20 2,30 5 21 2,3 4,9 22 2,3 4,2 23 2,20 4,2 24 1,90 3,6 25 1,8 2,6 26 1,8 2,4 27 1,70 2,3 28 1,6 1,8 29 1,5 1,6 30 1,40 1,5 31 0,8 1,2 32 0,8 1,1 33 0,7 0,8 34 0,6 0,7 0,6 0,3 36 0,5 0,3 37 0,5 0,05 38 0,40 0 39 0,3 0 40 0,2 0 41 0,1 42 0,1 43 0,07 44 0,05 45 0,05 46 0,00 47 0 Tabela 12. Níveis de expressão de Adalimumab em Células de CHO Transfectadas com pA205A2-Spe-trunc

Clone# pA205A2-Spe-trunc MTX 0 nM MTX 20 nM 1 5,5 4,7 2 3,1 2,3 3 2,1 2,0 4 2 2,0 5 1,3 1,9 6 1,2 1,8 7 1,1 1,4 8 1,1 1,2 9 1 1„0 10 0,9 0,8 11 0,9 0,4 12 0,9 0,2 13 0,8 0 14 0,7 0 15 0,7 0 16 0,7 17 0,6 18 0,5 19 0,4 20 0,4 21 0,4 22 0,4 23 0,4 24 0,3 25. 0,2 26 0,2 Tabela 13. Níveis de expressão de Adalimumab em Células de CHO Transfectadas com pA205A2-Swa-trunc

Clone# pA205A2-Swa-trunc MTX 0 nM MTX 20 nM 1 1,1 1,1 2 0,7 0,8 3 0,7 0,8 4 0,6 0,7 5 0,6 0,5 6 0,5 0,4 7 0,5 0,4 8 0,4 0,4 9 0,4 0,4 10 0,3 0,4 11 0,3 0,4 12 0,3 0,2 13 0,3 0,05 14 0,3 0 15 0,3 0 16 0,3 0 17 0,3 0 18 0,2 19 0,2 20 0,2 21 0,2 22 0,2 23 0,2 24 0,1 25 0,1 26 0,1 27 0,08 28 0 Ta

jela 14. Níveis de expressão de Anticorpo anti-EL-Selectina em Células de

CHO Transfectadas com pCHOEL246GGhum Clone# MTX MTX MTX MTX pCHOEL246GGhum 0 nM 20 nM 100 nM 500 nM 1 14,4 24,4 22,9 32,8 2 5,5 11,7 15,4 20,2 3 3,9 10,3 13,5 13,0 4 2,3 8,5 9,8 10,5 5 2,3 7,1 8,5 8,2 6 2,3 6,7 6,2 7,7 7 1,7 6,5 5,4 7,4 8 1,6 5,8 4,4 5,4 9 1,6 4,9 4,0 5,2 10 1,6 3,7 3,6 5,0 11 1,6 3,6 2,2 3,3 12 1,5 3,2 2,0 1,3 13 1,4 2,3 1,8 14 1,4 2,3 1,4 15 1,4 2,2 16 1,3 2,0 17 1,2 1,8 18 1,1 1,3 19 1,1 0,8 20 0,9 21 0,8 22 0,5 23 0,4 24 0,3 25 0,2 Tabela 15. Níveis de expressão de Anticorpo anti-EL-Selectina em Células de CHO Transfectadas com PA-Gen-EL-SeIectina

Clone# MTX MTX MTX MTX PA-Gen-EL-SeIeetina 0 nM 20 nM 100 nM 500 nM 1 9,1 30,5 30,0 62,5 2 5,6 15,0 27,1 35,5 3 4,1 14,1 22,8 34,4 4 3,4 13,4 22,6 31,3 5 3,4 13,4 19,4 30,1 6 3,2 9,6 16,3 29,9 7 3,2 6,4 13,0 26,9 8 3,1 6,2 12,8 25,1 9 2,9 5,7 12,6 19,9 10 2,8 5,6 12,1 17,9 11 2,8 5,2 11,7 14,4 12 2,7 5,1 9,0 12,5 13 2,3 4,5 8,1 8,6 14 2,1 4,5 7,9 3,3 15 2,0 4,4 6,5 2,8 16 1,8 4,1 6,4 0,7 17 1,8 4,0 5,7 18 1,6 3,0 19 1,6 3,8 20 1,4 3,4 21 1,3 3,4 22 1,1 3,3 23 1,1 2,7 24 1,1 2,6 25 1,0 2,6 26 1,0 2,4 27 0,9 2,3 28 0,9 2,1 29 0,8 30 0,8 31 0,7 32 0,6 33 0,2 34 0,1 Exemplo 8. Melhoramen to da Expressão de an ticorpo anti-IL-13. Este estudo mostra o melhoramento mediado por rEVE da expressão de um anticorpo anti-IL-13 em células de mamíferos transfectadas de forma estável em cultura comparada com células transfectadas com a expressão sem rEVE.

Molécula de DNA que codificam as cadeias leve e pesada de um anticorpo

monoclonal anti-IL-13 humanizado, que possui isotipo IgGYl de humano, (vide, documento de patente U.S.N0 de Série 11/899,819, incorporado aqui como referência) foram inseridas no vetor de expressão de plasmídeo pBJ, um plasmídeo de expressão amplificável com MTX-DHFR, usando métodos padrões para gerar o plasmídeo de expressão pBJ-13C5,5 (plasmídeo de expressão de origem). Um polinucleotídeo de rEVE compreendendo a seqüência ARM2 (SSEQ ID NO: 2) foi então inserido no pBJ-13C5.5 para gerar o plasmídeo pA2-13C5.5 de expressão contendo o rEVE (plasmídeo de expressão de rEVE ARM2).

Células de CHO foram transfectadas com o plasmídeo de expressão de origem pBJ-13C5.5 ou com o plasmídeo de expressão pA2-13C5.5 de rEVE contendo ARM2 seguindo o protocolo de transfecção geral descritos nos exemplos anteriores para obter células de CHO transfectadas de forma estável. Com 24 horas após a transfecção, as células de cada transfecção foram semeadas em quarenta e oito (48) placas de cultura de 96-poços (200células/poço). O meio de cultura dos poços individuais foram exibidos por ELISA para a expressão de IgG humano. As densidades óticas foram levemente maiores em culturas (poços) de células transfectadas com o plasmídeo de expressão rEVE ARM2 do que em células transfectadas com o plasmídeo de expressão de origem. Uma média de 74 colônias (poços) por placa de cultura sobreviveu ao processo de seleção quando as células foram transfectadas com plasmídeo pA2-13C5.5 de rEVE ARM2 comparado com uma média de 68 colônias por placa para células transfectadas com o plasmídeo pBJ-13C5.5 original. Quinze (15) clones transfectados de forma estável a partir de cada transfecção foram então sujeitos a amplificação com DHFR-metotrexato (MTX).

Antes da amplificação, o nível médio de expressão de anticorpo anti-IL-13 obtido a partir de clones transfectantes de plasmídeo rEVE ARM2 foi duas vezes maior que o nível médio de expressão a partir de clones transfectantes de plasmídeo de origem. A expressão de anticorpo foi então ampliada por qualquer dos dois protocolos. 25 Usando o protocolo básico para a amplificação com DHFR-MTX como descrito no Éxemplo 2, acima, os clones foram primeiramente sujeitos a seleção em uma concentração de MTX 20 nM, seguido por seleção adicional com MTX 100 nM sem uma seleção interveniente em uma concentração de MTX intermediário. A Tabela 16, abaixo, mostra o nível médio de produção de anticorpo anti-IL-13 em culturas de três principais clones 30 produtores a partir de cada transfecção após duas passagens em meio contendo o nível indicado de amplificação (concentração de metotrexato, “MTX”).

Tabela 16. Nível de Anticorpo Anti-IL-13 Humanizado em Células de CHO Transfectadas

Vetor de Expressão MTX 0 nM MTX 20 n M MTX 100 nM pBJ-13C5.5 2,63 pg/mL 2,00 pg/mL 3,04 pg/mL pBJ-13C5.5 2,63 pg/mL N.A. 1,72 pg/mL pA2-13C5.5 4,35 pg/mL 5,85 pg/mL 14,94 pg/mL pA2-13C5.5 4,35 pg/mL N.A. 14,33 pg/mL Ν.Α. = não aplicável, não é parte do protocolo de amplificação.

Os dados da Tabela 16 claramente mostram que o rEVE ARM2 melhorou o nível de expressão de anticorpo anti-IL-13 humanizado por aproximadamente 3 vezes a 5 vezes comparado com o nível de expressão obtido a partir de transfectantes que car5 regam os plasmídeos de expressão de origem sem DNA rEVE ARM2. Além disso, um subclone de um transfectante de plasmídeo de expressão rEVE ARM2 expressou o anticorpo anti-IL-13 humanizado em um nível tão alto quanto 95 pg/mL e uma produtividade específica de 21,74 pg/célula/dia quando cultivado em um nível de amplificaação de MTX 100 nM.

Os níveis ampliados de expressão do anticorpo anti-IL-13 por clones transfec

tados com plasmídeo de expressão rEVE ARM2 foram prontamente mantidos por pelo três semanas quando cultivadas sob seleção de MTX.

Exemplo 9. Efeito de moléculas de polinucleotídeos de rEVE ARM2 e ARM1 na expressão de adalimumab em um sistema de expressão transiente.

Este estudo foi designado para determinar se as moléculas de polinucleotídeos

de rEVE melhoram os níveis de expressão de proteínas recombinantes em um sistema de expressão transiente

Células HEK 293 foram transfectadas com vetores de plasmídeos de expressão pA205, pA205Genômico, pA205A1, pA205A2, pA205A2-Spec-trunc e pA205A2- 20 Swa-trunc. As células HEK 293 cultivadas em Meio de Expressão Freestyle 293 (GIBCO®, Invitrogen, Carlsbad, CA) foram transfectadas com DNAs de plasmídeo complexos com polietilenimina de acordo com as condições publicadas (Durocher et al., Nucleic Acids Res., 30: E9). Nenhuma seleção para integração de vetor foi realizada. As células foram cultivadas por sete dias após a transfecção e alíquotas de sobre25 nadante de cultura foram testadas a concentração de adalimumab como descrito acima. Os resultados de três transfecções são mostrados na Tabela 17. Os níveis de expressão foram corridos em triplicata para a terceira transfecção.

Tabela 17. Nível* de Adalimumab em Células HEK 293 Transfectadas

Transfecção pA205 pA205 pA205A1 pA205A2 pA205A2- pA205A2- Genômic Spec-trunc Swa-trunc 1 2,1 5,4 5,4 3,3 2 5,3 20,3 20,3 9,9 3 4,3 11,9 11,9 10,2 2,2 1,2 4,1 15,7 15,7 2,3 1,3 3,0 14,2 14,2 2,3 1,0 *pg/mL de adalimumab Os resultados da Tabela 17mostram que as seqüências ARM1 e ARM2 podem melhorar o nível de expressão de adalimumab em células de HEK 293 Transfectadas quando presentes separadamente em um vetor de plasmídeo de expressão (pA205A1, pA205A2) ou em combinação (pA205Genômico). A ARM1 conferiu um maior nível de 5 melhoramento de expressão de adalimumab do que a ARM2 neste sistema de expressão transiente de HEK 293. Em contraste, a ARM2 conferiu um maior nível de melhoramento de expressão de adalimumab do que ARM1 no sistema de expressão estável de CHO (vide Exemplo 3 acima). Como visto no sistema de expressão estável de CHO (Exemplo 6, acima), o efeito de melhoramento de ARM2 também foi claramente reduzi10 do em células de HEK 293 transfectadas com um vetor de plasmídeo de expressão carregando ou a seqüência de ARM2 de Swal-truncada ou a Sepl, incluindo uma redução da expressão abaixo daquela vista em células transfectadas com o vetor de expressão de plasmídeo de controle pA205 (nenhuma seqüência ARM).

Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações citadas no texto acima são incorporadas aqui para referência.

Outras variações e modalidades da invenção descrita aqui serão evidentes para uma pessoa versada na arte, e todas as tais variantes e modalidades alternativas da invenção se destinam a serem enquadradas dentro da descrição antecedente e das reivindicações que seguem.

Claims

1. Molécula de polinucleotídeo de elemento de vetor de expressão recombinante (rEVE) isolada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma seqüência de base de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo de seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, de seqüência de base de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, uma seqüência complementar a qualquer seqüência anterior, uma porção de melhoramento de expressão de qualquer seqüência anterior e combinações das mesmas.

2. Molécula de polinucleotídeo de rEVE isolada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo de (rEVE) compreende uma porção de melhoramento de expressão de seqüência de SEQ ID NO: 2 selecionada a partir do grupo consistindo de seqüência de bases 462-2422 de SEQ ID NO: 2 e seqüência de bases 1087-2422 de SEG ID NO: 2.

3. Vetor recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma molécula de polinucleotídeo de rEVE como descrita nas reivindicação 1 e ou reivindicação 2.

4. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo de um vetor de expressão de plasmídeo recombinante, um .

5. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo de um vetor de expressão de plasmídeo recombinante, um vetor de expressão viral eucariótico, um vetor de expressão de bacteriófago recombinante, um vetor de expressão de mini-cromossomo de levedura recombinante, um vetor de expressão de cromossomo artificial bacteriano recombinante e um vetor de plasmídeo de expressão de levedura recombinante.

6. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão recombinante compreende um ou mais genes de recombinantes funcionais que codificam uma ou mais proteínas de expressão.

7. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que uma ou mais proteínas recombinantes são selecionadas a partir do grupo consistindo de uma proteína solúvel, uma proteína de membrana, uma proteína estrutural, uma proteína ribossômica, uma enzima, um zimogênio, uma molécula de anticorpo, uma proteína receptora de superfície celular, uma proteína reguladora de transcrição, uma proteína reguladora de translação, uma proteína de cromatina, um hormônio, uma proteína reguladora de ciclo celular, uma proteínas G, um peptídeo neuroativo, uma proteína imunoreguladora, uma proteína componente do sangue, uma proteína porta íons, uma proteína de choque térmico, uma redutase dihidrofolato, uma proteína de resistência a antibiótico, um fragmento funcional de qualquer uma das proteínas antecedentes, um fragmento contendo epítope de qualquer uma das proteínas antecedentes e combinações das mesmas.

8. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de anticorpo é selecionada a partir do grupo consistindo de um anticorpo anti-TNF-σ, um anticorpo anti-EL-selectina, um anticorpo anti-IL-13 e uma molécula de imunoglobulina de domínio variável duplo.

9. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-TNF-σ é o adalimumab.

10. Vetor de expressão recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão recombinante compreende pelo menos uma cópia de um gene que codifica uma redutase dihidrofolato.

11. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vetor descrito em qualquer uma das reivindicações de 3 a 10.

12. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica ou uma céluIa hospedeira procariótica.

13. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica selecionada a partir do grupo consistindo de uma célula hospedeira de mamífero, uma célula hospedeira de inseto, uma célula hospedeira de planta, uma célula hospedeira de fungo, uma célula hospedeira algácea eucariótica, uma célula hospedeira de nematóide, uma célula hospedeira de protozoário e uma célula hospedeira de peixe.

14. Célula hospedeira eucariótica, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica é uma célula hospedeira de mamífero.

15. Célula hospedeira de mamífero, conforme a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de mamífero é selecionada a partir do grupo consistindo de uma célula de Ovário de Hamster Chinês, (CHO), uma célula COS, uma célula Vero, uma célula SP2/0, uma célula de mieloma NS/0, uma célula embriônica de rim humano (HEK 293), uma célula de rim de filhote de hamster (BHK), uma célula HeLa, uma célula B de humano, uma célula CV-1/EBNA, uma célula L, uma célula 3T3, uma célula HEPG2, uma célula PerC6 e uma célula MDCK.

16. Célula hospedeira de mamífero, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de mamífero é uma célula de CHO.

17. Célula hospedeira eucariótica, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica é uma célula hospedeira de fungo.

18. Célula hospedeira de fungo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de fungo é selecionada a partir do grupo consistindo de Aspergillus, Neurospora Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, kluyveromyces, Yarrowia e Candida.

19. Célula hospedeira de Saccharomyces, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma célula hospedeira S. cerevisiae.

20. Célula hospedeira eucariótica, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica é uma célula hospedeira de protozoário.

21. Célula hospedeira de protozoário, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de protozoário é uma célula hospedeira de Leishmania tarentolae.

22. Método para produzir uma proteína de interesse, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a transcrição e a translação de um ou mais genes que codificam a proteína recombinante de interesse presente no vetor de expressão recombinante descrito em qualquer uma das reivindicações de 4 a 10.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a transcrição e a translação ocorrem em um sistema de transcrição/translação sem células ou em uma célula hospedeira.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a transcrição e a translação ocorrem na célula hospedeira.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula hospedeira é uma célula hospedeira de CHO.

26. Método para produzir uma célula hospedeira que expressa de forma estável níveis elevados de uma proteína recombinante de interesse, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: inserir nas células hospedeiras um vetor de expressão recombinante descrito na reivindicação 10, cultivar as células hospedeiras na presença de metotrexato para selecionar uma célula hospedeira resistente a metotrexato que expressa a proteína recombinante de interesse, e isolar uma célula hospedeira resistente a metotrexato; em que a célula hospedeira resistente a metotrexato isolada expressa a proteína recombinante de interesse em um nível que é maior que aquele de uma célula hospedeira sensível a metotrexato, e em que a célula hospedeira resistente a metotrexato expressa de forma estável um nível elevado de proteína recombinante quando cultivada na presença ou na ausência de metotrexato.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o metotrexato está presente em uma concentração na faixa de 5 nM a 10 μΜ.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de CHO.

29. Método de metotrexato-redutase dihidrofolato (DHFR) para amplificar a expressão de uma proteína recombinante de interesse codificada em um vetor de expressão recombinante em uma célula hospedeira, em que o vetor de expressão recombinante compreende um código de gene para a proteína recombinante de interesse e um gene que codifica DHFR, CARACTERIZADO pelo fato de que o aperfeiçoamento reside no fato de que o vetor de expressão recombinante também compreende uma molécula de polinucleotídeo de rEVE como descrita na reivindicação 1 ou 2., em que o cultivo de células hospedeiras contendo o vetor de expressão na presença de metotrexato seleciona e produz uma célula hospedeira resistente a metotrexato que expressa de forma estável a proteína recombinante de interesse em um nível ampliado quando cultivada na presença ou na ausência de metotrexato.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o metotrexato está presente em uma concentração na faixa de5nMa10pM.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de CHO.

32. Método para aperfeiçoar ou melhorar a habilidade de uma população de células hospedeiras que expressam uma proteína recombinante para se adaptar ao cultivo na presença de metotrexato, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: Inserir nas células hospedeiras um vetor de expressão recombinante compreendendo: um gene recombinante que codifica uma proteína recombinante de interesse, uma molécula de polinucleotídeo de elemento de vetor de expressão recombinante (rEVE) compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, uma porção de SEQ ID NO: 1, uma porção de SEQ ID NO: 2 e combinações das mesmas, e um gene de redutase dihidrofolato (DHFR); em que uma população de células hospedeiras contendo o vetor de expressão possui uma taxa de crescimento maior e/ou taxa de sobrevivência maior na presença de metotrexato comparada com uma população de células hospedeiras que carregam o mesmo vetor de expressão sem a molécula de polinucleotídeo de rEVE.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o metotrexato está presente em uma concentração na faixa de 5 nM a 10 μΜ.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de CHO.

35. Método para produzir uma célula hospedeira resistente a metotrexato que expressa níveis elevados de uma proteína recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: inserir nas células hospedeiras um vetor de expressão recombinante compreendendo: um gene recombinante que codifica uma proteína recombinante de interesse, uma molécula de polinucleotídeo de elemento de vetor de expressão recombinante (rEVE) compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, uma porção de SEQ ID NO: 1, uma porção de SEQ ID NO: 2 e combinações das mesmas, e um gene de redutase dihidrofolato (DHFR); cultivar as células hospedeiras na presença de metotrexato para selecionar uma célula hospedeira resistente a metotrexato que expressa a proteína recombinante de interesse, e isolar a célula hospedeira resistente a metotrexato; em que a célula hospedeira resistente a metotrexato isolada expressa a proteína recombinante de interesse na presença de metotrexato em um nível que é maior que aquele de uma célula hospedeira resistente a metotrexato contendo um vetor de expressão sem uma seqüência de rEVE.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o metotrexato está presente em uma concentração na faixa de 5 nM a 10 μΜ.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de CHO.

38. Método para aumentar o número de seqüências da região de integração com a matriz (MAR) presentes em uma primeira molécula de ácido nucléico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende inserir na primeira molécula de ácido nucléico uma segunda molécula de ácido nucléico, a segunda molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo 35 consistindo de SEQ ID NO: 1, uma porção de SEQ ID NO: 1 compreendendo pelo menos uma seqüência de MAR, SEQ ID NO: 2, uma porção de SEQ ID NO: 2 compreendendo pelo menos uma seqüência de MAR e combinações das mesmas.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira molécula de ácido nucléico é selecionada a partir do grupo consistindo de uma molécula de vetor, um cromossomo de célula eucariótica, um genoma viral eucariótico, um cromossomo de célula procariótica, um genoma viral procariótico, um cromossomo artificial de levedura e um cromossomo artificial de bactéria.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro ácido nucléico é uma molécula de vetor.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de vetor é uma molécula de vetor de expressão recombinante.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão recombinante compreende um ou mais genes funcionais.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais genes funcionais codificam uma ou mais proteínas selecionadas a partir do grupo consistindo de uma proteína solúvel, uma proteína de membrana, uma proteína estrutural, uma proteína ribossômica, uma enzima, um zimogênio, uma molécula de anticorpo, uma proteína receptora de superfície celular, uma proteína reguladora de transcrição, uma proteína reguladora de translação, uma proteína de cromatina, um hormônio, uma proteína reguladora de ciclo celular, uma proteínas G, um peptídeo neuroativo, uma proteína imunoreguladora, uma proteína componente do sangue, uma proteína porta íons, uma proteína de choque térmico, uma redutase dihidrofolato (DHFR), uma proteína de resistência a antibiótico, um fragmento funcional de qualquer uma das proteínas antecedentes, um fragmento contendo epítope de qualquer uma das proteínas antecedentes e combinações das mesmas.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula de anticorpo é selecionada a partir do grupo consistindo de um anticorpo anti-TNF-σ, um anticorpo anti-EL-selectina, um anticorpo anti-IL-13 e uma molécula de imunoglobulina de domínio variável duplo.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-TNF-σ é o adalimumab.

46. Método para reduzir a expressão, suprimir substancialmente a expressão, ou silenciar essencialmente a expressão de uma proteína recombinante a partir de um vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: Inserir em um vetor de expressão que compreende um ou mais genes recombinantes que codificam uma ou mais proteínas recombinantes, uma molécula de ácido nucléico que compreende seqüência de base de nucleotídeo de bases 1-461 de SEQ ID NO: 2 ou de bases 1-1086 de SEG ID NO: 2.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente: Inserir dito vetor de expressão em uma célula hospedeira.