JP2014012014A - 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ） - Google Patents

Abstract

【課題】組換えタンパク質の発現レベルを増進するための組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）を含む組成物および方法の提供。
【解決手段】特定の塩基配列（“ＡＲＭ１”）、配列２の塩基配列（“ＡＲＭ２”）および上記配列のいずれかの発現増進性部分から成るグループから選択されたヌクレオチド塩基配列を含む単離ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子を提供する。この分子中では、目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と同じ発現ベクター上にｒＥＶＥポリヌクレオチドが存在するとき、組換えタンパク質の発現レベルがｒＥＶＥ非存在下の発現レベルに比較して増進されるであろう。組換えタンパク質の発現を低下させる、実質的に抑制するまたは本質的にサイレンシングさせる他の組成物および方法も記載されている。
【選択図】なし

Description

多種多様な真核性または原核性の宿主細胞中で組換えタンパク質を発現させるために核酸ベクター分子を使用する様々な系の利用が可能である。どのベクター／宿主細胞の組合せを使用するかの決定は一般に、どの系が目的の用途に最適な形態の望ましい組換え遺伝子産物を最大収率で提供するかに依存する。たとえば、所望の組換えタンパク質の必要条件（たとえば、抗原性、活性、コンホメーションなどの条件）にグリコシル化のような翻訳後修飾が不可欠である場合、原核細胞は特徴的に翻訳後グリコシル化活性がないので真核細胞系が望ましい。ベクター／宿主細胞の組合せが発現遺伝子産物を所望の形態で産生するだけでなく、所望の発現遺伝子産物の分子がそれらを産生する細胞から容易に単離できることも重要である。

ヒト治療用の組換えタンパク質の開発に要する費用は増加しつつあるので、特に真核性宿主細胞を使用する系におけるこのような組換えタンパク質の発現レベルを増進する努力が続けられている。所望の組換え遺伝子産物の発現効率および／または総収率を改善し得るヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を有している様々なシス−およびトランス−作用性調節要素が特性決定された。このような調節要素は非限定的に、高効率プロモーター、転写エンハンサー配列（参照：たとえばＤｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，９：１３４（１９９３）による考察）、遺伝子座コントロール領域（ＬＣＲ；参照：たとえばＧｒｏｓｖｅｌｄら，Ｃｅｌｌ，５１：９７５（１９８７））、マトリックスまたはスカフォールド付着領域（ＭＡＲ、ＳＡＲ；参照：たとえば米国特許第７，１２９，０６２号明細書；Ｂｏｄｅら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１６２Ａ：３８９−４５４（１９９５）；Ｂｏｄｅら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，６：１１５−１３８（１９９６））；絶縁要素（参照：たとえばＫｅｌｌｕｍら，Ｃｅｌｌ，６４：９４１（１９９１）；および内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ；参照：たとえばＭｃＢｒａｔｎｅｙら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，５：９６１（１９９３）による考察）を含む。このような要素の核酸配列のいくつかは発現を左右できる特異的サブ配列を有していることが後になって知見された。

様々な種類の宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を左右できる様々な配列およびその他の因子の解明は前進したとは言えるが、特にこのような組換えタンパク質が治療または他の専門用途に予定される場合、組換えタンパク質の収率の改善が依然として要望されている。

米国特許第７，１２９，０６２号明細書

Ｄｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，９：１３４（１９９３） Ｇｒｏｓｖｅｌｄら，Ｃｅｌｌ，５１：９７５（１９８７） Ｂｏｄｅら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１６２Ａ：３８９−４５４（１９９５） Ｂｏｄｅら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，６：１１５−１３８（１９９６） Ｋｅｌｌｕｍら，Ｃｅｌｌ，６４：９４１（１９９１） ＭｃＢｒａｔｎｅｙら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，５：９６１（１９９３）

本発明は組換えタンパク質の発現を増進するヌクレオチド塩基配列を含む単離核酸分子（ポリヌクレオチド分子）を提供する。この文中ではこのような核酸分子を組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）と表す。発現ベクター上のｒＥＶＥの存在は、発現ベクター上に内在する１つ以上の機能遺伝子によってコードされた１つ以上の組換えタンパク質の発現レベルをｒＥＶＥの非存在下の発現レベルに比較して増進する。組換えタンパク質の発現レベルのこのようなｒＥＶＥ媒介性増進は、ｒＥＶＥが（１つ以上の）目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子に対して５’側、３’側または５’側および３’側の双方のいずれに局在（たとえば、フランキング）するかにかかわりなく可能である。発現ベクター上に存在するｒＥＶＥは、発現ベクター上に存在する個別の対応遺伝子にコードされているかまたは単一のポリシストロン性遺伝子にコードされているかにかかわりなく１つ以上の組換えタンパク質の発現を増進し得る。ｒＥＶＥは、安定発現系および一過性発現系の双方を使用する組換えタンパク質発現のレベル増進に使用され得る。

１つの実施態様において本発明は、配列１の塩基配列（“ＡＲＭ１”）、配列２の塩基配列（“ＡＲＭ２”）および上記配列のいずれかの発現増進性部分から成るグループから選択されたヌクレオチド塩基配列を含む単離ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子を提供する。この分子中では、目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と同じ発現ベクター上にｒＥＶＥポリヌクレオチドが存在するとき、組換えタンパク質の発現レベルがｒＥＶＥ非存在下の発現レベルに比較して増進されるであろう。

本発明の好ましいｒＥＶＥ分子は、配列１のヌクレオチド塩基配列を有している２３２９塩基対（ｂｐ）のｒＥＶＥ核酸分子および配列２のヌクレオチド塩基配列を有している２４２２ｂｐのｒＥＶＥ核酸分子を含む。

配列２の配列の３’末端領域は、タンパク質発現のｒＥＶＥ媒介性増進に欠かせない配列を含有している。配列２のこのような好ましい３’末端領域配列は、配列２の塩基配列４６２−２４２２および配列２の塩基配列１０８７−２４２２の配列を含む。

この文中に記載のヌクレオチド塩基配列の１つ以上を含む単離ｒＥＶＥ核酸分子は、直鎖状核酸分子、プラスミド、真核性ウイルス分子、原核性ウイルス（バクテリオファージ）分子、人工染色体および組換え染色体を非限定的に含む様々な形態のいずれかを有し得る。

好ましい実施態様において本発明は、この文中に記載のｒＥＶＥを少なくとも１つ含んでいる発現ベクターを提供する。このようなｒＥＶＥ含有発現ベクターは、適正な宿主細胞中で、発現ベクターにコードされた少なくとも１つの組換えタンパク質の発現レベルをｒＥＶＥの欠如した同じ発現ベクターを担持する宿主細胞中の発現レベルに比較して増進する（向上させる）。本発明に有用な発現ベクターは、適正な（相同）宿主細胞中で１つ以上の組換えタンパク質をコードし発現するように操作できる核酸ベクター分子を含む。このような発現ベクターは非限定的に、真核性プラスミドベクター、真核性ウイルスベクター、原核性プラスミド、バクテリオファージベクター、シャトルベクター（たとえば、真核細胞および原核細胞中で複製できるベクター）、ミニ染色体および様々な人工染色体を含む。好ましくは、発現ベクターがプラスミド発現ベクターであり、より好ましくは真核性宿主細胞ゲノムに安定に組込まれるプラスミド発現ベクターであり、いっそう好ましくは非相同的組換えによって宿主細胞ゲノムに安定に組込まれるプラスミド発現ベクターである。

別の実施態様において本発明は、この文中に記載のｒＥＶＥと宿主細胞中で少なくとも１つの組換えタンパク質の発現を指令する組換え遺伝子とを含む発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は真核性宿主細胞でもよくまたは原核性宿主細胞でもよい。本発明に使用するための好ましい真核性宿主細胞は非限定的に、哺乳類宿主細胞、植物宿主細胞、真菌類宿主細胞、真核性藻類宿主細胞、原生動物宿主細胞、昆虫類宿主細胞および魚類宿主細胞を含む。より好ましくは、本発明に有用な宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞、幼若ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびＭＤＣＫ細胞を非限定的に含む哺乳類宿主細胞である。宿主細胞に挿入された発現ベクター上の組換え遺伝子のコピー数を増幅するために標準メトトレキセート処理プロトコルで処理できるＣＨＯ細胞が特に好ましい。本発明において宿主細胞として使用し得る真菌類細胞は非限定的に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａのようなＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅ細胞、および、酵母細胞、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＹａｒｒｏｗｉａおよびＣａｎｄｉｄａから成るグループから選択される属の酵母を含む。本発明による組換えタンパク質の発現用宿主細胞として使用し得る好ましい酵母種は非限定的に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。本発明による組換えタンパク質を発現させるために使用し得る原核性宿主細胞は非限定的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、種々の血清型のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｗｏｌｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種を含む。本発明による組換えタンパク質を発現させるために宿主細胞として使用し得る他の細胞は、トリパノゾマチド宿主Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅのような原生動物細胞、および、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの細胞を含む。

この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド、この文中に記載の１つ以上のｒＥＶＥを含むベクター、および、この文中に記載の１つ以上のｒＥＶＥを含むこのようなベクターを含む宿主細胞は、目的の組換えタンパク質の発現に関する様々な方法に使用され得る。

１つの実施態様において本発明は、この文中に記載のｒＥＶＥと宿主細胞中で目的の組換えタンパク質の合成をコードおよび指令する組換え遺伝子とを含む組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、組換えタンパク質の発現を推進する条件下で宿主細胞を培養する段階とを含む、宿主細胞中で目的の組換えタンパク質の発現を増進させる方法を提供する。

別の実施態様において本発明は、メトトレキセート（“ＭＴＸ”）の非存在下で，すなわち、メトトレキセートの存在によって提供される組換えタンパク質の高発現選択圧力の非存在下で、組換えタンパク質を安定に（一過性の逆）高レベルで発現するメトトレキセート耐性宿主細胞の製造方法を提供する。このような方法は、目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、この文中に記載のｒＥＶＥと、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（“ＤＨＦＲ”）をコードする遺伝子とを含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するためにメトトレキセートの存在下で宿主細胞を増殖させる段階と、メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階とを含み、メトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセート感受性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現すること、および、メトトレキセートの存在下またはメトトレキセートの非存在下で増殖させたときにメトトレキセート耐性宿主細胞が目的の組換えタンパク質を高レベルで安定に発現することを特徴とする。特に好ましい実施態様において、この方法に使用されるｒＥＶＥは、配列２の配列、または、目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子と同じ発現ベクター上に存在するときに宿主細胞中の組換えタンパク質の発現レベルを増進するその発現増進性部分を含む。

別の実施態様において本発明は、組換えタンパク質発現を増幅するためのＤＨＦＲ−メトトレキセート手順におけるメトトレキセートの存在に対する適応が強化または改善された宿主細胞集団の製造方法を提供する。方法は、目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子とこの文中に記載のｒＥＶＥとＤＨＦＲ遺伝子とを含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階を含み、発現ベクターを含有する宿主細胞集団が、ｒＥＶＥ配列の欠如した発現ベクターを担持する宿主細胞集団に比較してより高度にメトトレキセートの存在に適応している、すなわちメトトレキセートの存在下でより高い生存率および／またはより高い増殖速度を有していることを特徴とする。

また別の実施態様において本発明は、ＤＨＦＲ−メトトレキセート手順を使用して得られた宿主細胞中の組換えタンパク質の発現の増幅（向上）を増進する方法を提供する。方法は、目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子とこの文中に記載のｒＥＶＥとＤＨＦＲ遺伝子とを含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するためにメトトレキセートの存在下で宿主細胞を増殖させる段階と、メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階とを含み、単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセートの存在下でｒＥＶＥの欠如した同じ発現ベクターを含有するメトトレキセート耐性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現することを特徴とする。

この文中に記載の方法においてメトトレキセートは２０ｎＭから５００ｎＭの範囲で使用されるのが好都合であるが、目的の組換えタンパク質の増幅発現を選択するためのこのような方法では５ｎＭから１０μＭのようなもっと低いおよびもっと高い濃度で使用しても成功結果が得られるであろう。

さらに別の実施態様において本発明は、発現ベクターからの組換えタンパク質の発現を低下させる、実質的に抑制する、または、本質的にサイレンシングさせる方法を提供する。このような方法は、配列１または配列２の配列を含むｒＥＶＥを使用して提供される発現レベルよりも低いレベルで特定の組換え遺伝子産物を発現するｒＥＶＥの１つ以上のフラグメントを含む発現ベクターを使用する。このようなフラグメントは配列２の塩基１−１０８６または配列２の塩基１−４６１のヌクレオチド塩基配列を含む配列２の特別な末端欠失変異体である。配列２の塩基１−４６１から成る末端欠失ＡＲＭ２配列を有している核酸分子は、宿主細胞中のベクター分子による組換えタンパク質の発現を抑制または実質的にサイレンシングさせるために特に有用である。これらの知見はまた、組換えタンパク質の発現のｒＥＶＥ媒介性増進を最大にするために配列２のヌクレオチド塩基４６２−２４２２の配列および配列２のヌクレオチド塩基１０８７−２４２２の配列がもっとも好ましいことを示唆する。

その発現がこの文中に記載の１つ以上のｒＥＶＥ分子によって増進され得る組換えタンパク質は、（１つ以上の）機能遺伝子が適正な宿主細胞中で発現するように核酸ベクター分子に組込み操作できるいかなるタンパク質（ペプチド、ポリペプチドおよびオリゴマータンパク質を含む）でもよい。このようなタンパク質は非限定的に、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質（すなわち、細胞、組織または器官の構造または支持を提供するタンパク質）、リボソームタンパク質、酵素、チモーゲン、抗体分子、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質（たとえば、ヒストン）、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経作動性ペプチド、免疫調節タンパク質（たとえば、インターロイキン、サイトカイン）、血液成分タンパク質、イオンゲートタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、それらの機能フラグメント、それらのエピトープ含有フラグメント、および、それらの組合せを含む。

この文中に記載のｒＥＶＥまたはその一部分の配列を含有する核酸分子はまた、核酸ハイブリダイゼーションによって他の核酸分子中のｒＥＶＥ配列の存在を同定するため、または、たとえばこの文中に記載のｒＥＶＥ配列を操作、同定、産生または増幅するために使用されるような様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順で使用するプライマーのソースとして使用し得る。

ＡＲＭ１（配列１）およびＡＲＭ２（配列２）のｒＥＶＥ配列のようなｒＥＶＥ配列は１つ以上のマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列を含み得る。ＭＡＲ配列は、ｒＥＶＥ配列の５’および／または３’末端領域にクラスターとして存在するものも含めてｒＥＶＥ配列内部にクラスターとして存在し得る。この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチドはＭＡＲ配列の有用なソースである。従って本発明は、１つ以上のＭＡＲ配列を含有するこの文中に記載のｒＥＶＥまたはこの文中に記載のｒＥＶＥの一部分を核酸分子に挿入する段階を含む、核酸分子中のＭＡＲ配列を増加させるために有用な組成物および方法を提供する。

この文中に記載のヌクレオチド塩基配列はまた、その相補配列の提供にも役立つ。この文中に記載のＤＮＡ分子およびヌクレオチド塩基配列はまた、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換された対応するＲＮＡ分子および塩基配列ならびにそれらに相補的な核酸配列を提供する。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の安定なトランスフェクタント中で能動ヒト抗−ＴＮＦ−α ＩｇＧ分子（“アダリムマブ”）を形成する免疫グロブリンＨ鎖およびカッパＬ鎖を発現するために使用されるプラスミド発現ベクターｐＡ２０５の概略を示す図。略号：“ＥＮＨＡＮＣＥＲ“はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の中間初期遺伝子エンハンサーを表す。“ＡＤＥＮＯ ＰＲＯＭＯＴＥＲ”はアデノウイルスの主要後期プロモーターを表す。“ＡＤＡＬＩＭＵＭＡＢ ＨＥＡＶＹ ＣＨＡＩＮ”は、アダリムマブのＩｇＧ１ Ｈ鎖のコーディング領域を表す。“ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ Ａ”はサルウイルス４０のポリアデニル化部位を表す。“ＧＡＳＴＲＩＮ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ”はヒトガストリン遺伝子の転写終結シグナルを表す。“ＳＶ４０ ＰＲＯＭＯＴＥＲ”はサルウイルス４０のプロモーターである。“ＤＨＦＲ”はマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を表す。“ＴＫ Ｐｏｌｙ Ａ”は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のポリアデニル化部位を表す。“ＡＤＡＬＩＭＵＭＡＢ ＬＩＧＨＴ ＣＨＡＩＮ”はアダリムマブのカッパＬ鎖のコーディング領域を表す。“ＯＲＩ”はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で機能するプラスミドＣｏｌＥ１の原核性複製起点を表す。“Ｐ（ＢＬＡ）”はβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）の原核性プロモーターを表し、小矢印は転写方向を示す。“ＡＰｒ”（“アンピシリン耐性”）はβ−ラクタマーゼのコーディング領域を表す。矢印は転写方向（５’から３’）を示す。 配列１のヌクレオチド塩基配列を有しているＡＲＭ１（“Ａ１”）核酸がアデノウイルス主要後期遺伝子およびアダリムマブＩｇＧ１のＨ鎖コーディング領域の上流で発現ベクターｐＡ２０５（図１）に挿入され、配列２のヌクレオチド塩基配列を有しているＡＲＭ２（“Ａ２”）核酸がアダリムマブのカッパＬ鎖コーディング領域の下流に挿入されたプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ｇｅｎｏｍｉｃの概略を示す図。その他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 配列１の配列を有しているＡＲＭ１（“Ａ１”）核酸がアデノプロモーターおよびアダリムマブＩｇＧ１のＨ鎖コーディング領域の上流で発現ベクターｐＡ２０５（図１）に挿入されたプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａ１の概略を示す図。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 配列２のヌクレオチド塩基配列を有しているＡＲＭ２（“Ａ２”）核酸がアダリムマブのカッパＬ鎖コーディング領域の下流に挿入されたプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａの概略を示す図。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の安定なトランスフェクタント中で能動ヒト抗−ＥＬ−セレクチンＩｇＧ１分子を形成する免疫グロブリンのＨ鎖およびカッパＬ鎖を発現するために使用されたプラスミド発現ベクターｐＣＨＯＥＬ２４６ＧＧｈｕｍの概略を示す図。“ＡＮＴＩ−ＥＬ−ＳＥＬＥＣＴＩＮ ＨＥＡＶＹ ＣＨＡＩＮ”はヒト抗−ＥＬ−セレクチンＩｇＧ１抗体のＨ鎖のコーディング領域を表す。“ＡＮＴＩ−ＥＬ−ＳＥＬＥＣＴＩＮ ＬＩＧＨＴ ＣＨＡＩＮ”はヒト抗−ＥＬ−セレクチンＩｇＧ１抗体のカッパＬ鎖のコーディング領域を表す。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 配列１のヌクレオチド塩基配列を有しているＡＲＭ１（“Ａ１”）核酸が、抗−ＥＬ−セレクチンＩｇＧ１のＨ鎖のコーディング領域の上流で発現ベクターｐＣＨＯＥＬ２４６ＧＧｈｕｍ（図５）に挿入され、配列２のヌクレオチド塩基配列を有しているＡＲＭ２（“Ａ２”）核酸が抗−ＥＬ−セレクチンＩｇＧ１のカッパＬ鎖のコーディング領域の下流に挿入されたプラスミド発現ベクターｐＡ−Ｇｅｎ−ＥＬ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎの概略を示す図。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクタント中で増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現させるために使用されたプラスミド発現ベクターｐＡ２０５−ｅＧＦＰの概略を示す図。ｅＧＦＰコーディング領域（“ＥＧＦＰ”）がアデノウイルスの主要後期プロモーター（“ＡＤＥＮＯ ＰＲＯＭＯＴＥＲ”）の下流で、Ｌ鎖コーディング領域、近位プロモーター、近位エンハンサーおよびＨ鎖コーディング領域が欠失したｐＡ２０５（Ｆｉｇｕｒｅ１）に挿入されている。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 配列１のヌクレオチド塩基配列を有しているＡＲＭ１（“Ａ１”）核酸がｅＧＦＰコーディング領域（“ＥＧＦＰ”）の上流で発現ベクターｐＡ２０５−ｅＧＦＰ（図７）に挿入され、配列２のヌクレオチド塩基配列を有しているＡＲＭ２（“Ａ２”）核酸がｅＧＦＰコーディング配列の下流に挿入されたプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ｇ−ｅＧＦＰの概略を示す図。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩによるＡＲＭ２核酸消化の結果として配列２の塩基１−１０８６のヌクレオチド塩基配列を有している欠失ＡＲＭ２変異体“Ａ２（ｂｐ１−１０８６）”によってＡＲＭ２（配列２）が置換されている以外は図４に示した発現ベクターｐＡ２０５Ａ２に本質的に等しいプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａ２−Ｓｐｅ−ｔｒｕｎｃの概略を示す図。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。 制限エンドヌクレアーゼＳｗａＩによるＡＲＭ２核酸消化の結果として配列２の塩基１−４６１のヌクレオチド塩基配列を有している欠失ＡＲＭ２変異体“Ａ２（ｂｐ１−１０８６）”によってＡＲＭ２（配列２）が置換されている以外は図４に示した発現ベクターｐＡ２０５Ａ２に本質的に等しいプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａ２−Ｓｗａ−ｔｒｕｎｃの概略を示す図。他の略号に関しては上の図１の記述を参照されたい。

本発明は、配列１のヌクレオチド配列：

または配列２のヌクレオチド配列：

を含む１つ以上の単離核酸分子（ポリヌクレオチド分子）を発現ベクター分子に組込み操作することによって、発現ベクター分子に存在する１つ以上の遺伝子からの１つ以上の組換えタンパク質の発現を増進できるという知見に基づく。

配列１または配列２のヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子をこの文中で組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）と表す。本発明のｒＥＶＥはまた非限定的に、配列１（“ＡＲＭ１”）に示す配列の発現増進性部分または配列２（“ＡＲＭ２”）に示す配列の発現増進性部分を含むポリヌクレオチド分子を含む。配列２の塩基４６２−２４２２または配列２の塩基１０８７−２４２２の配列を有するような配列２のＡＲＭ２の３’末端領域からの配列は目的の組換えタンパク質の増進発現を提供するために特に有用である。この文中に記載のｒＥＶＥは、宿主細胞中で組換えタンパク質を増産するために現用されている他のコントロール配列、調節要素および手順と併用できる。

本発明をより明らかに説明するために以下の用語を定義する。

この文中に使用した “抗体”または“抗体分子”という用語はこの文中の理解では、４つのポリペプチド鎖すなわち２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とから成る免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、または、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合性構造を保持しているその機能フラグメント、突然変異体、変異体もしくは誘導体を表す。抗体のこのような突然変異体、変異体または誘導体は当業界で公知であり、以下に検討するような非限定実施態様を含む。

全長抗体中で、Ｈ鎖のおのおのはＨ鎖可変領域（ＶＨ）とＨ鎖定常領域とから成る。Ｈ鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。Ｌ鎖のおのおのはＬ鎖可変領域（ＶＬ）とＬ鎖定常領域とから成る。Ｌ鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）から成る。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、枠組み構造領域（ＦＲ）と呼ばれる高保存性の領域とモザイク状に配置された相補性決定部位（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分できる。ＶＨおよびＶＬのおのおのは３つのＣＤＲと４つのＦＲとから成り、これらはアミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の順序で配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子はいかなるタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスでもよい。

“抗体”および“抗体分子”という用語はまた、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上のフラグメントを包含する。抗体の抗原結合性機能が全長抗体のフラグメントによって実現できることが判明した。このような抗体の実施態様はまた、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する二重特異性、二元特異性または多重特異性のフォーマットでもよい。“抗体”という用語に包含される結合性フラグメントの例は、ＦａｂフラグメントすなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価（１つの結合性部位）のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントすなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価（２つの結合性部位）のフラグメント；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；単一可変ドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒら，国際公開ＷＯ ９０／０５１４４ Ａ１、これらは参照によってここに組込まれるものとする）；二元可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体（参照：たとえば国際公開ＷＯ ２００７／０２４７１５）；および単離された相補性決定部位（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え方法を使用し合成リンカーによってそれらを接合し、一対のＶＬ領域およびＶＨ領域が一価の分子を形成する一本鎖タンパク質を作製できる、（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、参照：Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３（１９８８））。このような一本鎖抗体は、“抗体”および“抗体分子”という用語に包含される。ジアボディも“抗体”および“抗体分子”という用語に包含される。ジアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが２つのドメインが同一鎖上で対合するためには短すぎるリンカーが使用されるのでドメインを別の鎖の相補的ドメインに強制的に対合させて２つの抗原結合性部位を形成する二価の二重特異的抗体である（参照：たとえばＨｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１−１１２３（１９９４））。“抗体”および“抗体分子”という用語はまた、ＤＶＤ−ＩＧ^ＴＭ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）二元可変ドメイン免疫グロブリン分子のような二元可変ドメイン免疫グロブリン分子を包含する（参照：たとえば国際公開ＷＯ ２００７／０２４７１５）。

この文中に使用した“ベクター”という用語は、宿主細胞中で外来ポリヌクレオチドの遺伝子導入、発現または複製を行うビヒクルとして機能できる遺伝要素を表す。たとえばベクターは人工染色体またはプラスミドであり、宿主細胞のゲノムに安定に組込まれるかまたは独立の遺伝要素（たとえばエピソーム、プラスミド）として存在し得る。ベクターは単一のポリヌクレオチドまたは２つ以上の個々のポリヌクレオチドとして存在し得る。ベクターは宿主細胞中に存在するときに単一コピーベクターでもよくまたはマルチコピーベクターでもよい。本発明に使用するための好ましいベクターは、ベクター分子が適正な（相同）宿主細胞中に内在するときに１つ以上のタンパク質の発現を指令するように、発現ベクター分子中に内在する発現コントロール要素に近接して１つ以上の機能遺伝子を適正な配向でベクター分子に挿入できる発現ベクター分子である。

発現ベクターは非限定的に、真核性プラスミドペクター、真核性ウイルスベクター、原核性プラスミド、バクテリオファージベクター、シャトルベクター（たとえば真核細胞および原核細胞中で複製できるベクター）、ミニ染色体および様々な人工染色体（たとえば細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ））を含む。好ましくは、本発明に使用される発現ベクターがプラスミド、より好ましくは宿主細胞ゲノムに安定に組込まれるプラスミド発現ベクター、いっそう好ましくは非相同的組換えによって宿主細胞ゲノムに安定に組込まれるプラスミド発現ベクターである。“シャトルベクター”（または二価性ベクター）は生物の２つ以上の種において複製できるベクターを意味する。たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の双方において複製できるシャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド由来の配列を酵母２μプラスミド由来の配列に連結することによって構築できる。

発現系は、発現ベクターと発現ベクターにコードされた（１種以上の）組換えタンパク質を発現する適正な（相同）宿主細胞とを含む。発現系は安定発現系または一過性発現系であろう。安定発現系においては、発現ベクターが宿主細胞ゲノムに安定に組込まれるかまたは連続的に複製されて双方の娘細胞に忠実に移行し、宿主細胞が適正条件下で培養されたときに（１種以上の）組換えタンパク質の発現を継続できる。一過性発現系においては、発現ベクター分子が双方の娘細胞に保持されず、増殖する細胞培養物中で最終的には喪失するかまたは極めて減少するので培養物からの（１つ以上の）組換えタンパク質の発現が最終的に停止するかまたはたいていの生産目的に役立たないほど減少するであろう。後出の実施例に使用した発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に挿入（たとえば形質転換によって）されたときに比較的高いコピー数に複製でき、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に挿入（たとえば形質転換によって）され安定に維持されてそれらにコードされた（１つ以上の）目的の遺伝子産物を安定に発現するか（Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１７５０−１７５９（１９８０））、または、ＨＥＫ２９３細胞中に一過性に維持され得る（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：Ｅ９）タイプのシャトルベクターである。従って、この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子は、安定な発現系および一過性発現系の双方において（１つ以上の）目的の組換えタンパク質の発現を増進するために使用し得る。

本発明に使用し得る代表的な真核性ベクターは非限定的にウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは非限定的に、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、その複製受容形態、複製欠損形態および実質喪失（ｇｕｔｌｅｓｓ）形態を含むアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バールウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腫瘍ウイルスベクターおよびラウス肉腫ウイルスベクターを含む。バキュロウイルスベクターは公知であり昆虫細胞中の発現に適している。

真核細胞または原核細胞中の発現に適した様々なベクターが当業界で公知であり、多くは市販されている。商品供給業者は非限定的に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含む。多くのベクター配列がＧｅｎＢａｎｋから入手でき、ベクターに関する追加情報はＲｉｋｅｎ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒからインターネットで入手できる。

ベクター分子は典型的には少なくとも１つの複製起点を有しており、また、宿主細胞に挿入されたときにベクターを同定または選択できる“マーカー”または“選択可能マーカー”を含み得る。このような有用なマーカーは非限定的に、抗生物質耐性を与えるか、マーカーの欠如した細胞に比べて有利な選択的増殖機能を与えるか、または、ベクターを有している細胞を容易に同定する手段（たとえば発色系）を提供する。このようなマーカーは当業界で公知であり、ベクター分子中に使用される適切な（１つ以上の）マーカー分子の選択は、宿主細胞の用途およびベクター含有宿主細胞に望まれる特性に依存する。

“機能遺伝子構築物”、“機能遺伝子”および“遺伝子”という用語は、プロモーター配列に作動可能に連結された１種以上のタンパク質のコーディング配列および場合によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのコーディング配列の適正な転写を指令する他の転写調節配列、また、所期の宿主細胞中でｍＲＮＡから所望のタンパク質への適正な翻訳を指令するために必要であるかまたは望まれる様々な翻訳調節配列のいずれかを含むポリヌクレオチドを意味する。原核細胞および真核細胞中で翻訳が開始されるためには、ｍＲＮＡ中に典型的には翻訳開始コドン（たとえばＡＴＧ）およびリボソーム結合性部位が必要である。宿主細胞次第で使用される他の翻訳調節配列は非限定的に、ＲＮＡスプライス部位およびポリアデニル化部位を含む。

この文中の“組換え体”という用語は、変更もしくは操作された核酸、それらが天然に存在する環境から単離された核酸、外因性核酸を含有するようにトランスフェクトもしくは他の操作が加えられた宿主細胞、または、単離ＤＮＡの操作および宿主細胞の形質転換によって非天然的に発現されたタンパク質を表す。より詳細には“組換え体”は、遺伝子操作技術を使用してインビトロ構築されたＤＮＡ分子を含意する用語であり、分子、構築物、ベクター、細胞、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを記述する形容詞としての“組換え”という用語の使用は、天然に存在するこのような分子、構築物、ベクター、細胞、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを明らかに排除する。特に、本発明の目的である“組換えタンパク質”は、タンパク質の発現に先立って宿主細胞中に天然には存在しない少なくとも１つの遺伝要素を組込むことによって操作された宿主細胞によって発現されるタンパク質である。たとえば、タンパク質のコーディング配列を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして宿主細胞がタンパク質を発現できるようにしたとき、そのコーディング領域が人為的に組込まれたタンパク質は、宿主細胞によって発現された“組換えタンパク質”である。

“宿主細胞”は、ベクター分子を挿入できる細胞すなわち真核細胞または原核細胞を表す。本発明によれば好ましい宿主細胞は、動物細胞（たとえば哺乳類、鳥類および魚類宿主細胞）、植物細胞（真核性藻類細胞を含む）、真菌類細胞、細菌類細胞および原生動物細胞を非限定的に含む真核細胞または原核細胞である。本発明に有用な宿主細胞はいかなる遺伝構築物でもよいが、好ましくは単相体細胞または二倍体細胞である。本発明に有用な好ましい哺乳類宿主細胞は非限定的に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞および幼若ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびＭＤＣＫ細胞を含む。好ましい昆虫細胞はＳｆ９である。本発明において宿主細胞として役立つ真菌類細胞は非限定的に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａのようなＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅ細胞、および、酵母細胞、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＹａｒｒｏｗｉａおよびＣａｎｄｉｄａ属の酵母を含む。組換えタンパク質を発現するための宿主細胞として役立つ特に好ましい酵母真菌類細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。本発明において宿主細胞として役立つ好ましい原核細胞は非限定的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、様々な血清型のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｗｏｌｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種を含む。本発明による組換えタンパク質を発現するために有用な他の細胞は、トリパノゾマチド宿主Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅのような原生動物および線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの細胞を含む。様々な発現ベクターが上記細胞中で有効に使用され得る。

ベクター分子を細胞に挿入するために、形質転換、トランスフェクション、細胞もしくはプロトプラスト融合、化学処理の使用（たとえばプロトプラストのポリエチレングリコール処理、カルシウム処理、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手できるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^（Ｒ）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ^（Ｒ）トランスフェクション試薬のようなトランスフェクト補助剤）、様々な種類のリポソームの使用、機械的デバイスの使用（たとえば核酸コートしたマイクロビーズ）、電荷の使用（たとえば電気穿孔）およびそれらの組合せを非限定的に含む様々な手段およびプロトコルが存在する。この文中に記載した特定のベクター分子を所望の宿主細胞に挿入するために使用する特定のプロトコルおよび／または手段を決定することは当業者の技量の範囲内である。

本発明においては一方のベクターまたは別の核酸分子から他方に“核酸配列情報を伝達する”方法は限定されない。当業界で公知の様々な遺伝子操作または組換え核酸技術のいずれかが包含される。特に好ましい伝達技術は非限定的に、制限消化および結合技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコル（特異的またはランダム配列のプライマー使用）、相同的組換え技術（ポリヌクレオチド相同領域の利用）および非相同的組換え（たとえばランダム挿入）技術を含む。また、たとえば全自動核酸シンセサイザーを使用して特定配列を含有している核酸分子を合成し、得られた核酸生成物を上記方法のいずれかによって別の核酸分子に組込んでもよい。

遺伝子操作技術の使用には、細胞および当業者が望む特定の細胞状態が必要とする条件によって決定される様々な特定条件下で組換え宿主細胞（たとえばトランスフェクタント、形質転換体）を増殖させることがどうしても必要である。たとえば、宿主細胞は（その遺伝素因によって決定された）いくつかの栄養要件または物理的（たとえば温度）および／または化学的（たとえば抗生物質）条件に対する固有の耐性もしくは感受性を有しているであろう。さらに、所望の遺伝子の発現調節（たとえば誘導プロモーターの使用）または特定の細胞状態の開始（たとえば酵母細胞の交配または胞子形成）には特別な培養条件が必要であろう。これらの様々な条件およびこのような条件を満たす要件は当業者に理解および認識されるであろう。

標準ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）−メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅手順を使用して宿主細胞中の組換えタンパク質発現を増幅する（向上させる）という文脈において、“安定性”および“安定発現”という用語は、メトトレキセートの非存在下、すなわち増幅手順に使用したメトトレキセートの存在によって提供される高発現選択圧力の非存在下で増殖されたときに組換えタンパク質を増幅（高）レベルで発現し続ける細胞培養物の能力を表す。したがって、いったん単離されると、安定なトランスフェクタント宿主細胞はメトトレキセートの存在下でも非存在下でも目的の組換えタンパク質を発現できる。

標準ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）−メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅手順を使用して宿主細胞中での組換えタンパク質発現を増幅するという文脈において、メトトレキセートの存在に対する“適応強化”または“適応改善”は、この文中に記載のｒＥＶＥを含む発現ベクターを担持している宿主細胞培養物のメトトレキセート存在下の生存率および／または増殖速度が、ｒＥＶＥの欠如した発現ベクターを担持している宿主細胞培養物のメトトレキセート存在下の生存率および／または増殖速度に比較して向上していることを表す。宿主細胞集団の“生存率”は、選択圧力（たとえばメトトレキセート）の存在下の宿主細胞集団の増殖および複製能力を表す。

“配列相同”は当業者が熟知している概念である。２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント相同を決定するために、比較目的に最適になるように配列を位置合せする（たとえば第二の比較アミノ酸または核酸配列に最適に位置合せするように第一のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入する）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列の１つの位置が第二配列の対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められているとき、分子はこの位置で相同である（すなわち、この文中に使用したアミノ酸または核酸の“相同”はアミノ酸または核酸の“一致”に等価である）。核酸配列相同は２つの配列間の一致の程度として決定できる。相同はＧＣＧプログラムパッケージとして提供されているＧＡＰソフトウェアのような当業界で公知のコンピュータープログラムを使用して決定し得る。参照：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）。

言及した１つ以上の要素または段階を“含む”とこの文中に記載した組成物または方法は、言及した要素または段階が必須であるが組成物または方法の範囲内で他の要素または段階を追加できるという開放型意味である。また、冗漫な表現を避けるために、言及した１つ以上の要素または段階を“含んでいる”または“含む”と記載された組成物または方法が、同じ言及された要素または段階“から本質的に構成されている”（または“から本質的に構成される”）というもっと限定された対応組成物または方法を記述し、組成物または方法が言及された必須の要素または段階を含みさらに組成物または方法の基本的で新規な（１つ以上の）特徴に実質的に影響を与えない追加の要素または段階も含むことを意味することは理解されよう。また、言及された１つ以上の要素または段階“を含んでいる”または“から本質的に構成されている”とこの文中に記載された組成物または方法が、言及されない他の要素または段階を排除して、言及された要素または段階“から構成されている”（または“から構成される”）というもっと限定された対応組成物または方法を記述する閉鎖型表現にもなり得ることも理解されよう。この文中に開示されたいずれかの組成物または方法においては、言及された必須要素または段階に等価の公知または公表の要素または段階が当該要素または段階に置換され得る。

また、“から成るグループから選択された”要素または段階が、その後に列挙された要素または段階の１つ以上、ならびに、列挙された要素または段階の２つ以上の組合せを表すことも理解されよう。

他の指示がない限り、他の用語の意味は文脈から明らかであるかまたは当業者が理解し使用する意味と同じであることは理解されよう。

当業者はまた、この文中に記載された核酸配列（ヌクレオチド塩基配列）がＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの相補配列を提供することを理解している。

本発明の組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）は、発現ベクター上に存在する遺伝子から格別に高いレベルの抗−ＩＬ−１２抗体を発現していたトランスフェクトＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞系の細胞中に存在する発現ベクターの組込み部位の両側に隣接するゲノムＤＮＡの領域から初めて単離された。ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯゲノムＤＮＡのこれらのフランキング領域のクローニングおよび配列決定から、配列１および配列２の配列が解明された。配列１の２３２９塩基の配列をこの文中で“ＡＲＭ１”と呼び、配列２の２４２２塩基の配列を“ＡＲＭ２”と呼ぶ。フランキングＡＲＭ１ ＤＮＡ配列は、組込まれた発現ベクターのＨ鎖遺伝子の転写方向の上流に局在し、フランキングＡＲＭ２ ＤＮＡ配列は組込まれた発現ベクターのＬ鎖遺伝子の転写方向の下流に局在することが判明した（後出の実施例の項参照）。

それらの存在が発現ベクター含有宿主細胞中の様々な組換えタンパク質の発現レベルを左右できるか否かを判断するために、ＡＲＭ１−およびＡＲＭ２−含有ＤＮＡ分子を単独でおよび組合せて発現ベクターに挿入した。宿主細胞中でＡＲＭ１およびＡＲＭ２の双方を含有するＤＮＡはこれらの配列の非存在下で得られた産生レベルに比較して増進したレベルで組換えタンパク質を発現する（後出の実施例の項参照）。従って、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２を含有する核酸分子は組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）の例である。典型的には、ＡＲＭ１ポリヌクレオチドによって得られた増進産生レベルはＡＲＭ２ポリヌクレオチドによってまたはＡＲＭ１ポリヌクレオチドとＡＲＭ２ポリヌクレオチドとの組合せによって得られた産生レベルよりもいくらか低い。

本発明によれば、目的の組換えタンパク質を産生する発現ベクターの構築にＡＲＭ１およびＡＲＭ２のいずれか一方を使用したかまたは双方を使用したかにかかわりなくすべての場合にＡＲＭ１および／またはＡＲＭ２発現エンハンサー要素を使用するとタンパク質の発現レベルが向上した。組換えタンパク質産物の発現レベルはＡＲＭエンハンサー非含有の対照発現系に比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、９倍、１０倍、１３倍、１６倍および１８倍を上回る増加を示した（後出の実施例の項参照）。さらに、ＡＲＭ１またはＡＲＭ２またはＡＲＭ１およびＡＲＭ２の双方を担持する発現ベクターを使用して得られた高発現レベルはトランスフェクト宿主細胞中で経時的に安定に維持されていた。

ＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列はマトリックス／スカフォールド付着領域配列が比較的豊富な領域を有している。（ＭＡＲ／ＳＡＲ；参照：たとえばＭｉｃｈａｌｏｗｓｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：１２７９５−１２８０４（１９９９）；Ｔｉｋｈｏｎｏｖら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１２：２４９０−２６４（２０００）米国特許Ｎｏ．７，１２９，０６２；Ｂｏｄｅら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１６２Ａ：３８９−４５４（１９９５）；Ｂｏｄｅら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，６：１１５−１３８（１９９６））。ＡＲＭ１の場合にはＭＡＲ配列モチーフが特に配列の３’末端領域に集中しており、ＡＲＭ２の場合にはＭＡＲモチーフのクラスターが配列の５’および３’末端領域の双方に出現し、配列の中間領域に存在するＭＡＲモチーフは少ない。欠失解析は、ＡＲＭ２核酸の約１２６０塩基対の３’末端領域がＡＲＭ２増進タンパク質発現活性に不可欠な配列を含有することを示す（後出の実施例６参照）。

本発明のｒＥＶＥ分子は、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列の発現増進性部分またはフラグメントを含む核酸分子を含む。ＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列のこのような発現増進性部分は、目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子と同じ発現ベクターに存在するとき、発現ベクターを含有する宿主細胞中の組換えタンパク質の発現レベルを、ＡＲＭ１またはＡＲＭ２配列のこのような部分またはフラグメントの非存在下で得られた発現レベルに比較して増進する。

この文中に記載のｒＥＶＥ部分は単独で使用されてもよくまたは宿主細胞中の（１種以上の）所望の組換えタンパク質の産生レベルを向上させる他のいずれかの調節要素または発現増進系と併用されてもよい。このような他の配列または系は非限定的に、（１つ以上の）目的組換えタンパク質をコードする（１つ以上の）遺伝子の転写をコントロールまたは最適化する調節プロモーターの使用、宿主細胞による（１つ以上の）組換えタンパク質の分泌を指令するシグナル配列の使用、および、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）−メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅プロトコルまたはグルタミンシンテターゼプロトコルのような遺伝子増幅方法の使用を含む。ＤＨＦＲ−ＭＴＸ増幅手順においては、ＤＨＦＲ遺伝子を含む発現ベクターを担持している宿主細胞をメトトレキセートに対する濃度増加耐性に基づいて選択する（参照：たとえばＫａｕｆｍａｎ，ＲＪ．，Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ（ｅｄ．Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ），ｖｏｌｕｍｅ ９，ｐａｇｅ １５５（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。典型的には、メトトレキセート耐性レベルの上昇に伴って（１つ以上の）組換え遺伝子のコピー数の増幅が生じ、これに対応して（１つ以上の）このような増幅遺伝子による組換えタンパク質の発現レベルが増幅（向上）する。

配列１および配列２の核酸配列はＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞系から得られたＤＮＡ分子から同定された。配列１、配列２のヌクレオチド配列またはこれらの配列のいずれかの部分を含む核酸分子を作製するために様々な方法のいずれかを使用し得る。このような方法は非限定的に、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡ由来のこのような配列を含む１つ以上のｒＥＶＥ ＤＮＡ分子のクローニング、このような配列を含むポリヌクレオチドを産生する固相核酸合成プロトコル、組換え核酸技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコル、全自動核酸シンセサイザーおよびそれらの組合せを含む。この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子はまた、注文設計の核酸分子商品の供給業者から購入できる。ｒＥＶＥの産生または合成方法に制限はなく、当業者はどの方法またはどの組合せがこの文中に記載の特定ｒＥＶＥの作製に最適であるかを判断できる。

この文中に記載のｒＥＶＥは、宿主細胞中の発現ベクターからの様々なタンパク質（ペプチド、ポリペプチドおよびオリゴマータンパク質を含む）のいずれかの発現を増進するために発現ベクターに挿入され得る。核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子上で（１つ以上の）ヌクレオチドコーディング配列が既知であるかまたは入手可能であるならば、当業界で利用できる様々な方法のいずれかを使用して目的タンパク質の（１つ以上の）コーディング配列または全機能遺伝子を発現ベクターに挿入し得る。コーディング配列は発現が望まれる宿主細胞型の細胞中で機能するプロモーターに作動可能に連結されている。宿主細胞中で所望の（１つ以上の）タンパク質の適正発現を得るために追加の転写配列および翻訳配列もベクターに組込み操作できる。

適正宿主細胞中の発現ベクターからの広範な種類のタンパク質（ペプチド、ポリペプチドおよびオリゴマータンパク質を含む）のいずれかの発現は、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質（すなわち、細胞、組織または器官に構造または支持を与えるタンパク質）、リボソームタンパク質、酵素、チモーゲン、様々な抗体分子（非限定的に、アダリムマブのようなＴＮＦ−αに対する抗体；セレクチンに対する抗体；ＩＬ−１３に対する抗体のような免疫調節タンパク質に対する抗体；ＤＶＤ−ＩＧ^ＴＭ二元性可変ドメイン免疫グロブリン分子のような二元性可変ドメイン免疫グロブリン分子に対する抗体；細胞表面受容体に対する抗体を含む）、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経作動性ペプチド、免疫調節タンパク質（たとえば、インターロイキン、サイトカイン、リンホカイン）、血液成分タンパク質、イオンゲートタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、上記タンパク質のいずれかの機能フラグメント、上記タンパク質のいずれかのエピトープ含有フラグメントおよびそれらの組合せを非限定的に含むこの文中に記載の１つ以上のｒＥＶＥによって増進され得る。

目的の組換えタンパク質は、組換えタンパク質をコードしておりこの文中に記載の発現ベクター分子上に存在している１つ以上の遺伝子を転写し翻訳することによって産生され得る。この文中に記載した遺伝子を含む発現ベクター上の１つ以上の遺伝子のこのような転写および翻訳は無細胞転写／翻訳系を使用することによってまたは発現ベクター分子を含有し発現ベクター分子上に存在する１つ以上の遺伝子から目的の組換えタンパク質を産生するために必要な適正な細胞性転写および翻訳機構を有している適正な宿主細胞を使用することによって行う。

スカフォールド付着領域（ＳＡＲ）とも呼ばれるマトリックス付着領域（ＭＡＲ）は、真核細胞の核内のスカフォールドまたはマトリックスを形成すると考えられる核タンパク質の調製物に結合する染色体ＤＮＡのフラグメントとして初めて同定された。ＭＡＲは核マトリックスに付着するクロマチンのループ中に存在しクロマチンの個々の構造単位の形状を規定するかまたは境界を画定すると考えられている。ＭＡＲはいくつかのエンハンサー配列に連合しているか、および／または、転写、トランスジーン発現、トランスジーン再編成、組換え、複製およびトランスフェクションの安定化のようなクロマチン中で生じる多くのプロセスに関連している（参照：たとえばＭｉｃｈａｌｏｗｓｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：１２７９５−１２８０４（１９９９）；Ｚｈｏｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（２１）：１１９７０−１１９７５（１９９９）；Ｔｉｋｈｏｎｏｖら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１２：２４９−２６４（２０００）；Ｚｈｏｕら，Ｇｅｎｅ，２７７：１３９−１４４（２００１）；Ｓｕｍｅｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：１７３７−１７４３（２００３）；米国特許Ｎｏ．７，１２９，０６２；Ｂｏｄｅら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１６２Ａ：３８９−４５４（１９９５）；Ｂｏｄｅら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，６：１１５−１３８（１９９６））。ＡＲＭ１（配列１）およびＡＲＭ２（配列２）は様々なＭＡＲ要素を有しており、これらは、３’および／または５’末端領域に主としてクラスターとして局在すると考えられる。ＡＲＭ１は３’末端領域にＭＡＲ要素のクラスターを含有している。ＡＲＭ２の場合にはＭＡＲ要素がｒＥＶＥ配列の全長にわたって見出され、ＭＡＲモチーフのクラスターが５’および３’の双方の末端領域に局在している。明らかに、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２の配列を担持しているベクターおよび他の核酸分子はＭＡＲ要素およびＭＡＲ要素クラスターの好都合なソースである。従って、ＡＲＭ１、ＡＲＭ２およびそれらのＭＡＲ含有部分は、組換えを行うためまたは核酸分子に核酸配列情報を他の経路で伝達するために当業界で利用できる様々な方法のいずれかを使用して目的の核酸分子中のＭＡＲ要素の数を増加させるために使用し得る。

この文中に記載のｒＥＶＥの配列またはその一部分を含む核酸分子はまた、他の核酸分子中のｒＥＶＥ配列を操作、同定、産生または増幅するための当業界で公知の様々な手順において使用し得る。このような手順は非限定的に、ｒＥＶＥまたはその一部分を当業界で公知の様々な核酸ハイブリダイゼーション法のいずれかでプローブとしてまたは当業界で公知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順のいずれかでプライマーとして使用する手順を含む。

この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子は目的の組換えタンパク質を産生する方法に使用し得る。好ましくは、目的の組換えタンパク質を産生するこのような方法は、目的の組換えタンパク質をコードする１つ以上の組換え遺伝子と少なくとも１つのこの文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子とを含むこの文中に記載の組換え発現ベクターを含んでおり、組換え発現ベクター上に存在する１つ以上の組換え遺伝子を転写および翻訳して目的の組換えタンパク質を産生する段階を含む。発現ベクターによる１つ以上の組換え遺伝子の転写および翻訳は好ましくは、発現ベクターを含みかつ目的の組換えタンパク質の発現を推進する条件下で培養される宿主細胞中で行われる。ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子は宿主細胞中の発現ベクターによる１つ以上の目的の組換えタンパク質の発現レベルを、一過性発現（たとえばトランスフェクトＣＯＳまたはＨＥＫ２９３宿主細胞中）であるかまたは安定発現（たとえばトランスフェクトＣＨＯ宿主細胞中）であるかにかかわりなく、増進するために使用され得る。この文中に記載のｒＥＶＥを担持する発現ベクターからの１つ以上の組換え遺伝子の転写および翻訳はまた、当業界で利用できるインビトロ無細胞転写／翻訳系を使用して行うこともできる。

この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子は、ＤＨＦＲ−メトトレキセート増幅手順を使用して発現レベルが増幅（向上）したときに組換えタンパク質を高レベルで安定（一過性の逆）に発現する宿主細胞を調製するために使用し得る。このような宿主細胞は、メトトレキセートの存在下で増殖するときだけでなくメトトレキセートの非存在下で増殖するときすなわちメトトレキセートの存在によって与えられる高発現選択圧力の非存在下で増殖するときにも組換えタンパク質の高レベル発現を継続するメトトレキセート耐性（ＭＴＸ耐性）細胞である。好ましい実施態様において、このようなメトトレキセート耐性宿主細胞の製造方法は、
目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
ｒＥＶＥまたはその発現増進性部分と、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子と、
を含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、
目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するためにメトトレキセートの存在下で宿主細胞を増殖させる段階と、
メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と、
を含み、単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセート感受性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現すること、および、該メトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセートの存在下または非存在下で増殖したときに組換えタンパク質を高レベルで安定に発現することを特徴とする。好ましくはｒＥＶＥが配列１、配列２またはそれらの発現増進性部分を含む。より好ましくはｒＥＶＥが配列２を含む。

この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子はまた、組換えタンパク質を発現する宿主細胞集団がメトトレキセートの存在下の増殖に適応する能力を改善する方法に使用し得る。好ましい実施態様においてこのような方法は、
目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
配列１、配列２、配列１の一部分、配列２の一部分およびそれらの組合せから成るグループから選択された配列を含む組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）ポリヌクレオチド分子と、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子と、
を含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階を含み、メトトレキセートの存在下で増殖させたときに、発現ベクターを含有している宿主細胞集団が該ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子の欠如した発現ベクターを担持している宿主細胞集団に比較してより高い生存率および／またはより高い増殖速度を有していることを特徴とする。

この文中に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子はまた、ＤＨＦＲ−メトトレキセート増幅手順を使用する宿主細胞中の組換えタンパク質の発現の増幅（向上）を増進するために使用し得る。好ましい実施態様においてこのような方法は、
目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
配列１、配列２、配列１の一部分、配列２の一部分およびそれらの組合せから成るグループから選択された配列を含むｒＥＶＥポリヌクレオチド分子と、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子と、
を含む発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、
目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するために宿主細胞をメトトレキセートの存在下で増殖させる段階と、
メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と、
を含み、単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセートの存在下で該ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子の欠如した発現ベクターを含有するメトトレキセート耐性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現することを特徴とする。

（１種以上の）所望の組換えタンパク質の増幅発現にメトトレキセート選択を使用するこの文中に記載の方法において、メトトレキセートは２０ｎＭから５００ｎＭの範囲で使用し得る。しかしながら、５ｎＭから１０μＭのようなもっと低いおよびもっと高いメトトレキセート濃度が発現を増幅するためのメトトレキセート選択に使用されて成功結果を与えるという利点も当業者は認識している（参照：たとえばＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５：５３７−５６６（１９９０））。

本発明はまた、発現ベクターによる組換えタンパク質の発現を低下、実質的に抑制または本質的にサイレンシングさせる方法を提供する。このような方法は、全長ｒＥＶＥ配列を使用したときよりも低いレベルで特定の組換え遺伝子産物を発現する、この文中に記載のｒＥＶＥ配列の１つ以上のフラグメントを含む発現ベクターを使用し得る。このような発現低下性または発現抑制性のｒＥＶＥ由来配列は、配列２の塩基１−１０８６または配列２の塩基１−４６１の塩基配列を有しているＡＲＭ２配列の欠失変異体を含む。これらの２つの変異体から欠失した３’末端配列領域の存在が組換えタンパク質のｒＥＶＥ媒介性増幅発現に極めて望ましいことは明白である。配列２の塩基１−４６１のＡＲＭ２欠失配列を有している核酸分子は、宿主細胞中の発現ベクター分子からの組換えタンパク質の発現を抑制するかまたは実質的にサイレンシングさせるために特に有用である。このような方法は、組換えタンパク質の発現が宿主細胞に有毒である懸念が存在する場合、または、ある種の発現レベルが所望のタンパク質の精製もしくは単離に対してタンパク質凝集のような問題を生じる場合を非制限的に含むいくつかの状況に用途を見出す。

すなわち、配列２の塩基４６２−２４２２の配列および配列２の塩基１０８７−２４２２の配列は組換えタンパク質発現のＡＲＭ２ ｒＥＶＥ媒介性増進を最大にするために最も好ましい。したがって、組換えタンパク質の発現を増進するために特に有用なｒＥＶＥポリヌクレオチドは、配列２の塩基４６２−２４２２の配列および配列２の塩基１０８７−２４２２の配列を含む。

本発明のその他の実施態様および特徴は以下の非限定実施例から明らかであろう。

ＡＲＭ１およびＡＲＭ２組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）のクローニングおよび配列解析
宿主ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした発現ベクターにコードされている組換え抗−ＩＬ−１２抗体の極めて高い発現レベルの根拠を確かめるために、安定に組込まれた発現ベクターを担持するＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞系を試験した。この試験では、組込まれた発現ベクターに隣接するゲノムＤＮＡの領域をクローニングし配列決定した。簡単に説明すると、宿主細胞から得られたゲノムＤＮＡをＸｂａＩで消化し、基本的にＲｅｙｎａｕｄら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４０：４８１−５０４（１９８０））によって記載された方法でＢｉｏＧｅｌ Ａ−５０カラムを使用して平均サイズ約５キロ塩基（ｋｂ）のフラグメントを精製した。精製したゲノムフラグメントのライブラリーはフラグメントをラムダ（λ）ＤＡＳＨ^（Ｒ）クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローニングすることによって調製した。ライブラリーを増幅し、ＧＩＧＡＰＡＣＫ^（Ｒ）パッケージングエキストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してパッケージし、製造業者のプロトコルに従ってＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡまたはＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞に形質導入した。次にＳｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコルに従って抗−ＩＬ−１２抗体のＨ鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）のコーディング配列に対するプローブでライブラリーをスクリーニングした。λＤＡＳＨクローン＃２１中の１４．５ｋｂのＸｂａＩフラグメントは抗体発現ベクター挿入部位をフラクキングゲノム配列と共に含有していた。これらのフランキングゲノム領域をＡＲＭ１およびＡＲＭ２と命名した。ＡＭＲ１領域およびＡＲＭ２領域の配列はそれぞれ配列１および配列２の配列であることが判定された。ＣＨＯ細胞ゲノム中の抗体発現ベクター挿入部位に関しては、ＡＲＭ１は挿入部位の上流で抗体Ｈ鎖ベクター遺伝子の転写方向に対して５’側に局在し、ＡＲＭ２は挿入部位の下流で抗体Ｌ鎖ベクター遺伝子の転写方向に対して３’側に局在する。

ＣＨＯ発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースに対する配列１および配列２のＢＬＡＳＴ解析は、何らかの近縁コーディング配列を示すことができなかった。これは、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２ ｒＥＶＥ配列がＣＨＯコーディング配列を含有しないことを示唆する。マウスゲノムに対してもｒＥＶＥ配列のＢＬＡＳＴ解析を行った。ＡＲＭ１配列に相同のマウスゲノム配列は同定されなかった。しかしながら、ＡＲＭ２配列は未知のコーディング配列を含有するマスウ染色体１４上の高度に保存された領域に近縁であると考えられる。

また、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ配列解析プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ＡＲＭ１（配列１）およびＡＲＭ２（配列２）の配列をマトリックス付着領域（ＭＡＲ）要素に対する様々な代表的（すなわち全部でない）ヌクレオチド配列モチーフのサンプリングの存在に基づいてスクリーニングした（参照：たとえばＭｉｃｈａｌｏｗｓｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：１２７９５−１２８０４（１９９９））。コンピュータープログラムによってスクリーニングされた特異的ＭＡＲ ＤＮＡ配列モチーフを表１に示す（相補鎖配列は表示しない）。

以下の表２に示すように、ＡＲＭ１ ＤＮＡ配列（配列１）またはその相補鎖配列中の少なくとも４１のＭＡＲ要素配列が同定され、ＡＲＭ２ ＤＮＡ配列（配列２）またはその相補鎖配列中の少なくとも１１４のＭＡＲ要素配列が同定された。

表２のＡＲＭ１およびＡＲＭ２のＭＡＲ配列解析（相補鎖解析を含んでいた）の結果は、様々なＭＡＲが主としてＡＲＭ１（配列１）の３’末端部分およびＡＲＭ２（配列２）の５’部分および３’部分の双方においてクラスター化していることを示す。ＡＲＭ１が有しているこれらのＭＡＲＳ部位の数はＡＲＭ２よりも少ない。さらに、ＡＲＭ１中のＭＡＲ配列の大半は配列の３’領域に存在するが、ＡＲＭ２の５’および３’の双方の領域にＭＡＲ配列集団が存在する。

組換えタンパク質の発現レベルに対するＡＲＭ１およびＡＲＭ２ ｒＥＶＥの影響を試験するための一般的プロトコル
発現試験用細胞
ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞系は、ジヒドロ葉酸レダクターゼの発現が欠失している（ＤＨＦＲ⁻）ＣＨＯ細胞系である（参照：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４２１６−４２２０（１９８０））。この細胞系のＤＨＦＲ⁻表現型は、これらの細胞にトランスフェクトされた発現ベクターのコピー数を増幅するために標準ジヒドロ葉酸レダクターゼ−メトトレキセート系（ＤＨＦＲ−ＭＴＸ）プロトコルを使用できる（参照：たとえばＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．， Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ｅｄ．Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ），ｖｏｌｕｍｅ ９，ｐａｇｅ １５５（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。

ＡＲＭ１およびＡＲＭ２ ｒＥＶＥ配列を含有する発現ベクター
図１は、プラスミド発現ベクターｐＡ２０５の概略図を提示する。図２は、ＡＲＭ１配列がアダリムマブのＨ鎖の遺伝子の上流に局在しＡＲＭ２配列がアダリムマブのＬ鎖の遺伝子の下流に局在するようにＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列がアダリムマブのＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に隣接しているプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ｇｅｎｏｍｉｃの概略図を提示する。図３は、ＡＲＭ１配列がアダリムマブのＨ鎖の上流に局在するプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａ１の概略図を提示する。図４は、ＡＲＭ２配列がアダリムマブのＬ鎖の遺伝子の下流に局在するプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａ２の概略図を提示する。

図５は、ヒト抗−ＥＬ−セレクチン抗体のＨ鎖およびＬ鎖の遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターｐＣＨＯＥＬ２４６ＧＧｈｕｍの概略図を提示する。図６は、ＡＲＭ１配列が抗体Ｈ鎖遺伝子の上流に局在しＡＲＭ２配列が抗体Ｌ鎖遺伝子の下流に局在するようにＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列が抗−ＥＬ−セレクチン抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に隣接しているプラスミド発現ベクターｐＡ−Ｇｅｎ−ＥＬ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎの概略図を提示する。

図７は、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターｐＡ２０５−ｅＧＦＰの概略図を提示する。図８は、ＡＲＭ１配列がｅＧＦＰ遺伝子の上流に局在しＡＲＭ２配列がｅＧＦＰ遺伝子の下流に局在するようにＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列が増強緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子に隣接しているプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ｇ−ｅＧＦＰの概略図を提示する。

図９は、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩによるＡＲＭ２ ＤＮＡ消化の結果として配列１の塩基１−１０８６の核酸塩基配列を有している欠失ＡＲＭ２変異体“Ａ２（ｂｐ１−１０８６）”によってＡＭＲ２配列が置換されている以外は図４に示した発現ベクターｐＡ２０５Ａ２に本質的に等しいプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａ２−Ｓｐｅ−ｔｒｕｎｃの概略図を提示する。図１０は、制限エンドヌクレアーゼＳｗａＩによるＡＲＭ２ ＤＮＡ消化の結果として配列２の塩基１−４６１の核酸塩基配列を有している欠失ＡＲＭ２変異体“Ａ２（ｂｐ１−４６１）”によってＡＭＲ２配列が置換されている以外は図４に示した発現ベクターｐＡ２０５Ａ２に本質的に等しいプラスミド発現ベクターｐＡ２０５Ａ２−Ｓｗａ−ｔｒｕｎｃの概略図を提示する。

培養培地
αＭＥＭは最小必須培地、α培地（ＧＩＢＣＯ^（Ｒ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。

細胞の増殖およびトランスフェクション
トランスフェクションあたり３つの１０ｃｍ組織培養プレートのおのおのに５％の透析ＦＢＳおよびＨ／Ｔ（ＧＩＢＣＯ）を補充した１０ｍｌのαＭＥＭ中の１×１０^６のＢ３．２親ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞を播種した。以下に示すいくつかの変更を加えたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｖ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ， ．Ａ．およびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編），（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０））に記載のリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコルに従って、これらの細胞をその後１８時間トランスフェクトした。増殖培地を吸引によって培養プレートから除去し、９ｍｌのＨａｍ Ｆ１２倍地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各プレートに加えた。トランスフェクションの前にプレートを３７℃で２時間インキュベートした。

リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコル
５０ｍｌ容の円錐管で７５マイクログラム（７５μｇ）のＤＮＡを１．３５ｍｌの水に溶解した。１５０マイクロリットル（１５０μｌ）の２．５ＭのＣａＣｌ_２を添加し、このＤＮＡ−カルシウム混合物を、５０ｍｌ容の円錐管に入れた１．５ｍｌの２×ＨｅＢＥＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）に滴下した。ＨｅＢＥＳをピペットで吹込みながらＤＮＡ−カルシウム混合物をパスツールピペットで添加した。混合物を５秒間渦流混合し、室温で２０分間インキュベートした。１ミリリットル（１ｍｌ）のＤＮＡ−カルシウム混合物を付着細胞の培養皿のおのおのに均等に分配し、増殖させ、上述のようなＦ１２培地中のトランスフェクション用に調製し、次いで培養物を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを吸引し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む２ｍｌのＦ１２倍地を各プレートに添加した（ＤＭＳＯショック処理）。ＤＭＳＯショックを１分間続けた後、５ｍｌのＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）を各プレートに加えてＤＭＳＯを希釈した。プレートを吸引し、ＰＢＳでさらに２回洗浄した。１０ｍｌのαＭＥＭ／５％のＦＢＳ／ＨＴを添加し、プレートを３７℃で一夜インキュベートした。

９６−ウェルプレートへのトランスフェクト細胞の播種およびメトトレキセート（ＭＴＸ）増幅
翌日、以下の手順で細胞を９６−ウェルプレートに播種した。全部の１０ｃｍプレートからトリプシン消化によって細胞を採取し、２０００細胞／ｍｌの密度でαＭＥＭ／５％ＦＢＳに再浮遊させた。９６個の９６−ウェルプレートに１０ｍｌ／プレート、１００μｌ／ウェルで播種した。１週後、２週後、およびそれから５週後に９６−ウェルプレートの培地を交換した。使用した培地αＭＥＭ／５％ＦＢＳはＤＨＦＲ発現細胞選択的であった。

最終培地交換の２日後、培養上清を１：４０に希釈し、アダリムマブまたは抗−ＥＬ−セレクチン抗体の発現を検出するためにヒトＩｇＧガンマ鎖に特異的なＥＬＩＳＡで試験した。最も高いＥＬＩＳＡシグナルを与えたクローンを９６−ウェルプレートから２．０ｍｌ／ウェルのαＭＥＭ／５％ＦＢＳ中の１２−ウェルプレートに移した。集密単層状態に達すると（約２から５日後）これらを再びアッセイにかけ、２０ｎＭのＭＴＸを加えた同じ培地にクローンを分割して増幅した。最初に細胞を１２−ウェル組織培養プレート中のαＭＥＭ／５％ＦＢＳおよび２０ｎＭのＭＴＸで選択した。このＭＴＸレベルの初期選択後のこれらの細胞を、２０ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中、１８日の平均期間で最少でもさらに２回以上継代した。次に細胞系を１００ｎＭ ＭＴＸに増幅した。この培養期間中、培養物のアダリムマブ（ヒト抗−ＴＮＦ−α抗体）または抗−ＥＬ−セレクチン産生率は増加した。１００ｎＭ ＭＴＸレベルで選択後、系を１００ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中、１８日の平均期間で最少でもさらに２回以上継代した。指示がある場合には細胞系をさらに５００ｎＭ ＭＴＸに増幅した。５００ｎＭ ＭＴＸレベルで選択後、系を５００ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中、１８日の平均期間で最少でもさらに２回以上継代した。

ＡＲＭ１核酸配列（配列１）、ＡＲＭ２核酸配列（配列２）またはＡＲＭ１配列とＡＲＭ２配列との組合せを含む発現ベクターを担持しているトランスフェクトＣＨＯ細胞の培養物は、このようなｒＥＶＥ配列の欠如した同じ発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に比較してメトトレキセートの存在によく適応した。すなわちより高い生存率および／またはより高い増殖速度を示した。

トランスフェクトＣＨＯ細胞中の抗−ＴＮＦ−αの発現レベルに対するＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列の効果
この試験では、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中の抗−ＴＮＦ−α抗体（アダリムマブ）の発現に対するＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列の効果を試験した。発現ベクターｐＡ２０５（ＡＲＭ配列非含有）、ｐＡ２０５Ｇｅｎｏｍｉｃ（ＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列の双方を含有）、ｐＡ２０５Ａ１（ＡＲＭ１含有）またはｐＡ２０５Ａ２（ＡＲＭ２含有）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中のアダリムマブの発現レベルを比較した。表３は、指示された増幅レベルの各ベクタートランスフェクションから得られた上位３つの生産性クローンの付着培養物中のアダリムマブの平均産生レベルを示す（メトトレキセート濃度、“ＭＴＸ”）。

表３のデータは、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列が単独でもまたは組合せても、ＡＲＭ配列の欠如したベクター（ｐＡ２０５）でトランスフェクトされた細胞で見られたレベルに比較してアダリムマブの発現レベルを増進させたことを示す。総合的には、ＡＲＭ２単独（ｐ２０５Ａ２）はすべての他のトランスフェクタントに比べて最大の増進発現レベルを提供したが、ＡＲＭ１単独（ｐ２０５Ａ１）は最も低い増進発現レベルを提供した。データは、ＡＲＭ１配列（配列１）またはＡＲＭ２配列（配列２）を有している単離核酸分子が代表的な組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）であり、これらは発現ベクターに挿入されたときに、発現ベクターによってコードされ発現ベクターから発現される組換えタンパク質の発現を増進できることを示す。

またメトトレキセート増幅の非存在下の懸濁培養物中で上記のベクタートランスフェクションの個々のクローンによるアダリムマブの発現レベルを１週後および４週後に比較した。結果を表４に示す。

表４のデータは、ＡＲＭ１を伴わずにｐＡ２０５にＡＲＭ２が組込まれると（ｐＡ２０５Ａ２）、アダリムマブの増進発現レベルの安定性が経時的に増加することを示す。特に、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２の双方が存在（ｐＡ２０５Ｇｅｎｏｍｉｃ）またはＡＲＭ１単独が存在（ｐＡ２０５Ａ１）する場合、培養物中のアダリムマブの増進発現レベルが最初は観察されたが、このレベルは数週間のうちにはるかに低いレベルに急速に低下した（表４参照）。対照的に、ＡＲＭ２単独（ｐＡ２０５Ａ２）の存在下でアダリムマブを発現する細胞培養物中ではアダリムマブの増進発現レベルが４つの培養物中の３つにおいて４週という期間後も安定に維持された。したがって、ＡＲＭ２はトランスフェクトＣＨＯ細胞の懸濁培養物中のアダリムマブの発現レベルの有意な向上を維持している。

トランスフェクトＣＨＯ細胞中の抗−ＥＬ−セレクチン抗体の発現レベルに対するＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列の効果
この試験では、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中のヒト−ＥＬ−セレクチン抗体（Ｅ−およびＬ−セレクチンに結合する）の発現に対するＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列の効果を試験した。この抗−セレクチン抗体の発現レベルを、発現ベクターｐＣＨＯＥＬ２４６ＧＧｈｕｍ（ＡＲＭ配列非含有）または発現ベクターｐＡ−Ｇｅｎ−ＥＬ−セレクチン（ＡＲＭ１およびＡＲＭ２の双方を含有）で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で比較した。表５は、指示された増幅レベルの各ベクタートランスフェクションから得られた上位３つの生産性クローンの付着培養物中の抗−セレクチン抗体の平均産生レベルを示す（メトトレキセート濃度、“ＭＴＸ”）。

表５のデータは、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のメトトレキセート増幅培養物中の抗−ＥＬ−セレクチン抗体の発現レベルの向上にＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列（ｐＡＧｅｎ−ＥＬ−セレクチン）が有効であったことを示す。

トランスフェクトＣＨＯ細胞中の増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現レベルに対するＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列の効果
安定なトランスフェクタントの選択可能マーカーすなわちヒグロマイシン耐性を与えるｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏと細胞とをコトランスフェクトした以外は上記と同様にして、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子を含有する構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。発現ベクターｐｅＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターの転写コントロール下のｅＧＦＰの発現の陽性対照を提供する。プラスミドｐＡ２０５−ｅＧＦＰはＡＲＭ１またはＡＲＭ２配列のないｐＡ２０５発現ベクター上にｅＧＦＰ遺伝子を含有している（図７）。プラスミドｐＡ２０５Ｇｅｎ−ｅＧＦＰ（図８）は、ｅＧＦＰをコードする遺伝子に隣接するＡＲＭ１およびＡＲＭ２の双方を含有している。これらのプラスミドのいずれにもＤＨＦＲ選択遺伝子は存在しない。従って、ＤＨＦＲ−メトトレキセート増幅段階は行わなかった。４００μｇ／ｍｌの濃度のヒグロマイシンでトランスフェクタントを２週間選択し、必要ならば分割し、次にＦＡＣＳによって選別して発現レベルを決定した。最初に細胞を各種ベクター用プールに選別し、発現性の細胞をさらに２週間増殖させ、次いで再度選別した。

表６のデータは、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列は、ＡＲＭ配列の欠如した同じｅＧＦＰ発現ベクター（ｐＡ２０５−ｅＧＦＰ）でトランスフェクトされた細胞中の発現レベルに比較して、トランスフェクトＣＨＯ細胞中のｅＧＦＰの発現レベルを有意に増進するために有効であったことを示す。

トランスフェクトＣＨＯ細胞中のアダリムマブの発現レベルに対するＡＲＭ２欠失突然変異体の効果
ｐＡ２０５Ａ２ベクター中のＡＲＭ２配列（配列２）の３’末端領域をＳｐｅＩ開裂部位（配列２の塩基１０８６）またはＳｗａＩ開裂部位（配列２の塩基４６１）まで欠失させてそれぞれｐＡ２０５Ａ２−Ｓｐｅ−ｔｒｕｎｃ（配列２の塩基１−１０８６含有）およびｐＡ２０５Ａ２−Ｓｗａ−ｔｒｕｎｃ（配列２の塩基１−４６１含有）を作製した。得られたプラスミドを上述のようにＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、２０ｎＭ ＭＴＸに増幅した。表７は各増幅レベルで各トランスフェクションから得られた上位３つの生産性クローンの付着培養物中の平均発現レベルを示す。

表７のデータは、ＡＲＭ２ ＤＮＡの５’末端の１０８６塩基対を含有する発現ベクターｐＡ２０５Ａ２−Ｓｐｅ−ｔｒｕｎｃが、ｐＡ２０５ Ａ２ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に比較して低い増進発現レベルでアダリムマブを産生したことを示す。意外にも、ＡＲＭ２ ＤＮＡの５’末端の４６１塩基対を含有する発現ベクターｐＡ２０５Ａ２−Ｓｗａ−ｔｒｕｎｃでトランスフェクトされた細胞は、ＡＲＭ配列を全く含有しないｐＡ２０５でトランスフェクトされた細胞よりもさらに低い発現レベルでアダリムマブを産生した。表７のデータは、ＡＲＭ２ ＤＮＡの３’末端からの欠失領域が宿主細胞中の組換えタンパク質の増進発現に特別に重要であることを示す。さらに、ＡＲＭ２ ＤＮＡの比較的短いすなわち４６１塩基対の５’末端フラグメントの存在は単独でトランスフェクト宿主細胞中の組換え遺伝子産物の発現を現実に減少させると考えられ、組換え遺伝子産物の発現を実質的に低下させるかまたはサイレンシングさせるために特に有用であろう。たとえばいくつかの培養条件下で遺伝子産物の発現が宿主細胞に有毒であるかまたは宿主細胞に望ましくないときにはこれらの利用が望ましい。

先行試験の個々のトランスフェクタントの発現レベル
以下に示す表は上述の試験で生成された個々のトランスフェクトクローンによって産生された組換えタンパク質の発現レベルを示す。

抗−ＩＬ−１３抗体の発現増進
この試験は、安定にトランスフェクトされた哺乳類の培養細胞中のヒト化抗−ＩＬ−１３抗体のｒＥＶＥ媒介性発現増進をｒＥＶＥの欠如した発現ベクターでトランスフェクトされた細胞に比較して示す。

ヒトＩｇＧγアイソタイプを有しているヒト化抗−ＩＬ−１３モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡ分子（参照、米国出願Ｎｏ．１１／８９９，８１９、参照によってここに組込まれるものとする）を、ＤＨＦＲ−ＭＴＸ増幅可能発現プラスミドである発現ベクタープラスミドｐＢＪに標準方法を用いて挿入し、発現プラスミドｐＢＪ−１３Ｃ５．５（親発現プラスミド）を作製した。次に、ＡＲＭ２配列（配列２）を含むｒＥＶＥポリヌクレオチドをプラスミドｐＢＪ−１３Ｃ５．５に挿入して、ｒＥＶＥ含有発現プラスミドｐＡ２−１３Ｃ５．５（ＡＲＭ２ ｒＥＶＥ発現プラスミド）を作製した。

先行実施例に記載した一般トランスフェクションプロトコルに従って、ＣＨＯ細胞に親発現プラスミドｐＢＪ−１３Ｃ５．５またはＡＲＭ２−含有ｒＥＶＥ発現プラスミドｐＡ２−１３Ｃ５．５をトランスフェクトし、安定なトランスフェクタントＣＨＯ細胞を取得した。トランスフェクションの２４時間後、各トランスフェクションで得られた細胞を４８の９６−ウェル培養プレートに播種した（２００細胞／ウェル）。個々のウェルの培養培地をヒトＩｇＧ発現に基づいてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＡＲＭ２ ｒＥＶＥ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞培養物（ウェル）の光学密度は親発現プラスミドをトランスフェクトした細胞よりもやや高い値であった。細胞に親プラスミドｐＢＪ−１３Ｃ５．５をトランスフェクトしたときはプレートあたり平均６８のコロニーであったのに比べて細胞にＡＲＭ２ ｒＥＶＥプラスミドｐＡ２−１３Ｃ５．５をトランスフェクトしたときは培養プレートあたり平均７４のコロニーが選択プロセスで生存した。各トランスフェクションで得られた平均１５の安定にトランスフェクトされたクローンを次にＤＨＦＲ−メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅処理した。

増幅の前に、ＡＲＭ２ ｒＥＶＥプラスミドトランスフェクタントクローンから得られた抗−ＩＬ−１３抗体の平均発現レベルは、親プラスミドトランスフェクタントクローンから得られた平均発現レベルの２倍であった。次に２つのプロトコルの双方によって抗体発現を増幅した。上記の実施例２に記載したような基本的ＤＨＦＲ−ＭＴＸ増幅プロトコルを使用しクローンを先ず２０ｎＭのＭＴＸ濃度で選択し、次いで１００ｎＭのＭＴＸ濃度でさらに選択した。他方の増幅プロトコルでは、中間ＭＴＸ濃度の選択を介在させずに直接に１００ｎＭのＭＴＸでクローンを選択した。以下の表１６は、表示した増幅レベル（メトトレキセート濃度、“ＭＴＸ”）を含有する培地中の２回の継代後に各トランスフェクションから得られた上位３つの生産性クローンの培養物中の抗−ＩＬ−１３抗体の平均産生レベルを示す。

表１６のデータは、ＡＲＭ２ ｒＥＶＥ ＤＮＡの欠如した親発現プラスミドを担持するトランスフェクタントから得られた発現レベルに比較してＡＲＭ２ ｒＥＶＥがヒト化抗−ＩＬ−１３抗体の発現レベルを約３倍から５倍に増進することを明らかに示す。さらに、ＡＲＭ２ ｒＥＶＥ発現プラスミドトランスフェクタントの１つのサブクローンは１００ｎＭ ＭＴＸの増幅レベルで増殖させたときにヒト化抗−ＩＬ−１３抗体を９５μｇ／ｍｌという高レベルおよび比産生率２１．７４ｐｇ／細胞／日で発現した。

ＡＲＭ２ ｒＥＶＥ発現プラスミドをトランスフェクトしたクローンによる抗ＩＬ−１３抗体の増幅発現レベルはＭＴＸ選択下で増殖させたときに少なくとも３週間は容易に維持された。

一過性発現系中のアダリムマブの発現に対するＡＲＭ１およびＡＲＭ２ ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子の効果
この試験は、ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子が一過性発現系中で組換えタンパク質の発現レベルを増進するか否かを判定するように設計した。

ＨＥＫ２９３細胞に発現プラスミドベクターｐＡ２０５、ｐＡ２０５Ｇｅｎｏｍｉｃ、ｐＡ２０５Ａ１、ｐＡ２０５Ａ２、ｐＡ２０５Ａ２−Ｓｐｅｃ−ｔｒｕｎｃおよびｐＡ２０５Ａ２−Ｓｗａ−ｔｒｕｎｃをトランスフェクトした。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ^（Ｒ）， ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養したＨＥＫ２９３細胞を、公表された条件（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：Ｅ９）に従ってポリエチレンイミンに複合したプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ベクター組込みの選択はしなかった。トランスフェクション後の細胞を７日間培養し、培養上清のアリコートのアダリムマブ濃度を上述のように試験した。３つのトランスフェクションの結果を表１７に示す。第三のトランスフェクションについては発現レベルを三重複で試験した。

表１７の結果は、ＡＲＭ１およびＡＲＭ２配列が発現プラスミドベクター上に個別に（ｐＡ２０５Ａ１，ｐＡ２０５Ａ２）存在するときまたは組合せて（ｐＡ２０５Ｇｅｎｏｍｉｃ）存在するとき、ＨＥＫ２９３細胞中のアダリムマブの発現レベルが増進されることを示す。このＨＥＫ２９３一過性発現系中でＡＲＭ１はＡＲＭ２よりも高いアダリムマブ発現増進レベルを与えた。これに対してＡＲＭ２はＣＨＯ安定発現系中でＡＲＭ１よりも高いアダリムマブ発現増進レベルを与えた（上記の実施例３参照）。またＣＨＯ安定発現系で見られたように（上記の実例６）、ＡＲＭ２の増進効果は、ＳｐｅＩ−またはＳｗａＩ−欠失ＡＲＭ２配列を担持する発現プラスミドベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中では明らかに減少し、ｐＡ２０５対照（ＡＲＭ配列非含有）プラスミド発現ベクターでトランスフェクトされた細胞中で見られる発現よりも低下していた。

上記明細書に引用したすべての特許、出願および公開は参照によって本発明に組込まれるものとする。

この文中に記載した本発明の他の変更形態および実施態様はいまや当業者に明らかであろう。本発明のこのような変更形態および代替的実施態様は上記の明細書および以下の特許請求の範囲内に包含されることとする。

Claims (47)

1. 配列１のヌクレオチド塩基配列、配列２のヌクレオチド塩基配列、前記配列のいずれかに相補的な配列、前記配列のいずれかの発現増進性部分およびそれらの組合せから成るグループから選択されたヌクレオチド塩基配列を含む単離された組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）ポリヌクレオチド分子。
2. ｒＥＶＥポリヌクレオチド分子が、配列２の塩基４６２−２４２２の配列および配列２の塩基１０８７−２４２２の配列から成るグループから選択された配列２の配列の発現増進性部分を含む請求項１に記載の単離されたｒＥＶＥポリヌクレオチド分子。
3. 請求項１または請求項２に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
4. 組換えベクターが組換え発現ベクターである請求項３に記載の組換えベクター。
5. 組換えプラスミド発現ベクター、組換え真核性ウイルス発現ベクター、組換えバクテリオファージ発現ベクター、組換え酵母ミニ染色体発現ベクター、組換え細菌性人工染色体発現ベクターおよび組換え酵母発現プラスミドベクターから成るグループから選択される請求項４に記載の組換え発現ベクター。
6. 組換え発現ベクターが１つ以上の組換えタンパク質をコードする１つ以上の機能性組換え遺伝子を含む請求項４に記載の組換え発現ベクター。
7. 前記１つ以上の組換えタンパク質が、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、酵素、チモーゲン、抗体分子、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経作動性ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンゲートタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、抗生物質耐性タンパク質、上記タンパク質のいずれかの機能フラグメント、上記タンパク質のいずれか一項のエピトープ含有フラグメントおよびそれらの組合せから成るグループから選択される請求項６に記載の組換え発現ベクター。
8. 抗体分子が、抗−ＴＮＦ−α抗体、抗−ＥＬ−セレクチン抗体、抗−ＩＬ−１３抗体および二元可変ドメイン免疫グロブリン分子から成るグループから選択される請求項７に記載の組換え発現ベクター。
9. 抗−ＴＮＦ−α抗体がアダリムマブである請求項８に記載の組換え発現ベクター。
10. 前記組換え発現ベクターがジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む請求項４から９のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
11. 請求項３から１０のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
12. 宿主細胞が真核性宿主細胞または原核性宿主細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
13. 宿主細胞が、哺乳類宿主細胞、昆虫類宿主細胞、植物宿主細胞、真菌類宿主細胞、真核性藻類宿主細胞、線虫類宿主細胞、原生動物宿主細胞および魚類宿主細胞から成るグループから選択された真核性宿主細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
14. 真核性宿主細胞が哺乳類宿主細胞である請求項１３に記載の真核性宿主細胞。
15. 哺乳類宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞、幼若ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびＭＤＣＫ細胞から成るグループから選択される請求項１４に記載の哺乳類宿主細胞。
16. 哺乳類宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求項１５に記載の哺乳類宿主細胞。
17. 真核性宿主細胞が真菌類宿主細胞である請求項１３に記載の真核性宿主細胞。
18. 真菌類宿主細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＹａｒｒｏｗｉａおよびＣａｎｄｉｄａから成るグループから選択される請求項１７に記載の真菌類宿主細胞。
19. Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞である請求項１８に記載のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ宿主細胞。
20. 真核性宿主細胞が原生動物宿主細胞である請求項１３に記載の真核性宿主細胞。
21. 原生動物宿主細胞がＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ宿主細胞である請求項２０に記載の原生動物宿主細胞。
22. 請求項４から１０のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター上に存在する目的の組換えタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の転写および翻訳を含む目的の組換えタンパク質の産生方法。
23. 前記転写および翻訳が無細胞転写／翻訳系または宿主細胞中で生じる請求項２２に記載の方法。
24. 前記転写および翻訳が宿主細胞中で生じる請求項２３に記載の方法。
25. 前記宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞である請求項２４に記載の方法。
26. 請求項１０に記載の組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、
    目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するためにメトトレキセートの存在下で前記宿主細胞を増殖させる段階と、
    前記メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と、
    を含み、前記単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセート感受性宿主細胞よりも高いレベルで目的の組換えタンパク質を発現すること、および、前記メトトレキセート耐性宿主細胞がメトトレキセートの存在下または非存在下で増殖したときに組換えタンパク質を高レベルで安定に発現することを特徴とする、目的の組換えタンパク質を高レベルで安定に発現する宿主細胞の製造方法。
27. 前記メトトレキセートが５ｎＭから１０μＭの範囲の濃度で存在する請求項２６に記載の方法。
28. 前記宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞である請求項２６に記載の方法。
29. 宿主細胞中の組換え発現ベクターにコードされた目的の組換えタンパク質の発現を増幅するためのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）−メトトレキセート方法において、前記組換え発現ベクターが目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子とＤＨＦＲをコードする遺伝子とを含んでおり、改良が、前記組換え発現ベクターがさらに請求項１または請求項２に記載のｒＥＶＥポリヌクレオチド分子を含み、メトトレキセート存在下の発現ベクター含有宿主細胞の増殖は、メトトレキセートの存在下または非存在下で増殖したときに目的の組換えタンパク質を増幅レベルで安定に発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択し産生することを特徴とする改良方法。
30. 前記メトトレキセートが５ｎＭから１０μＭの範囲の濃度で存在する請求項２９に記載の方法。
31. 前記宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞である請求項２９に記載の方法。
32. 組換えタンパク質を発現する宿主細胞集団のメトトレキセート存在下の増殖適応能力を改善または増進する方法であって、
    目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
    配列１、配列２、配列１の一部分、配列２の一部分およびそれらの組合せから成るグループから選択された配列を含む組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）ポリヌクレオチド分子と、
    ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子と、
    を含む組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階を含み、
    メトトレキセートの存在下で増殖したときに、組換え発現ベクターを含有している宿主細胞集団がｒＥＶＥポリヌクレオチド分子の欠如した同じ組換え発現ベクターを担持している宿主細胞集団に比較して、より高い生存率および／またはより高い増殖速度を有していることを特徴とする方法。
33. 前記メトトレキセートが５ｎＭから１０μＭの範囲の濃度で存在する請求項３２に記載の方法。
34. 前記宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞である請求項３２に記載の方法。
35. 目的の組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子と、
    配列１、配列２、配列１の一部分、配列２の一部分およびそれらの組合せから成るグループから選択された配列を含む組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）ポリヌクレオチド分子と、
    ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子と、
    を含む組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階と、
    目的の組換えタンパク質を発現するメトトレキセート耐性宿主細胞を選択するために宿主細胞をメトトレキセートの存在下で増殖させる段階と、
    前記メトトレキセート耐性宿主細胞を単離する段階と、
    を含み、前記単離されたメトトレキセート耐性宿主細胞はメトトレキセートの存在下で目的の組換えタンパク質をｒＥＶＥ配列の欠如した発現ベクターを含有するメトトレキセート耐性宿主細胞よりも高いレベルで発現することを特徴とする、組換えタンパク質を高レベルで発現するメトトレキセート耐性宿主細胞の製造方法。
36. 前記メトトレキセートが５ｎＭから１０μＭの範囲の濃度で存在する請求項３５に記載の方法。
37. 前記宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞である請求項３５に記載の方法。
38. 第一核酸分子に存在するマトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列の数を増加させる方法であって、前記第一核酸分子に第二核酸分子を挿入する段階を含み、前記第二核酸分子が、配列１、少なくとも１つのＭＡＲ配列を含む配列１の一部分、配列２、少なくとも１つのＭＡＲ配列を含む配列２の一部分およびそれらの組合せから成るグループから選択されたヌクレオチド配列を含む方法。
39. 前記第一核酸分子が、ベクター分子、真核細胞染色体、真核性ウイルスゲノム、原核細胞染色体、原核性ウイルスゲノム、酵母人工染色体および細菌人工染色体から成るグループから選択される請求項３８に記載の方法。
40. 前記第一核酸がベクター分子である請求項３９に記載の方法。
41. 前記ベクター分子が組換え発現ベクター分子である請求項４０に記載の方法。
42. 前記組換え発現ベクターが１つ以上の機能遺伝子を含む請求項４１に記載の方法。
43. 前記１つ以上の機能遺伝子が、可溶性タンパク質、膜タンパク質、構造タンパク質、リボソームタンパク質、酵素、チモーゲン、抗体分子、細胞表面受容体タンパク質、転写調節タンパク質、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経作動性ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分タンパク質、イオンゲートタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、抗生物質耐性タンパク質、上記タンパク質のいずれかの機能フラグメント、上記タンパク質のいずれかのエピトープ含有フラグメントおよびそれらの組合せから成るグループから選択された１つ以上のタンパク質をコードする請求項４２に記載の方法。
44. 前記抗体分子が、抗−ＴＮＦ−α抗体、抗−ＥＬ−セレクチン抗体、抗−ＩＬ−１３抗体および二元可変ドメイン免疫グロブリン分子から成るグループから選択される請求項４３に記載の方法。
45. 抗−ＴＮＦ−α抗体がアダリムマブである請求項４４に記載の方法。
46. １つ以上の組換えタンパク質をコードする１つ以上の組換え遺伝子を含む発現ベクターに、配列２の塩基１−４６１または配列２の塩基１−１０８６のヌクレオチド塩基配列を含む核酸分子を挿入する段階を含む、発現ベクターからの組換えタンパク質の発現を低下させる、発現を実質的に抑制する、または、発現を実質的にサイレンシングさせる方法。
47. 前記発現ベクターを宿主細胞に挿入する段階をさらに含む請求項４６に記載の方法。

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