CN110592090A - Ssa4基因启动子及利用该启动子驱动外源基因转录的毕赤酵母表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了SSA4基因启动子及利用该启动子驱动外源基因转录的毕赤酵母表达载体。所述SSA4基因启动子的序列如SEQ ID NO:1所示。利用SSA4基因启动子驱动外源基因转录的毕赤酵母表达载体包括胞内表达和胞外分泌型表达两种。本发明获得的SSA4基因启动子以及所构建的表达载体可以有效的提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达，同时可以满足更多启动子的选择。
Description
技术领域
本发明涉及基因表达调控技术领域，更具体地，涉及SSA4基因启动子及利用该启动子驱动外源基因转录的毕赤酵母表达载体。
背景技术
毕赤酵母由于具有生长快速、可高密度发酵、遗传操作简单和能进行翻译后修饰等特点，现已成为重要的工业微生物。毕赤酵母表达系统从1993年投入商业化使用以来，到目前为止表达的外源蛋白已超过1000多种。毕赤酵母全基因组和转录组的测序完成后，不仅使其作为外源蛋白的表达系统上得到更加完善，而且也逐渐成为合成生物学和代谢工程研究和应用的一个重要平台。
无论是将毕赤酵母作为外源基因的表达系统，还是将毕赤酵母作为细胞工厂用于合成生物学或代谢工程，均要求有强的启动子来驱动外源基因的转录。特别是将毕赤酵母作为细胞工厂用于合成生物学或代谢工程研究，涉及合成通路中多基因的共表达，要求有更多的启动子启动多个基因的表达。目前商用的启动子只有Invitrogen公司开发的GAP和AOX1两种，无法满足毕赤酵母作为细胞工厂在合成生物学或代谢工程上的应用。
本发明尝试开发新的高效启动子和构建可用于外源蛋白表达的载体，更好的满足毕赤酵母用于多基因的表达。
发明内容
本发明的目的是针对以上存在的问题和不足，提供一种全新的SSA4基因启动子，并构建了SSA4基因启动子驱动的表达载体，该表达载体可以让外源基因在毕赤酵母中高效表达，适合于毕赤酵母作为表达系统或作为细胞工厂表达外源基因。
为了解决上述目的，本发明的第一方面，从毕赤酵母中分离得到SSA4基因启动子，该启动子序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明第二方面，是提供了一种含所述启动子序列的表达载体，利用本发明所构建的表达载体可以高效在毕赤酵母中表达外源基因。所述的表达载体分为胞内表达和胞外分泌型表达两种。
较佳地，将所述的SEQ ID NO:1序列与通过Bgl II和EcoR I限制酶双酶切去除GAP启动子的载体pGAPZ A连接构建成表达载体pSSA4P，该载体可用于在毕赤酵母细胞中胞内表达外源蛋白。
较佳地，将所述的SEQ ID NO:1序列与通过Sac I和BamH I限制酶双酶切去除AOX1启动子的载体pPIC9K连接构建成表达载体pSSA4Pα，该载体可用于在毕赤酵母细胞中胞外分泌表达外源蛋白。
本发明成功的获得了SSA4基因启动子并构建了该基因启动子驱动外源基因转录的毕赤酵母表达载体。实验证明，与商业化的GAP启动子驱动外源基因转录的表达载体相比，本发明所构建的SSA4基因启动子驱动外源基因转录的胞内表达载体，表达量高329.7％，所构建的SSA4基因启动子驱动外源基因转录的胞外分泌型表达载体，表达量高233.3％
因此，本发明获得的SSA4基因启动子以及所构建的表达载体可以有效的提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达，同时可以满足更多启动子的选择。
附图说明
图1为SSA4基因启动子PCR扩增结果，其中泳道M为DNA分子量标准，泳道1为SSA4基因启动子序列的PCR扩增产物。
图2为SSA4基因启动子驱动外源基因转录的胞内表达载体结构示意图。
图3为SSA4基因启动子驱动外源基因转录的胞外分泌型表达载体结构示意图。
图4为SSA4基因启动子与GAP启动子的胞内表达比较。
图5为SSA4基因启动子与GAP启动子的胞外表达比较。
具体实施方式
为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，具体实施例仅用于说明和解释本发明，而不是用于限定本发明。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均为常规方法。
本发明的实施例中使用了以下菌株和质粒：
大肠杆菌TOP 10(E.coli TOP 10):用于基因克隆操作，购买于赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)公司。
毕赤酵母GS115：用于载体表达效果测试，购买于赛默飞世尔(Thermo FisherScientific)公司。
pGAPZ A和pPIC9K表达质粒：提供载体骨架，分别用于构建本发明的胞内和胞外表达载体，购买于赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)公司。
pAd/CMV/V5-GW/lacZ质粒：该质粒含有Lac Z报告基因，为胞内表达载体效果测试提供Lac Z报告基因，购买于赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)公司。
pEGFP-N1质粒：该质粒含有EGFP报告基因，为胞外分泌型表达载体效果测试提供EGFP报告基因，购买于Clontech公司。
实施例1 SSA4基因启动子扩增
SSA4基因启动子序列如SEQ ID NO:1所示，依据其序列设计一对PCR引物：
SSA4-up(上游引物):5'-TGGGTTGTATCCATTCACTA-3'
SSA4-down(下游引物)：5'-AATGTTTAACTTTGTTTA-3'
在超净工作台内，接种一毕赤酵母GS115单菌落到含有5mLYPD液体培养基的25mL锥形瓶中，30℃培养24-48h。取1ml培养到OD600＝2.0～2.5的毕赤酵母培养液，1500g，4℃离心5min，收集菌体。利用酵母基因组提取试剂盒(TaKaRa公司)按说明书操作步骤提取基因组DNA。吸取100ng-500ng的毕赤酵母GS115基因DNA为模板，利用Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)进行PCR反应。PCR扩增条件：预变性95℃10min；变性95℃20sec；退火55℃20sec；延伸72℃1min；30个循环；72℃延伸5min。1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增结果(附图1)。
利用DNA胶纯化回收试剂盒(购买于promega公司)对PCR产物进行回收，具体操作方法参考试剂盒操作手册。纯化后的PCR产物与pMD-18T(TaKaRa公司)载体进行连接。连接产物转化大肠杆菌TOP 10，具体连接和转化步骤参考说明书。平板上长出的转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，确定序列的正确性。为了更方便说明实施例，将所构建的载体命名为pMD-SSA4P。
实施例2 SSA4启动子驱动外源基因转录的胞内表达载体构建及效果
1)胞内表达载体pSSA4P构建
质粒pGAPZ A用Bgl II和EcoR I双酶切，利用DNA胶纯化回收试剂盒回收大分子量载体骨架片段。利用一对引物(上游：5'-AGGTCGACGGTATCGAGATCT TGGGTTGTATCCATTCACTA-3'，划线部分为Bgl II酶切位点；下游：5'-GACGGGATCTATCATCATGGTGAATTCAATGTTTAACTTTGTTTA-3'，划线部分为EcoR I酶切位点)从pMD-SSA4P载体上扩增出SSA4启动子序列，经BglII和EcoR I双酶切，割胶纯化后与pGAPZ A载体骨架转接，连接产物转化大肠杆菌TOP 10，具体连接和转化步骤参考说明书。平板上长出的转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，确定序列的正确性。为了更方便说明实施例，将所构建的胞内表达载体命名为pSSA4P。
2)含LacZ报告基因表达载体pSSA4P-LacZ构建
pSSA4P质粒用EcoR I和Xho I双酶切，利用DNA胶纯化回收试剂盒回收线性化质粒。
利用高保真酶PrimeSTAR(TaKaRa公司)和一对引物(上游：5'-AGGTCGACGGTATCGA GATCTATGATAGATCCCGTCGTTTTA-3'，划线部分为EcoR I酶切位点；下游：5'-CGGCTGGGCCACGTCTCGAGTTATTTTTGACACCAGACCAACTGG-3'，划线部分为XhoΙ酶切位点)从pAd/CMV/V5-GW/lacZ质粒上扩增出LacZ基因，PCR扩增出的LacZ基因经EcoR I和Xho I双酶切后，用DNA胶纯化回收试剂盒回收纯化。将割胶纯化后的pSSA4P线性化质粒和LacZ基因连接。连接产物转化大肠杆菌TOP 10，具体连接和转化步骤参考说明书。平板上长出的转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，确定序列的正确性。为了更方便说明实施例，将所构建的胞内表达载体命名为pSSA4P-LacZ。
3)pSSA4P-LacZ电转化毕赤酵母GS115
质粒线性化：限制酶Bgl II对质粒pSSA4P-LacZ进行酶切线性化，利用DNA胶纯化回收试剂盒进行纯化回收线性化后的质粒pSSA4P-LacZ。为了保证转化效率，纯化后的线性化质粒浓度应大于100ng/ul以上。制备好的线性化质粒-20℃保存备用。
毕赤酵母GS115感觉态细胞制备：在超净工作台内，接种一毕赤酵母GS115单菌落到含有5mL YPD液体培养基的25mL锥形瓶中，30℃培养12-16h。将过夜培养的毕赤酵母GS115按照1：1000的比例转接含有50mLYPD液体培养基的250mL大锥形瓶中，30℃培养12-16h，直到OD600＝1.3～1.5。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用40mL冰浴的无菌双蒸水重悬。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用25mL冰浴的无菌双蒸水重悬。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用25mL冰浴的1M山梨醇溶液重悬。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用0.5mL冰浴的1M山梨醇溶液重悬，即成毕赤酵母感受态细胞。
电转化：将5～10μg经过冰预冷的线性化质粒pSSA4P-LacZ加入到80μl上述处理好的感受态细胞中，混合，加入的质粒体积不要超过20μl。为了提高转化效率，整个处理过程应在冰浴上完成。将混合液转移入预先冰浴的转化杯中(0.2cm型)，冰上静置5min。将电转化杯放入Gene pulserⅡ电转化仪(Bio-Rad公司)中，按毕赤酵母电转程序进行电转。电转后立即往转化杯中加入1mL冰浴冷的1M山梨醇溶液，在超净工作台内，动作轻柔地将转化杯中的酵母重悬，。将转化液转移到一个新的1.5ml离心管中，30℃静置培养1小时。吸取培养后的转化液200μl，涂布含Zeocin YPD平板中，30℃培养箱倒置，直到转化子出现。
4)LacZ基因表达检测：
牙签挑取转化子转移到含X-Gal的BMMY平板上，3-4天β-半乳糖苷酶分解X-Gal产生不溶性的蓝色化合物在平板上看到明显篮斑，然后挑取三个转化子甲醇诱导发酵5ml，平衡发酵液OD600＝1，取1ml发酵液在12000g下离心1min,弃上清，1ml Z buffer(已加2-巯基乙醇)中重悬,滴3滴氯仿，2滴0.1％的SDS涡旋在最高速度下10s，重复三次，预孵育样品在28℃下5min，加入0.2ml ONPG开始反应，开始计时，当样品在试管中变成黄色停止反应，立即加入0.5ml的碳酸钠，注意计时停止，离心10min去除细胞碎片，取上清，丢弃沉淀，测上清OD420的值。计算β-galactosidase活性公式如下：
OD420是反应物的光密度
OD600是发酵物的光密度
volume用于实验的体积(单位：ml)
time是时间(单位：minutes)
结果如图4所示，图中GAP为利用GAP启动子表达结果，SSA4为利用SSA4启动子表达结果。对GAP启动子表达量进行归一化处理。从结果中可以看出SSA4启动子表达水平比GAP启动子表达水平高3倍多。
实施例3 SSA4启动子驱动外源基因转录的胞外分泌型表达载体构建及效果
1)胞外分泌型表达载体pSSA4Pα构建
质粒pPIC9K用Sac I和BamH I双酶切，利用DNA胶纯化回收试剂盒分别回收载体骨架片段。利用引物(上游：5'-TATTGGGCTTGATTGGAGCTCTGGGTTGTATCCATTCACTA-3'，划线部分为Sac I酶切位点；下游：5'-AATTGAAGGAAATCTCATGGATCC AATGTTTAACTTTGTTTA-3'，划线部分为BamH I酶切位点)从pMD-SSA4P载体上扩增出SSA4启动子序列，经Sac I和BamH I双酶切，割胶纯化后与pPIC9K载体骨架转接，连接产物转化大肠杆菌TOP 10，具体连接和转化步骤参考说明书。平板上长出的转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，确定序列的正确性。为了更方便说明实施例，将所构建的胞内表达载体命名为pSSA4Pα。
2)含EGFP报告基因表达载体pSSA4Pα-EGFP构建
pSSA4Pα质粒用EcoR I单酶切，利用DNA胶纯化回收试剂盒回收线性化质粒。
利用高保真酶PrimeSTAR(TaKaRa公司)和一对引物(上游：5'-GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'；下游：5'-ATTCGCGGCCGCCCTAGGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGT-3'，划线部分为EcoR I酶切位点)从pEGFP-N1质粒上扩增出EGFP基因，PCR产物经EcoR I酶切后，用DNA胶纯化回收试剂盒回收纯化。将割胶纯化后的pSSA4Pα线性化质粒和EGFP基因连接。连接产物转化大肠杆菌TOP 10，具体连接和转化步骤参考说明书。平板上长出的转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，确定序列的正确性。为了更方便说明实施例，将所构建的胞内表达载体命名为pSSA4Pα-EGFP。
3)pSSA4Pα-EGFP电转化毕赤酵母GS115
质粒线性化：利用限制酶Sac I对质粒pSSA4Pα-EGFP进行酶切线性化，利用DNA胶纯化回收试剂盒进行纯化回收线性化后的质粒pSSA4Pα-EGFP，为了保证转化效率，纯化后的线性化质粒应大于100ng/ul以上。制备好的线性化质粒-20℃保存备用。
毕赤酵母GS115感觉态细胞制备：在超净工作台内，接种一毕赤酵母GS115单菌落到含有5mL YPD液体培养基的25mL锥形瓶中，30℃培养12-16h。将培养的毕赤酵母GS115按照1：1000的比例转接含有50mL YPD液体培养基的250mL大锥形瓶中，30℃培养12-16h，直到OD600＝1.3～1.5。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用40mL冰浴的无菌双蒸水重悬。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用25mL冰浴的无菌双蒸水重悬。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用25mL冰浴的1M山梨醇溶液重悬。1500g，4℃离心5min，收集菌体，菌体用0.5mL冰浴的1M山梨醇溶液重悬，即成毕赤酵母感受态细胞。
电转化：将5～10μg经过冰预冷的线性化质粒pSSA4Pα-EGFP加入到80μl上述处理好的感受态细胞中，混合，加入的质粒体积不要超过20μl。为了提高转化效率，整个处理过程应在冰浴上完成。将混合液转移入预先冰浴的转化杯中(0.2cm型)，冰上静置5min。将电转化杯放入Gene pulserⅡ电转化仪(Bio-Rad公司)中，按毕赤酵母电转程序进行电转。电转后立即往转化杯中加入1mL冰浴冷的1M山梨醇溶液，在超净工作台内，动作轻柔地将转化杯中的酵母重悬，。将转化液转移到一个新的1.5ml离心管中，吸取转化液200μl，涂布含MD平板中，30℃培养箱倒置，直到转化子出现。
4)EGFP基因表达检测：
挑取三个转化子甲醇诱导发酵5ml，平衡OD600＝2，取200ul发酵液离心12000g，4℃，1min，取上清，即为蛋白样品。加入4×SDS上样缓冲液按比例置于蛋白质样品中，混合95℃加热5min，速离。因为EGFP大小为26.9kDa，选用12％的分离胶和5％的层积胶，配制如下：
配制后沿玻璃板壁轻轻连续倒入板中，避免气泡，加水液封分离胶，待分离胶凝固，倒入积层胶，插梳子(不要有气泡)待凝固，拔出梳子。SDS-PAGE：胶板固定到电泳槽中，加入适量的1Tris缓冲液，用细移液吸头依次上样。电泳槽连接电源，正负极对齐，起先电压为60V恒压，观察Marker指示的大小，待样品跑下分离胶电压为恒压120V。根据EGFP蛋白及Marker指示的大小，停止电泳。转膜：做三明治，黑色泡沫放下边，然后滤纸2张，凝胶，硝酸纤维素薄膜，滤纸2张，膜与凝胶之间不要有气泡，300mA恒流电泳2-3h，若是过夜恒压30V。印迹分析：封闭：5％的脱脂牛奶封闭1h(摇床上)；加一抗：EGFP抗体按比例稀释4℃孵育过夜或者室温摇床2-3h，洗脱用PBS-T洗3次，每次5-10min；加二抗：抗体稀释后避光摇床1h，洗脱用PBS-T洗3次，每次5-10min。拍照或扫描，保存结果。
结果如图5所示，图中GAP为利用GAP启动子表达结果，SSA4为利用SSA4启动子表达结果。从图中可以看出SSA4启动子表达水平比GAP启动子高。
序列表
<110> 福建师范大学
<120> SSA4基因启动子及利用该启动子驱动外源基因转录的毕赤酵母表达载体
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggttgtat ccattcacta tttactcttt gtttcatttc ttgaattatt tggatactac 60
tctgctggca actctaccag tctcaaacgc agaccaggtt cgcaatttga ttagaatgtt 120
cgtgagctct tacaatgaaa agtccatgta ccttgcggct agttgtgaat tatttttagt 180
tccttctttg ttgctatcct ctttgaagtc gattatattg ctggaatggt atagggctcc 240
cttttcattt atcaggcaat taatcgtggt attctccgtg atctcgtttc tgagattaag 300
atatcaacag aatgtttaca tgaaacaatt agttgatagt tatgatttga agatcagtca 360
actcttatac catccccaac ttcctcaagg attcaggttg ggatatttac gatttaagag 420
tctattaaca agcacgctag gatacttaga attggaaaaa aagaccagat aatgagattg 480
aactcgaaat ttaggatcac ccatatgacg aagaattcat ttagattatt gaaggtgttt 540
tcatgtttac ctccatgaga ccatttctgt cacagcaaat acaggcaacg cttttcacca 600
gagcttgttg gtacaacttt tcagatgacg ccaaattctc acgcgcctca ctttgtgcgg 660
cgctaacaat aggccatttt tttgtacctc ccggatggtt cagctcaatc actcgattga 720
gaggtttttg ttccgcgatt tttgttcacc ccacactttt ctcgaaggtt ctagcaatca 780
agataaacac cgcaaagaga gccgcaggaa ccatatgtgg taccacaagt ggtcttaaac 840
aactctggta gaattcgatg gaattcgatg gaagccgatc gactccgatc gaattgaagc 900
aattcgtata tataaggaga acctagttcc accccttact cgaccattag tttacaagac 960
taacttcaca gaagcataga aattaaacaa agttaaacat t 1001
Claims (6)
1.SSA4基因启动子，其特征在于：所述SSA4基因启动子的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.含有权利要求1所述SSA4基因启动子序列的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是用于在毕赤酵母细胞中胞内表达外源蛋的表达载体pSSA4P。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体pSSA4P的制备方法如下：将SSA4基因启动子序列与通过Bgl II和EcoR I限制酶双酶切去除GAP启动子的载体pGAPZ A连接构建而成。
5.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是用于在毕赤酵母细胞中胞外分泌表达外源蛋白的表达载体pSSA4Pα。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体pSSA4Pα的制备方法如下：将SSA4基因启动子序列与通过Sac I和BamH I限制酶双酶切去除AOX1启动子的载体pPIC9K连接构建而成。
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