CN112961816A

CN112961816A - 具有甾体c1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌

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Publication number: CN112961816A
Application number: CN202110228234.1A
Authority: CN
Inventors: 骆健美; 王敏; 申雁冰; 曹书婷; 朱文成; 李芳�
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2041-03-02
Also published as: CN112961816B

Abstract

本发明涉及一种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株，在简单节杆菌中将3个调控基因单独过表达，或者将调控基因分别和3‑甾酮‑Δ¹‑脱氢酶基因串联后表达，获得了具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的工程菌株。在15g/L醋酸可的松(CA)、8％乙醇下，调控单基因过表达菌株生成醋酸泼尼松(PA)的产量较对照菌株提高了16.1％‑23.4％。在45g/L CA、8％乙醇下，调控基因和3‑甾酮‑Δ¹‑脱氢酶基因串联表达菌株的PA生成量较对照菌株提高了48.3％‑68.1％。这种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株对于提高甾体类化合物转化效率具有重要意义。

Description

具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株的构建及其应用。

背景技术：

甾体激素类药物是目前临床用量仅次于抗生素的第二大类药物。甾体C1,2脱氢反应是采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表,化合物药理活性在双键引入后成倍增加且副作用减少。

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)因专一性高、反应速率快等优点,在工业生产上表现出巨大应用优势。3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(3-Ketosteroid-Δ¹-dehydrogenase，KsdD)是催化该反应的关键酶。目前，研究者多采用增加关键酶表达量的方法构建高效菌株，但随着测序技术和系统生物学的发展，研究者认识到菌株的反应性能还受到胞内其他基因和代谢途径的调控作用。本发明以简单节杆菌催化醋酸可的松生成醋酸泼尼松的过程为对象，基于蛋白质组学技术，筛选得到影响简单节杆菌C1,2脱氢反应能力的调控基因,并通过这些基因的过表达或者这些调控基因与3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因的串联表达，构建具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株。

发明内容：

本发明的目的在于挖掘多个能提高简单节杆菌甾体C1,2脱氢反应能力的调控基因，通过调控基因的过表达或者它们与3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因的串联表达，构建具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的工程菌株。

本发明实现上述目的的技术方案如下：

一株具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：基因工程菌是以简单节杆菌CPCC 140451为宿主细胞，过表达序列表SEQ ID No1-3任一所示的调控蛋白编码基因所得。

而且，以pART2A质粒为表达载体，该质粒是在pART2质粒野生型启动子hdnOp的5’端引入限制性酶切位点EcoRV后获得的。

而且，SEQ ID No.7对应的调控蛋白为HYD，其编码基因hyd的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

而且，SEQ ID No.8对应的调控蛋白为PPS，其编码基因pps的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

而且，SEQ ID No.9对应的调控蛋白为HYP，其编码基因hyp的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；

优选地，所述基因工程菌以pART2A质粒为表达载体。

本发明还提供一种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力简单节杆菌基因工程菌株，是在简单节杆菌中串联表达SEQ ID No.7-9所示的调控蛋白和SEQ ID No.10-12任一所示的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶；

而且，SEQ ID No.10对应的关键酶蛋白为红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)SQ1的KsdD1_Re，其编码基因ksdD1_Re的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

而且，SEQ ID No.11对应的关键酶蛋白为简单节杆菌CPCC 140451的KsdD4_As，其编码基因ksdD4_As的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

而且，SEQ ID No.12对应的关键酶蛋白为简单节杆菌CPCC 140451的KsdD5_As，其编码基因ksdD5_As的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选地，所述基因工程菌以pART2A质粒为表达载体。

本发明还提供上述基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)以简单节杆菌CPCC 140451基因组为模板，PCR扩增得到该菌株中的hyd、pps、hyp、ksdD4_As和ksdD5_As基因；以红平红球菌SQ1基因组为模板，PCR扩增得到该菌株中的ksdD1_Re基因；

(2)利用基因工程的手段将上述单个调控蛋白编码基因或调控蛋白和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的串联基因分别连接到大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒pART2A的启动子后，化转到大肠杆菌DH5α中进行复制；

(3)提取重组质粒，分别电转化到简单节杆菌CPCC 140451中进行表达。

上述基因工程菌应用于甾体转化中，体系中底物醋酸可的松浓度为10-60g/L，优选12-50g/L，乙醇浓度为4-15％，优选6-10％。

本发明的有益成果：

本发明通过单独过表达调控基因或者串联表达调控基因和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因，构建具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株。这些菌株在高浓度底物和有机溶剂的转化体系中仍保持良好的催化活性，其C1,2脱氢反应能力较对照菌株提高了16.1-68.0％。

附图说明：

图1 hyd、pps和hyp基因过表达简单节杆菌工程菌株的PCR电泳图；

其中，M:DL5000 marker，(a)为重组pART2A-hyd质粒的PCR结果；(b)为重组pART2A-pps质粒的PCR结果；(c)为重组pART2A-hyp质粒的PCR结果；

图2对照菌株pART2A与hyd、pps和hyp过表达简单节杆菌工程菌株不同时间转化醋酸可的松(CA)生成醋酸泼尼松(PA)的产量；

图3 pps-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As基因串联表达简单节杆菌工程菌株的PCR电泳图；

其中，M₀:DL2000 marker，M:DL5000 marker，(a)为重组pART2A-ksdD1_Re质粒的PCR结果；(b)为重组pART2A-ksdD4_As质粒的PCR结果；(c)为重组pART2A-ksdD5_As质粒的PCR结果；(d)为重组pART2A-pps-ksdD1_Re质粒的PCR结果；(e)为重组pps-ksdD4_As质粒的PCR结果；(f)为重组pART2A-pps-ksdD5_As质粒的PCR结果；

图4对照菌株pART2A与pps-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As基因串联表达简单节杆菌工程菌株的KsdD比酶活；

图5对照菌株pART2A与pps-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As基因串联表达简单节杆菌工程菌株不同时间转化醋酸可的松(CA)生成醋酸泼尼松(PA)的产量。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1

C1,2脱氢反应能力调控基因的筛选

分别收集简单节杆菌CPCC 140451在添加4g/L甾体底物醋酸可的松(CA)转化不同时间的菌体细胞，进行蛋白质组学分析发现，与转化3h样品组相比，转化7h样品组中一系列蛋白的表达水平显著上调，从中获得了差异表达水平排在前3的蛋白。由表1可知，水合酶，WP_038682812.1，上调3.23倍；磷脂酰丝氨酸/磷脂酰甘油磷酸/心磷脂合酶家族，WP_082003531.1，上调2.33倍；假定蛋白，WP_052138649.1，上调2.04倍，其编码基因分别命名为：hyd、pps和hyp。

表1 C1,2脱氢反应能力调控基因蛋白水平差异表达情况

注：差异蛋白筛选标准：FC≥1.2，FC≤0.83，p-value≤0.05

实施例2

hyd、pps和hyp基因过表达简单节杆菌工程菌株的构建

2.1目的基因hyd、pps和hyp的扩增

使用G⁺细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取简单节杆菌CPCC 140451的总DNA。以提取的总DNA作为模板，分别扩增目的基因hyd、pps和hyp。其引物序列及序列表对应编码如表2所示：

表2引物序列表

注：下划线代表酶切位点

PCR反应体系如表3所示

表3 PCR反应体系的组成

PCR反应条件为：①98℃预变性30s；②98℃10s；③72℃时间根据靶基因长度而定，扩增速度为20-30kb/s，②～③30个循环；⑤72℃2min；⑥4-10℃保温。

按照Omega Gel Extraction试剂盒说明书回收PCR扩增产物。用核酸分析仪检测DNA的浓度及纯度。

2.2质粒载体线性化及同源重组构建重组质粒

将E.coli DH5α/pART2A菌液从甘油管按照1％接种量转接与5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB试管中，200r/min，37℃过夜振荡培养。12000r/min离心收集菌液，取菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书的步骤提取质粒。

采用合适的限制性内切酶对pART2A质粒与回收后PCR目的产物进行双酶切，酶切体系如表4所示，37℃酶切反应90min。

表4 BamHI和XbaI酶切体系的组成

将胶回收的目的片段与酶切纯化后的载体质粒pART2A按ClonExpress Ultra OneStep Cloning Kit说明书进行连接反应，重组连接体系如表5所示：

表5重组连接体系的组成

最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)

x＝最适克隆载体使用量/线性化载体的浓度

y＝最适插入片段使用量/插入片段PCR产物的浓度

将重组质粒转化至大肠杆菌感受态中，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落接种于含有50μg/mL卡纳霉素的LB试管中，200r/min，37℃震荡过夜培养，吸取菌液进行菌液PCR。用1.0％琼脂糖凝胶电泳验证菌液PCR产物。由图1可知，PCR重组质粒pART2A-hyd、pART2A-pps和pART2A-hyp得到的产物分别在1200bp、1200bp和1500bp左右出现条带，分别与对应基因的理论大小1185bp、1218bp和1449bp相符合，且无杂带和引物二聚体。将验证正确的重组质粒送到金唯智生物科技有限公司进行测序，获得正确的重组质粒pART2A-hyd、pART2A-pps和pART2A-hyp。

2.3简单节杆菌工程菌株A.simplex/pART2A-hyd、A.simplex/pART2A-pps和A.simplex/pART2A-hyp的构建。

(1)简单节杆菌感受态细胞的制备

挑取简单节杆菌CPCC 140451接种于LB液体培养基中，32℃、160r/min震荡培养30h，至菌体OD₆₀₀为2.5形成种子液，取1mL种子液接入装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，32℃、160r/min培养8-10h，至OD₆₀₀为0.8-1.0，加入细胞壁处理剂青霉素G(浓度为70μg/mL)振荡处理1h后，将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20min，4℃下6500r/min离心10min，弃上清；加40mL预冷至0℃的电击缓冲液(由15％甘油和0.5mol/L山梨醇组成)洗涤菌体后，4℃下5000r/min离心10min，弃上清；重复洗涤两次后，加入1.2mL电击缓液重悬菌体，摇匀，获得简单节杆菌感受态细胞，于-80℃保存待用。

(2)重组质粒电激转化及验证

取120μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，分别加入200ng构建好的重组质粒，混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴3min；打开电脉冲仪，2.1kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入1.2mL无菌复苏培养基(含有0.5moL/L山梨醇的LB液体培养基)，混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，32℃倒置培养72h，挑取转化子。培养后重提质粒进行PCR和测序。验证正确的菌株为分别过表达hyd、pps和hyp基因的简单节杆菌工程菌株，分别命名为A.simplex/pART2A-hyd、A.simplex/pART2A-pps和A.simplex/pART2A-hyp。

实施例3

对照菌株pART2A与hyd、pps和hyp基因过表达简单节杆菌工程菌株的甾体C1,2脱氢反应能力的分析

(1)静息细胞的制备

分别从斜面挑取实施例2构建的基因hyd、pps和hyp过表达工程菌株与对照菌株pART2A接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，32℃，160r/min振荡培养36h，以一定的接种量转接到装有50mL上述新鲜培养基的250mL三角瓶中，初始OD₆₀₀值调整为0.2，32℃，160r/min震荡培养至对数生长期，分别加入终浓度为0.1g/L的底物醋酸可的松诱导C1,2脱氢酶产生，32℃，160r/min继续振荡培养18h至各个菌株的对数中后期。培养液经4℃，6000r/min离心10min，收集的菌体用预冷的pH 7.2的0.1M的KH₂PO₄-NaOH溶液(PBS缓冲溶)洗涤2次，将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中制备得到静息细胞。

(2)转化反应

利用上述静息细胞制备30mL的转化体系：菌体OD₆₀₀为2.0，底物CA浓度为15g/L,8％乙醇助溶；在34℃，180r/min振荡转化，定时取样测定产物醋酸泼尼松的浓度。每次取样0.4mL加入0.8mL乙酸乙酯终止反应，超声萃取10min以上，12000r/min离心10min，吸取100μL上清液于新的1.5mL离心管中，在通风橱中过夜挥发，再用1mL流动相复溶，通过HPLC法测定产物PA的生成量。

HPLC检测条件为：

高效液相色谱仪：Agilent 1100Series LC(G1314Pump，G1322ADEGASSERG1314VWD检测器，10μLAN进样器，HP Chem Station)；

色谱柱：Kromasil 100-5SIL 250mm×4.6mm×5μm；

流动相：二氯甲烷:乙醚:甲醇(体积比86:12:2)，0.45μm微孔滤膜过滤；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

检测器：UVDetector，波长：240nm。

进样量：20μL

由图2所示，hyd、pps和hyp过表达工程菌株在转化36h时PA生成量最大，分别为13.08g/L、13.64g/L和12.83g/L，比对照菌株(11.05g/L)分别提高了18.4％、23.4％和16.1％。这一结果说明，hyd、pps和hyp基因对简单节杆菌甾体C1,2脱氢反应性能有正向调控作用，与它们蛋白水平的显著上调是一致的。

实施例4

串联表达pps基因和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的简单节杆菌基因工程菌株的构建

4.1重组质粒pART2A-ksdD1_Re、pART2A-ksdD4_As和pART2A-ksdD5_As的构建

使用G⁺细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取简单节杆菌CPCC 140451和红平红球菌SQ1的总DNA。以提取的总DNA为模板扩增ksdD1_Re、ksdD4_As和ksdD5_As基因。其引物序列及序列表对应编码如下表6所示：

表6引物序列表

注：下划线代表酶切位点

PCR反应体系、反应条件及重组质粒构建方法同实施例2。

将胶回收的目的片段与酶切纯化后的载体质粒pART2A按实施例2中进行同源重组，将连接产物分别转化至大肠杆菌感受态中，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落接种于含有50μg/mL卡纳霉素的LB试管中，200r/min，37℃震荡过夜培养，吸取菌液进行菌液PCR。用1.0％琼脂糖凝胶电泳验证菌液PCR产物，如图3所示。将验证正确的重组质粒送到金唯智生物科技有限公司进行测序，获得正确的重组质粒pART2A-ksdD1_Re、pART2A-ksdD4_As和pART2A-ksdD5_As。

4.2重组质粒pART2A-pps-ksdD1_Re、pART2A-pps-ksdD4_As和pART2A-pps-ksdD5_As的构建

以重组质粒pART2A-pps为模板扩增启动子和pps基因，其引物序列及序列表对应编码如下表7所示：

表7引物序列表

注：下划线代表酶切位点

PCR反应体系、反应条件同实施例2。PCR结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合。

将胶回收的目的片段与酶切纯化后的载体质粒pART2A-ksdD1_Re、pART2A-ksdD4_As和pART2A-ksdD5_As按实施例2中进行同源重组，将连接产物分别转化至大肠杆菌感受态中，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落接种于含有50μg/mL卡纳霉素的LB试管中，200r/min，37℃震荡过夜培养，吸取菌液进行菌液PCR。由表7提供的序列PCR扩增pps-ksdD-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。由图3可知，PCR产物分别在3000bp左右出现条带，同基因的理论大小pps-ksdD1_Re(172+1218+172+1533bp)3095bp、pps-ksdD4_As(172+1218+172+1548bp)3110bp、pps-ksdD4_As(172+1218+172+1659bp)3221bp相符。将PCR结果验证正确的重组质粒送到金唯智生物科技有限公司进行测序，获得正确的重组质粒pART2A-pps-ksdD1_Re、pART2A-pps-ksdD4_As和pART2A-pps-ksdD5_As。

4.3串联表达简单节杆菌工程菌株A.simplex/pART2A-pps-ksdD1_Re、A.simplex/pART2A-pps-ksdD4_As和A.simplex/pART2A-pps-ksdD5_As的构建

(1)简单节杆菌感受态细胞的制备

简单节杆菌感受态的制备方法如实施例2所述。

(2)重组质粒电激转化及验证

取120μL简单节杆菌感受态细胞于1.5mL离心管中，加入200ng构建好的重组质粒混合均匀后转移到预冷的电脉冲杯内冰浴3min；打开电脉冲仪，2.1kV电击转化；电激后立即向电脉冲杯内加入0.8mL无菌复苏培养基(含有0.5mol/L山梨醇的LB液体培养基)，混匀后，32℃缓慢振荡培养11h后，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的选择平板上，32℃倒置培养72h，挑取转化子。提取质粒进行PCR，由表7提供的序列PCR扩增重组质粒pART2A-pps-ksdD1_Re、pART2A-pps-ksdD4_As、pART2A-pps-ksdD5_As中pps-ksdD-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合。PCR产物分别在3000bp左右出现条带，同基因的理论大小pps-ksdD1_Re(3095bp)、pps-ksdD4_As(3110bp)和pps-ksdD4_As(3221bp)相符，表明工程菌株已成功表达pps和ksdD两个基因。将PCR结果验证正确的重组质粒送往金唯智生物科技有限公司进一步测序得到验证将验证正确的工程菌株命名为A.simplex/pART2A-pps-ksdD1_Re、A.simplex/pART2A-pps-ksdD4_As和A.simplex/pART2A-pps-ksdD5_As。

实施例5

对照菌株pART2A与pps-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As基因串联表达简单节杆菌工程菌株的KsdD酶活检测

(1)菌体制备

从甘油管中吸取菌液(2％)，接种到含有5mL LB培养基(含有终浓度50μg/mL卡那霉素)的试管中，培养48h后转接至50mL LB培养基(含有终浓度50μg/mL卡那霉素)的250mL三角瓶用新鲜的LB液体培养基将培养液的初始OD₆₀₀值均调为0.2，32℃，160r/min震荡培养，将进入对数中后期(培养24h)的培养液转接到含有50mL LB培养基(含有50μg/mL的卡那霉素)的250mL三角瓶中，用新鲜的LB液体培养基将三个菌株培养液的初始OD₆₀₀值均调为0.2，32℃，160r/min震荡培养12小时。加0.1g/L CA诱导C1,2脱氢酶。32℃，160r/min震荡培养16h后4℃(5000r/min,10min)离心收集菌体。

(2)粗酶液制备

将收集好的菌体置于冰上，用预冷的PBS缓冲液吹吸混匀清洗2次。用预冷的PBS缓冲液重悬菌体，利用实验室AH高压细胞破碎仪进行菌体细胞破碎(运行参数1300bar5min)，需要按100:1的比例加入蛋白酶抑制剂保护KsdD酶不受破坏。

将破碎好的菌液在4℃，6000r/min条件下离心15min，取上清用于酶活检测。

(3)酶活的检测

使用DCPIP法检测KsdD酶活(检测体系见表8)

表8 KsdD酶活检测体系

酶活定义：在30℃，pH 7.0条件下，每分钟还原1nmol DCPIP所需的酶量为1个单位。

酶活力单位(U/mL)＝(Vt*ΔA/Δt)/(e*L*Vs)

Vt：反应液总体积(反应液总体积1mL)

Vs：样品体积(mL)

e：摩尔吸光系数，DCPIP在600nm处的摩尔消光系数为18.7*10³cm^-1M^-1

L：比色杯光径(cm)，本实验中采用光径1.0cm比色杯

比酶活力(U/mg)：酶活(U/mL)与蛋白浓度(mg/mL)的比值。实验中利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

由图4所示，pps-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As基因串联表达简单节杆菌工程菌株的KsdD比酶活较对照菌株分别提高了108.8％、100.5％和100.0％。

实施例6

对照菌株pART2A与pps-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As基因串联表达简单节杆菌工程菌株的甾体C1,2脱氢反应能力的分析

(1)静息细胞的制备

具体方法同实施例3。

(2)转化反应

利用上述静息细胞制备30mL的转化体系：菌体OD₆₀₀为2.0，底物CA浓度为45g/L,8％乙醇助溶；转化反应条件、取样方法和HPLC法测定产物PA的生成量的条件同实施例3。

由图5所示，pps-ksdD1_Re、pps-ksdD4_As和pps-ksdD5_As基因串联表达简单节杆菌工程菌株在转化60h时PA生成量分别为22.47g/L、20.80g/L和19.83g/L，比对照菌株(13.37g/L)分别提高了68.0％、55.6％和48.3％。

以上所述实施例仅表达了本发明的6种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1185

<212> DNA

<213> 基因序列(Unknown)

<400> 1

atgggcaacg atgtcctgtc cgcgatcgag gagcgcgccg agcagatcgc cgcgaccggt 60

gcggccaacg agaagctcgg ccggctggac gaccaggcgg tcgccctgct gcgcgagacc 120

ggcgtgatgc ggatgctgca gccggccaag tacggcggcc ggcagtccac cccggcggag 180

ttcgccgagg ccgtcatgaa ggtggccgcc tgcgacggcg ccaccggctg ggtcgccggc 240

atcgtgggcc tgcacccgtg ggagatggcg atgatggact cccgcctgca ggaggaggtc 300

tggggcagcg accccgacgt ctggatcgcc tccccctacg cgccgatggg catgctgacc 360

ccggccgacg gcggcttcca cctctccggg cgctggcagt tctcgtcggg caccgaccac 420

tgcgactgga tcttcctggg cgccaccaag gccgacgccg acggcaaccc cgacttcgcg 480

gcgggcatgt ggcacgtcgt cctgccgcgt gcggactaca cgatcgtcga ggactcctgg 540

gacgtcgtgg gcctgcgcgg caccggcagc aaggacgtcg tcgtcgacgg cgcgttcatc 600

cccgactacc gggtgctcgc ctacgagcgg ctcaccgacg gctccgctcc gcgcgacgcc 660

gggctcgacg acccgacgta cctgatgccg ttcacgaccg tcttcccgag cggcatcacc 720

tccgccgtcc tcggcatctg cgagggtgcg ctcgcgcacc acctcgccta ccagaccaac 780

cggctgcaga tcagcggcac cgcggtgcgc gaggacccct acgtcctctc cgccatcggc 840

gccgcggcgg ccgagatcca cgcctccaag atcgcgctgc tcgacagcct gcgctggagc 900

tacgaccgcg ccgccgcggg tcacgagctg accttcgccg agcggtccaa gaaccggcag 960

acccaggtca ccgcgtcgtg gcgcgcggtg cgcgcgatgg acgagatcgt cgcccgctcg 1020

ggcggcaacg gcctgcggat ggaccacccg atgcagcgct tctggcgcga cggccacatg 1080

ggcctggcgc acgccatcaa cgtccccgga cccgtcctgc acgcctcggc cctcggcgag 1140

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<210> 2

<211> 1218

<212> DNA

<213> 基因序列(Unknown)

<400> 2

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gccgcggggt tggcgctggc cgcctcgctg gccatgccga cctccagcag tcctgcgtcg 120

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atcatcatcg acaagatcgt cggcttggtg aatgcgacgc agggggctgg agaccagatc 300

cggctcaaca cctacaactt cacgggaggc accgctcccg tcctcgccct cgccacggcg 360

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gctgcgctca agcgactgcg gaacatggac tgcaacgtcc gggtcatcgc gatcgacaac 960

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<211> 1449

<212> DNA

<213> 基因序列(Unknown)

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ggcggcaacg acccctgggg cgccgagcag ttctcgtgcg gccgcaaggc ggtcgagcgg 1260

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cgccgctga 1449

<210> 4

<211> 1533

<212> DNA

<213> 基因序列(Unknown)

<400> 4

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accggcgcat ataccgccgc tgctcaggga ttgacgacga tcgtcctcga gaaaaccgat 120

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caggaacgcg ccggacttcc cgactcgacc gagaatgccc gcacctatct gcgcgcgttg 240

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gctctactcg agcagaaccc gaacatcgaa ttcgagttcc gtgcgttccc cgactactac 360

aaagccgaag gccggatgga cacgggacgc tccatcaacc ctctcgatct cgatcccgcc 420

gacatcggtg acctcgccgg caaggtgcgt ccggaactgg accaagaccg caccggtcag 480

gatcatgctc ccggcccgat gatcggtggg cgcgcactga tcggccgtct gctggccgca 540

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caggcaggca cccccggcaa ggcgatctgg agtatgggtc ccttcggcgc caacaccggc 780

gacgcgatct ctgccggtat tgctgtcggc ggcgcaacag ccttgctcga tcaggcgtgg 840

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gggctcgtcg tcgacagcgc cggtgagcgc tacctcaacg agtcgcttcc gtacgaccag 960

ttcggacgag ccatggatgc tcacgacgac aacggttctg ccgtgccgtc gttcatgatc 1020

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tcactgagcg gccgcttcta ccccggcccc ggagttccac tcggcacggc tatggtcttc 1500

tcgtaccgag cagctcagga catggcgaag taa 1533

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ctgctgcggg cgggcaccga cgacacgatc gaggacgctc tcgagtacta ccgagcggtc 240

gtcggcgacc gcacccccgc ggacctgcag gagacctacg tccgcggcgg cgccggcctg 300

gtcgcctacc tcgaggagga cgaccacttc tccttcgagt cctacccgtg gccggactac 360

ttcggcgacg cccccaaggc ccgtcgcgac ggccagcggc acatcatccc gacgccgctg 420

ccggtgccct ccgcacccga gctgcgcgag gtggtccgcg ggccgctcga caacgaccgg 480

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ctcgtcgtcg aggacggcgt cgtggtcggc gcgatcgtcg agaccgacgg cgtccgccgc 660

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ctcagcgcgc gcgagcaggg gctcgacgtc ctcgtcgtcg agaagaccga gtacgtcgga 120

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gacgccccga aggcccgctg gcaggcgttc ctgcggcacg gccccgagac catccggatg 300

ctgcggcgga cgacgtcgct ccagctgatg tgggcgcgcg gctactccga ctaccacccg 360

gagctgccgg gcggcgacgc cgcggggcgc agcatcgaga gcaagccgtt cgacgcgtcg 420

gtgctgggcg agtcccgggc gctgctgcgg ccgggcgtcg tcgaggcacc ggtcccgatg 480

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Tyr Ala Pro Met Gly Met Leu Thr Pro Ala Asp Gly Gly Phe His Leu

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Phe Leu Gly Ala Thr Lys Ala Asp Ala Asp Gly Asn Pro Asp Phe Ala

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Ala Gly Met Trp His Val Val Leu Pro Arg Ala Asp Tyr Thr Ile Val

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Glu Asp Ser Trp Asp Val Val Gly Leu Arg Gly Thr Gly Ser Lys Asp

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Val Val Val Asp Gly Ala Phe Ile Pro Asp Tyr Arg Val Leu Ala Tyr

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Ser Ala Val Leu Gly Ile Cys Glu Gly Ala Leu Ala His His Leu Ala

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Pro Tyr Val Leu Ser Ala Ile Gly Ala Ala Ala Ala Glu Ile His Ala

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Thr Gln Val Thr Ala Ser Trp Arg Ala Val Arg Ala Met Asp Glu Ile

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Val Ala Arg Ser Gly Gly Asn Gly Leu Arg Met Asp His Pro Met Gln

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<212> PRT

<213> 蛋白序列(Unknown)

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Val Ala Pro Leu Ala Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Met

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Pro Thr Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ala Ala Thr Glu Ala Pro Thr Val

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Gln Ala Ala Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr

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Ser Gly Ser Trp Glu Ile Cys Phe Gln Asp Leu Ser Asp Thr Glu Ser

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Ile Ile Ile Asp Lys Ile Val Gly Leu Val Asn Ala Thr Gln Gly Ala

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Pro Val Leu Ala Leu Ala Thr Ala Leu Lys Asp Ala Lys Thr Arg Gly

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Val Asp Val Arg Leu Val Leu Asp Asp Ser Ala Arg Ser Gly Thr Val

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Asp Val Ser Cys Ile Pro Ser Asp Asn Ser Ala Gly Asn Gly Phe Ile

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Ser Tyr Thr Ser Val Val Thr Ser Met Asn Phe Val Pro Asn Gln His

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Tyr Asn Gly Leu Asn Ala Tyr Trp Asn Ser Leu Asn Ala Gly Ala Trp

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Gly Ala Gly Ile Pro Ala Asn Arg Val Ile Asn Gln Thr Gly Trp Asn

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260 265 270

Ala Ile Thr Gly Cys Ser Pro Asp His Arg Arg Ile Phe Leu Met Ala

275 280 285

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Arg Leu Arg Asn Met Asp Cys Asn Val Arg Val Ile Ala Ile Asp Asn

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Asp Asn Pro Cys Ala Gly Met Ser Ser Tyr Ile Glu Gln Asn Arg Thr

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Val Arg Val Pro Ala His Asp Lys Val Leu Val Val Asp Ala Leu Leu

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<212> PRT

<213> 蛋白序列(Unknown)

<400> 9

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Ala Ala Thr Leu Thr Ala Gly Leu Ala Ala Pro Pro Ala Ser Ser Thr

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Pro Gln His His Ala Gln Gln Arg Ala Gln Gln Asp Gln Arg Asp Ile

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Ala Asp Arg Ile Ala Ala Leu Pro Gly Val Thr Ser Val Thr Glu Ala

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85 90 95

Leu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Pro Met Val Met Tyr Thr Ser Gly

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Tyr Asn Val Ser Gln Asn Pro Ser Arg Ser Glu Pro Thr Gln Ile Val

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Asp Gly Asn Gln Leu Ser Met Glu Tyr Arg Tyr Phe Glu Pro Ser Ile

130 135 140

Pro Ala Arg Thr Asp Trp Pro Lys Gln Leu Thr Ile Trp Gln Ala Ala

145 150 155 160

Ala Asp Gln His Ala Ile Ile Gln Ser Phe Arg Arg Leu Tyr Arg Glu

165 170 175

Ser Trp Leu Thr Thr Gly Gly Ser Lys Gly Gly Met Thr Ala Thr Tyr

180 185 190

His Arg Arg Phe Phe Pro Asp Asp Val Gln Gly Thr Ile Pro Tyr Val

195 200 205

Ala Pro Asn Asp Val Asp Asn Asp Glu Asp Ala Tyr Asn Glu Phe Leu

210 215 220

Ala Asn Val Gly Thr Asp Pro Gln Cys Arg Ala Ala Leu Thr Ala Val

225 230 235 240

Gln Arg Arg Ile Leu Gly Pro Asp Arg Ala Trp Phe Leu Glu Arg Thr

245 250 255

Arg Gln Asp Ala Glu Ala Thr Gly Asp Ser Trp Glu Ile Leu Gly Ser

260 265 270

Leu Asp Arg Gly Met Glu Thr Ala Val Val Asp Leu Tyr Phe Thr Phe

275 280 285

Trp Gln Tyr Ser Pro Gln Ser Ala Cys Ala Asp Val Pro Gly Ala Asp

290 295 300

Ala Thr Asn Glu Gln Val Trp Asp Trp Thr Gln Gly Val Val Pro Leu

305 310 315 320

Thr Gly Tyr Leu Asp Gln Gly Leu Arg Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Tyr

325 330 335

Gln Ala Ala Tyr Gln Leu Gly Trp Tyr Glu Ala Tyr Glu Ala Pro Leu

340 345 350

Ala Gly Val Leu Arg Tyr Pro Gly Gly Trp Gly Gly Ala Asn Phe Val

355 360 365

Pro Gln Glu Leu Arg Pro Ile Arg Phe Asp Lys Arg Ala Met Ala Asp

370 375 380

Ile Asp Arg Trp Val Arg Asn Lys Ser Asp Arg Met Leu Tyr Val Tyr

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Gly Gly Asn Asp Pro Trp Gly Ala Glu Gln Phe Ser Cys Gly Arg Lys

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Ala Val Glu Arg Arg Gln Cys Ser Val His Val Val Ala Gly Gly Thr

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20 25 30

Thr Ile Val Leu Glu Lys Thr Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ser Ala Tyr

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Ser Gly Ala Ser Ile Trp Leu Pro Gly Thr Gln Val Gln Glu Arg Ala

50 55 60

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Leu Gly Asp Ala Glu Ser Glu Arg Gln Asp Ala Tyr Val Glu Thr Ala

85 90 95

Pro Ala Val Val Ala Leu Leu Glu Gln Asn Pro Asn Ile Glu Phe Glu

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Phe Arg Ala Phe Pro Asp Tyr Tyr Lys Ala Glu Gly Arg Met Asp Thr

115 120 125

Gly Arg Ser Ile Asn Pro Leu Asp Leu Asp Pro Ala Asp Ile Gly Asp

130 135 140

Leu Ala Gly Lys Val Arg Pro Glu Leu Asp Gln Asp Arg Thr Gly Gln

145 150 155 160

Asp His Ala Pro Gly Pro Met Ile Gly Gly Arg Ala Leu Ile Gly Arg

165 170 175

Leu Leu Ala Ala Val Gln Ser Thr Gly Lys Ala Glu Leu Arg Thr Glu

180 185 190

Ser Val Leu Thr Ser Leu Ile Val Glu Asp Gly Arg Val Val Gly Ala

195 200 205

Glu Val Glu Ser Gly Gly Glu Thr Gln Arg Ile Lys Ala Asn Arg Gly

210 215 220

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225 230 235 240

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 32

ccacgcggcc accgcctgat ctagacacca ccatcaccat ca 42

Claims

1.一株具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：基因工程菌是以简单节杆菌(Arthrobactersimplex)CPCC 140451为宿主细胞，过表达序列表SEQ IDNo1-3任一所示的调控蛋白编码基因所得。

2.根据权利要求1所述的具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：

核苷酸序列如SEQ ID No.1表达调控蛋白HYD；

核苷酸序列如SEQ ID No.2表达调控蛋白PPS；

核苷酸序列如SEQ ID No.3表达调控蛋白HYP。

3.权利要求1所述的一株具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)以简单节杆菌CPCC 140451基因组为模板，通过PCR扩增得到该菌株中的调控蛋白编码基因，基因为SEQ ID No.1-3任一所示的基因；

(2)利用基因工程的手段将上述调控蛋白编码基因分别连接到大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒pART2A的启动子后，化转到大肠杆菌DH5α中进行复制；

4.一株具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是以简单节杆菌CPCC 140451为宿主细胞，同时表达序列表SEQ ID No.1-3任一所示的调控蛋白编码基因和SEQ ID No.4-6任一所示3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因所得。

5.根据权利要求3所述的具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：

核苷酸序列如SEQ ID No.1表达调控蛋白HYD；

核苷酸序列如SEQ ID No.2表达调控蛋白PPS；

核苷酸序列如SEQ ID No.3表达调控蛋白HYP；

核苷酸序列如SEQ ID No.4表达红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)SQ1的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶KsdD1_Re；

核苷酸序列如SEQ ID No.5表达简单节杆菌CPCC 140451的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶KsdD4_As；

核苷酸序列如SEQ ID No.6表达简单节杆菌CPCC 140451的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶KsdD5_As。

6.根据权利要求1或3所述的具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：以pART2A质粒为表达载体，该质粒是在pART2质粒野生型启动子hdnOp的5’端引入限制性酶切位点EcoRV后获得的。

7.权利要求3所述的一株具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)以简单节杆菌CPCC 140451和红平红球菌SQ1的基因组为模板，通过PCR分别扩增得到调控蛋白编码基因和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因，调控蛋白编码基因为SEQ ID No.1-3任一所示的基因，3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因为SEQ ID No.4-6任一所示的基因；

(2)利用基因工程的手段将上述调控蛋白和3-甾酮-Δ¹-脱氢酶的编码基因串联后分别连接到大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒pART2A的启动子，化转到大肠杆菌DH5α中进行复制；

8.一种催化醋酸可的松发生C1,2脱氢反应方法，其特征在于：采用权利要求1-7之一所述的具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌进行底物醋酸可的松转化。

9.根据权利要求8所述的催化醋酸可的松发生C1,2脱氢反应方法，其特征在于：转化体系中底物醋酸可的松的浓度为10-60g/L，优选12-50g/L。

10.根据权利要求8所述的催化醋酸可的松发生C1,2脱氢反应方法，其特征在于：转化体系中的乙醇浓度为4-15％，优选6-10％。