CN113637658A

CN113637658A - 基于dCas9-oToV的基因转录系统及其应用

Info

Publication number: CN113637658A
Application number: CN202110953684.7A
Authority: CN
Inventors: 范术丽; 栗战帅; 张朝军; 王慧颖; 马启峰; 乔凯凯
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2021-11-12

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，提供了一种基于dCas9‑oToV的基因转录系统及其应用。本发明将用于棉花基因编辑的Cas9突变成dCas9，通过瞬时表达系统筛选出转录激活效率显著的dCas9‑oToV。在陆地棉CCRI24中克隆得到启动子GhU6_1，用于启动sgRNA。用单个sgRNA引导dCas9‑oToV结合到靶基因启动子特定位置时，可以将棉花内源基因进行有效激活。在每个sgRNA前引入tRNA^Gly，用同一个pGhU6_1进行启动，可以同时实现棉花中多个内源基因被有效激活。本发明具有较高的实用性和特异性，为棉花基因功能研究和分子育种提供更加高效的策略。

Description

基于dCas9-oToV的基因转录系统及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种基于dCas9-oToV的基因转录系统及其应用。

背景技术

在对基因的功能进行研究时，不仅需要对目标基因进行功能丧失，还需要将目标基因进行超量表达，这是对基因功能研究的常规策略，同时也是植物分子育种中将特定基因过表达来增强有益农艺性状的重要途径。但是由于载体的容量有限，同时过表达多个基因很难实现。此外，由于缺少稳定转录的UTR(非翻译区)和内含子序列，不能有效的产生可变剪切转录本等不足，使传统基因过表达策略的应用受限，一定程度上限制了基因功能研究和分子育种的进程。随着基因编辑技术的广泛应用，科研人员发现CRISPR/Cas9系统不仅具有强大的基因编辑功能，将Cas9蛋白序列修饰后还可以实现对靶基因的转录调控。当Cas9蛋白RuvCⅠ催化结构域的第10位Asp和HNH的第840位His被突变成Ala(D10A和H840A)时，Cas9蛋白丧失切割DNA活性(其它功能仍然保留)，变成dead-Cas9(dCas9)。失去DNA双链切割功能的核酸酶Cas(dCas)蛋白与自主性的转录激活域(Transcriptional activationdomain,TADs)融合，可以被sgRNA引导并与特定启动子序列结合，然后对靶基因进行转录调控，从而使靶基因的转录水平被上调。

目前，在动物中已有dCas9-SunTag、dCas9-SAM、dCas9-VPR等几个有效的系统，而将这些系统应用到植物中时，其效果并未达到预期效果。并且在植物中常用的CRISPR/dCas9介导的转录激活系统(dCas9-VP64、dCas9-Act2/3等)的效率比较低，当用多个sgRNA来提高激活效率时，效率提高的不明显，并且提高了基因组内脱靶风险，无法满足植物基因功能研究和分子育种工作。

综上所述，目前CRISPR/dCas9介导的转录激活系统只在拟南芥、水稻、烟草和番茄等植物中有少量相关报道，但在棉花作为重要的战略物资和经济作物，相关研究上未见报道。因此，在棉花中建立CRISPR/dCas9介导的转录激活技术，将会为在细胞内激活一个或多个内源基因的转录水平提供了强有力的新策略，对进一步全面开展棉花基因功能研究和分子育种工作具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种人工转录激活因子dCas9-oToV。

本发明的第二目的在于提供一种与人工转录激活因子dCas9-oToV相关的生物材料。

本发明的第三目的在于提供一种基于dCas9-oToV的基因转录系统。

本发明的第四目的在于提供上述在棉花中的应用。

本发明的第五目的在于提供一种特异性激活棉花靶基因表达的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种人工转录激活因子dCas9-oToV，包括dCas9和TAD，所述TAD包括4-8个oTAL转录激活结构域和2-3个oVP64转录激活结构域；

oTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

oVP64的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，还包括至少一个核定位信号，优选为1-3个，进一步优选为2个；

优选地，所述TAD包括6个oTAL转录激活结构域和2个oVP64转录激活结构域。

进一步地，人工转录激活因子dCas9-oToV的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，人工转录激活因子dCas9-oToV的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

与上述人工转录激活因子dCas9-oToV相关的生物材料，包括：

(a)核酸分子，编码本发明的人工转录激活因子dCas9-oToV；

(b)载体，含有(a)核酸分子；

(c)细胞，含有(a)核酸分子或(b)载体。

进一步地，载体的骨架为pGreenⅡ62-SK载体。

一种基于dCas9-oToV的基因转录系统，包括由RNA聚合酶Ⅲ型U6启动子驱动表达的sgRNA和本发明的人工转录激活因子dCas9-oToV，所述sgRNA的数目为一个或多个。

进一步地，所述RNA聚合酶Ⅲ型U6启动子为陆地棉CCRI24的内源启动子pGhU6_1，所述pGhU6_1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

优选地，每个所述sgRNA上游均独立地含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的tRNA^Gly。

进一步地，所述sgRNA的靶基因包括GhTLP19、GhTULP34、GhLac1和GhLFY的至少一种；

优选地，GhTLP19的靶位点包括SEQ ID NO.7-16任一个所示的核苷酸序列；

优选地，GhTULP34的靶位点包括SEQ ID NO.17-26任一个所示的核苷酸序列；

优选地，GhLac1的靶位点包括SEQ ID NO.27-33任一个所示的核苷酸序列；

优选地，GhLFY的靶位点包括SEQ ID NO.34-42任一个所示的核苷酸序列。

上述人工转录激活因子dCas9-oToV、生物材料或基因转录系统在棉花中的应用。

一种特异性激活棉花靶基因表达的方法，将本发明的基因转录系统导入棉花中，得到转基因棉花。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的人工转录激活因子dCas9-oToV适用于植物棉花，TAD(转录激活域)可以有效的激活棉花内源基因的表达水平。

(2)本发明的基因编辑系统可以实现多个基因的同时过表达，并且效率高，脱靶风险低。

(3)本发明对进一步全面开展棉花基因功能研究和分子育种工作具有重要意义和应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中不同转录激活结构域与dCas9融合后对下游基因的激活效率；

图2为实施例2中AtU6-26启动子与陆地棉CCRI24中U6启动子的序列比对；

图3为实施例3中GhTLP19和GhTULP34两个基因启动子区域sgRNA的选择，柱子上的数字表示平均倍数±S.D.(n＝3)；

图4为实施例4中dCas9-oToV对棉花内源基因GhTLP19和GhTULP34的转录激活分析；

图5为实施例5中GhLac1和GhLFY启动子区域sgRNA的筛选，及棉花转基因阳性株中靶基因表达水平分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及的基因或核苷酸序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条，及其可反推成相应的氨基酸序列或蛋白序列。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，同时也公开了相应的氨基酸序列或蛋白序列。例如提及oTAL的核苷酸序列，实际上包括该序列以及其互补序列，以及相应的翻译成氨基酸或蛋白的序列。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补的核苷酸序列，也包括其对应的翻译后的氨基酸序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然；本申请中的基因序列包括RNA形式或DNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

本发明提供的人工转录激活因子dCas9-oToV，包括dCas9和TAD，其中，TAD包括4-8个oTAL转录激活结构域和2-3个oVP64转录激活结构域；oTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；oVP64的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

发明人将用于棉花基因编辑的Cas9突变成dCas9，并与不同的经过密码子优化后的VP64、TAL和EDLL转录激活结构域融合，通过瞬时表达系统筛选出转录激活效率良好的dCas9-oToV。该dCas9-oToV的基因激活效率高，可以实现目标基因的显著内源高表达，避免了目标基因的多拷贝外源导入的技术水平限制，同时填补了棉花这一领域的空白。

本发明中的dCas9为Cas9蛋白RuvCⅠ催化结构域的第10位Asp和HNH的第840位His被突变成Ala(D10A和H840A)后的蛋白。TAD可以为4个oTAL转录激活结构域和2个oVP64转录激活结构域，也可以为6个oTAL转录激活结构域和2个oVP64转录激活结构域，也可以为8个oTAL转录激活结构域和2个oVP64转录激活结构域，等结构。

在优选的实施方式中，人工转录激活因子dCas9-oToV还包括至少一个核定位信号(NLS)，优选为1-3个，进一步优选为2个。核定位信号可以定位于dCas9的N末端、C末端或内部位置。此外，人工转录激活因子dCas9-oToV还可以包括至少一个标志物结构域，例如荧光蛋白、纯化标签和表位标签。

在优选的实施方式中，TAD包括6个oTAL转录激活结构域和2个oVP64转录激活结构域。该结构下，靶基因pGhTULP34-LUC表达量可增加到51.9倍。

在优选的实施方式中，人工转录激活因子dCas9-oToV的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；进一步地，人工转录激活因子dCas9-oToV的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供与上述人工转录激活因子dCas9-oToV相关的生物材料，可以为核酸分子，例如SEQ ID NO.4或其转录的RNA；也可以为载体，例如在pGreenⅡ62-SK载体中重组SEQ ID NO.4得到的重组载体；也可以为细胞，该细胞可以得到上述载体或dCas9-oToV。上述生物材料可以作为生物模块直接用于实验或生产，避免从头构建的麻烦和核酸的降解。

本发明还提供一种基于dCas9-oToV的基因转录系统，包括由RNA聚合酶Ⅲ型U6启动子驱动表达的sgRNA和本发明的人工转录激活因子dCas9-oToV，其中，sgRNA的数目为一个或多个。当sgRNA的数目为一个时，可以对某个基因实现精准激活，当sgRNA的数目为多个时，实现多个基因同时激活。优选地，RNA聚合酶Ⅲ型U6启动子为陆地棉CCRI24的内源启动子pGhU6_1，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在优选的实施方式中，每个所述sgRNA上游均独立地含有核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的tRNA^Gly。在每个sgRNA前引入tRNA^Gly，用同一个pGhU6_1进行启动，可以同时实现棉花中多个内源基因被有效激活。

发明人在陆地棉CCRI24中克隆得到与拟南芥AtU6-26同源的启动子GhU6_1，用于启动sgRNA。用单个sgRNA引导dCas9-oToV结合到靶基因启动子特定位置时，可以将棉花内源基因进行有效激活。在每个sgRNA前引入tRNA^Gly，用同一个pGhU6_1进行启动，可以同时实现棉花中多个内源基因被有效激活，具有较高的实用性和特异性。

在一些实施方式中，sgRNA的靶基因包括GhTLP19、GhTULP34、GhLac1和GhLFY的至少一种。其中，GhTLP19的靶位点包括SEQ ID NO.7-16任一个所示的核苷酸序列；GhTULP34的靶位点包括SEQ ID NO.17-26任一个所示的核苷酸序列；GhLac1的靶位点包括SEQ IDNO.27-33任一个所示的核苷酸序列；GhLFY的靶位点包括SEQ ID NO.34-42任一个所示的核苷酸序列。

上述人工转录激活因子dCas9-oToV、生物材料或基因转录系统均可用于棉花，特异性激活内源靶基因的表达。

最后提供一种特异性激活棉花靶基因表达的方法，将本发明的基因转录系统导入棉花中，得到转基因棉花。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1：转录激活表达盒的构建和筛选

通过PCR定点突变和重叠延伸方法将Cas9的第10位Asp和第840位His都突变成Ala，使Cas9的核酸内切酶活性失活，变成dCas9。所需引物如下：

Cas9-F：ATGGACTATAAGGACCACGA(SEQ ID NO.43)；

dCas9(D10A)-1R：GGTGCCGATGTCCAGGCCGATGCTGTA(SEQ ID NO.44)；

dCas9(D10A)-1F：ATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTG(SEQ ID NO.45)；

dCas9(H840A)-2R：AGGCACGATATGGTCCACATCGTAGTCGG(SEQ ID NO.46)；

dCas9(H840A)-2F：GATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTC(SEQ ID NO.47)；

Cas9-R：CTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGG(SEQ ID NO.48)；

定点突变PCR反应体系如下：

Cas9质粒由本实验室提供。反应程序：94℃变性4min；98℃变性20s，52℃退火25s，68℃延伸5min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物使用EasyPure^@Quick GelExtraction Kit进行切胶回收，得到dCas9。将经过密码子优化后的oVP64、oTAL和EDLL于公司合成并与dCas9融合，分别构建入pGreenⅡ62-SK-dCas9载体的HindIII和KpnI两个酶切位点之间，得到不同的pGreenⅡ62-SK-dCas9-TAD(dCas9-TAD的结构如图1的A图所示)。

根据TM-1的基因组序列信息分别在基因GhTULP34 CDS上游设计引物，以CCRI24的DNA为模板对其启动子序列进行克隆，得到ATG上游序列，长度分别为1545bp。用无缝克隆试剂盒分别将这4个启动子序列构建入已经用BamHI线性化的pGreenⅡ0800-LUC载体中，获得pGreenⅡ0800-proGhTULP34-LUC载体。

将载体分别转入GV3101(pSoup-19)农杆菌中，挑取单克隆，经卡那霉素和利福平抗性筛选和sanger测序验证，随后在烟草中瞬时表达进行筛选最适激活转录因子。具体方式如下：1)将本氏烟草种植于条件为22℃，16h光照/8h黑暗的培养室中3周左右；2)将转化好的农杆菌分别于28℃摇床过夜活化扩摇，待其OD₆₀₀摇1.2左右时离心机4000rpm离心5min，弃掉上清；3)用重悬液(10mM MgCl₂、10mM MES pH5.7和0.2mM乙酰丁香酮)将菌液的OD₆₀₀重悬至0.6左右，将菌液进行混匀(pGreenⅡ62-SK-dCas9-TAD：pGreenⅡ0800-promoterGhTULP34)-LUC＝1：1；pGreenⅡ62-SK-dCas9-TAD：pGreenⅡ0800-promoterGhTULP34-LUC：pGreenⅡ62-SK-pGhU6-sgRNAn＝1：1：2)；4)注射到平展的烟草叶片背面中下部左右对称的部位，每个组合注射3颗烟草，每一颗注射3个叶片；5)注射后的烟草黑暗过夜培养，再于光下培养两天；6)取下注射过的烟草叶片，使用棉签轻轻的将100mM荧光素涂抹于叶片背面，于黑暗处放置10min；7)将处理好的叶片背面朝上放于低温冷却后的电荷耦合器件(CCD)成像设备Lumazone_1300B上，曝光时间为10min，然后进行观察拍照；8)最后计算LUC和REN的比值来确定不同的转录激活结构域对下游报告基因LUC的激活效率。结果如图1的B所示。

当2个oVP64与dCas9融合时对下游基因的激活效率是最好的。EDLL不适合本发明构建的dCas9介导的对下游基因激活转录系统。随后不同数量的oVP64和oTAL与dCas9融合表达后，结果发现三种组合(dCas9-4oTAL-2oVP64、dCas9-6oTAL-2oVP64和dCas9-8oTAL-2oVP64)都能对靶基因进行高效地转录激活，其中最高的达到51.9倍。

实施例2：陆地棉CCRI24中pGhU6启动子的获得

利用拟南芥AtU6-26基因的snRNA和启动子序列在陆地棉CCRI24的基因组中进行blast比对，一共筛选得到序列相似度最高的6个U6启动子序列，使用DNAMAN软件把这6个序列和拟南芥AtU6-26启动子序列进行比对，并对启动子区域的U6基因转录所必须的TATA-box和USE元件进行分析。根据比对结果选取相似度最高的CCRI24_GhU6-1在CCRI24的模板DNA中进行克隆。PCR反应体系为：

FastPfu Fly PCR SuperMix 25μl；U6-Fprimer(10μM)1μl；U6-R primer(10μM)1μl；DNA模板2μl；无菌水ddH₂O 21μl；共50μl体系，将所得产物用琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收连接T载并送公司测序(结果如图2)，例如，pGhU6_1的引物如下：

pGhU6_1-F：TTTATAAAGCAACATTATTGATTGG(SEQ ID NO.49)；

pGhU6_1-R：CATCTGGTGCTTCTTTCGC(SEQ ID NO.50)。

实施例3：靶基因启动子上sgRNA的设计和筛选

根据克隆得到的GhTLP19、GhTULP34、GhLac1和GhLFY四个基因的启动子序列信息，利用CRISPR-P 2.0和CRISPR-GE两个在线软件设计它们各自的sgRNA靶标序列。GhTLP19和GhTULP34分别设计了10个sgRNA(sgRNA1～10、图3的A图和sgRNA11～20、图3的A图)，GhLac1和GhLFY分别设计了7个(sgRNA21～27)和9个sgRNA(sgRNA31～39)。

利用重叠PCR延伸方法将pGhU6启动子、sgRNAn和guide RNA拼成一个片段，以sgRNA1为例，用引物pGhU6-F和sgRNA1-R(将sgRNA1互补序列以接头方式添加到引物pGhU6-R前)扩增得到第一个片段；用引物sgRNA1-F(将sgRNA1序列以接头方式添加到引物guideRNA前15bp上)和guideRNA-R扩增得到第二个片段；然后以得到的两个片段为模板，用引物pGhU6-F和guideRNA-R扩增得到pGhU6-sgRNA1-guideRNA。最后利用无缝克隆试剂盒将pGhU6-sgRNA1-guideRNA连接到已用SnaBI和KpnI线性化后的pGreenⅡ62-SK载体中得到pGreenⅡ62-SK-pGhU6-sgRNA1。根据此方法构建pGreenⅡ62-SK-pGhU6-sgRNAn(n为1～10，11～20，21～27，31～39)。引物如下：

infpGhU6_1-F：TCAGCTTGGTACGTATTTATAAAGCAACATTATTGATTGG(SEQ ID NO.51)；

guideRNA-R：AAAACAAAAAAGCACCGACTC(SEQ ID NO.52)；

infguideRNA-R：TACCGAATTGGTACCAAAACAAAAAAGCACCGACTC(SEQ ID NO.53)；

sgRNA1-R：CCACATCATCCCAATTCTCC CATCTGGTGCTTCTTTCGC(SEQ ID NO.54)；

sgRNA1-F：GGAGAATTGGGATGATGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.55)。

GhTLP19和GhTULP34启动子区域的靶位点序列如下所示。

参照实施例1进行sgRNA的筛选，图3的B图所示GhTLP19基因启动子区域内选取的10个sgRNA中，激活效率最高的是sgRNA7，在瞬时表达情况下对下游基因的激活效率是对照组的45.2倍。图3的C图所示在GhTULP34基因启动子区域内选取的10个sgRNA中，激活效率最高的是sgRNA19，在瞬时表达情况下对下游基因的激活效率是对照组的53.4倍。

实施例4：dCas9-oToV对棉花内源基因GhTLP19和GhTULP34的转录激活

对GhTLP19和GhTULP34两个基因启动子区域筛选得到的最适合靶标sgRNA位点表达盒(pGhU6-tRNA-sgRNA7和pGhU6-tRNA-sgRNA19)利用无缝克隆的方式插入到表达载体中，得到两个单靶标激活表达载体。为了探究此系统是否能同时激活两个基因的表达水平，我们在每个sgRNA前引入一个tRNA^Gly序列，采用重叠PCR方法分别得到pGhU6-tRNA-sgRNA7-tRNA-sgRNA19载体。引物序列如下：

infGhU6-F：AATTCTAGAGGCGCGCCTTAATCTGATGCTCCACCTGCTTTTGAT

(SEQ ID NO.56)；

infgRNA-R：

GAGGATATCGGCGCGCCATTTCTAGCTCTAAAACAAAAAAGCACCGAC(SEQ ID NO.57)；

sgRNA-F：AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG(SEQ ID NO.58)；

infsgRNA-F：AAGCATCAGATGGGCAAACAAA(SEQ ID NO.59)；

sgRNA7-R：ATTTGAATTTCCTACAGGCCTGCACCAGCCGGGAAT(SEQ ID NO.60)；sgRNA19-F：GGCCTGTAGGAAATTCAAATGTTTTAGAGCTAGAAATA(SEQ ID NO.61)；

sgRNA19-R：TTCTGTTTTCAGCTATTGCTTGCACCAGCCGGGAAT(SEQ ID NO.62)；infsgRNA19-R：TTCTAGCTCTAAAACTTCTGTTTTCAGCTATTGCT(SEQ ID NO.63)。

棉花的遗传转化和组织培养具体过程参照张朝军博士论文。

利用CTAB法抽提DNA。将需要提取RNA的样品收集好，采用天根公司的多糖多酚总RNA提取试剂盒进行RNA的提取。使用宝生物公司的反转录试剂盒RR047A进行反转录和qRT-PCR。通过对转基因后代DNA中dCas9基因进行PCR分子检测，将扩增得到的条带进行Sanger测序进一步确定阳性单株。随后对阳性单株和对照单株内dCas9和靶基因的表达水平进行qRT-PCR，确定被激活的效率。CRISPR/dCas9介导的转录激活表达载体模式图如图4的A所示。图4的B图显示，dCas9的转录水平正常，只是一些阳性植物的dCas9表达低或不表达。甘露醇胁迫下TULP#5和WT植物的气孔运动结果如图4的C图所示。图4的D图显示，检测单靶点sgRNA19子代植物中GhTULP34的转录水平发现TULP#6中的转录水平比对照高6.4倍，其中最高转录水平是TULP#5中靶基因的35.5倍。当棉花受到渗透胁迫时，GhTULP34的过表达可以抑制气孔关闭(Li等，2021)。我们用400mM甘露醇处理TULP#5和WT植物，并观察它们的气孔闭合。图4的E图结果表明经处理的TULP#5植物的气孔关闭受到显着抑制，进一步证明我们构建的转录激活系统有效上调了GhTULP34的表达。图4的F图显示在单靶点sgRNA7的转化后代中，75％阳性植物中GhTLP19的转录水平显着上调，最高效率达到30.5倍。我们还检测了双靶标sgRNA7和sgRNA19转化后代中靶基因的表达水平，图4的G图结果显示GhTLP19和GhTULP34均被激活超过15倍。这表明该系统可以有效地激活棉花中的靶基因(单/双靶)。检测引物如下：

dCas9-1F：GATGGATGGAACCGAGGAGC(SEQ ID NO.64)；

dCas9-1R：CAGCAAGGTTAGCGATGTGC(SEQ ID NO.65)；

qrtGhTLP19-F：GCAGTCAAGGCAGTTGGTGGTA(SEQ ID NO.66)；

qrtGhTLP19-R：ATATTCCGGCGTGTTGAAGGCA(SEQ ID NO.67)；

qrtGhTULP34-F：GCCTGGTCCGAAGGAATGTCTC(SEQ ID NO.68)；

qrtGhTULP34-R：TCATCTTTGCACCGGCATGACT(SEQ ID NO.69)。

实施例5：dCas9-oToV对棉花内源基因GhLac1和GhLFY的转录激活

为了进一步验证dCas9与转录激活结构域TAL和VP64融合后对下游特定靶基因的激活作用(图5)。采用实施例4的试验方案，通过瞬时表达筛选得到两个基因GhLac1和GhLFY启动子上效率较高的sgRNA27(图5的A图)和sgRNA34(图5的B图)，并将pGhLac1-sgRNA27和pGhLFY-sgRNA34构建入棉花表达载体，进行棉花遗传转化。最终获得单独激活GhLac1的棉花阳性苗3株，Lac#7单株中GhLac1的表达水平最高，是对照的4.71倍(图5的C图)。在单独激活GhLFY的5株棉花阳性苗中，单株LFY#11和LFY#15的表达水平分别被激活到了3.61倍和4.68倍(图5的D图)。在GhLac1和GhLFY的双基因激活的转化后代中只检测到了2株阳性苗，单株LL#25中GhLac1和GhLFY两个的表达水平都被有效的激活，表达水平分别是对照单株中的4.33倍和3.47倍(图5的E图)。所用引物如下：

GhLac1和GhLFY启动子区域的靶位点序列如下表所示。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 基于dCas9-oToV的基因转录系统及其应用

<160> 87

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgcttgatc ctggaactcc aatggatgct gatttggttg cttcatctac agttgtttgg 60

gagcaagatg ctgatccttt tgctggaact gctgatgatt ttcctgcttt taatgaagag 120

gaattggctt ggcttatgga gttgttgcct caa 153

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacgcattgg acgattttga tctggatatg ctgggaagtg acgccctcga tgattttgac 60

cttgacatgc ttggttcgga tgcccttgat gactttgacc tcgacatgct cggcagtgac 120

gcccttgatg atttcgacct ggacatgctg 150

<210> 3

<211> 1881

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp

1 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25 30

Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu

35 40 45

Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr

50 55 60

Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His

65 70 75 80

Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu

85 90 95

Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr

100 105 110

Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu

115 120 125

Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe

130 135 140

Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn

145 150 155 160

Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His

165 170 175

Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu

180 185 190

Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu

195 200 205

Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe

210 215 220

Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile

225 230 235 240

Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser

245 250 255

Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys

260 265 270

Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr

275 280 285

Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln

290 295 300

Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln

305 310 315 320

Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser

325 330 335

Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr

340 345 350

Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His

355 360 365

Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu

370 375 380

Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly

385 390 395 400

Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys

405 410 415

Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu

420 425 430

Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser

435 440 445

Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg

450 455 460

Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu

465 470 475 480

Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg

485 490 495

Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile

500 505 510

Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln

515 520 525

Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu

530 535 540

Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr

545 550 555 560

Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro

565 570 575

Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe

580 585 590

Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe

595 600 605

Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp

610 615 620

Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile

625 630 635 640

Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu

645 650 655

Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu

660 665 670

Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys

675 680 685

Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys

690 695 700

Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp

705 710 715 720

Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile

725 730 735

His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val

740 745 750

Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly

755 760 765

Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp

770 775 780

Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile

785 790 795 800

Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser

805 810 815

Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser

820 825 830

Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu

835 840 845

Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp

850 855 860

Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile

865 870 875 880

Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu

885 890 895

Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu

900 905 910

Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala

915 920 925

Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg

930 935 940

Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu

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Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser

965 970 975

Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val

980 985 990

Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp

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Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala

1010 1015 1020

His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys

1025 1030 1035

Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys

1040 1045 1050

Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile

1055 1060 1065

Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn

1070 1075 1080

Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys

1085 1090 1095

Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp

1100 1105 1110

Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met

1115 1120 1125

Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1130 1135 1140

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu

1145 1150 1155

Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe

1160 1165 1170

Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val

1175 1180 1185

Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu

1190 1195 1200

Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile

1205 1210 1215

Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu

1220 1225 1230

Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly

1235 1240 1245

Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn

1250 1255 1260

Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala

1265 1270 1275

Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln

1280 1285 1290

Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile

1295 1300 1305

Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp

1310 1315 1320

Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp

1325 1330 1335

Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr

1340 1345 1350

Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr

1355 1360 1365

Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1370 1375 1380

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg

1385 1390 1395

Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr

1400 1405 1410

Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Arg Gly Gly Ser

1415 1420 1425

Gly Gly Leu Leu Asp Pro Gly Thr Pro Met Asp Ala Asp Leu Val

1430 1435 1440

Ala Ser Ser Thr Val Val Trp Glu Gln Asp Ala Asp Pro Phe Ala

1445 1450 1455

Gly Thr Ala Asp Asp Phe Pro Ala Phe Asn Glu Glu Glu Leu Ala

1460 1465 1470

Trp Leu Met Glu Leu Leu Pro Gln Gly Gly Ser Gly Gly Leu Leu

1475 1480 1485

Asp Pro Gly Thr Pro Met Asp Ala Asp Leu Val Ala Ser Ser Thr

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Val Val Trp Glu Gln Asp Ala Asp Pro Phe Ala Gly Thr Ala Asp

1505 1510 1515

Asp Phe Pro Ala Phe Asn Glu Glu Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu

1520 1525 1530

Leu Leu Pro Gln Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Leu Leu Asp Pro

1535 1540 1545

Gly Thr Pro Met Asp Ala Asp Leu Val Ala Ser Ser Thr Val Val

1550 1555 1560

Trp Glu Gln Asp Ala Asp Pro Phe Ala Gly Thr Ala Asp Asp Phe

1565 1570 1575

Pro Ala Phe Asn Glu Glu Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu Leu Leu

1580 1585 1590

Pro Gln Gly Gly Ser Gly Gly Leu Leu Asp Pro Gly Thr Pro Met

1595 1600 1605

Asp Ala Asp Leu Val Ala Ser Ser Thr Val Val Trp Glu Gln Asp

1610 1615 1620

Ala Asp Pro Phe Ala Gly Thr Ala Asp Asp Phe Pro Ala Phe Asn

1625 1630 1635

Glu Glu Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu Leu Leu Pro Gln Ala Arg

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Gly Gly Ser Gly Gly Leu Leu Asp Pro Gly Thr Pro Met Asp Ala

1655 1660 1665

Asp Leu Val Ala Ser Ser Thr Val Val Trp Glu Gln Asp Ala Asp

1670 1675 1680

Pro Phe Ala Gly Thr Ala Asp Asp Phe Pro Ala Phe Asn Glu Glu

1685 1690 1695

Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu Leu Leu Pro Gln Gly Gly Ser Gly

1700 1705 1710

Gly Leu Leu Asp Pro Gly Thr Pro Met Asp Ala Asp Leu Val Ala

1715 1720 1725

Ser Ser Thr Val Val Trp Glu Gln Asp Ala Asp Pro Phe Ala Gly

1730 1735 1740

Thr Ala Asp Asp Phe Pro Ala Phe Asn Glu Glu Glu Leu Ala Trp

1745 1750 1755

Leu Met Glu Leu Leu Pro Gln Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1760 1765 1770

Gly Ser Gly Gly Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu

1775 1780 1785

Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser

1790 1795 1800

Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala

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Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Ala Arg Gly Ser Asp Ala

1820 1825 1830

Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp

1835 1840 1845

Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe

1850 1855 1860

Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu

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Asp Met Leu

1880

<210> 4

<211> 5646

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60

gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120

gacaagaagt acagcatcgg cctggctatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400

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aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggacgctatc 2640

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700

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tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880

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aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120

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atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240

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accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660

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tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200

ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260

aagaaaaagc caaggggagg atcaggtggt ttgcttgatc ctggaactcc aatggatgct 4320

gatttggttg cttcatctac agttgtttgg gagcaagatg ctgatccttt tgctggaact 4380

gctgatgatt ttcctgcttt taatgaagag gaattggctt ggcttatgga gttgttgcct 4440

caaggaggtt ctggtggatt gcttgatcct ggaactccaa tggatgctga tttggttgct 4500

tcatctacag ttgtttggga gcaagatgct gatccttttg ctggaactgc tgatgatttt 4560

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acagttgttt gggagcaaga tgctgatcct tttgctggaa ctgctgatga ttttcctgct 4740

tttaatgaag aggaattggc ttggcttatg gagttgttgc ctcaaggagg ttcaggaggt 4800

ttgcttgatc ctggaactcc aatggatgct gatttggttg cttcatctac agttgtttgg 4860

gagcaagatg ctgatccttt tgctggaact gctgatgatt ttcctgcttt taatgaagag 4920

gaattggctt ggcttatgga gttgttgcct caagctaggg gaggatctgg tggtttgctt 4980

gatcctggaa ctccaatgga tgctgatttg gttgcttcat ctacagttgt ttgggagcaa 5040

gatgctgatc cttttgctgg aactgctgat gattttcctg cttttaatga agaggaattg 5100

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ccaatggatg ctgatttggt tgcttcatct acagttgttt gggagcaaga tgctgatcct 5220

tttgctggaa ctgctgatga ttttcctgct tttaatgaag aggaattggc ttggcttatg 5280

gagttgttgc ctcaagctag gggtggatct ggaggtggtg gtagcggagg agacgcattg 5340

gacgattttg atctggatat gctgggaagt gacgccctcg atgattttga ccttgacatg 5400

cttggttcgg atgcccttga tgactttgac ctcgacatgc tcggcagtga cgcccttgat 5460

gatttcgacc tggacatgct ggctagggga tctgacgcat tggacgattt tgatctggat 5520

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gatgactttg acctcgacat gctcggcagt gacgcccttg atgatttcga cctggacatg 5640

ctgtaa 5646

<210> 5

<211> 385

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttataaagc aacattattg attggtaata tacattaatt ccaaggcaaa cccaaatatt 60

ttaaaattta acctacaact gtggtaaatc aaacttaata gtaacccgat tgtaatgtga 120

agtcaaatat gaaagtaaca ttggtttata tatatatttt tctctaaatt ctaataatca 180

agttgggata agtgataaac actgagcttg ccacgtgtgt taacctcgtt ttcatcatgt 240

gccactccaa agacatcagg cctctattca agctggcatg gtcaggacgt ggtagcatac 300

ttcagggatc tggttagaaa atatcccata tcgctaaaga actataacac aggagcgttt 360

atataagcga aagaagcatc agatg 385

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgca 77

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagaattgg gatgatgtgg ggg 23

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<212> DNA

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<400> 8

gggggcagta gaacccgaac tgg 23

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<212> DNA

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tctactgccc ccataaattt tgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttgcaacca aaatttatgg ggg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aatcttgttc acgaaaagat agg 23

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<212> DNA

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<212> DNA

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gggatcttaa ccgagaatca agg 23

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<212> DNA

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<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taagatgcag agagaaaaaa ggg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttagttacta caaattgtag agg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

attcggaatt gaatgttttt agg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttgtgagct ggaggatgtt agg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcgaatcgtt agtgtttatt cgg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agatcgaaaa gtcacagaag tgg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggaggagaaa ttgtgattag ggg 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atatctaaga aaataacaca agg 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

attggctgaa gggtaagttt tgg 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agcaatagct gaaaacagaa agg 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaactaacag ataataagaa agg 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

actaagaaca cattagacag ggg 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ataaaacgag cacagcagtg agg 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctctcattcc aaaaactgta ggg 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ccaaagatga gaacattcag ggg 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tctttgggtc aaccatttat agg 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gggtcaacca tttataggaa agg 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ccctgaatgt tctcatcttt ggg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gatgcttcaa aattgcccta cgg 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agtggaggtt cacaccttag ggg 23

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

agggaaccga acttgacagt tgg 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ggaaatcgac acgtcaatac ggg 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgtaccctga tatcaggata cgg 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

atgctcaaca ccctaacaaa agg 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

agaccatggg ggcaactcca agg 23

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

attccttgga gttgccccca tgg 23

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ttcacacctt aggggtataa agg 23

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

atggactata aggaccacga 20

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ggtgccgatg tccaggccga tgctgta 27

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

atcggcctgg acatcggcac caactctgtg 30

<210> 46

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

aggcacgata tggtccacat cgtagtcgg 29

<210> 47

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gatgtggacc atatcgtgcc tcagagcttt c 31

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ctttttcttt tttgcctggc cgg 23

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tttataaagc aacattattg attgg 25

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

catctggtgc ttctttcgc 19

<210> 51

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tcagcttggt acgtatttat aaagcaacat tattgattgg 40

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

aaaacaaaaa agcaccgact c 21

<210> 53

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

taccgaattg gtaccaaaac aaaaaagcac cgactc 36

<210> 54

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

ccacatcatc ccaattctcc catctggtgc ttctttcgc 39

<210> 55

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ggagaattgg gatgatgtgg gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 56

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

aattctagag gcgcgcctta atctgatgct ccacctgctt ttgat 45

<210> 57

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gaggatatcg gcgcgccatt tctagctcta aaacaaaaaa gcaccgac 48

<210> 58

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

aagcatcaga tgggcaaaca aagcaccagt ggtctag 37

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

aagcatcaga tgggcaaaca aa 22

<210> 60

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

atttgaattt cctacaggcc tgcaccagcc gggaat 36

<210> 61

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

ggcctgtagg aaattcaaat gttttagagc tagaaata 38

<210> 62

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ttctgttttc agctattgct tgcaccagcc gggaat 36

<210> 63

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ttctagctct aaaacttctg ttttcagcta ttgct 35

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gatggatgga accgaggagc 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

cagcaaggtt agcgatgtgc 20

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gcagtcaagg cagttggtgg ta 22

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

atattccggc gtgttgaagg ca 22

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

gcctggtccg aaggaatgtc tc 22

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

tcatctttgc accggcatga ct 22

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

aatattggct ttctgttctt tgaatcttgc 30

<210> 71

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ttctcccctg tctaatgtgt tcttagttc 29

<210> 72

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

gcagcccggg ggatccaata ttggctttct gttctttgaa tcttgca 47

<210> 73

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

tagaactagt ggatccttct cccctgtcta atgtgttctt agttct 46

<210> 74

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

ttgttgtcct tgtgggaacg atat 24

<210> 75

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

ttttgaagtg aaaacaagaa aatagagaag aag 33

<210> 76

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gcagcccggg ggatccttgt tgtccttgtg ggaacgatat atttgt 46

<210> 77

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

tagaactagt ggatcctttt gaagtgaaaa caagaaaata gagaagaaga aaaaatattc 60

ttatcc 66

<210> 78

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

aaagatgaga acattcaggg tgcaccagcc gggaat 36

<210> 79

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

ccctgaatgt tctcatcttt gttttagagc tagaaata 38

<210> 80

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

ccctgaatgt tctcatcttt gttttagagc tagaaata 38

<210> 81

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

ttctagctct aaaacgtatt gacgtgtcga tttcc 35

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

ttcctctgct gcacctgttg ac 22

<210> 83

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

ggcaagttgt ttaccgcgag tg 22

<210> 84

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

ttcaaggagc gaggcgagaa tg 22

<210> 85

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

ctgtcgaagc ttagtcggga cg 22

<210> 86

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

gaaggcattc cacctgacca ac 22

<210> 87

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

cttgaccttc ttcttcttgt gcttg 25

Claims

1.一种人工转录激活因子dCas9-oToV，其特征在于，包括dCas9和TAD，所述TAD包括4-8个oTAL转录激活结构域和2-3个oVP64转录激活结构域；

oTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

oVP64的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的人工转录激活因子dCas9-oToV，其特征在于，还包括至少一个核定位信号，优选为1-3个，进一步优选为2个；

3.根据权利要求2所述的人工转录激活因子dCas9-oToV，其特征在于，人工转录激活因子dCas9-oToV的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

4.与权利要求1-3任一项所述的人工转录激活因子dCas9-oToV相关的生物材料，包括：

(a)核酸分子，编码权利要求1-3任一项所述的人工转录激活因子dCas9-oToV；

(b)载体，含有(a)核酸分子；

(c)细胞，含有(a)核酸分子或(b)载体。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，载体的骨架为pGreenⅡ62-SK载体。

6.一种基于dCas9-oToV的基因转录系统，其特征在于，包括由RNA聚合酶Ⅲ型U6启动子驱动表达的sgRNA和权利要求1-3任一项所述的人工转录激活因子dCas9-oToV，所述sgRNA的数目为一个或多个。

7.根据权利要求6所述的基因转录系统，其特征在于，所述RNA聚合酶Ⅲ型U6启动子为陆地棉CCRI24的内源启动子pGhU6_1，所述pGhU6_1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

8.根据权利要求7所述的基因转录系统，其特征在于，所述sgRNA的靶基因包括GhTLP19、GhTULP34、GhLac1和GhLFY的至少一种；

9.权利要求1-3任一项所述的人工转录激活因子dCas9-oToV、权利要求4或5所述的生物材料或权利要求6-8任一项所述的基因转录系统在棉花中的应用。

10.一种特异性激活棉花靶基因表达的方法，其特征在于，将权利要求6-8任一项所述的基因转录系统导入棉花中，得到转基因棉花。