CN114106123B - 转录激活结构域TaL及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转录激活结构域TaL及其应用，所述转录激活结构域TaL氨基酸序列为ADEVGTKRIRLDSEPST，本发明的转录激活结构域转录活性优于现有的转录激活域，而且TaL转录激活域只有17个氨基酸，所以只需要51个碱基便可以编码一个拷贝，对于dCas9载体的影响不大。相较于动辄数十上百的其它转录激活域具有较大优势，更利于做稳定转化，获得转基因材料。

Description

转录激活结构域TaL及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种转录激活结构域TaL及其应用。

背景技术

转录因子(Transcription Factor,TF)是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子，能够与基因上游启动子元件结合对基因的转录水平起抑制或增强的作用。TF通常由DNA结合结构域与效应结构域两部分组成，研究发现这两个结构域可以各自独立发生作用。基于转录因子的这种结构特点，可以人为地选择针对特定序列的DNA结合结构域与具有特定作用的效应结构域构建人工转录因子(Artificial Transcription Factor，ATF)，这就是第一代的ATF。 ATF的构建已在TF的生物学功能研究中起到重要作用。第一代ATF的DNA结合结构域多为C2H2(Cys2His2)型锌指结构，每一个锌指单元由大约30个氨基酸组成，识别DNA双螺旋大沟中相连的3bp序列，并可通过氢键作用与相应的碱基结合；多个锌指结构可以串联成簇，从而识别并结合较长的DNA序列区域。ATF的效应结构域有激活结构域或抑制结构域，不同的效应结构域赋予人工转录因子不同的功能。通过体外设计筛选或建模构建特异的 ATF，然后进入体内与特异DNA序列结合调控目的基因的表达。ATF在基因组遗传筛选、生物合成通路改造及作物改良、药物设计以及基因治疗等领域得到广泛应用。

第一代ATF需要深入研究已有转录因子的分子结构，才能找到能特异识别DNA序列的蛋白结构域，不能根据基因启动子序列寻找合适的DNA结合结构域，在应用方面具有极大的限制因素。第二代ATF由CRISPR Cas9技术衍生的基因激活系统构成。该系统包括核酸酶失活的Cas9(nuclease-dead mutants of Cas9,dCas9)和已知的转录激活结构域或转录抑制结构域。融合而成的dCas9 ATF具有转录调控功能。使用靶向目标基因启动子的sgRNA，便可将dCas9 ATF结合到目标基因启动子区域，行使转录调控功能。目前已经报道的可用于构建人工转录因子的转录激活域并不多，有VP16、VP64、EDLL和SAC3。

其中，SAC3是从杉木cDNA文库中分离得到一段高效转录激活序列。在拟南芥中，SAC3的转录激活活性为VP16的两倍以上、EDLL的50倍，表明不同的转录激活域具有不同的转录激活能力。

因此开发更多植物来源的转录激活域，将其应用于植物的基因工程技术中，用以精确激活植物体内特定基因表达，改善植物与该特定基因相关的性状，大幅提高作物的经济价值具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：开发转录激活功能更强的转录激活结构域，为构建用于激活基因转录的ATF提供更多选择。

本发明的技术方案为：转录激活结构域TaL，其氨基酸序列为ADEVGTKRIRLDSEPST(SEQ ID No.1所示)。

多核苷酸片段，编码上述所述的转录激活结构域TaL。

重组载体，含有上述所述多核苷酸片段。

人工转录因子，含有上述所述的转录激活结构域TaL。

进一步地，所述人工转录因子包括dCas9蛋白和转录激活结构域TaL。

本发明的转录激活结构域TaL或多核苷酸片段或重组载体或人工转录因子在调控基因表达中的用途。

TaL是小麦TaLHY基因C-端的转录激活域。TaLHY基因是在小麦中首次克隆的一个参与抗条锈病防御和穗伸长、株高发育、叶片生长发育调控的重要节律基因，同时它的编码蛋白也是一个Ⅰ型R1/R2-MYB类转录因子。使用酵母双杂交的方法鉴定出TaLHY转录因子的转录激活结构域(AD,Activating Domain)，命名为TaL，并将AD融合至dCas9蛋白的 C末端，构成基于dCas9的ATF——dCas9-TaL(dCas9-TaL activating domain)。由于转录激活结构域TaL只包括17个氨基酸残基，因此可以构建多个拷贝的TaL或使用TaL和别的AD 进行串联。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、使用dCas9融合转录激活域在小麦原生质体中进行验证，dCas9融合TaL转录激活域蛋白可以极显著提高35Smini启动子转录活性。证明，TaLHY蛋白只有一个转录激活域TaL，并且可以应用于构建dCas9人工转录因子。目前已经报道的可用于构建人工转录因子的转录激活域有VP16、VP64、EDLL以及SAC3。TaL转录激活域的发现和应用为构建人工转录因子提供更多选择。

2、通过和VP16、VP64、EDLL以及SAC3进行比较，发现转录激活域TaL具有最高的转录激活能力，约是VP16、VP64以及SAC3的2倍。

3、TaL转录激活域只有17个氨基酸(ADEVGTKRIRLDSEPST)，所以只需要51个碱基便可以编码一个拷贝，对于dCas9载体的影响不大。相较于动辄数十上百的其它转录激活域具有较大优势，更利于做稳定转化，获得转基因材料。

附图说明

图1酵母GAL4-UAS系统工作原理；注：GAL4表示酵母菌的GAL4转录因子，AL4- BD表示GAL4的DNA结合结构域(DNA binding domain，也即是pGBKT7载体编码的氨基酸序列)。UAS表示GAL4-BD能特异识别的DNA序列。TaL表示小麦MYB转录因子 TaLHY的转录激活结构域。RNAP表示RNA聚合酶。mRNA表示由基因组DNA转录而成的信使RNA。gDNA表示基因组DNA。Nucleus表示细胞核。Yeast表示酵母菌。

图2 Y2H鉴定TaL具有转录激活功能，注：SD-W表示营养缺陷培养基SD-Trp， SD-WHA表示营养缺陷培养基SD-Trp/-His/-Ade。酵母菌能在SD-WHA生长则表明 pGBKT7的融合蛋白具有转录激活功能。

图3dCas9-TaL工作原理图，注：dCas9为核酸酶失活的Cas9蛋白。gRNA为引导 RNA，可以依据碱基互补配对原则特异识别DNA序列。NGG的N表示任意碱基，G表示鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸。TaL表示TaLHY的转录激活结构域。RNAP表示RNA聚合酶。 LUC mRNA表示荧光素酶LUC基因的mRNA。p35Smini表示最小35S启动子。Wheat Protoplast表示小麦原生质体。

图4dCas9-TaL具有激活功能，注：纵坐标LUC/GUS表示ATF的转录激活能力。 TaL表示dCas9-TaL，VP16、VP64、EDLL、SAC3表示已知的几个转录激活域和dCas9分别融合的ATF，NA表示dCas9蛋白。**表示和NA相比，差异极显著，p<0.05。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1酵母中验证TaL转录激活域

1)实验方法

基于酵母菌GAL4-UAS系统(图1)，使用酵母双杂交方法验证TaL的转录激活域。参考文献Chen S,Han X,Yang L,et al.Identification and functional analyses ofhost factors interacting with the 17-kDa protein of Barley yellow dwarfvirus-GAV[J].Scientific Reports,2021, 11(1):8453-8465中的方法方法，构建pGBKT7融合载体，使用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切 pGBKT7载体。合成编码TaL转录激活结构域的DNA序列(GCTGACGAGGTTGGTACCAAGAGGATTCGCCTTGACAGCGAACCCTCCACG)，将其构建至两个酶切位点之间，命名新载体pGBKT7-TaL。

使用AH109酵母感受态，参考说明书将pGBKT7-TaL转化到酵母细胞中。使用酵母营养缺陷培养基SD-Trp筛选阳性单菌落，将筛选到的阳性单菌落转移至三缺培养基SD-Trp-His-Ade上，使用pGBKT7-AD做阳性对照，使用pGBKT7空载体做阴性对照。30℃培养3d，观察酵母菌生长状态，若酵母菌SD-Trp-His-Ade营养缺陷培养基上生长良好，则证明插入基因具有转录激活域。

2)实验结果

使用pGBKT7载体构建pGBKT7-TaL重组载体。使用营养缺陷培养基SD-Trp和 SD-Trp-His-Ade，在酵母菌AH109中验证TaL的转录激活功能。酵母双杂交结果显示，阴性对照酵母菌带有pGBKT7质粒，不能在SD-Trp-His-Ade营养缺陷培养基培养基上正常生长；带有pGBKT7-TaL质粒的酵母菌和阳性对照pGBKT7-AD一样，均可以在SD-Trp- His-Ade营养缺陷培养基培养基上正常生长，证明TaL具有转录活性功能(图2)。

实施例2dCas9-TaL的应用

1)实验方法

参考文献Piatek A,Ali Z,Baazim H,et al.RNA-guided transcriptionalregulation in planta via synthetic dCas9-based transcription factors.[J].Plant Biotechnology Journal,2015,13(4):578- 589的方法，使用特异引物进行定点突变，将Cas9改造成无核酸酶活性的dCas9(D10A、 H840A)。分别使用三对引物dCas9-F1/dCas9-R1、dCas9-F2/dCas9-R2、dCas9-F3/dCas9- R3克隆出包括突变位点的可用于重组连接的DNA片段，将扩增的片段纯化后置于4℃备用。使用XhoⅠ和NheⅠ双酶切质粒35S::HAHA-NLS-Cas9-HAHA-NLS载体，切去 Cas9基因后，将载体骨架DNA片段回收备用。使用DNA重组酶，将包括突变位点的3 个DNA片段和一个载体骨架进行重组连接，参考上文构建载体方法获得测序无误的 35S::HAHA-NLS-dCas9-HAHA-NLS重组载体，命名dCas9。使用已知的转录激活域VP16、 VP64、EDLL和SAC3做对照，分析TaL转录激活域的转录激活强度。使用NcoⅠ和Mlu Ⅰ双酶切测序无误的dCas9质粒，将合成的TaL(TaLHY的3’端51个碱基)、EDLL、 VP16、SAC3、VP64分别连入dCas9的末端，测序正确后将甘油菌(20％)置于-80℃备用。

基于dCas9系统(图3)，分别构建sgRNA载体和dCas9载体。使用一对长引物35Smini-F/35Smini-R，扩增出46bp的35Smini启动子 (AGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCCCCAAGCTTGGGCCC)，使用BamHⅠ和 KpnⅠ双酶切LUC载体，使用同源重组的方法将最小35S启动子(35Smini)连接至LUC (Luciferase)的5’端。使用引物AtU6-F/35Smini-sg-R、35Smini-sg-F/sg-R分别扩增含有 gRNA片段的AtU6启动子和sgRNA序列，使用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切PUC18载体，使用重组酶构建pAtU6::sg重组载体。

表1引物序列

参考分子克隆实验指南Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecularcloning:a laboratory manual[M].Cold spring harbor laboratory press,1989.doi:10.2307/1309366.，使用CsCl密度梯度离心方法提dCas9、dCas9-TaL、dCas9-VP16、dCas9-VP64、dCas9-SAC3、dCas9- EDLL、35Smini::LUC、pAtU6::sg质粒。然后使用Nanodrop2000将其浓度调至2μg/μL，置于-20℃备用。

参考Shan Q,Wang Y,Li J,et al.Genome editing in rice and wheat usingthe CRISPR/Cas system[J].Nature Protocols,2014,9(10):2395-2410.试验方法，使用PEG-Ca²⁺介导的方法，将质粒共转染至小麦原生质体。2000lx 23℃培养16h，进行LUC分析。将过夜培养的小麦原生质体80g离心2min，置于冰上备用。加入50μL细胞裂解液，剧烈震荡120s以裂解细胞(20s/次)。置于冰上5min后12000r/minin离心2min。取10μL裂解液加入100μL LUC mix(E1501，Promega)，使用酶标仪测定LUC活性。参考LUC分析过程，使用10μL裂解液，加入100μL MUG substrate mix，37℃反应30min，使用0.2M Na₂CO₃终止反应，直接使用酶标仪测定GUS活性。使用LUC/GUS对报告基因LUC的表达进行相对定量分析。

2)实验结果

为了验证TaL在小麦细胞内是否具有转录激活功能，构建基于dCas9系统的ATF。分别构建35Smin启动子连接报告基因LUC、dCas9蛋白融合TaL转录激活域瞬时过表达载体、TaU6::sgRNA和35Smini::LUC。在小麦原生质体中共转染dCas、sgRNA和 35Smini::LUC以及35S::GUS，进行LUC分析，结果表明针对不同的sgRNA位点，所构建的人工转录因子具有不同的转录激活功能。dCas9连接TaLHY C端的17个氨基酸构成融合蛋白具有转录激活功能，并且，使用特异sgRNA均可极显著提高35Smini启动子转录活性(图4)。其中TaL的转录活性约是VP16、VP64以及SAC3的2倍。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 转录激活结构域TaL及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 1

Ala Asp Glu Val Gly Thr Lys Arg Ile Arg Leu Asp Ser Glu Pro Ser

1 5 10 15

Thr

Claims (6)

1.转录激活结构域TaL，其氨基酸序列为ADEVGTKRIRLDSEPST。

2.多核苷酸片段，编码权利要求1所述的转录激活结构域TaL。

3.重组载体，含有权利要求2所述多核苷酸片段。

4.人工转录因子，含有权利要求1所述的转录激活结构域TaL。

5.根据权利要求4所述的人工转录因子，其特征在于，所述人工转录因子包括dCas9蛋白和转录激活结构域TaL。

6.权利要求1所述的转录激活结构域TaL或权利要求2所述的多核苷酸片段或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的人工转录因子在调控酵母或植物的基因表达中的用途。

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