CN107012164B

CN107012164B - CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用

Info

Publication number: CN107012164B
Application number: CN201710146782.3A
Authority: CN
Inventors: 张勇; 唐旭; 郑雪莲; 邓科君; 周建平
Original assignee: University of Electronic Science and Technology of China
Current assignee: University of Electronic Science and Technology of China
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2037-03-13
Also published as: CN107012164A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用。本发明要解决的技术问题是：依据CRISPR/Cpf1系统的的作用原理及植物细胞基因表达特性，构建有效的植物基因组CRISPR/Cpf1定向修饰骨架载体，并实现其在植物基因组定向修饰中的高效应用。本发明的技术方案是：构建由一个毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)Cpf1核酸酶蛋白(LbCpf1)表达单元及一个向导crRNA转录表达单元构成的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体。本发明还提供了采用所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体，针对水稻基因组目标位点设计特异性向导crRNA并构建CRISPR/Cpf1重组表达载体的方法。本发明提供了一种高效的CRISPR/Cpf1植物定向修饰骨架载体，可以针对植物基因组目标序列有效实现基于CRISPR/Cpf1系统的简单、快捷、高效定向修饰。

Description

CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该框架的载体及其应用方法。

背景技术

基因组定向修饰一直是生物学研究的前沿与热点领域，通过对基因组特定区域进行精确定向修饰：一方面可以针对目标序列进行精确突变，获得突变材料，对目标基因功能进行明确鉴定；另一方面可以进行目标序列的精确置换或插入，将外源基因随机导入造成的表达及遗传的不确定性降至最低。自1996年起，研究者相继报道了ZFN(Kim et al.,1996)、TALEN(Christian et al.,2010)、CRISPR/Cas9(Jinek et al.,2012)的DNA定向剪切活性，被广泛应用于动物、植物基因组定向修饰中，极大推进了真核生物基因组工程的基础及应用研究。

最近发现的CRISPR/Cas9系统是(古)细菌中一类异于“限制-修饰系统”的对抗外源核酸分子入侵的基因组免疫系统：研究表明，在细菌中一个序列特异性的crRNA(CRISPRRNA)与另一tracrRNA分子(trans-activating crRNA)同源区域配对，之后可识别DNA双链中的同源序列，进而引导Cas9蛋白识别并切割目标DNA双链，形成定向DSB(Jinek et al.,2012)。自2013年，CRISPR/Cas9系统的细胞内源DNA定向修饰活性被证实以来，研究者采用CRISPR/Cas9系统在包括食蟹猴、斑马鱼、小鼠、人源细胞系、拟南芥、水稻等动植物系统中实现了基于RNA导向的基因组定向修饰。由于CRISPR/Cas9系统能够在活细胞中高效地、便捷地“编辑”任何基因，作为科研、医疗等领域的强有力工具，已被广泛地应用于全世界的生物及医学实验室。尽管CRISPR比之前的基因编辑方法要简单得多，也被认为是遗传研究领域的革命性技术，但研究者依然没有放弃CRISPR技术的改进及拓展工作，希望能够实现更简单、更精准的目标基因组定向修饰。

2015年《Cell》的一项报道中(Zetsche B,Gootenberg JS,Abudayyeh OO,Slaymaker IM,Makarova KS,Essletzbichler P,Volz SE,Joung J,van der Oost J,Regev A,Koonin EV,Zhang F.2015.Cpf1is a single RNA-guided endonuclease of aclass 2CRISPR-Cas system.Cell,163(3):759-771.)，研究者发现了一种新的CRISPR系统(CRISPR/Cpf1)，能够在crRNA引导下在人类细胞内剪切目的DNA底物。与CRISPR/Cas9相比，CRISPR/Cpf1有以下四点优势：1)、Cpf1蛋白比标准的SpCas9蛋白要小，且CRISPR/Cpf1剪切DNA仅需要一个crRNA分子，而CRISPR/Cas9需要序列更长的tracrRNA和crRNA两个分子共同识别、剪切底物DNA；2)、CRISPR/Cpf1是粘性末端剪切，而CRISPR/Cas9是平末端剪切(研究表明：粘性末端剪切让DNA插入更可控，也更有利于DNA剪切后的编辑修复)；3)、CRISPR/Cpf1和CRISPR/Cas9识别DNA底物上的PAM(protospacer adjacent motif)位点不同(CRISPR/Cpf1识别5’-TTTN-3’的PAM位点，CRISPR/Cas9识别5’-NGG-3’的PAM位点)，拓宽了CRISPR编辑位点设计的选择性；4)、CRISPR/Cpf1切割位点在PAM位点的3’远端，而CRISPR/Cas9的切割位点在PAM位点的5’近端，使得编辑结果有了更多变化。

已有的证据表明，CRISPR/Cpf1可应用于人类细胞以及小鼠中进行基因组编辑，显示其具有应用前景。但CRISPR/Cpf1是否可以在植物中发挥有效的基因组编辑功能，还需要切实的实验研究。最近，两个课题组发表了植物CRISPR/Cpf1的初步报道(1、Endo A,Masafumi M,Kaya H,Toki S.2016.Efficient targeted mutagenesis of rice andtobacco genomes using Cpf1from Francisella novicida.Scientific Reports,6:38169.doi:10.1038/srep38169；2、Xu R,Qin R,Li H,Li D,Li L,Wei P,YangJ.2016.Generation of targeted mutant rice using a CRISPR-Cpf1system.PlantBiotechnol Journal,doi:10.1111/pbi.12669.)，但结果表明CRISPR/Cpf1在植物细胞中显示了剪切编辑效率较低、遗传稳定性较差的结果。这使得CRISPR/Cpf1是否可以与CRISPR/Cas9类似，作为有效的植物基因组定向编辑工具受到了质疑，极大限制了CRISPR/Cpf1在植物基因组定向修饰中的研究及何应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：基于植物细胞基因组结构及表达特性，构建CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体，实现CRISPR/Cpf1系统在植物基因组定向修饰中的有效应用。

本发明的技术方案是CRISPR/Cpf1植物基因组定向功能单元，其特征在于：包括Cpf1核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元两个结构区域。

具体的，所述的Cpf1核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为：启动子-Cpf1核酸酶编码基因-终止子。

优选的，所述Cpf1核酸酶编码基因的5’端和/或3’端融合核定位信号NLS编码序列。

优选的，所述的NLS为SV40NLS、nucleoplasmin NLS、c-Myc NLS、TUS-protein NLS或EGL-13NLS中的至少一种。

具体的，所述的crRNA转录表达克隆单元从5’到3’方向依次为：启动子-核酶A编码序列-crRNA克隆单元的编码序列(crRNA cloning scaffold编码序列)-核酶B编码区序列-终止子。

优选的，所述的植物基因组定向修饰功能单元从5’到3’方向依次为：

启动子-Cpf1核酸酶编码基因-终止子-启动子-核酶A编码基因-crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码基因-终止子；

或者为：启动子-核酶A编码基因-crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码基因-终止子-启动子-Cpf1核酸酶编码基因-终止子。

具体的，所述的启动子为PolⅡ型启动子。

优选的，所述的PolⅡ型启动子为ZmUb1、OsUb1、CaMV35S、ZmUb1、AtUb10或pZmUbi1中的至少一种。

具体的，所述的终止子为Nos T、35s T或HSP T中的至少一种。

具体的，所述的核酶A为Ⅰ类内含子核酶、RNaseP、发夹状核酶、VS核酶、HH核酶、HDV核酶或tRNA自剪切序列中的至少一种。

优选的，所述的核酶A为HH核酶或HDV核酶。

具体的，所述的核酶B为Ⅰ类内含子核酶、RNaseP、发夹状核酶、VS核酶、HH核酶(锤头状核酶Hammerhead ribozyme)、HDV核酶或tRNA自剪切序列中的至少一种。

优选的，所述的核酶B为HDV核酶或HH核酶。

优选的，所述的功能单元从5’到3’方向依次为：

ZmUbi1-LbCpf1 ORF-Nos T-pZmUbi1-HH Ribozyme-crRNA cloning scaffold-HDV Ribozyme-Nos T；

所述pZmUbi1即玉米pZmUbi1启动子，LbCpf1 ORF即毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)Cpf1核酸酶蛋白(LbCpf1)编码框，Nos T即Nos终止子，HH RiboZyme即HH核酶，crRNA cloning scaffold(简写为crRNA CS，即向导crRNAcrRNA克隆单元的编码序列)，HDVRiboZyme即HDV核酶。

优选的，所述的LbCpf1核酸酶蛋白编码框5’端融合SV40NLS序列，5’端SV40NLS的氨基酸序列如Seq ID No.2所示；LbCpf1核酸酶蛋白编码框3’端融合nucleoplasmin NLS序列，3’端NLS的氨基酸序列如Seq ID No.3所示。

其中，所述的包含核定位信号的LbCpf1核酸酶蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示的。

其中，所述的包含核定位信号的LbCpf1核酸酶蛋白编码框的核苷酸序列如Seq IDNo.6中2049～5831位所示。

具体的，所述向导crRNA克隆单元的编码序列中设计有Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ序列。

优选的，Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ序列的苷酸序列如Seq ID No.6中8231～8867位所示。

具体的，所述的核酶A编码基因-向导crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码基因核心元件(HH Ribozyme-crRNA cloning scaffold-HDV Ribozyme核心元件)具有如Seq IDNo.6中8166～8936位所示的核苷酸序列。

具体的，所述的pZmUbi1-LbCpf1 ORF-Nos T-pZmUbi1-HH Ribozyme-crRNAcloning scaffold-HDV Ribozyme-Nos T功能单元具有如Seq ID No.6所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元的载体。

优选的，所述的载体为植物转基因骨架载体。

优选的，所述的植物转基因骨架载体为pCambia系列、pBI系列、pMDC系列或pGreen系列中的至少一种。

本发明还提供了所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元在进行植物基因组定向修饰中的用途。

本发明还提供了含有所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元的载体在进行植物基因组定向修饰中的用途。

本发明还提供了针对目标位点特异性修饰CRISPR/Cpf1重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

a、明确特定植物基因组目标DNA区域，分析其中的具有LbCpf1核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的18～25bpDNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TTTN-3’，N表示A、G、C、T中的任一种；

b、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-AGAT-N_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-CCGG-N_X-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且18≤X≤25，其中所述正向寡核苷酸链中的N_X和反向寡核苷酸中的N_X具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；

c、将含有所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元的载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，反应体系中同时加入Bsa Ⅰ内切酶及T4 DNA连接酶，设置"酶切-连接"循环反应，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR/Cpf1重组载体。

具体的，步骤a中特异性靶序列长度为18～25bp。

优选的，步骤a中特异性靶序列长度为23bp。

优选的，步骤b中5’-AGAT-N_X-3中X的数目与步骤a中选择的PAM结构相邻的18～25bpDNA序列作为特异性修饰靶序列长度一致。

本发明发明人经过创造性的研究认为现有技术难以在植物中获得剪切编辑效率高、遗传稳定性好的编辑结果的主要原因并不一定是CRISPR/Cpf1本身不适合植物的基因组编辑，而有可能是没有找到适合CRISPR/Cpf1的植物基因组定向修饰功能单元，以确保CRISPR/Cpf1能发挥出好的效果。

本发明开发的CRISPR/Cpf1植物基因组定向功能单元：包括Cpf1核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元两个结构区域。

具体的，所述的Cpf1核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为：启动子-Cpf1核酸酶编码基因-终止子。而crRNA转录表达克隆单元从5’到3’方向依次为：启动子-核酶A编码序列-crRNA克隆单元的编码序列(crRNA cloning scaffold编码序列)-核酶B编码区序列-终止子。

本发明优选的植物基因组定向修饰功能单元可为两种结构，从5’到3’方向依次为：

启动子-Cpf1核酸酶编码基因-终止子-启动子-核酶A编码基因-crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码基因-终止子；或者为：启动子-核酶A编码基因-crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码基因-终止子-启动子-Cpf1核酸酶编码基因-终止子。其中的核心单元中的其启动子、终止子、核酶、Cpf1核酸酶编码基因等原件均能在本发明中说明的范围内根据具体使用的要求进行选择和变化。

比如在实施例中使用了一种具体的CRISPR/Cpf1植物基因组定向功能单元，其具体结构为pZmUbi1-LbCpf1 ORF-Nos T-pZmUbi1-HH Ribozyme-crRNA cloning scaffold-HDV Ribozyme-Nos T，可以在实践中针对具体转化宿主生物及实验需要，替换任何PolⅡ型启动子元件(如：植物中常用的ZmUb1、OsUb1、CaMV35S、ZmUb1、AtUb10等启动子元件)及终止子元件(如：植物中常用的Nos T、35s T、HSP T等终止子元件)，并可以放置于任何植物表达骨架载体中(如：植物中常用的pCambia、pBI、pMDC、pGreen等载体系列)，实现CRISPR/Cpf1剪切复合体组装及定向修饰活性体现。

本发明所述核心单元中使用的HH、HDV核酶元件可以有不同变化形式，如：1)可以保留本发明中的核酶元件，但对其切割识别位点的核苷酸序列进行取代、缺失或者添加一个或几个核苷酸，使其依然可以被本发明中的HH、HDV核酶元件识别切割；2)可以替换本发明中的HH、HDV核酶元件为其他类型的核酶(如：Ⅰ类内含子、RNaseP、发夹状核酶、VS核酶或tRNA自剪切序列等)。这些变化都不影响本发明的核心内容，即：由PolⅡ启动子驱动LbCpf1核酸酶蛋白编码框及向导crRNA转录单元有效转录，分别产生LbCpf1 mRNA分子及“HHRibozyme-crRNA-HDV Ribozyme”转录表达单元RNA转录分子(该转录单元在HH、HDV核酶或其他起类似作用的核酶、各种自剪切序列的作用下发生自剪切，最终得到可识别目标位点的成熟向导crRNA分子)，在细胞体系内LbCpf1 mRNA进行翻译得到LbCpf1核酸酶蛋白，并和成熟的向导crRNA分子结合形成功能性的“Cpf1核酸酶蛋白+向导crRNA分子”复合物进行基因组目标位点定向剪切。

再比如，本发明中为了使Cpf1的蛋白部分进入到细胞核中，使用了核定位信号NLS的编码序列。核定位信号NLS编码序列可置于Cpf1核酸酶编码基因的附近，如设置于3’端或者5’端或者两端各设置一个，如在两端各设置一个，两个NLS编码序列可以相同，也可以不同，只要能达到使Cpf1的蛋白部分进入到细胞核中的效果即可。在本发明提供的实例是在Cpf1核酸酶编码基因的5’端和/或3’端都融合核定位信号NLS编码序列。本领域可供选用的常用NLS为SV40NLS，nucleoplasmin NLS，c-Myc NLS，TUS-protein NLS或EGL-13NLS等。本发明中，在向导crRNA克隆单元的3’端融合了Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元，其作用是作为多克隆位点酶切CRISPR/Cpf1定向修饰骨架载体，以便克隆目标向导crRAN特异性靶序列(protospacer)。本发明骨架载体上具有的BsaI-ccdB-BsaI单元可以被其他包含具体限制内切酶的DNA片段替代，并相应修改向导crRAN特异性靶序列克隆位点，以便有效实现本发明骨架载体的线性化及连接，构建目标基因的CRISPR-Cpf1定向修饰表达载体。

在本发明的一种优选的实施方式中，核心单元pZmUbi1-LbCpf1 ORF-Nos T-pZmUbi1-HH Ribozyme-crRNA cloning scaffold-HDV Ribozyme-Nos T具有如Seq IDNo.6所示的核苷酸序列。

具体的，所述的玉米ZmUbi1启动子(pZmUbi1)的核苷酸序列如Seq ID No.6中1～1963位或6197～8159位所示。

具体的，所述的包含核定位信号的LbCpf1核酸酶蛋白编码框的核苷酸序列如SeqID No.6中2049～5831位所示。

具体的，所述的Nos终止子的核苷酸序列如Seq ID No.6中5859～6106位或9046～9293位所示。

具体的，所述的HH核酶的核苷酸序列如Seq ID No.6中8166～8208位所示。

具体的，所述的向导crRNA克隆单元的核苷酸序列如Seq ID No.6中8209～8868位所示。

具体的，所述的HDV核酶的核苷酸序列如Seq ID No.6中8869～8936位所示。

本发明中，基于CRISPR/Cpf1定向修饰骨架载体，完成构建具体Cpf1+crRNA重组表达载体进行转化后，在活体细胞条件下，PolⅡ启动子驱动LbCpf1核酸酶蛋白编码框及crRNA转录表达单元有效转录，分别产生LbCpf1 mRNA分子及“HH Ribozyme-crRNA-HDVRibozyme”转录单元分子(该转录单元随后在HH、HDV核酶作用下发生自剪切，最终得到可识别目标位点的成熟向导crRNA分子)。在细胞体系内，LbCpf1 mRNA进行翻译得到LbCpf1核酸酶蛋白，并和成熟向导crRNA分子结合形成功能性的“Cpf1核酸酶蛋白+向导crRNA分子”复合体进行基因组目标位点定向剪切。

本发明中，完整的向导crRNA由能够与所述靶标片段互补结合的18～25bp RNA片段替换骨架载体crRNA克隆单元中的Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元而成；RNA克隆单元的序列是不变。

针对具体的目标基因，确定向导crRNA位点后(5’-TTTN-N_X-3’；N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且18≤X≤25(22、23为常用值))，依据发明中提供的Cpf1+crRNA重组表达载体构建方法，将设计的向导crRNA特异性靶序列(protospacer)“Bsa Ⅰ酶切-T4 DNA连接酶连接”循环反应的方式，替换Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元克隆入crRNA克隆单元，得到特定的有功能的Cpf1+crRNA重组表达载体。5’-AGAT-N_X-3’中的X与选择的PAM结构相邻的18～25bpDNA序列作为特异性修饰靶序列可以是一样的长度。

本发明中实例中在向导crRNA克隆单元的3’端融合了637bp的Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元。Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元，用于与识别目标基因的特异性靶序列(protospacer)的克隆。通过Bsa Ⅰ内切酶及T4 DNA连接酶的协同作用，可以快捷、高效的完成目标位点特定Cpf1+crRNA重组表达载体构建。在构建针对目标位点特异性修饰Cpf1+crRNA重组表达载体，特定的互补寡核苷酸双链替换了骨架载体中637bp的Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元，进入CRISPR/Cpf1定向修饰骨架载体。

在构建目标位点特异性序列修饰的Cpf1+crRNA重组表达载体过程中，可通过转化大肠杆菌、细菌筛选压筛选含正确Cpf1+crRNA重组表达载体的重组克隆，并可采用菌落PCR、质粒酶切、序列测定等方式进行鉴定，以明确获得了用于目的生物基因组定向修饰的Cpf1+crRNA重组表达载体。

本发明中，通过原生质、基因枪及农杆菌介导的多种转化方法，将依据本发明构建的Cpf1+crRNA重组表达载体转入植物细胞，使转化细胞同时具有Cpf1核酸酶蛋白及针对特定基因组目标序列的向导crRNA分子；在Cpf1核酸酶蛋白及向导crRNA分子共同作用下，对特定基因组目标序列DNA双链进行定向剪切；进而在细胞内源DNA修复途径作用下，实现目标序列NHEJ(nonhomologous end joining，非同源末端连接)或HR(homologousrecombination，同源重组)定向修饰结果。本发明所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体在植物中应用时，可以使用包括卡那霉素、潮霉素、basta等抗性基因进行植物转化子筛选，由阳性转化子细胞或组织(如原生质体或愈伤组织)分化再生，得到包含目标位点定向修饰的再生植株。

本发明的有益效果：本发明提供了一种高效的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体，可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向修饰。本发明所述骨架载体中，在由PolⅡ启动子驱动LbCpf1核酸酶蛋白编码框及向导crRNA转录表达单元有效转录。为了更好实现CRISPR-Cpf1表达载体构建时Bsa Ⅰ内切酶+T4 DNA连接酶的协同克隆反应，，实现目标位点特定Cpf1+crRNA重组表达载体的快捷、有效构建，在向导crRNA克隆单元3’端融合了Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元。本发明由PolⅡ型启动子驱动“HH Ribozyme-crRNA-HDVRibozyme”核心RNA转录表达单元转录的策略，可以实现向导crRNA成熟分子的精确、高效的生成，有效促进了Cpf1核酸酶蛋白与向导crRNA剪切复合物的形成，提高了CRSIPR/Cpf1系统的定向剪切效率。通过使用相关植物通用PolⅡ型启动子(如植物中常用的ZmUbi1、CaMV35S等启动子)，可以有效避免在不同物种中需要使用物种特异性U6、U3等小RNA转录启动子的问题，极大拓展了基于CRSIPR/Cpf1系统的基因组定向修饰的应用范围。

附图说明

图1本发明中CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体T-DNA区域结构示意图(a)及向导crRNA加工成熟示意图(b)；RB：T-DNA右边界；pZmUbi：玉米Ubi1启动子元件；LbCpf1p：LbCpf1蛋白编码框(融合NLS信号肽)；Nos T：Nos终止子元件；HH：HH核酶；Lb-crRNA：Lb-crRNA克隆单元(3’端融合了637bp的Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元)；HDV：HDV核酶；Hyg+：Hyg选择压表达单元；LB：T-DNA左边界；图b中序列见SEQ ID No.4。

图2基于本发明中的含OsPDS-crRNA01的Cpf1+crRNA重组表达载体对水稻内源基因OsPDS的定点突变检测结果。其中，M为Marker，泳道1和泳道4为野生型的原生质体PCR产物，泳道2和泳道5为野生型的原生质体PCR产物经AflⅡ酶切产物，泳道3和泳道6为含OsPDS-crRNA01的CRISPR/Cpf1表达载体转化的原生质体PCR产物经AflⅡ酶切产物。

图3基于本发明中的含OsDEP1-crRNA01的Cpf1+crRNA重组表达载体对水稻内源基因OsDEP1的定点突变检测结果图。其中，M为Marker，泳道1和泳道4为野生型的原生质体PCR产物，泳道2和泳道5为野生型的原生质体PCR产物经OliⅠ酶切产物，泳道3和泳道6为含OsDEP1-crRNA01的CRISPR/Cpf1表达载体转化的原生质体PCR产物经OliⅠ酶切产物。

图4基于本发明中的含OsDEP1-crRNA02的Cpf1+crRNA重组表达载体对水稻内源基因OsDEP1的定点突变检测结果图。其中，M为Marker，泳道1和泳道4为野生型的原生质体PCR产物，泳道2和泳道5为野生型的原生质体PCR产物经BglⅡ酶切产物，泳道3和泳道6为含OsDEP1-crRNA02的CRISPR/Cpf1表达载体转化的原生质体PCR产物经BglⅡ酶切产物。

图5基于本发明中的含OsROC5-crRNA01的Cpf1+crRNA重组表达载体对水稻内源基因OsROC5的定点突变检测结果图。其中，M为Marker，泳道1和泳道4为野生型的原生质体PCR产物，泳道2和泳道5为野生型的原生质体PCR产物经XmiⅠ酶切产物，泳道3和泳道6为含OsROC5-crRNA01的CRISPR/Cpf1表达载体转化的原生质体PCR产物经XmiⅠ酶切产物。

图6基于本发明中的含OsROC5-crRNA02的Cpf1+crRNA重组表达载体对水稻内源基因OsROC5的定点突变检测结果图。其中，M为Marker，泳道1和泳道4为野生型的原生质体PCR产物，泳道2和泳道5为野生型的原生质体PCR产物经Hin1Ⅱ酶切产物，泳道3和泳道6为含OsROC5-crRNA02的CRISPR/Cpf1表达载体转化的原生质体PCR产物经Hin1Ⅱ酶切产物。

图7基于本发明中的含OsPDS-crRNA01的Cpf1+crRNA重组表达载体的水稻转基因T0代幼苗基因修饰检测结果图。图7a为水稻转基因T0代幼苗PCR产物经AflⅡ酶切产物，1-10代表不同的10个检测单株，“+”表示进行AflⅡ酶切，“—”表示未进行AflⅡ酶切；图7b为含OsPDS-crRNA01的CRISPR/Cpf1表达载体介导的水稻PDS基因突变表型，其中，左侧为野生型对照(WT)，右侧为PDS基因纯合突变体表型，表现为全株白化(Mutant)。

具体实施方式

实施例1 CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体的构建

本发明涉及一种用于植物基因组工程的CRISPR/Cpf1基因组定向修饰骨架载体，其核心包括Cpf1核酸酶蛋白表达单元和向导crRNA转录表达克隆单元。Cpf1核酸酶蛋白表达单元由PolⅡ型启动子、Cpf1蛋白编码框(含核定位信号NLS)、转录终止子组成。crRNA转录表达克隆单元由PolⅡ型启动子、HH核酶、crRNA克隆单元(3’端融合了Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元)、HDV核酶、Nos转录终止子元件依次组成。

毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium ND2006)的Cpf1核酸酶蛋白编码基因(LbCpf1，其核苷酸序列如Seq ID No.5)序列在5’端和3’端分别融合核定位信号(NLS)，依据植物细胞基因表达特点进行编码区密码子优化，合成LbCpf1核酸酶蛋白编码基因完整ORF序列(包含5’SV40NLS和3’端NLS)，蛋白质序列DNA序列如Seq ID No.1所示。通过GibsonAssembly的方法将来自玉米的组成型启动子ZmUbi1元件(Seq ID No.6中1～1963位)，含NLS信号肽的LbCpf1蛋白ORF编码框(Seq ID No.6中2049～5831位)和Nos终止子元件(SeqID No.6中5859～6106位)串联克隆至植物表达载体pCAMBIA1300上(Hajdukiewicz P,SvabZ,Maliga P.1994.The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant transformation.Plant Mol Biol.,25(6):989-894.)。

为了实现向导crRNA的准确高效转录表达，本发明所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体在向导crRNA克隆单元的5’端和3’端分别融合HH核酶和HDV核酶，PolⅡ启动子驱动转录单元有效转录，首先产生“HH Ribozyme-crRNA-HDV Ribozyme”初级mRNA转录单元分子，进而在HH、HDV核酶作用下发生自剪切，最终得到可识别目标位点的成熟向导crRNA分子。同时，为了实现特定基因组目标Cpf1+crRNA重组表达载体的快捷、高效构建，本发明所述的CRISPR/Cpf1核酸酶骨架载体在crRNA克隆单元的3’端融入637bp的Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元，基于此设计策略，在后续目标的Cpf1+crRNA重组表达载体构建中，仅需在构建体系中混合本发明所述的CRISPR/Cpf1基因组定向修饰骨架载体、特异性靶序列互补寡核苷酸双链退火片段、Bsa Ⅰ内切酶及T4 DNA连接酶，并设置“37℃酶切-16℃连接”循环反应，即可实现特定Cpf1+crRNA重组表达载体的构建。人工合成包括“HH Ribozyme-crRNAcloning scaffold(含5’端融入637bp的Bsa Ⅰ-ccdB-Bsa Ⅰ单元)-HDV Ribozyme”的向导crRNA转录表达克隆核心元件DNA片段。通过Gibson Assembly的方法将来自玉米的组成型启动子元件ZmUbi1，向导crRNA转录表达克隆核心元件DNA片段和Nos转录终止子元件串联一起克隆到上一步克隆获得的含Cpf1核酸酶蛋白表达单元的pCAMBIA1300中间载体的Cpf1核酸酶蛋白表达单元下游。针对筛选的阳性克隆进行菌落PCR、质粒限制酶切、DNA测序确认，完成CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体的构建工作。

实施例2基于CRISPR/Cpf1系统的水稻内源基因OsPDS定向修饰

1.水稻OsPDS基因向导crRNA设计及Cpf1+crRNA重组表达载体构建

依据水稻OsPDS序列(NCBI号NM001055721)为参考序列，依据第73bp-99bp(Seq IDNo.7：TTTGGAGTGAAATCTCTTGTCTTAAGG，下划线为PAM位点)区域，设计OsPDS-crRNA01(表1)。

表1水稻OsPDS基因向导crRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsPDS-crRNA01位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表所设计的位点特异性向导crRNA位点；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端)：

OsPDS-crRNA01-F：agatGAGTGAAATCTCTTGTCTTAAGG(Seq ID No.11)；

OsPDS-crRNA01-R：ggccCCTTAAGACAAGAGATTTCACTC(Seq ID No.12)。

分别将OsPDS-crRNA01-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uL PCR管中加入CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端插入片段、Bsa Ⅰ内切酶、T4 DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体。

2.含Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体的水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，进行Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,ZhangD,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,Zhang Y.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9Systemfor Efficient Genome Editing in Plants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。

3.水稻OsPDS基因定向修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsPDS-crRNA01对应AflⅡ进行酶切检测)，具体方法参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,Zhang Y.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9System forEfficient Genome Editing in Plants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。

由图2可知：OsPDS-crRNA01位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变(图2)，根突变效率为51.6％和61.0％；针对图2中3号泳道(由于突变类型不同，一个泳道内的条带回收TA克隆后可得到不同的测序结果，即多个独立定向修饰。)限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，结果表明在OsPDS-crRNA01位点发生了定向修饰(表2所给出的测序结果为5个独立定向修饰的测序结果，并未给出全部定向修饰结果)。

表2 OsPDS-crRNA01位点定向修饰结果

实施例3基于CRISPR/Cpf1系统的水稻内源基因OsDEP1定向修饰

1.水稻OsDEP1基因向导crRNA设计及Cpf1+crRNA重组表达载体构建

依据水稻OSDEP1序列(NCBI号FJ039904)为参考序列，依据第3241BP-3267BP(SeqID No.14：TTTGCTACTGTTGCAAGTGCTCACCCA，下划线为PAM位点)区域及第2745BP-2771BP(Seq ID No.15：TTTCCAGAAAGAGAAGGAGGCACAGAT，下划线为PAM位点)区域，分别设计OSDEP1-crRNA01、OSDEP1-crRNA02(表3)。

表3水稻OsDEP1基因向导crRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsDEP1-crRNA01、OsDEP1-crRNA02位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表所设计的位点特异性向导crRNA位点；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端)：

OsDEP1-crRNA01-F：agatCTACTGTTGCAAGTGCTCACCCA(Seq ID No.22)

OsDEP1-crRNA01-R：ggccTGGGTGAGCACTTGCAACAGTAG(Seq ID No.23)

OsDEP1-crRNA02-F：agatCAGAAAGAGAAGGAGGCACAGAT(Seq ID No.24)

OsDEP1-crRNA02-R：ggccATCTGTGCCTCCTTCTCTTTCTG(Seq ID No.25)

分别将OsDEP1-crRNA01-F/R及OsDEP1-crRNA02-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uLPCR管中加入CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端插入片段、Bsa Ⅰ内切酶、T4 DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到Cpf1+OsDEP1-crRNA01、Cpf1+OsDEP1-crRNA02重组表达载体。

2.Cpf1+OsDEP1-crRNA01、Cpf1+OsDEP1-crRNA02重组表达载体的水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，分别进行Cpf1+OsDEP1-crRNA01、Cpf1+OsDEP1-crRNA02重组表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,Zhang Y.2006.A SingleTranscript CRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing in Plants.MolPlant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。

3.水稻OsDEP1基因定向修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsDEP1-crRNA01、OsDEP1-crRNA02分别对应OliⅠ、BglⅡ进行酶切检测)，具体方法参考文献(Tang X,ZhengX,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,Zhang Y.2006.A Single TranscriptCRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing in Plants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。

由图3可知：OsDEP1-crRNA01位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变(图3)，突变效率为12.9％和41.0％；针对图3中3号泳道限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，结果表明在OsDEP1-crRNA01位点发生了定向修饰(表4)。

表4 OsDEP1-crRNA01位点定向修饰结果

	修饰位点	长度
			WT	CATGTCTTTGCTACTGTTGCAAGTGCTCACCCAAGTGCAAAAG(Seq ID No.26)	43bp
M1	与野生型相比，24～32位缺失	34bp
			M2	与野生型相比，23～34位缺失	31bp
M3	与野生型相比，25～32位缺失	35bp
			M4	与野生型相比，30～34位缺失	38bp
M5	与野生型相比，24～30位缺失	36bp

由图4可知：OsDEP1-crRNA02位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变(图4)，突变效率为41.6％和35.9％；针对图4中3号泳道(一个泳道的结果进行克隆可以得到5个测序结果，同上)限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，结果表明在OsDEP1-crRNA02位点发生了定向修饰(表5)。

表5OsDEP1-crRNA02位点定向修饰结果

	修饰位点	长度
			WT	TTTCCTTTTCCAGAAAGAGAAGGAGGCACAGATCTTGCCGTCT(Seq ID No.27)	43bp
M1	与野生型相比，26～33位缺失	35bp
			M2	与野生型相比，25～32位缺失	35bp
M3	与野生型相比，26～35位缺失	33bp
			M4	与野生型相比，28～34位缺失	36bp
M5	与野生型相比，23～32位缺失	33bp

实施例4基于CRISPR/Cpf1系统的水稻内源基因OsROC5定向修饰

1.水稻OsROC5基因向导crRNA设计及Cpf1+crRNA重组表达载体构建

依据水稻OsROC5序列(NCBI号XM_015770130)为参考序列，依据第1689bp-1715bp(Seq ID No.28：GTCTACCGGCATTGCAGGAAGCAGAAA，下划线为PAM位点)区域及第1796bp-1822bp(Seq ID No.29：TTTGTAAGCAGCTGGCTGAGGGTGCAT，下划线为PAM位点)区域，分别设计OsROC5-crRNA01、OsROC5-crRNA02(表6)。

表6水稻OsDEP1基因向导crRNA设计、合成及检测信息

依据设计的OsROC5-crRNA01、OsROC5-crRNA02位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表所设计的位点特异性向导crRNA位点；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端)：

OsROC5-crRNA01-F：agatTGCTTCCTGCAATGCCGGTAGAC(Seq ID No.36)

OsROC5-crRNA01-R：ggccGTCTACCGGCATTGCAGGAAGCA(Seq ID No.37)

OsROC5-crRNA02-F：agatTAAGCAGCTGGCTGAGGGTGCAT(Seq ID No.38)

OsROC5-crRNA02-R：ggccATGCACCCTCAGCCAGCTGCTTA(Seq ID No.39)

分别将OsROC5-crRNA01-F/R及OsROC5-crRNA02-F/R等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。于200uLPCR管中加入CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端插入片段、Bsa Ⅰ内切酶、T4 DNA连接酶，设置“37℃酶切-16℃连接”10个循环反应，80℃处理失活内切及连接酶后，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到Cpf1+OsROC5-crRNA01、Cpf1+OsROC5-crRNA02重组表达载体。

2.Cpf1+OsROC5-crRNA01、Cpf1+OsROC5-crRNA02重组表达载体的水稻原生质体转化

分离水稻日本晴原生质体，基于PEG方法，分别进行Cpf1+OsROC5-crRNA01、Cpf1+OsROC5-crRNA02重组表达载体的水稻原生质体转化。水稻原生质体转化具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,Zhang Y.2006.A SingleTranscript CRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing in Plants.MolPlant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。

3.水稻OsROC5基因定向修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，CTAB方法提取水稻原生质体基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析(OsROC5-crRNA01、OsROC5-crRNA02分别对应XmiⅠ、Hin1Ⅱ进行酶切检测)，具体方法参考文献(Tang X,ZhengX,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,Zhang Y.2006.A Single TranscriptCRISPR-Cas9System for Efficient Genome Editing in Plants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。

由图5可知：OsROC5-crRNA01位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变(图5)，突变效率为13.1％和9.9％；针对图5中3号泳道限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，结果表明在OsROC5-crRNA01位点发生了定向修饰(表7)。

表7 OsROC5-crRNA01位点定向修饰结果

由图6可知：OsROC5-crRNA02位点处，水稻内源序列发生了定向剪切突变(图6)，突变效率为37.8％和32.7％；针对图6中3号泳道限制酶抗性条带进行回收，并进行TA克隆及测序，结果表明在OsROC5-crRNA02位点发生了定向修饰(表8)。

表8 OsROC5-crRNA02位点定向修饰结果

	修饰位点	长度
			WT	TCCGGTTTTGTAAGCAGCTGGCTGAGGGTGCATGGGCAGTAGT(Seq ID No.41)	43bp
M1	与WT相比，26～31位缺失	37bp
			M2	与WT相比，25～34位缺失	33bp
M3	与WT相比，26～32位缺失	36bp
			M4	与WT相比，24～32位缺失	34bp
M5	与WT相比，26～34位缺失	34bp

实施例5基于CRISPR/Cpf1系统的水稻OsPDS定向修饰再生植株创制及效率分析

1.含OsPDS-crRNA01的Cpf1+crRNA重组表达载体的农杆菌转化

将实施例2中成功构建，且于水稻原生质体中检测过定向修饰活性的Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体通过热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，涂布在含50毫克/升卡那霉素和50毫克/升利福平的LB固体培养基上，28℃黑暗培养2天后，得到阳性克隆。阳性克隆在含50毫克/升卡那霉素和50毫克/升利福平的LB液体培养基中活化，用于后续转化。

2.农杆菌介导的Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体的水稻愈伤转化

将Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体通过农杆菌介导的转化方法，进行水稻愈伤组织转化。转化的具体过程参考文献(Tang X,Zheng X,Qi Y,Zhang D,Cheng Y,Tang A,Voytas DF,Zhang Y.2006.A Single Transcript CRISPR-Cas9System for EfficientGenome Editing in Plants.Mol Plant,9(7):1088-1091.)中公开的实验方法。

3.水稻Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体稳定转化再生植株定向修饰检测及效率分析

待转化后抗性愈伤诱导成水稻幼苗，提取转基因水稻幼苗基因组DNA，以该DNA为模板进行PCR扩增及限制性内切酶验证分析。在检测的10株Cpf1+OsPDS-crRNA01重组表达载体转基因水稻苗中，有10株苗含有OsPDS基因突变，且10株突变体材料均为双等位基因突变，突变效率为100％(图7a)，进一步测序进一步验证了OsPDS-crRNA01位点的定向修饰结果(表9)，OsPDS双等位基因突变体材料为白化苗表型(图7b)。

表9水稻OsPDS定向修饰再生植株结果

SEQUENCE LISTING

<110> 电子科技大学

<120> CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应

用

<130> A170099KN

<150> CN201710019842.5

<151> 2017-01-11

<160> 41

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1260

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 包含N' 端和C'端NLS信号肽的LbCpf1 protein

<400> 1

Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala

1 5 10 15

Ala Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

20 25 30

Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp

35 40 45

Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys

50 55 60

Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp

65 70 75 80

Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu

85 90 95

Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

100 105 110

Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn

115 120 125

Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu

130 135 140

Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe

145 150 155 160

Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn

165 170 175

Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile

180 185 190

Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys

195 200 205

Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys

210 215 220

Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe

225 230 235 240

Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile

245 250 255

Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn

260 265 270

Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys

275 280 285

Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser

290 295 300

Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe

305 310 315 320

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys

325 330 335

Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile

340 345 350

Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe

355 360 365

Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp

370 375 380

Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp

385 390 395 400

Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu

405 410 415

Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu

420 425 430

Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser

435 440 445

Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys

450 455 460

Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys

465 470 475 480

Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr

485 490 495

Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile

500 505 510

Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr

515 520 525

Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro

530 535 540

Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala

545 550 555 560

Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys

565 570 575

Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly

580 585 590

Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met

595 600 605

Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro

610 615 620

Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly

625 630 635 640

Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys

645 650 655

Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn

660 665 670

Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu

675 680 685

Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys

690 695 700

Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile

705 710 715 720

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His

725 730 735

Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile

740 745 750

Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys

755 760 765

Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys

770 775 780

Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr

785 790 795 800

Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile

805 810 815

Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val

820 825 830

Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

835 840 845

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly

850 855 860

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn

865 870 875 880

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

885 890 895

Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile

900 905 910

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

915 920 925

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

930 935 940

Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

945 950 955 960

Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

965 970 975

Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile

980 985 990

Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe

995 1000 1005

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser

1010 1015 1020

Thr Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala

1025 1030 1035

Asp Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val

1040 1045 1050

Pro Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe

1055 1060 1065

Ser Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser

1070 1075 1080

Tyr Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn

1085 1090 1095

Val Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu

1100 1105 1110

Leu Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg

1115 1120 1125

Ala Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe

1130 1135 1140

Met Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr

1145 1150 1155

Gly Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser

1160 1165 1170

Asp Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn

1175 1180 1185

Ala Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile

1190 1195 1200

Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys Ala Glu

1205 1210 1215

Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu

1220 1225 1230

Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His Lys Arg Pro Ala

1235 1240 1245

Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1250 1255 1260

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> SV40 NLS

<400> 2

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> nucleoplasmin NLS

<400> 3

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 155

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> 向导crRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(87)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 4

aaauuacuga ugaguccgug aggacgaaac gaguaagcuc gucuaauuuc uacuaagugu 60

agaunnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggc cggcaugguc ccagccuccu cgcuggcgcc 120

ggcugggcaa caugcuucgg cauggcgaau gggac 155

<210> 5

<211> 3684

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> LbCpf1编码序列

<400> 5

atgtcaaagc tcgagaaatt caccaactgt tattcgttga gcaaaacact gcggtttaaa 60

gcgattccag tcggcaagac tcaagagaat atagacaata agcggctgtt ggtggaagat 120

gaaaagcgcg cggaagacta caaaggggtg aagaagttgt tggacagata ctacctctct 180

tttatcaatg atgtcttgca ctcaatcaaa ttgaagaatc tgaacaacta catctccctc 240

ttcagaaaga aaacaaggac agaaaaggag aataaggaac ttgaaaattt ggagatcaat 300

ctgaggaaag agatcgcgaa agcctttaaa ggcaacgaag gatacaaaag tctgttcaag 360

aaggatataa ttgagacaat tttgccagag ttcctcgatg acaaggacga gattgcgctg 420

gtcaattcgt tcaacggatt cacaacagca ttcacaggct tctttgataa tcgggaaaat 480

atgttctctg aggaggcaaa gtccacttct attgcgttca ggtgtatcaa tgagaatctc 540

actaggtaca tttccaacat ggatatcttt gagaaggttg acgcaatttt tgacaagcac 600

gaagttcagg agattaagga gaagatcctc aattccgatt atgacgttga ggacttcttc 660

gaaggtgagt tttttaattt cgtgctcact caagagggta tcgacgtgta taatgcgatc 720

atcggtgggt tcgtgactga gtccggtgaa aagattaagg gattgaacga gtatatcaac 780

ctttacaacc aaaagacgaa acagaagctg ccaaagttca agcctcttta caaacaggtt 840

ctttcagacc gcgagtcact ctcgttctat ggggagggct acacttcgga tgaggaagtc 900

ctggaggtgt tcaggaatac tctcaataag aattcggaga ttttctcttc tataaaaaaa 960

ctggaaaagt tgtttaagaa ttttgacgaa tactctagcg ccggcatatt tgtgaaaaac 1020

ggcccggcca tatcaacgat aagtaaagat atcttcggcg aatggaacgt gatcagagac 1080

aaatggaacg cggagtatga cgatattcac ctgaagaaga aggctgtcgt aacggagaag 1140

tacgaggatg atcgcaggaa aagcttcaaa aagatcggaa gtttcagcct ggaacagttg 1200

caggagtatg ctgacgccga tcttagcgtc gtcgagaagt tgaaggagat aatcatccaa 1260

aaggtcgacg agatatataa agtctatgga tcaagtgaaa aactgttcga cgccgacttc 1320

gttttggaga agtccctgaa gaagaacgac gctgttgttg ccattatgaa ggatctgctc 1380

gacagcgtga agagtttcga gaactatatt aaggcttttt tcggggaggg gaaggagact 1440

aacagagatg agtccttcta cggagacttc gtcctcgcgt acgatatact ccttaaggta 1500

gaccacatct acgacgcaat cagaaattac gtgacacaaa agccgtacag caaggacaag 1560

ttcaaactct acttccagaa cccccagttc atgggcggct gggacaagga caaggaaacg 1620

gattacaggg ctacgatcct gaggtatggt tcaaaatact acttggcgat tatggacaag 1680

aagtacgcca agtgtctcca gaagattgac aaagacgatg tcaatggcaa ttatgagaag 1740

atcaactaca agctgcttcc gggtccgaac aagatgctcc caaaggtttt cttcagcaag 1800

aaatggatgg cctactataa cccaagcgag gacatccaga agatttataa gaacggtacg 1860

ttcaagaagg gcgacatgtt caatcttaac gactgtcaca agctgatcga cttcttcaaa 1920

gactcaatta gccggtaccc aaagtggtct aacgcctatg acttcaactt ttcggaaacc 1980

gagaagtaca aggatatagc cggattttat agagaggtgg aagagcaggg ctacaaggtg 2040

tcattcgagt ccgccagcaa gaaggaagtg gacaagctcg tggaagaggg taagctctac 2100

atgttccaga tttataataa agactttagc gataagagcc acgggacacc taatctccac 2160

acaatgtatt tcaagctgct cttcgacgag aataaccacg gccaaatcag gttgtcagga 2220

ggggctgaac tcttcatgcg gcgcgctagc cttaagaagg aggagcttgt agtccaccct 2280

gcgaatagtc caattgcgaa taagaacccg gacaatccta aaaagactac aacattgagc 2340

tacgacgtgt acaaggataa gaggttttcc gaggatcagt acgagctcca catcccgatt 2400

gcgatcaaca agtgcccaaa gaatattttc aagataaaca cagaggtgcg tgtactcctg 2460

aagcatgacg acaatcctta cgtcattggg attgatcggg gcgagaggaa cctcctctat 2520

attgtggtgg tggacgggaa ggggaacata gtcgaacagt actcccttaa cgaaataatt 2580

aacaatttca acggcatccg tatcaagacc gactaccatt cgttgctgga caagaaggag 2640

aaggagagat ttgaggcgcg gcaaaattgg acaagtatcg agaacatcaa ggaactcaaa 2700

gcaggttata tctctcaagt tgtgcataag atatgcgagc tggttgagaa gtatgacgca 2760

gtgatcgctc ttgaggacct caactcgggc tttaagaatt ctagagttaa agtggagaag 2820

caggtctatc aaaagttcga gaagatgctt atagataagc tcaactacat ggtcgataag 2880

aaatcgaacc catgtgccac cggcggcgca ctcaaaggtt accaaataac aaacaaattc 2940

gagtccttca aatcgatgag tactcagaat gggttcatat tttatatacc ggcgtggctt 3000

acgtctaaga tcgacccgtc aactggtttt gtcaacctgt tgaagacgaa atacacgtcc 3060

attgccgatt cgaaaaagtt catatctagt tttgatcgta ttatgtacgt cccagaggaa 3120

gatcttttcg agtttgctct cgactacaaa aacttttcgc ggaccgatgc ggattacatt 3180

aaaaaatgga aactctattc gtacggcaac agaatcagga tttttcgcaa ccctaagaag 3240

aataacgtct ttgattggga ggaagtttgc ttgactagcg cgtacaagga gctctttaat 3300

aagtatggca ttaactacca acagggtgat atcagagcac tgctttgcga acaatctgac 3360

aaggctttct actcatcctt catggctttg atgagcctga tgctccagat gagaaattca 3420

attacaggca gaaccgacgt ggatttcttg atctccccgg ttaaaaattc tgatggcatc 3480

ttttacgata gcaggaacta tgaagcgcaa gagaatgcga ttctgccaaa aaatgcagac 3540

gccaacggtg cctataacat cgccaggaaa gtcctgtggg cgatcggcca gttcaaaaag 3600

gccgaagacg aaaaattgga caaggtcaaa atcgctatca gcaacaaaga gtggctggag 3660

tatgctcaga catccgtaaa gcat 3684

<210> 6

<211> 9293

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> pZmUbi1-LbCpf1 ORF-Nos T-pZmUbi1-HH Ribozyme-crRNA cloning

scaffold-HDV Ribozyme-Nos T的DNA序列

<400> 6

agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac 60

acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat 120

aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt 180

tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt 240

ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc 300

cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt 360

tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta 420

gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa 480

caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata 540

atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc 600

gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct 660

ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg 720

cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc 780

agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata 840

aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca 900

cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg 960

tcctcccccc cccccccctc tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg 1020

cccggtagtt ctacttctgt tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc 1080

tgctagcgtt cgtacacgga tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc 1140

cagtgtttct ctttggggaa tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt 1200

tcatgatttt ttttgtttcg ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata 1260

tatgccgtgc acttgtttgt cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat 1320

gatgtggtct ggttgggcgg tcgttctaga tcggagtaga attaattctg tttcaaacta 1380

cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga 1440

attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt 1500

actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg 1560

gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt 1620

attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga 1680

tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca 1740

tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata 1800

aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca 1860

gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt 1920

cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg caggtcgact ctagaggatc 1980

ccctcgaggc gcgccaagct atcaaacaag tttgtacaaa aaagcaggct ccgaattcgc 2040

ccttcaccat ggctcctaag aagaagcgga aggttggtat tcacggggtg cctgcggctt 2100

caaagctcga gaaattcacc aactgttatt cgttgagcaa aacactgcgg tttaaagcga 2160

ttccagtcgg caagactcaa gagaatatag acaataagcg gctgttggtg gaagatgaaa 2220

agcgcgcgga agactacaaa ggggtgaaga agttgttgga cagatactac ctctctttta 2280

tcaatgatgt cttgcactca atcaaattga agaatctgaa caactacatc tccctcttca 2340

gaaagaaaac aaggacagaa aaggagaata aggaacttga aaatttggag atcaatctga 2400

ggaaagagat cgcgaaagcc tttaaaggca acgaaggata caaaagtctg ttcaagaagg 2460

atataattga gacaattttg ccagagttcc tcgatgacaa ggacgagatt gcgctggtca 2520

attcgttcaa cggattcaca acagcattca caggcttctt tgataatcgg gaaaatatgt 2580

tctctgagga ggcaaagtcc acttctattg cgttcaggtg tatcaatgag aatctcacta 2640

ggtacatttc caacatggat atctttgaga aggttgacgc aatttttgac aagcacgaag 2700

ttcaggagat taaggagaag atcctcaatt ccgattatga cgttgaggac ttcttcgaag 2760

gtgagttttt taatttcgtg ctcactcaag agggtatcga cgtgtataat gcgatcatcg 2820

gtgggttcgt gactgagtcc ggtgaaaaga ttaagggatt gaacgagtat atcaaccttt 2880

acaaccaaaa gacgaaacag aagctgccaa agttcaagcc tctttacaaa caggttcttt 2940

cagaccgcga gtcactctcg ttctatgggg agggctacac ttcggatgag gaagtcctgg 3000

aggtgttcag gaatactctc aataagaatt cggagatttt ctcttctata aaaaaactgg 3060

aaaagttgtt taagaatttt gacgaatact ctagcgccgg catatttgtg aaaaacggcc 3120

cggccatatc aacgataagt aaagatatct tcggcgaatg gaacgtgatc agagacaaat 3180

ggaacgcgga gtatgacgat attcacctga agaagaaggc tgtcgtaacg gagaagtacg 3240

aggatgatcg caggaaaagc ttcaaaaaga tcggaagttt cagcctggaa cagttgcagg 3300

agtatgctga cgccgatctt agcgtcgtcg agaagttgaa ggagataatc atccaaaagg 3360

tcgacgagat atataaagtc tatggatcaa gtgaaaaact gttcgacgcc gacttcgttt 3420

tggagaagtc cctgaagaag aacgacgctg ttgttgccat tatgaaggat ctgctcgaca 3480

gcgtgaagag tttcgagaac tatattaagg cttttttcgg ggaggggaag gagactaaca 3540

gagatgagtc cttctacgga gacttcgtcc tcgcgtacga tatactcctt aaggtagacc 3600

acatctacga cgcaatcaga aattacgtga cacaaaagcc gtacagcaag gacaagttca 3660

aactctactt ccagaacccc cagttcatgg gcggctggga caaggacaag gaaacggatt 3720

acagggctac gatcctgagg tatggttcaa aatactactt ggcgattatg gacaagaagt 3780

acgccaagtg tctccagaag attgacaaag acgatgtcaa tggcaattat gagaagatca 3840

actacaagct gcttccgggt ccgaacaaga tgctcccaaa ggttttcttc agcaagaaat 3900

ggatggccta ctataaccca agcgaggaca tccagaagat ttataagaac ggtacgttca 3960

agaagggcga catgttcaat cttaacgact gtcacaagct gatcgacttc ttcaaagact 4020

caattagccg gtacccaaag tggtctaacg cctatgactt caacttttcg gaaaccgaga 4080

agtacaagga tatagccgga ttttatagag aggtggaaga gcagggctac aaggtgtcat 4140

tcgagtccgc cagcaagaag gaagtggaca agctcgtgga agagggtaag ctctacatgt 4200

tccagattta taataaagac tttagcgata agagccacgg gacacctaat ctccacacaa 4260

tgtatttcaa gctgctcttc gacgagaata accacggcca aatcaggttg tcaggagggg 4320

ctgaactctt catgcggcgc gctagcctta agaaggagga gcttgtagtc caccctgcga 4380

atagtccaat tgcgaataag aacccggaca atcctaaaaa gactacaaca ttgagctacg 4440

acgtgtacaa ggataagagg ttttccgagg atcagtacga gctccacatc ccgattgcga 4500

tcaacaagtg cccaaagaat attttcaaga taaacacaga ggtgcgtgta ctcctgaagc 4560

atgacgacaa tccttacgtc attgggattg atcggggcga gaggaacctc ctctatattg 4620

tggtggtgga cgggaagggg aacatagtcg aacagtactc ccttaacgaa ataattaaca 4680

atttcaacgg catccgtatc aagaccgact accattcgtt gctggacaag aaggagaagg 4740

agagatttga ggcgcggcaa aattggacaa gtatcgagaa catcaaggaa ctcaaagcag 4800

gttatatctc tcaagttgtg cataagatat gcgagctggt tgagaagtat gacgcagtga 4860

tcgctcttga ggacctcaac tcgggcttta agaattctag agttaaagtg gagaagcagg 4920

tctatcaaaa gttcgagaag atgcttatag ataagctcaa ctacatggtc gataagaaat 4980

cgaacccatg tgccaccggc ggcgcactca aaggttacca aataacaaac aaattcgagt 5040

ccttcaaatc gatgagtact cagaatgggt tcatatttta tataccggcg tggcttacgt 5100

ctaagatcga cccgtcaact ggttttgtca acctgttgaa gacgaaatac acgtccattg 5160

ccgattcgaa aaagttcata tctagttttg atcgtattat gtacgtccca gaggaagatc 5220

ttttcgagtt tgctctcgac tacaaaaact tttcgcggac cgatgcggat tacattaaaa 5280

aatggaaact ctattcgtac ggcaacagaa tcaggatttt tcgcaaccct aagaagaata 5340

acgtctttga ttgggaggaa gtttgcttga ctagcgcgta caaggagctc tttaataagt 5400

atggcattaa ctaccaacag ggtgatatca gagcactgct ttgcgaacaa tctgacaagg 5460

ctttctactc atccttcatg gctttgatga gcctgatgct ccagatgaga aattcaatta 5520

caggcagaac cgacgtggat ttcttgatct ccccggttaa aaattctgat ggcatctttt 5580

acgatagcag gaactatgaa gcgcaagaga atgcgattct gccaaaaaat gcagacgcca 5640

acggtgccta taacatcgcc aggaaagtcc tgtgggcgat cggccagttc aaaaaggccg 5700

aagacgaaaa attggacaag gtcaaaatcg ctatcagcaa caaagagtgg ctggagtatg 5760

ctcagacatc cgtaaagcat aagcgtcctg ctgccaccaa aaaggccgga caggctaaga 5820

aaaagaagtg agacgactag tggcggccgc cgacgtccga tcgttcaaac atttggcaat 5880

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 5940

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 6000

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 6060

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggaattga 6120

tcccccctcg acagcttccg gaaagggcga attcgcaact ttgtatacaa aagttgcccc 6180

atggcgttcc ctctagagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac 6240

atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa 6300

actttactct acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat 6360

catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact 6420

ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc 6480

tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt 6540

tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 6600

ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 6660

gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc 6720

ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa 6780

ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg 6840

ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca 6900

tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc 6960

ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 7020

ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt 7080

tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 7140

caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 7200

cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt 7260

tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt 7320

ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc 7380

gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt 7440

ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt 7500

ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaatta 7560

attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga tctgtatgtg tgtgccatac 7620

atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 7680

tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt tttgttcgct tggttgtgat 7740

gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc ggagtagaat actgtttcaa 7800

actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg tgtcatacat cttcatagtt 7860

acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgtgggttt 7920

tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc atatgctcta accttgagta 7980

cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt tgatcttgat atacttggat 8040

gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc tgccttcata cgctatttat 8100

ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg tttggtgtta cttctgcagg 8160

gatccaaatt actgatgagt ccgtgaggac gaaacgagta agctcgtcta atttctacta 8220

agtgtagatg gagaccttat attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat 8280

tttcgcggtg gctgagatca gccacttctt ccccgataac ggaaaccggc acactggcca 8340

tatcggtggt catcatgcgc cagctttcat ccccgatatg caccaccggg taaagttcac 8400

gggagacttt atctgacagc agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc cgtcgcccgg 8460

gcgtgtcaat aatatcactc tgtacatcca caaacagacg ataacggctc tctcttttat 8520

aggtgtaaac cttaaactgc atttcaccag cccctgttct cgtcagcaaa agagccgttc 8580

atttcaataa accgggcgac ctcagccatc ccttcctgat tttccgcttt ccagcgttcg 8640

gcacgcagac gacgggcttc attctgcatg gttgtgctta ccagaccgga gatattgaca 8700

tcatatatgc cttgagcaac tgatagctgt cgctgtcaac tgtcactgta atacgctgct 8760

tcatagcata cctctttttg acatacttcg ggtatacata tcagtatata ttcttatacc 8820

gcaaaaatca gcgcgcaaat acgcatactg ttatctggct tggtctcagg ccggcatggt 8880

cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca acatgcttcg gcatggcgaa tgggacggta 8940

cccggccgga attcgaccca gctttcttgt acaaagtggt tcgataattc cttaattaac 9000

tagttctaga gcggccgccc accgcggtgg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt 9060

tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 9120

tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 9180

agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 9240

atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt act 9293

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsPDS基因特异性修饰靶序列

<400> 7

tttggagtga aatctcttgt cttaagg 27

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物Cpf1-OsPDS-F1

<400> 8

ctggctgcct gtcatctatg aa 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物Cpf1-OsPDS-R1

<400> 9

ccaaaacatc ccttgcctca 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsPDS-crRNA

<400> 10

gagtgaaatc tcttgtctta agg 23

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsPDS-crRNA01-F

<400> 11

agatgagtga aatctcttgt cttaagg 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsPDS-crRNA01-R

<400> 12

ggccccttaa gacaagagat ttcactc 27

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsPDS野生型序列

<400> 13

gtgagctttg gagtgaaatc tcttgtctta aggaataaag gaa 43

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1基因特异性修饰靶序列

<400> 14

tttgctactg ttgcaagtgc tcaccca 27

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1基因特异性修饰靶序列

<400> 15

tttccagaaa gagaaggagg cacagat 27

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsDEP-F

<400> 16

tcaccgattc tttccatgcg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsDEP-R

<400> 17

gccacaatcg ggtttgcatt 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsDEP-F

<400> 18

tcaccgattc tttccatgcg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsDEP-R

<400> 19

gccacaatcg ggtttgcatt 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA01

<400> 20

ctactgttgc aagtgctcac cca 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA02

<400> 21

cagaaagaga aggaggcaca gat 23

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA01-F

<400> 22

agatctactg ttgcaagtgc tcaccca 27

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA01-R

<400> 23

ggcctgggtg agcacttgca acagtag 27

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA02-F

<400> 24

agatcagaaa gagaaggagg cacagat 27

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA02-R

<400> 25

ggccatctgt gcctccttct ctttctg 27

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA01野生型序列

<400> 26

catgtctttg ctactgttgc aagtgctcac ccaagtgcaa aag 43

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsDEP1-crRNA02野生型序列

<400> 27

tttccttttc cagaaagaga aggaggcaca gatcttgccg tct 43

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5基因特异性修饰靶序列

<400> 28

gtctaccggc attgcaggaa gcagaaa 27

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5基因特异性修饰靶序列

<400> 29

tttgtaagca gctggctgag ggtgcat 27

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsROC5-F

<400> 30

cttatgttcc gttccaatcc t 21

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsROC5-R

<400> 31

cctacacttc acatttccac ct 22

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsROC5-F

<400> 32

cttatgttcc gttccaatcc t 21

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Cpf1-OsROC5-R

<400> 33

cctacacttc acatttccac ct 22

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA01

<400> 34

tgcttcctgc aatgccggta gac 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA02

<400> 35

taagcagctg gctgagggtg cat 23

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA01-F

<400> 36

agattgcttc ctgcaatgcc ggtagac 27

<210> 37

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA01-R

<400> 37

ggccgtctac cggcattgca ggaagca 27

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA02-F

<400> 38

agattaagca gctggctgag ggtgcat 27

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA02-R

<400> 39

ggccatgcac cctcagccag ctgctta 27

<210> 40

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA01野生型序列

<400> 40

ttgaggaggt gtctaccggc attgcaggaa gcagaaatgg cgc 43

<210> 41

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OsROC5-crRNA02野生型序列

<400> 41

tccggttttg taagcagctg gctgagggtg catgggcagt agt 43

Claims

1.CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：包括Cpf1核酸酶蛋白表达单元和crRNA转录表达克隆单元两个结构区域；所述的Cpf1核酸酶蛋白表达单元从5’到3’方向依次为：启动子-Cpf1核酸酶编码基因-终止子；所述的crRNA转录表达克隆单元从5’到3’方向依次为：启动子-核酶A编码序列-crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码序列-终止子；所述的启动子为Pol II型启动子；

所述的功能单元从5’到3’方向依次为：

pZmUbi1-LbCpf1 ORF-Nos T-pZmUbi1-HH Ribozyme-crRNA cloning scaffold-HDVRibozyme-Nos T；

其中，所述pZmUbi1即玉米Ubi1启动子，LbCpf1 ORF即毛螺科菌Cpf1核酸酶蛋白编码框，Nos T即Nos终止子，HH RiboZyme即HH核酶，crRNA cloning scaffold即向导crRNA克隆单元的编码序列，HDV RiboZyme即HDV核酶。

2.如权利要求1所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：所述Cpf1核酸酶编码基因的5’端和/或3’端融合核定位信号NLS编码序列。

3.如权利要求2所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：所述的NLS为SV40 NLS、nucleoplasmin NLS、c-Myc NLS、TUS-protein NLS或EGL-13 NLS中的至少一种。

4.如权利要求3所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：

所述的LbCpf1核酸酶蛋白编码框5’端融合SV40 NLS序列，5’端SV40 NLS的氨基酸序列如Seq ID No.2所示；LbCpf1核酸酶蛋白编码框3’端融合nucleoplasmin NLS序列，3’端NLS的氨基酸序列如Seq ID No.3所示。

5.如权利要求4所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：包含核定位信号的LbCpf1核酸酶蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示的。

6.如权利要求5所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：编码包含核定位信号的LbCpf1核酸酶蛋白的核苷酸序列如Seq ID No.6中 2049～5831位所示。

7.如权利要求1所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：crRNA转录表达克隆单元的编码序列中连有BsaⅠ-ccdB-BsaⅠ序列。

8.如权利要求7所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：BsaⅠ-ccdB-BsaⅠ序列的苷酸序列如Seq ID No.6中 8231～8867位所示。

9.如权利要求1所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：所述的核酶A编码序列- crRNA克隆单元的编码序列-核酶B编码序列的核苷酸序列如Seq IDNo.6中 8166～8936位所示。

10.如权利要求1~9任一项所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元，其特征在于：所述的pZmUbi1-LbCpf1 ORF-Nos T-pZmUbi1-HH Ribozyme-crRNA cloningscaffold-HDV Ribozyme-Nos T功能单元的核苷酸序列如Seq ID No.6所示。

11.含有权利要求1~10任一项所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元的载体。

12.如权利要求11所述的载体，其特征在于：所述的载体为植物转基因骨架载体。

13.如权利要求12所述的载体，其特征在于：所述的植物转基因骨架载体为pCambia系列、pBI系列、pMDC系列或pGreen系列中的至少一种。

14.权利要求1~10任一项所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元或权利要求11所述的载体在进行植物基因组定向修饰中的用途。

15.针对目标位点特异性修饰CRISPR/Cpf1重组表达载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a、明确特定植物基因组目标DNA区域，分析其中的具有LbCpf1核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的18～25bpDNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征5’-TTTN-3’， N表示A、G、C、T中的任一种；

c、将权利要求11~13任一项所述的载体与步骤b得到的互补寡核苷酸双链片段混合，反应体系中同时加入BsaⅠ内切酶及T4 DNA连接酶，设置酶切-连接循环反应，得到针对目标位点进行特异性修饰的CRISPR/Cpf1重组载体。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：步骤a中特异性靶序列长度为23bp。

17.如权利要求15或16任一项所述的方法，其特征在于：步骤b中5’-AGAT-N_X-3中X的数目与步骤a中选择的PAM结构相邻的18～25bpDNA序列作为特异性修饰靶序列长度一致。