CN108660139A

CN108660139A - 植物育性调控基因np2及其编码蛋白和应用

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Publication number: CN108660139A
Application number: CN201710192419.5A
Authority: CN
Inventors: 严维; 唐晓艳; 邓兴旺
Original assignee: SHENZHEN XINGWANG BIOLOGICAL SEED INDUSTRY Co Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Current assignee: SHENZHEN XINGWANG BIOLOGICAL SEED INDUSTRY Co Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2037-03-28
Also published as: CN108660139B

Abstract

本发明公开了一种植物育性调控基因NP2及其编码蛋白和应用，属于植物生物技术领域，具体涉及调控植物育性的基因及其编码的蛋白和应用，及植物杂交育种方法，包括不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及一个导致水稻无粉型雄性不育的基因NP2及其突变体在杂交育种中的应用。本研究通过EMS诱变水稻品种黄华占，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的无粉型雄性不育突变体，命名为os5763，对其进行初步的表型鉴定、遗传分析及遗传背景鉴定，并利用SIMM方法，结合HRM及基因序列分析，成功定位并克隆了该雄性不育基因，命名为NP2（no pollen 2）。本发明所提供的雄性不育基因具有重要的应用价值。

Description

植物育性调控基因NP2及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及调控植物育性的基因及其编码的蛋白和应用，及植物杂交育种方法，包括不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及一个导致水稻无粉型雄性不育的基因NP2及其突变体在杂交育种中的应用。

技术背景

水稻(Oryza sativa L.)是世界重要的粮食作物之一，也是分子遗传学及基因组学研究中重要的模式植物。雄性生殖细胞的发育是一个重要的生物学过程，除了内在的有性生殖功能，它还是研究细胞分裂、分化、极性建立、细胞-细胞识别和通信等基础细胞过程的极好模式系统。一方面，花粉育性的高低直接影响着水稻产量；另一方面，以雄性不育系为核心的杂交水稻技术，充分发挥水稻杂种优势，对提高粮食产量和品质做出了巨大贡献。水稻雄性不育的发现与利用为增加水稻产量，改进品质，增加抗性和适应性提供优异种源，因而在植物育种上具有重要的应用价值。水稻雄性不育系资源开发和利用，对世界粮食生产和粮食安全都有举足轻重的影响，这是研究者对水稻花药发育保持长久研究兴趣的最大驱动力。

花粉发育是复杂而有序的细胞活动过程，包括雄蕊原基的形成和发育、体细胞以及生殖细胞的分化和细胞间通信、减数分裂和有丝分裂(Ma,H.Molecular geneticanalyses of microsporogenesis and microgametogenesis in floweringplants.Annual Review of Plant Biology2005,56,393-434.)。近年来，应用遗传学和分子生物学等手段，水稻的花药发育研究取得了多个重大的成果。转录组分析表明，约有29,000个基因在水稻花药发育和花粉形成的不同阶段表达，其中约4,000个是花药特异表达的基因(Hobo et al.,Various spatiotemporal expression profiles of anther-expressed genes in rice.Plant and Cell Physiology 2008,49,1417-1428.；Wei etal.,Genome-scale analysis and comparison of gene expression profiles indeveloping and germinated pollen in Oryza sativa.BMC Genomics 2010,11,338.)。花粉发育过程中任何一个进程或关键基因出现异常都可能影响植株育性，表现为雄性器官缺失、造孢细胞异常、花药不能开裂或花药萌发失败(Guo and Liu,Molecular control ofmale reproductive development and pollen fertility in rice.Journal ofIntegrative Plant Biology 2012,54,967-978.；Wang et al.,Gene,protein,andnetwork of male sterility in rice.Frontiers in Plant Science 2013,4,92.)。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)和环境敏感型细胞核雄性不育(environment-sensitive genic male sterility,EGMS)的机理研究都有了突破性进展(Chen and Liu,Male sterility and fertility restoration in crops.Annual Reviewof Plant Biology 2014,65,579-606.；Fan et al.,PMS1T,producing phased small-interfering RNAs,regulates photoperiod-sensitive male sterility inrice.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2016.)。遗传分析表明，大多数雄性育性是由核基因控制的(Sunok et al.,Therice FON1gene controls vegetative and reproductive development by regulatingshoot apical meristem size.Molecules and Cells.2006,21(1):147-152)。目前，已有超过40个水稻隐性核雄性不育(genic male sterility,GMS)基因已被克隆(Guo and Liu,Molecular control of male reproductive development and pollen fertility inrice.Journal of Integrative Plant Biology 2012,54,967-978.；Wang et al.,Gene,protein,and network of male sterility in rice.Frontiers in Plant Science2013,4,92.)，包括与雄蕊原基的形成和发育相关的基因、与早期发药发育相关的基因、与减数分裂相关的基因、与减数分裂后花药发育相关的基因。

随着水稻粳稻和籼稻基因组测序的完成，水稻突变体库的构建以及基因表达谱分析等工作的开展，水稻花粉发育的分子机理研究起取得了一定的进展，发现了一些控制水稻花器官数目基因，如FON1～4^[、OsLRK1，控制花粉囊细胞的分开和分化基因MSP1、OsTDL1A，控制雄性减数分裂基因PAIR1、PAIR2、PAIR3、MEL1、MIL1、DTM1、OsSGO1等，促进花粉粒发育的关键基因CYP703A3、CYP704B2、WDA1、OsNOP、DPW、Ugp2、MTR1等。这些基因涉及多个方面，包括小孢子母细胞的减数分裂、绒毡层发育及降解，以及花粉细胞壁形成等方面。根据不育基因的功能和调控时期的差异，可将水稻隐性核雄性不育基因主要分为3类：1)小孢子母细胞发育时期不育基因；2)绒毡层发育时期不育基因；3)花粉囊和花粉外壁发育时期不育基因。

目前水稻突变体基因克隆最常用的技术有图位克隆、同源克隆、转座子或T-DNA标记法、表达序列标签法、差异表达基因克隆等技术。随着高通量测序技术的发展，2012年，日本科学家提出了基于重测序方法的Mutmap基因克隆技术(Abe et al.,Genome sequencingreveals agronomically important loci in rice using MutMap.NatureBiotechnology.2012,30(2):174-178)，该技术将突变体与野生型亲本进行杂交，产生F₂代分离群体，随机取20-30个突变个体，分别提取基因组DNA，等量混合后，利用二代测序技术，结合分子生物学与生物信息学分析测序数据，找出候选突变基因，大大缩短了基因克隆时间，降低了基因克隆成本。

到目前为止，涉及水稻花药发育和花粉形成的一些关键基因已被鉴定和研究，这些基因的突变导致雄性不育的表型。但对水稻雄配子体发育过程和调控机制并未完全探明，水稻雄性不育基因的定位与克隆有助于更全面地了解雄配子体发育的分子机制，加快利用雄性不育株系进行育种的进程。

本研究通过EMS诱变水稻品种黄华占，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的无粉型雄性不育突变体，命名为os5763，对其进行初步的表型鉴定、遗传分析及遗传背景鉴定，并利用SIMM方法(Yan et al.,Simultaneous identification of multiple causalmutations in rice.Frontiers in Plant Science,2016)，结合HRM及基因序列分析，成功定位并克隆了该雄性不育基因，命名为NP2(no pollen 2)。本发明还阐述了所述雄性不育基因的应用范围和应用方法。

发明简述

本发明提供了一种育性调控基因NP2的DNA序列，所述DNA序列具有调控植物雄性育性的功能，其特征在于，所述DNA序列选自下列组的序列之一：

a)具有SEQ ID NO：1、2、4、5、9、10、12、14、15或32所示的核苷酸序列；

b)在严格条件下能够与(a)之任一所述序列的DNA杂交的DNA序列；或

c)与(a)-(b)之任一所述序列互补的DNA序列。

上述DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、6、11、14或3、6、11、14、16、17、18、19、20、21、22或23所示。

本发明还提供了一种表达盒，其特征在于所述表达盒包含上述的DNA序列。

本发明还提供了一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含上述的表达盒。

本发明还提供了一种工程菌，其特征在于所述工程菌包含上述的表达载体。

本发明还提供了一种基因在植物育性调控中的应用，其特征在于，所述育性调控基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

c)与(a)-(b)之任一所述序列互补的DNA序列。

本发明还包括一种通过突变育性调控基因SEQ ID NO:1、2、4、5、9、10、12、14、15或32获得雄性不育材料的方法。

本发明中所述的“突变”包括在育性调控基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。所述的突变可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变。所述突变可以通过化学诱变或基因定点突变的方式获得，化学诱变的方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变；基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等定点突变方法。

本发明还提供了一种恢复由相应的SEQ ID NO:1、2、4、5、9、10、12、14、15或32所示基因突变所导致的雄性不育，使雄性不育突变体恢复成可育的方法。

本发明还包括一种突变体材料的应用，其特征在于所述突变材料是由核苷酸序列的突变所造成，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、4、5、9、10、12、14、15或32所示。

上述“突变”可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，也可以是通过RNAi、定点突变等手段产生。

本发明还提供了将上述材料和DNA序列应用于育种中的方法，更具体地所述应用是指将突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。

本发明还包括上述DNA序列在以下(a)至(d)中任一项中的应用：

(a)培育植物品种或品系；

(b)培育授粉受精能力增强的植物品种或品系；

(c)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

(d)培育雄性不育植物品种或品系。

本发明还提供了一种用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态的方法(详细方法可参阅PCT专利PCT/CN2013/086657)，所述方法包括：

a)提供第一植株，其包含NP2基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的；

b)向第一植株中引入下述构建体，形成第二植株，所述第二植株包含NP2基因的纯合隐性等位基因和所述构建体，且构建体在第二植株中为半合状态，所述构建体包含：

i)第一核苷酸序列，其包含NP2核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复雄性生育力；

ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；以及

c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。

本发明还提供了一种调控植物育性的方法，通过调控育性相关基因的表达进而调控该植株的育性，其特征在于，所述育性相关基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、3、6、7、11、13、17、18或19所示，所述育性相关基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：1、2、4、5、9、10、12、14、15或32；在严格条件下能够与(a)中任一所述序列的DNA杂交的DNA序列；或与(a)-(b)之任一所述序列互补的DNA序列。

本发明所提供的调控植物育性的方法，还包括通过突变育性调控基因SEQ ID NO:1、2、4、5、9、10、12、14、15或32获得雄性不育材料。以及用本发明所提供的育性调控基因NP2的DNA序列恢复由相应的SEQ ID NO:1、2、4、5、9、10、12、14、15或32所示基因突变所导致的雄性不育，使雄性不育突变体恢复成可育。

本发明中所述的突变包括在育性调控基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。

本发明公开了一种获得雄性不育突变体材料的方法，所述突变体材料通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入等，影响植株体内的育性相关基因的表达，其特征在于所述育性相关基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、3、6、7、11、13、17、18或19所示。更具体的，所述育性相关基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、4、5、9、10、12、14、15或32所示。

上述方法中所述的突变包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，还可以是通过RNAi、基因定点突变等手段产生，基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等基因编辑方法。

本发明还包括通过上述方法所获得的雄性不育突变体在育种中的应用。更具体的，所述应用指将突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。

本发明还公开了一种核雄性不育系的繁殖方法，所述方法包括：

(a)提供一种核雄性不育系作为第一植株，所述核雄性不育系的雄性不育性状由NP2基因突变导致；

(b)往上述第一植株中转入下述构建体形成第二植株，所述构建体包含：

i)育性恢复基因表达盒，其包含NP2基因的基因组DNA序列，当其在上述核雄性不育系中表达时可以恢复所述植株的雄性生育力；

ii)花粉失活基因表达盒，当其表达时，可以抑制所转入植株的可育雄性配子的形成或功能；以及

(c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，使第一植株的核雄性不育系得到繁殖；或是使第二植株自花授粉，按1:1的比例繁殖出雄性不育的第一植株和作为保持系的第二植株。

附图说明

图1是os5763突变体和野生型黄华占植株形态。

图2是os5763突变体和野生型黄华占小穗及花药形态。

图3为os5763突变体和野生型黄华占花药横向切片分析,其中E是epidermis(表皮层)；En是endothecium(内皮层)；M是middle layer(中层)；T是tapetal layer(绒毡层)；PMC是pollen mother cell(小孢子母细胞)；Tds是tetrads(四分体)；DMsp是degeneratedmicrospores(降解的小孢子)；MP是mature pollen(成熟花粉粒)；Msp是microspores(小孢子)。

图4为采用基于重测序的SIMM方法定位突变体os5763突变基因。SNP index表示突变体中突变的比例，ED为考虑其他突变体中突变比例而得到的欧式距离。

图5为野生型黄华占、os5763突变体，日本晴，籼稻珍汕97和明恢63的NP2 CDS(coding sequences)序列比对结果，其中HHZ表示黄华占NP2序列，Mutant表示os5763突变体序列，Nipponbare表示日本晴中的NP2序列，ZS97表示珍汕97中的NP2序列，MH63表示明恢63中的NP2序列。

图6为野生型黄华占、os5763突变体，日本晴，籼稻珍汕97和明恢63的NP2蛋白序列比对结果，其中HHZ表示黄华占NP2蛋白序列，Mutant表示os5763突变体NP2蛋白序列，Nipponbare表示日本晴中的NP2蛋白序列，ZS97表示珍汕97中的NP2蛋白序列，MH63表示明恢63中的NP2蛋白序列。

图7NP2在不同水稻组织器官中的表达水平分析。

图8水稻雄性不育突变体(os5763)的转基因功能互补载体。

图9NP2基因的CRISPR敲除载体。

图10突变体os5763，野生型黄华占，日本晴，珍汕97和明恢63中NP2基因编码的蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、杨树(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)和谷子(Setaria italic)基因组中的同源蛋白的序列比对图。

图11突变体os5763，野生型黄华占，日本晴，珍汕97和明恢63中NP2基因编码的蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、杨树(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)和谷子(Setaria italic)基因组中的同源蛋白的序列进化树。

发明详述

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

本发明包括一种育性相关基因及其核苷酸和蛋白序列，还包括通过操作该基因在调控植株雄性生育力中的应用。非限制性地举例而言，下文描述的任何方法都可与本发明所提供的相应核苷酸序列一起使用，例如，将所述育性基因的突变体序列引入植株以导致植株雄性不育、使植株内源序列突变、向植株中引入该序列的反义序列、使用发卡形式、或将其与其它核苷酸序列连接起来调控植株的表型，或者是本领域技术人员已知的可用于影响植株的雄性生育力的多种方法中的任一方法。

本发明所提供的育性基因NP2，是一个花粉发育相关的基因。在水稻中该育性基因位于第4号染色体上，在多种植物中序列具有保守性。其在籼稻中的核苷酸序列如SEQ IDNO:4、9或12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6、11或14所示；在粳稻中其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；在拟南芥中该育性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；在高粱中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；在玉米中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；在杨树中该基因的同源基因POPTR_0001s47430的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，同源基因POPTR_0011s17060的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；在大豆中该基因的同源基因Glyma08g44950的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，同源基因Glyma18g07960的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；在谷子中该基因的同源基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。

目前，已通过转基因技术将NP2基因开发成一个可逆的雄性不育系统应用到作物杂交育种中。在水稻突变体os5763中，NP2基因CDS上第220位发生单碱基突变，导致其编码的蛋白第74位谷氨酸(GAG)突变成赖氨酸(AAG)，该突变不影响植株的营养生长和小穗发育，仅导致花药瘦小且呈浅黄色，无法正常形成花粉粒，最终形成完全雄性不育突变体。

本发明还包括下列组的序列之一：a)与上述NP2基因序列具有至少90％(优选为至少95％)序列相似性，且具有相同功能的DNA序列；b)在严格条件下能够与(a)所述序列的DNA杂交的DNA序列；c)与上述任一所述序列互补的DNA序列。

上述所述育性基因，可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本发明所述的育性恢复基因包括与NP2基因高度同源，并且具有同样的育性调控功能的高度同源的功能等价体序列。所述高度同源的功能等价体序列包括在严谨条件下能够与本发明所公开的NP2基因的核苷酸序列杂交的DNA序列。本发明中所使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

功能等价体序列还包括与本发明所公开的NP2基因所示的序列有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列相似性，且具有育性调控功能的DNA序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

本发明所述的基因序列可以从任何植物中分离获得，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。

本发明还提供了通过影响NP2的核苷酸序列或者通过调控NP2基因的转录表达从而影响植株育性的方法。所述影响植株育性是指通过调控NP2基因的表达，从而使所述植株的育性发生改变，如导致植株雄性不育。具体地，取决于具体应用需求，可以通过多种方法来影响NP2基因在植物体内的表达，从而达到调控植株雄性育性的效果。更具体地，调控NP2基因的表达可以使用许多本领域普通技术人员可获得的工具进行，例如，通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入等，都可以用于破坏NP2基因的正常表达，从而获得雄性不育的植株。另一方面，本发明还包括通过将野生型NP2的核苷酸序列引入植株来恢复NP2表达被破坏的植株的雄性育性。

本发明还提供了一种NP2基因的不育突变体序列及其雄性不育突变体材料。更具体地，所述雄性不育突变体材料是通过突变水稻内源的NP2基因，或突变与其高度同源的基因的核苷酸序列，使该植物体丧失雄性育性的过程。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，还可以是通过RNAi、基因定点突变等手段产生，基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等定点突变方法。

具体地，本发明还提供了一种水稻雄性不育突变体，其含有突变后的雄性不育基因，所述突变后的雄性不育基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示。与野生型相比，在不育突变体中，该基因CDS第220位一个单碱基突变G..A，导致序列SEQ ID NO:5编码的蛋白(如SEQ ID NO:7所示)第74位氨基酸由谷氨酸(GAG)突变成谷氨酸(AAG)，如SEQ ID NO:8所示(图7)。本领域技术人员应该知晓，可以将所述核苷酸序列SEQ ID NO:7构建到植物表达载体，进行植物转化，从而获得新的转基因的雄性不育突变体材料。

此外，本发明的启动子可与并非NP2基因的核苷酸序列相连，以在花药中特异表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达，更具体地，在该植株的雄性器官中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。

在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作地连接在本发明启动子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。

本发明还包括含有NP2基因和/或其启动子的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表达盒。所述构建体中的启动子可以是天然启动子或被取代的启动子，其将驱动所连核苷酸序列在植株中的表达。构建体中的启动子可以是诱导型启动子。当将NP2基因的核苷酸序列与另一个启动子相连，优选的是，该启动子在花粉发育早期充分驱动该序列的表达,例如可以在花粉发育的第9时期特异性表达。具体地，可使用的启动子的种类包括组成型病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子，或玄参花叶病毒35S启动子,或泛素启动子。

组织特异表达启动子可用于靶向特定的植物组织中增强转录和/或表达。启动子可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。在一种实施方式中，启动子是偏好在植物的雄性或雌性组织中特异表达的类型。本发明不必须在方法中使用任何特定的雄性组织优先型启动子，本领域技术人员已知的很多此类启动子中的任何都可以使用。本文描述的天然的NP2启动子是可使用的启动子的一个例子。另一种此类启动子是5126启动子、MS45启动子、MS26启动子、BS92-7启动子、SGB6调控元件和TA29启动子等，其偏好于指导其连接的基因在植物雄性组织中的表达。某些构建体中还可以包括配子组织优先表达启动子。雄性配子优先表达启动子包括PG47启动子以及ZM13启动子。

上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亚基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽等。

在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁膦抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。

本发明还包括所公开的NP2基因及其启动子的应用，在某些应用的实施方式中，可以应用本发明所提供的NP2基因或其启动子来实现NP2或其他类似育性相关基因突变所获得的雄性不育系的繁殖和保持。

具体地，上述雄性不育系的繁殖和保持，是指以纯合隐性核雄性不育突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育突变体受体植株中。所述3个目标基因分别是育性恢复基因、花粉失活基因和筛选基因。其中，育性恢复基因可使不育的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。

在本发明中，所述花粉失活基因包括但不限于DAM甲基化酶基因、Zea maysα淀粉酶基因、细胞毒素编码基因、或Barnase与Barstar的组合序列。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子选自聚半乳糖醛酸酶47基因(PG47)、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因或硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域即其启动子区域。

上述筛选基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的筛选基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁膦抗性基因。所述筛选基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

更具体地，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育os5763/os5763突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系：其中，育性恢复基因NP2可使转化受体育性恢复；花粉失活基因Zm-PA可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；荧光色选基因RFP(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题(详细方法可参阅PCT专利PCT/CN2013/086657)。

本发明还提供了一种植物的生产方法，其包括：

(1)构建本发明所提供的表达盒；

(2)将步骤(1)获得的表达盒导入植物细胞；

(3)再生出转基因植物；和

(4)选择出转基因植物；并且

(5)任选地，增殖步骤(4)获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见Horsch RB等(1985)Science 225：1229；WhiteFF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等.Techniquesfor Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press，1993，pp.128-143，等)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供了一种水稻花粉发育基因以及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳定、不受环境条件影响、能够被野生型转基因恢复。该基因以及该基因突变产生的不育系为构建第三代杂交育种体系提供了必要的元件，该基因突变产生的雄性不育系，用来生产杂交种子，对于突破并改良现有的“三系”和“两系”杂交技术有重要意义。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、水稻雄性不育突变体(os5763)筛选

采用0.7％的EMS诱变籼稻黄华占种子(M0)，处理12小时,混收M0代种子，获得突变体库(M1)。通过田间观察和表型观察，筛选获得不育突变株(图1)。将不育株割稻桩再生，并在生殖期采用I₂-KI染色检测花粉发育和染色反应。其中一个突变体的花粉为无粉型不育，植株表现为完全雄性不育，命名为os5763。

实施例2、水稻雄性不育突变体(os5763)遗传分析

将os5763突变体不育株与野生型黄华占杂交，三个杂交群体F1代植株均表现为可育。将F1代进行自交，F2代植株中不育与可育植株的分离比接近1:3(80:232)，显示该突变是由隐性单基因控制。

实施例3、水稻雄性不育突变体(os5763)生殖器官表型分析

与野生型相比，突变体植株营养生长发育正常，花期相同。外稃和内稃大小、形态、开张尺寸、开张时间与野生型没有明显差别(图2)。但突变体花药瘦小，呈浅黄色(图2)，花药不开裂，进一步用I₂-KI溶液对突变体的花粉进行染色检测，结果如图2所示，野生型的花粉染色正常，而突变体表现为无粉型败育，故将控制os5763突变体性状的基因命名为NP2(no pollen 2)。通过横向切片发现，与野生型相比，其结果如图3所示，在花药发育第9时期(stage 9)，突变体小孢子没有明显的液泡化并且皱缩，第10时期，花药室开始皱缩，直到第12时期(stage 12)突变体花药室内小孢子降解消失，其他组织如绒毡层、花药外壁、花粉外壁没有明显差别，说明候选基因主要通过影响小孢子的形成，最终引起突变体无粉型败育。

实施例4、水稻雄性不育突变体基因的克隆

突变体基因克隆采取SIMM方法(Yan et al.,Simultaneous identification ofmultiple causal mutations in rice.Frontiers in Plant Science,2016)，即利用突变体与野生型亲本杂交后自交构建F2群体，选取群体中具有不育表型的植株，通过混样重测序进行基因定位的方法。将不育株与野生型黄华占杂交，选取30株F2代不育植株，取叶片提取基因组DNA，等量混合后用于高通量基因组重测序，共获得约13G基因组序列数据，相当于28x水稻基因组(表1)。以其他同样来源于黄华占的突变体作为参照，通过SIMM分析发现，将造成突变体os5763雄性不育突变表型的基因定位到第4染色体上(图4)，考虑候选位点所在基因的功能，确定候选基因可能是第4染色体上的LOC_Os04g39470。

表1水稻雄性不育突变体os5763重测序数据

在粳稻日本晴中，候选基因LOC_Os04g39470的编码区全长1,119bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码全长为372个氨基酸的蛋白。而在野生型黄华占(籼稻)中该基因的编码区全长1,110bp，比日本晴少9bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO:5所示，共369个氨基酸。在另外两个籼稻品种珍汕97和明恢63中，珍汕97的编码区全长为1,119bp，编码全长为372个氨基酸的蛋白，与日本晴相同；而明恢63的编码区全长为1,110bp，编码全长为369个氨基酸的蛋白，与黄华占相同。与日本晴和明恢63相比，黄华占、os5763突变体和珍汕97中均缺失编码区第692至700位共9个碱基，如图5所示。此外，日本晴和珍汕97在编码区第582位于黄华占、os5763突变体及明恢63存在单碱基变异(T..C)，日本晴在编码区第950位与黄华占、珍汕97、明恢63和os5763突变体存在单碱基变异(A..C)，黄华占和os5763突变体在编码区第701和702位与其他参照存在连续的碱基变异(CC..GG)。与所有参照相比，在不育突变体os5763中，编码区第220位G突变成A，导致编码的氨基酸第74位由谷氨酸(GAG)突变成赖氨酸(AAG)。采用最新的SNP(单核苷酸多态性)验证工具HRM(High Resolution Melting curve，即高分辨率熔解曲线)分析，进一步验证在F2群体中，所有的雄性不育植株均携带纯合突变基因型，而可育植株携带纯合野生或杂合基因型(表2)。该位点为纯合野生型的植株自交后代全部可育，该位点为杂合型的植株自交后代表现1:3(不育：可育)分离。

表2突变基因(LOC_Os04g39470)HRM分型结果

候选基因LOC_Os04g39470的编码区在粳稻日本晴、籼稻珍汕97、明恢63和野生型黄华占之间存在核苷酸序列多态性(图5)，导致对应的氨基酸序列出现个别氨基酸多态性(图6)。

目前，已通过转基因技术将NP2开发成一个可逆的雄性不育系统应用到作物杂交育种中。

实施例5、NP2基因在水稻各器官中的表达分析

根据NP2的cDNA序列设计引物，上游引物为NP2-qRT-F 5’-ACGGACAACGACGTGAAGAACC-3’(SEQ ID NO:24)，下游引物为NP2-qRT-R 5’-GCGAGAAGGACTTGTGCGTGAC-3’(SEQ ID NO:25)，同时以水稻Actin基因作为内参对照设计引物，上游引物为5’-GCTATGTACGTCGCCATCCA-3’(SEQ ID NO:26)，下游引物为5’-GGACAGTGTGGCTGACACCAT-3’(SEQ ID NO:27)。采用黄华占水稻材料提取总RNA并反转录合成cDNA模板。采取实时定量PCR方法，分析NP2基因在水稻根、茎、叶、外稃、内稃、颖片、雌蕊和幼穗颖花原基分化期(stage6)、幼穗花粉母细胞减数分裂时期(stage 7)及四分体形成阶段(stage 8)、小孢子早期(stage 9)、小孢子中晚期(stage 10)及成熟花粉期(stage12)的表达谱，其结果如图7所示，该基因在水稻花药中特异表达，并且是花药发育的晚期表达。

实施例6、水稻雄性不育突变体(os5763)的转基因功能互补

互补载体的构建(图8)：用引物NP2-Res-F(5’-CCATGATTACGAATTCGGTAGCTACTACATGCTCATGTTC-3’，SEQ ID NO:28)和NP2-Res-R(5’-GGCCAGTGCCAAGCTTGTGTCTGCTGATGACATGGATG-3’，SEQ ID NO:29)扩增水稻基因组，获得含有NP2起始密码子ATG上游的2500bp左右的碱基和终止密码子TAA后的2500个碱基的全长基因组DNA序列片段(SEQ ID NO:32)，同时采用EcoRⅠ、HindⅢ内切酶双酶切pCAMBIA1300载体并回收酶切后的片段，利用In-Fusion酶将载体回收片段与全长基因组DNA序列片段连接。将测序验证正确的质粒采用农杆菌介导的方法转化至黄华占os5763突变体的种子诱导的愈伤组织中，筛选再生得到转基因植株。

分析所有获得的转基因阳性植株，发现所有转基因阳性植株均表现为完全雄性可育，进一步证明基因NP2参与花粉发育调控，该基因突变导致无粉型败育。

实施例7、NP2基因的敲除转基因株系的获得与表型分析

NP2基因的敲除载体(图9)的构建：用靶点Target1(AGAAGGACAACGTGAAGCGC，SEQID NO:30)和Target2(AGGGATCGCTCATGATGGCG，SEQ ID NO:31)分别连接到CRISPR/Cas9载体的U6a和U3启动子上，酶切后连入CRISPR/Cas9载体中得到CRISPR:NP2敲除载体。通过农杆菌介导的方法转化武运粳的愈伤组织，筛选再生得到转基因植株。对该转基因阳性植株进行表型分析，发现所有转基因植株均表现出花粉败育，该实施例进一步说明NP2参与花粉发育调控，该基因的表达被抑制导致花粉败育。

实施例8、NP2基因编码的蛋白与拟南芥、高粱、玉米、杨树、大豆、谷子基因组中预测的同源蛋白的序列比对及进化树分析

在NCBI数据库中，利用protein blast工具，对水稻NP2基因编码的蛋白全序列在蛋白数据库中进行查找，得到了其在籼稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：4、9或12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6、11或14所示；在粳稻中其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；在拟南芥中该育性基因的同源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；在高粱中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID17所示；在玉米中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；在杨树中该基因的同源基因POPTR_0001s47430的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，同源基因POPTR_0011s17060的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；在大豆中该基因的同源基因Glyma08g44950的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，同源基因Glyma18g07960的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；在谷子中该基因的同源基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。将这些蛋白序列进行比对分析和进化树分析，结果显示来自不同植物的同源蛋白都具有非常相似的保守序列，彼此之间具有较高的同源性(图10和11)，表明该蛋白在植物花的雄性器官发育过程中生物学功能保守，起着非常重要的作用。该基因在单子叶植物(如水稻、高粱、玉米和谷子)和双子叶植物(如拟南芥、杨树和大豆)中分别聚类分布，说明该基因在单子叶和双子叶植物中存在分开进化的可能。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳兴旺生物种业有限公司

深圳市作物分子设计育种研究院

<120> 植物育性调控基因NP2及其编码蛋白和应用

<130>

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1618

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L. japonica）

<400> 1

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gacggcggcg acatcatggg gcgggtgccg tgctgcgaga aggacaacgt gaagcgcggg 120

cagtggacgc ccgaggagga caacaagctg ctctcctaca tcacccagta cggcacccgc 180

aactggcgcc tcatccccaa gaacgccggt acgttggcgc gcgcgccgcc accggcgaac 240

gcgtggttgc agcagcggcg gcgctctgac cggggtgttt gttgctggaa cgttggcagg 300

gttgcagcgg tgcgggaaga gctgccggct gcggtggacc aactacctcc ggcccgacct 360

caagcacggc gagttcaccg acgccgagga gcagaccatc atcaagctcc actccgtcgt 420

cggcaacagg taggcatcaa cgagtggtct cgctacaccg tcttgtgatc ttgggtcatt 480

tttggaggaa tgtattgagc aatgcgggat ggggctgtgt gtggcaaggt ggtcggtgat 540

cgcggcgcag cttccggggc ggacggacaa cgacgtgaag aaccactgga acacgaagct 600

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catggccgag atcgccacca cgctggcgcc gccgcaggtg gcgcacctcg ccgaggccgc 720

gctggggtgc ttcaaggacg agatgctcca cctcctcacc aagaagcgcc cctccgactt 780

cccctcgccc gccgtgcacg acggcgccgg cgccggcgcc agcgcgtccg cgctcgccgc 840

gccctgtttc cccgccgcgc cgccgcacca cccgcaggcc gacgacacca tcgagcgcat 900

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cgccgccgcg ccctccgccc ccgcggagga caagccgtgg ccgcccggcg acatgtccga 1020

ggggctcgcc gggatgtacg ccacgtacaa cccggcggcg cacgcgcacg cgcaggccca 1080

ggccgagttc cggtacgacg gggcctccgc ggcgcagggc tacgtcctcg gcggcgacgg 1140

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tctttttgct tggaaaagag aaaaaaaagt gagatgtgaa tagttttacc gagaagca 1618

<210> 2

<211> 1119

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L. japonica）

<400> 2

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gaggacaaca agctgctctc ctacatcacc cagtacggca cccgcaactg gcgcctcatc 120

cccaagaacg ccgggttgca gcggtgcggg aagagctgcc ggctgcggtg gaccaactac 180

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caccagagcc tgtacagcgg gagctccggc accgaggagg ccaggcggga gttgccggag 960

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<210> 3

<211> 372

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L. japonica）

<400> 3

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1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ser

115 120 125

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130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Ser Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val His Asp Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ala Leu Ala Ala

180 185 190

Pro Cys Phe Pro Ala Ala Pro Pro His His Pro Gln Ala Asp Asp Thr

195 200 205

Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Asp Pro

210 215 220

Ser Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala

225 230 235 240

Glu Asp Lys Pro Trp Pro Pro Gly Asp Met Ser Glu Gly Leu Ala Gly

245 250 255

Met Tyr Ala Thr Tyr Asn Pro Ala Ala His Ala His Ala Gln Ala Gln

260 265 270

Ala Glu Phe Arg Tyr Asp Gly Ala Ser Ala Ala Gln Gly Tyr Val Leu

275 280 285

Gly Gly Asp Gly Asp Gln Gly Thr Ser Met Trp Ser His Gln Ser Leu

290 295 300

Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Thr Glu Glu Ala Arg Arg Glu Leu Pro Glu

305 310 315 320

Lys Gly Asn Asp Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Asp Asp Asp Ala Ala

325 330 335

Asp Asp Gly Lys Asp Ser Gly Lys Gly Ala Ala Ser Asp Met Ser Gly

340 345 350

Leu Phe Ala Ser Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Asn His Met Val

370

<210> 4

<211> 1609

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 4

atttataaca cgcggcgcgg ccgtgtgagc gccgcacgca cgcagcagca gcggaatctc 60

gacggcggcg acatcatggg gcgggtgccg tgctgcgaga aggacaacgt gaagcgcggg 120

cagtggacgc ccgaggagga caacaagctg ctctcctaca tcacccagta cggcacccgc 180

aactggcgcc tcatccccaa gaacgccggt acgttggcgc gcgcgccgcc accggcgaac 240

gcgtggttgc agcagcggcg gcgctctgac cggggtgttt gttgctggaa cgttggcagg 300

gttgcagcgg tgcgggaaga gctgccggct gcggtggacc aactacctcc ggcccgacct 360

caagcacggc gagttcaccg acgccgagga gcagaccatc atcaagctcc actccgtcgt 420

cggcaacagg taggcatcaa cgagtggtct cgctacaccg tcttgtgatc ttgggtcatt 480

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gctggggtgc ttcaaggacg agatgctcca cctcctcacc aagaagcgcc cctccgactt 780

cccctcgccc gccgtgcacg acggcgccgg cgccggcgcc agcgcgtccg cgctcgccgc 840

gccctgcttc cccgccgcgc cgccgcacca cccgcaggcc gacgacacca tcgagcgcat 900

caagctcggc ctgtcccgcg ccatcatgag cgatccctcc accgcctccg ccgccggggc 960

gccctccgcc cccgcggagg acaagccgtg gccgcccggc gacatgtccg aggggctcgc 1020

cgggatgtac gccacgtaca acccggcggc gcacgcgcac gcgcaggccc aggccgagtt 1080

ccggtacgac ggggcctccg cggcgcaggg ctacgtcctc ggcggcgacg gcgaccaggg 1140

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ctccgactgc gtgctctggg acttgcccga cgagctcacg aatcacatgg tgtagctaag 1380

ctataaaacg cgggaaaact tagcacggcg aagcacgcca tgatccacat cacttgcagt 1440

tgcaggtggt gagaattgga tagagcgaaa aattgctacc aataatattg ctgaaggagt 1500

gacagaaaaa gtgaaaaact atagtatgta gctggcaaga aaaatgggga ttctttttgc 1560

ttggaaaaga gaaaaaaaaa tgagatgtga atagttttac cgagaagca 1609

<210> 5

<211> 1110

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 5

atggggcggg tgccgtgctg cgagaaggac aacgtgaagc gcgggcagtg gacgcccgag 60

gaggacaaca agctgctctc ctacatcacc cagtacggca cccgcaactg gcgcctcatc 120

cccaagaacg ccgggttgca gcggtgcggg aagagctgcc ggctgcggtg gaccaactac 180

ctccggcccg acctcaagca cggcgagttc accgacgccg aggagcagac catcatcaag 240

ctccactccg tcgtcggcaa caggtggtcg gtgatcgcgg cgcagcttcc ggggcggacg 300

gacaacgacg tgaagaacca ctggaacacg aagctgaaga agaagctgtc cgggatgggc 360

atcgaccccg tcacgcacaa gtccttctcg cacctcatgg ccgagatcgc caccacgctg 420

gcgccgccgc aggtggcgca cctcgccgag gccgcgctgg ggtgcttcaa ggacgagatg 480

ctccacctcc tcaccaagaa gcgcccctcc gacttcccct cgcccgccgt gcacgacggc 540

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atgagcgatc cctccaccgc ctccgccgcc ggggcgccct ccgcccccgc ggaggacaag 720

ccgtggccgc ccggcgacat gtccgagggg ctcgccggga tgtacgccac gtacaacccg 780

gcggcgcacg cgcacgcgca ggcccaggcc gagttccggt acgacggggc ctccgcggcg 840

cagggctacg tcctcggcgg cgacggcgac cagggcacgt cgatgtggag ccaccagagc 900

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gacagcgtcg gcagcagcgg cggcgacgac gacgccgcgg acgacggcaa ggacagcggg 1020

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cccgacgagc tcacgaatca catggtgtag 1110

<210> 6

<211> 369

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 6

Met Gly Arg Val Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Glu Phe Thr Asp Ala Glu Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ser

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Ser Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val His Asp Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ala Leu Ala Ala

180 185 190

Pro Cys Phe Pro Ala Ala Pro Pro His His Pro Gln Ala Asp Asp Thr

195 200 205

Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Asp Pro

210 215 220

Ser Thr Ala Ser Ala Ala Gly Ala Pro Ser Ala Pro Ala Glu Asp Lys

225 230 235 240

Pro Trp Pro Pro Gly Asp Met Ser Glu Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ala

245 250 255

Thr Tyr Asn Pro Ala Ala His Ala His Ala Gln Ala Gln Ala Glu Phe

260 265 270

Arg Tyr Asp Gly Ala Ser Ala Ala Gln Gly Tyr Val Leu Gly Gly Asp

275 280 285

Gly Asp Gln Gly Thr Ser Met Trp Ser His Gln Ser Leu Tyr Ser Gly

290 295 300

Ser Ser Gly Thr Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gly Asn

305 310 315 320

Asp Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Asp Asp Asp Ala Ala Asp Asp Gly

325 330 335

Lys Asp Ser Gly Lys Gly Ala Ala Ser Asp Met Ser Gly Leu Phe Ala

340 345 350

Ser Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr Asn His Met

355 360 365

Val

<210> 7

<211> 1110

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 7

atggggcggg tgccgtgctg cgagaaggac aacgtgaagc gcgggcagtg gacgcccgag 60

gaggacaaca agctgctctc ctacatcacc cagtacggca cccgcaactg gcgcctcatc 120

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ctccactccg tcgtcggcaa caggtggtcg gtgatcgcgg cgcagcttcc ggggcggacg 300

gacaacgacg tgaagaacca ctggaacacg aagctgaaga agaagctgtc cgggatgggc 360

atcgaccccg tcacgcacaa gtccttctcg cacctcatgg ccgagatcgc caccacgctg 420

gcgccgccgc aggtggcgca cctcgccgag gccgcgctgg ggtgcttcaa ggacgagatg 480

ctccacctcc tcaccaagaa gcgcccctcc gacttcccct cgcccgccgt gcacgacggc 540

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gcggcgcacg cgcacgcgca ggcccaggcc gagttccggt acgacggggc ctccgcggcg 840

cagggctacg tcctcggcgg cgacggcgac cagggcacgt cgatgtggag ccaccagagc 900

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<210> 8

<211> 369

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 8

Met Gly Arg Val Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Glu Phe Thr Asp Ala Lys Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ser

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Ser Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val His Asp Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ala Leu Ala Ala

180 185 190

Pro Cys Phe Pro Ala Ala Pro Pro His His Pro Gln Ala Asp Asp Thr

195 200 205

Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Asp Pro

210 215 220

Ser Thr Ala Ser Ala Ala Gly Ala Pro Ser Ala Pro Ala Glu Asp Lys

225 230 235 240

Pro Trp Pro Pro Gly Asp Met Ser Glu Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ala

245 250 255

Thr Tyr Asn Pro Ala Ala His Ala His Ala Gln Ala Gln Ala Glu Phe

260 265 270

Arg Tyr Asp Gly Ala Ser Ala Ala Gln Gly Tyr Val Leu Gly Gly Asp

275 280 285

Gly Asp Gln Gly Thr Ser Met Trp Ser His Gln Ser Leu Tyr Ser Gly

290 295 300

Ser Ser Gly Thr Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gly Asn

305 310 315 320

Asp Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Asp Asp Asp Ala Ala Asp Asp Gly

325 330 335

Lys Asp Ser Gly Lys Gly Ala Ala Ser Asp Met Ser Gly Leu Phe Ala

340 345 350

Ser Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr Asn His Met

355 360 365

Val

<210> 9

<211> 1375

<212> DNA

<213> 明恢63（Minghui 63）

<400> 9

atttataaca cgcggcgcgg ccgtgtgagc gccgcacgca cgcagcagca gcggaatctc 60

gacggcggcg acatcatggg gcgggtgccg tgctgcgaga aggacaacgt gaagcgcggg 120

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aactggcgcc tcatccccaa gaacgccggt acgttggcgc gcgcgccgcc accggcgaac 240

gcgtggttgc agcagcggcg gcgctctgac cggggtgttt gttgctggaa cgttggcagg 300

gttgcagcgg tgcgggaaga gctgccggct gcggtggacc aactacctcc ggcccgacct 360

caagcacggc gagttcaccg acgccgagga gcagaccatc atcaagctcc actccgtcgt 420

cggcaacagg taggcatcaa cgagtggtct cgctacaccg tcttgtgatc ttgggtcatt 480

tttggaggaa tgtattgagc aatgcgggat ggggctgtgt gtggcaaggt ggtcggtgat 540

cgcggcgcag cttccggggc ggacggacaa cgacgtgaag aaccactgga acacgaagct 600

gaagaagaag ctgtccggga tgggcatcga ccccgtcacg cacaagtcct tctcgcacct 660

catggccgag atcgccacca cgctggcgcc gccgcaggtg gcgcacctcg ccgaggccgc 720

gctggggtgc ttcaaggacg agatgctcca cctcctcacc aagaagcgcc cctccgactt 780

cccctcgccc gccgtgcacg acggcgccgg cgccggcgcc agcgcgtccg cgctcgccgc 840

gccctgcttc cccgccgcgc cgccgcacca cccgcaggcc gacgacacca tcgagcgcat 900

caagctcggc ctgtcccgcg ccatcatgag cgatccctcc accgcctccg ccgccgccgc 960

gccctccgcc cccgcggagg acaagccgtg gccgcccggc gacatgtccg aggggctcgc 1020

cgggatgtac gccacgtaca acccggcggc gcacgcgcac gcgcaggccc aggccgagtt 1080

ccggtacgac ggggcctccg cggcgcaggg ctacgtcctc ggcggcgacg gcgaccaggg 1140

cacgtcgatg tggagccacc agagcctgta cagcgggagc tccggcaccg aggaggccag 1200

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ctccgactgc gtgctctggg acttgcccga cgagctcacg aatcacatgg tgtag 1375

<210> 10

<211> 1110

<212> DNA

<213> 明恢63（Minghui 63）

<400> 10

atggggcggg tgccgtgctg cgagaaggac aacgtgaagc gcgggcagtg gacgcccgag 60

gaggacaaca agctgctctc ctacatcacc cagtacggca cccgcaactg gcgcctcatc 120

cccaagaacg ccgggttgca gcggtgcggg aagagctgcc ggctgcggtg gaccaactac 180

ctccggcccg acctcaagca cggcgagttc accgacgccg aggagcagac catcatcaag 240

ctccactccg tcgtcggcaa caggtggtcg gtgatcgcgg cgcagcttcc ggggcggacg 300

gacaacgacg tgaagaacca ctggaacacg aagctgaaga agaagctgtc cgggatgggc 360

atcgaccccg tcacgcacaa gtccttctcg cacctcatgg ccgagatcgc caccacgctg 420

gcgccgccgc aggtggcgca cctcgccgag gccgcgctgg ggtgcttcaa ggacgagatg 480

ctccacctcc tcaccaagaa gcgcccctcc gacttcccct cgcccgccgt gcacgacggc 540

gccggcgccg gcgccagcgc gtccgcgctc gccgcgccct gcttccccgc cgcgccgccg 600

caccacccgc aggccgacga caccatcgag cgcatcaagc tcggcctgtc ccgcgccatc 660

atgagcgatc cctccaccgc ctccgccgcc gccgcgccct ccgcccccgc ggaggacaag 720

ccgtggccgc ccggcgacat gtccgagggg ctcgccggga tgtacgccac gtacaacccg 780

gcggcgcacg cgcacgcgca ggcccaggcc gagttccggt acgacggggc ctccgcggcg 840

cagggctacg tcctcggcgg cgacggcgac cagggcacgt cgatgtggag ccaccagagc 900

ctgtacagcg ggagctccgg caccgaggag gccaggcggg cgttgccgga gaagggcaac 960

gacagcgtcg gcagcagcgg cggcgacgac gacgccgcgg acgacggcaa ggacagcggg 1020

aagggggcag cctccgacat gtcgggcctg ttcgcctccg actgcgtgct ctgggacttg 1080

cccgacgagc tcacgaatca catggtgtag 1110

<210> 11

<211> 369

<212> PRT

<213> 明恢63（Minghui 63）

<400> 11

Met Gly Arg Val Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Glu Phe Thr Asp Ala Glu Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ser

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Ser Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val His Asp Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ala Leu Ala Ala

180 185 190

Pro Cys Phe Pro Ala Ala Pro Pro His His Pro Gln Ala Asp Asp Thr

195 200 205

Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Asp Pro

210 215 220

Ser Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Glu Asp Lys

225 230 235 240

Pro Trp Pro Pro Gly Asp Met Ser Glu Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ala

245 250 255

Thr Tyr Asn Pro Ala Ala His Ala His Ala Gln Ala Gln Ala Glu Phe

260 265 270

Arg Tyr Asp Gly Ala Ser Ala Ala Gln Gly Tyr Val Leu Gly Gly Asp

275 280 285

Gly Asp Gln Gly Thr Ser Met Trp Ser His Gln Ser Leu Tyr Ser Gly

290 295 300

Ser Ser Gly Thr Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gly Asn

305 310 315 320

Asp Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Asp Asp Asp Ala Ala Asp Asp Gly

325 330 335

Lys Asp Ser Gly Lys Gly Ala Ala Ser Asp Met Ser Gly Leu Phe Ala

340 345 350

Ser Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr Asn His Met

355 360 365

Val

<210> 12

<211> 1384

<212> DNA

<213> 珍汕97（Zhenshan97）

<400> 12

atttataaca cgcggcgcgg ccgtgtgagc gccgcacgca cgcagcagca gcggaatctc 60

gacggcggcg acatcatggg gcgggtgccg tgctgcgaga aggacaacgt gaagcgcggg 120

cagtggacgc ccgaggagga caacaagctg ctctcctaca tcacccagta cggcacccgc 180

aactggcgcc tcatccccaa gaacgccggt acgttggcgc gcgcgccgcc accggcgaac 240

gcgtggttgc agcagcggcg gcgctctgac cggggtgttt gttgctggaa cgttggcagg 300

gttgcagcgg tgcgggaaga gctgccggct gcggtggacc aactacctcc ggcccgacct 360

caagcacggc gagttcaccg acgccgagga gcagaccatc atcaagctcc actccgtcgt 420

cggcaacagg taggcatcaa cgagtggtct cgctacaccg tcttgtgatc ttgggtcatt 480

tttggaggaa tgtattgagc aatgcgggat ggggctgtgt gtggcaaggt ggtcggtgat 540

cgcggcgcag cttccggggc ggacggacaa cgacgtgaag aaccactgga acacgaagct 600

gaagaagaag ctgtccggga tgggcatcga ccccgtcacg cacaagtcct tctcgcacct 660

catggccgag atcgccacca cgctggcgcc gccgcaggtg gcgcacctcg ccgaggccgc 720

gctggggtgc ttcaaggacg agatgctcca cctcctcacc aagaagcgcc cctccgactt 780

cccctcgccc gccgtgcacg acggcgccgg cgccggcgcc agcgcgtccg cgctcgccgc 840

gccctgtttc cccgccgcgc cgccgcacca cccgcaggcc gacgacacca tcgagcgcat 900

caagctcggc ctgtcccgcg ccatcatgag cgatccctcc accgcctccg ccgccgccgc 960

cgccgccgcg ccctccgccc ccgcggagga caagccgtgg ccgcccggcg acatgtccga 1020

ggggctcgcc gggatgtacg ccacgtacaa cccggcggcg cacgcgcacg cgcaggccca 1080

ggccgagttc cggtacgacg gggcctccgc ggcgcagggc tacgtcctcg gcggcgacgg 1140

cgaccagggc acgtcgatgt ggagccacca gagcctgtac agcgggagct ccggcaccga 1200

ggaggccagg cgggcgttgc cggagaaggg caacgacagc gtcggcagca gcggcggcga 1260

cgacgacgcc gcggacgacg gcaaggacag cgggaagggg gcagcctccg acatgtcggg 1320

cctgttcgcc tccgactgcg tgctctggga cttgcccgac gagctcacga atcacatggt 1380

gtag 1384

<210> 13

<211> 1119

<212> DNA

<213> 珍汕97（Zhenshan97）

<400> 13

atggggcggg tgccgtgctg cgagaaggac aacgtgaagc gcgggcagtg gacgcccgag 60

gaggacaaca agctgctctc ctacatcacc cagtacggca cccgcaactg gcgcctcatc 120

cccaagaacg ccgggttgca gcggtgcggg aagagctgcc ggctgcggtg gaccaactac 180

ctccggcccg acctcaagca cggcgagttc accgacgccg aggagcagac catcatcaag 240

ctccactccg tcgtcggcaa caggtggtcg gtgatcgcgg cgcagcttcc ggggcggacg 300

gacaacgacg tgaagaacca ctggaacacg aagctgaaga agaagctgtc cgggatgggc 360

atcgaccccg tcacgcacaa gtccttctcg cacctcatgg ccgagatcgc caccacgctg 420

gcgccgccgc aggtggcgca cctcgccgag gccgcgctgg ggtgcttcaa ggacgagatg 480

ctccacctcc tcaccaagaa gcgcccctcc gacttcccct cgcccgccgt gcacgacggc 540

gccggcgccg gcgccagcgc gtccgcgctc gccgcgccct gtttccccgc cgcgccgccg 600

caccacccgc aggccgacga caccatcgag cgcatcaagc tcggcctgtc ccgcgccatc 660

atgagcgatc cctccaccgc ctccgccgcc gccgccgccg ccgcgccctc cgcccccgcg 720

gaggacaagc cgtggccgcc cggcgacatg tccgaggggc tcgccgggat gtacgccacg 780

tacaacccgg cggcgcacgc gcacgcgcag gcccaggccg agttccggta cgacggggcc 840

tccgcggcgc agggctacgt cctcggcggc gacggcgacc agggcacgtc gatgtggagc 900

caccagagcc tgtacagcgg gagctccggc accgaggagg ccaggcgggc gttgccggag 960

aagggcaacg acagcgtcgg cagcagcggc ggcgacgacg acgccgcgga cgacggcaag 1020

gacagcggga agggggcagc ctccgacatg tcgggcctgt tcgcctccga ctgcgtgctc 1080

tgggacttgc ccgacgagct cacgaatcac atggtgtag 1119

<210> 14

<211> 372

<212> PRT

<213> 珍汕97（Zhenshan97）

<400> 14

Met Gly Arg Val Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Glu Phe Thr Asp Ala Glu Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ser

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Ser Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val His Asp Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ala Leu Ala Ala

180 185 190

Pro Cys Phe Pro Ala Ala Pro Pro His His Pro Gln Ala Asp Asp Thr

195 200 205

Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Asp Pro

210 215 220

Ser Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala

225 230 235 240

Glu Asp Lys Pro Trp Pro Pro Gly Asp Met Ser Glu Gly Leu Ala Gly

245 250 255

Met Tyr Ala Thr Tyr Asn Pro Ala Ala His Ala His Ala Gln Ala Gln

260 265 270

Ala Glu Phe Arg Tyr Asp Gly Ala Ser Ala Ala Gln Gly Tyr Val Leu

275 280 285

Gly Gly Asp Gly Asp Gln Gly Thr Ser Met Trp Ser His Gln Ser Leu

290 295 300

Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Thr Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Pro Glu

305 310 315 320

Lys Gly Asn Asp Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Asp Asp Asp Ala Ala

325 330 335

Asp Asp Gly Lys Asp Ser Gly Lys Gly Ala Ala Ser Asp Met Ser Gly

340 345 350

Leu Phe Ala Ser Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Asn His Met Val

370

<210> 15

<211> 1474

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 15

atgggtcgga ttccatgttg tgaaaaggag aatgtgaaga gaggacaatg gactcctgaa 60

gaagacaaca aattggcttc ttatattgct caacatggta ctcgtaattg gcgtctcatc 120

cctaagaatg ctggtaattt aaattttctc tatatttttt ttaatgtttt atttagtcaa 180

gtgatcattg taatgtaata taatgaatcg acaaaatttg gtctttaata gggttgcaaa 240

gatgtgggaa gagttgtagg ctgcgatgga caaactatct gcgtccggat ttgaaacatg 300

gccagttctc ggaggctgaa gaacatatca ttgtcaagtt tcactctgtt cttggtaacc 360

ggtatgatca ctactcacta gatctaatta actacggttt tatgattttc ttgaaaagat 420

ttaatctagg tgtataaatt acagatggac tcataaatat cgggtttctt tactaagttt 480

ttgaaatttt gatgctgact tactgatgaa ttgtttttat gagttttttg acaagtttct 540

tgggacacaa gaaactgaat aagacataag ttttgttcta tataccataa taccaaatct 600

aagtataggg ttttaaactt ttgggaactt ttaattttct ataaatttgt tttcgactca 660

taaatagagt ttgatgatgt attgctgatg aatagtctgg gatttttcat gagaaacaac 720

agttaacatc tttcttggga aacatttaat aatcttttga catatatggt tcaggtggtc 780

gttgattgcg gcgcaacttc ctggtcggac agacaacgat gtgaaaaatt attggaacac 840

gaagctgaag aagaagttgt caggaatggg aatagatccg gtgacccaca agcctttctc 900

gcatctaatg gcagagatca ccactacact taatcctcct caggtttctc acctagccga 960

agctgccctc ggctgtttca aggacgagat gcttcacttg ctcaccaaga aacgtgttga 1020

cctaaaccaa atcaactttt caaaccataa ccctaaccca aacaactttc acgagattgc 1080

tgataatgaa gctggtaaga taaagatgga tggtttggac catgggaatg ggataatgaa 1140

gttatgggac atgggtaatg gattctcata tggatcctct tcgtcttcgt ttgggaatga 1200

agaaagaaat gatggatcag cgtctcctgc cgttgcagct tggaggggtc acggaggaat 1260

acgtaccgcg gtagctgaaa ccgcggcagc ggaggaggag gagagaagga agctgaaggg 1320

agaagtggtt gatcaagagg agattggatc tgaaggagga agaggagatg gaatgacgat 1380

gatgaggaac catcatcatc atcaacatgt gtttaatgtg gataatgtct tgtgggattt 1440

acaagctgat gatctcatca atcatatggt ttga 1474

<210> 16

<211> 320

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 16

Met Gly Arg Ile Pro Cys Cys Glu Lys Glu Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Ala Ser Tyr Ile Ala Gln His

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Gln Phe Ser Glu Ala Glu Glu His Ile Ile Val Lys

65 70 75 80

Phe His Ser Val Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Pro

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Thr Thr Thr Leu Asn Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ser His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Val Asp Leu Asn Gln Ile Asn Phe

165 170 175

Ser Asn His Asn Pro Asn Pro Asn Asn Phe His Glu Ile Ala Asp Asn

180 185 190

Glu Ala Gly Lys Ile Lys Met Asp Gly Leu Asp His Gly Asn Gly Ile

195 200 205

Met Lys Leu Trp Asp Met Gly Asn Gly Phe Ser Tyr Gly Ser Ser Ser

210 215 220

Ser Ser Phe Gly Asn Glu Glu Arg Asn Asp Gly Ser Ala Ser Pro Ala

225 230 235 240

Val Ala Ala Trp Arg Gly His Gly Gly Ile Arg Thr Ala Val Ala Glu

245 250 255

Thr Ala Ala Ala Glu Glu Glu Glu Arg Arg Lys Leu Lys Gly Glu Val

260 265 270

Val Asp Gln Glu Glu Ile Gly Ser Glu Gly Gly Arg Gly Asp Gly Met

275 280 285

Thr Met Met Arg Asn His His His His Gln His Val Phe Asn Val Asp

290 295 300

Asn Val Leu Trp Asp Leu Gln Ala Asp Asp Leu Ile Asn His Met Val

305 310 315 320

<210> 17

<211> 371

<212> PRT

<213> 高粱（Sorghum bicolor）

<400> 17

Met Gly Arg Ile Pro Cys Cys Glu Lys Asp Ser Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Glu Phe Thr Asp Ala Glu Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ser

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Thr Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val Pro Pro Asp Met Ala Thr Ile Ala Gly Gly Ser Gly Ala Gly Ala

180 185 190

Leu Gly Ala Pro Pro Cys Gly Phe Pro Ala Pro Pro Gln Thr Asp Asp

195 200 205

Thr Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Glu

210 215 220

Pro Gly Ala Pro Pro Gly Lys Gln Gln Gln Pro Pro Trp Ala Pro Ala

225 230 235 240

Asp Val Thr Glu Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ala Thr Tyr Asn Pro Ala

245 250 255

Thr His Ala Gln Glu Glu Phe Arg Tyr Asp Asn Gly Ala Val Pro Glu

260 265 270

Tyr Val Leu Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Asp Ala Asp Gln Gly Thr

275 280 285

Ser Met Trp Ser His Gln Ser Met Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Thr Glu

290 295 300

Ala Ala Pro Arg Pro Met Ala Ala Leu Pro Glu Lys Gly Asn Asp Ser

305 310 315 320

Val Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala

325 330 335

Asp Asp Val Lys Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Met Ser Gly Leu

340 345 350

Phe Gly Ser Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr Asn

355 360 365

His Met Val

370

<210> 18

<211> 356

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 18

Met Gly Arg Ile Pro Cys Cys Glu Lys Asp Ser Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Glu Phe Thr Asp Thr Glu Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Ile Thr His Lys Ser

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Thr Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val Pro Asp Met Ser Ala Ile Ala Gly Gly Ser Gly Val Ala Ala Pro

180 185 190

Cys Gly Phe Pro Ala Pro Pro Gln Thr Asp Asp Thr Ile Glu Arg Ile

195 200 205

Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Glu Pro Ala Ala Pro Pro

210 215 220

Gly Lys Gln Glu Gln Pro Trp Ala Pro Ala Asp Leu Pro Glu Gly Leu

225 230 235 240

Pro Gly Met Tyr Ala Thr Tyr Asn Pro Ala Ser His Gly His Glu Glu

245 250 255

Phe Arg Tyr Asp Asn Gly Thr Val Pro Glu Tyr Val Leu Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ala Asp Gln Gly Thr Ser Met Trp Ser His Gln Ser Met Tyr

275 280 285

Ser Gly Ser Ser Ala Thr Glu Ala Ala Pro Arg Pro Ala Glu Val Leu

290 295 300

Pro Glu Lys Gly Asn Asp Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Gly Glu Glu

305 310 315 320

Ala Asp Asp Val Lys Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Met Ser Gly

325 330 335

Leu Phe Gly Ser Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr

340 345 350

Asn His Met Val

355

<210> 19

<211> 327

<212> PRT

<213> 杨树（Populus trichocarpa）

<400> 19

Met Gly Arg Ile Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Ser Ser Tyr Ile Ala Gln His

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Gln Phe Ser Asp Ala Glu Glu Gln Thr Ile Val Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Thr Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Pro

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Thr Pro Gln

130 135 140

Val Thr His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu Gln Leu Leu Thr Lys Lys Arg Ile Asp Phe Gln Leu Gln His Cys

165 170 175

Asn Thr Asn Val Ala Gln Gly Asn Thr Ser Ser Pro Cys Ile Ser Thr

180 185 190

Lys His Asp Glu Asn Asp Asp Thr Ile Glu Lys Ile Lys Leu Gly Leu

195 200 205

Ser Arg Ala Met Gln Glu Pro Gly Met Leu Pro Pro Asn Lys Ile Trp

210 215 220

Asp Ser Thr Gly Val Thr Ser Pro Asn Leu Ala Gly Thr Cys Cys Asp

225 230 235 240

Phe Pro Ser Ser Val Asn Ala Phe Leu Cys Cys Pro Ser Ser Phe Gly

245 250 255

Asn Glu Gly Ala Leu Ser Leu Trp Asn Gln Ser Met Cys Thr Gly Ser

260 265 270

Thr Cys Thr Thr Gly Asp Gln Gln Gly Arg Leu His Glu Met Leu Asp

275 280 285

Asn Glu Asn Gly Glu Glu Phe Glu Gly Gly Lys Glu Ile Arg Lys Val

290 295 300

Ser Ser Ile Phe Asn Thr Asp Cys Val Leu Trp Asp Met Pro Ser Asp

305 310 315 320

Asp Leu Met Asn Pro Ile Ile

325

<210> 20

<211> 327

<212> PRT

<213> 杨树（Populus trichocarpa）

<400> 20

Met Gly Arg Ile Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Ser Ser Tyr Ile Ala Gln His

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Gln Phe Ser Asp Ala Glu Glu His Thr Ile Val Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Arg Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Pro

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Thr Pro Gln

130 135 140

Val Ala Asn Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Ile Asp Phe Gln Leu Leu Gln Cys

165 170 175

Asn Thr Asn Gly Val Gln Gly Asn Thr Ser Ser Pro Tyr Thr Ala Thr

180 185 190

Lys His Asp Glu Asn Asp Asp Thr Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Phe

195 200 205

Ser Arg Ala Met Gln Glu Pro Gly Ile Leu Pro Pro Asn Lys Thr Trp

210 215 220

Asp Ser Thr Gly Ala Thr Ser Ala Asn Phe Ala Gly Thr Cys Ala Tyr

225 230 235 240

Phe Pro Ser Ser Val Asn Ala Phe Leu Cys Gly Pro Ser Ser Phe Gly

245 250 255

Asn Glu Val Ala Leu Ser Pro Trp Ser Gln Ser Met Cys Thr Gly Ser

260 265 270

Thr Cys Thr Ala Gly Asp Gln Gln Gly Arg Leu His Glu Lys Leu Asp

275 280 285

Asp Glu Asn Gly Glu Glu Ser Gln Gly Gly Lys Glu Ile Arg Asn Gly

290 295 300

Ser Ser Leu Phe Asn Thr Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Ser Asp

305 310 315 320

Asp Leu Met Asn Ser Ile Val

325

<210> 21

<211> 311

<212> PRT

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 21

Met Gly Arg Ile Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Ser Ser Tyr Ile Val Gln His

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Gln Phe Ser Asp Ser Glu Glu Gln Thr Ile Val Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Phe Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Pro

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Ala Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Val

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Pro Ile Asn Phe His Gln Gly Gln His

165 170 175

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Asn Asn Phe Thr Asp Tyr Val Asn Cys Lys

180 185 190

Pro Asp Glu Lys Asp Ala Thr Val Glu Lys Ile Lys Phe Asp Leu Ser

195 200 205

Lys Ala Ile Gln His Asp Pro Glu Ile Met Pro Ala Asn Lys Pro Trp

210 215 220

Asp Ser Asn Ala Thr Thr Ser Ala Asn Phe Ala Met Pro Tyr Gly Val

225 230 235 240

Phe Pro Thr Met Ser Gly Phe Gln Leu Ser Pro Val Ser Phe Ser Lys

245 250 255

Gly His Ala Ser Gln Trp Ser Gln Ser Val Cys Thr Gly Ser Thr Cys

260 265 270

Thr Ala Met Asp Gln Gln Ile Gln Leu His Glu Lys Leu Glu Ala Glu

275 280 285

Ile Gly Asp Asp Ser Glu Ala Thr Lys Glu Ile Arg Asn Leu Ser Asn

290 295 300

Ile Phe Ser Ser Asp Cys Val

305 310

<210> 22

<211> 326

<212> PRT

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 22

Met Gly Arg Ile Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Ser Ser Tyr Ile Ala Gln His

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Gln Phe Ser Asp Ser Glu Glu Gln Thr Ile Val Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Phe Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Pro

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Ala Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Val

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Pro Ile Asn Phe His Gln Gly Gln His

165 170 175

Ser Thr Ala Ala Leu Glu Asn Asn Phe Thr Asp Tyr Ile Asn Cys Lys

180 185 190

Pro Asp Glu Lys Asp Thr Ala Ile Glu Lys Ile Lys Phe Asp Leu Ser

195 200 205

Lys Ala Ile Gln His Glu Pro Glu Met Met Pro Ala Asn Lys Pro Trp

210 215 220

Asp Ser Asn Ala Thr Thr Ser Ala Asn Phe Val Met Pro Tyr Gly Val

225 230 235 240

Phe Pro Thr Met Pro Gly Phe Gln Phe Ser Pro Ala Thr Phe Gly Lys

245 250 255

Gly Asp Asp Ala Ser Pro Trp Ser Gln Ser Val Cys Thr Gly Ser Thr

260 265 270

Cys Thr Val Met Asp Gln Gln Ser Gln Leu His Glu Lys Leu Glu Asp

275 280 285

Glu Ile Gly Asp Asp Ser Glu Ala Thr Lys Glu Ile Arg Asn Leu Ser

290 295 300

Asn Ile Phe Asn Ser Asp Cys Val Val Trp Asp Leu Pro Thr Asp Asp

305 310 315 320

Leu Ile Asn Pro Met Val

325

<210> 23

<211> 368

<212> PRT

<213> 谷子（Setaria italica）

<400> 23

Met Gly Arg Val Pro Cys Cys Glu Lys Asp Asn Val Lys Arg Gly Gln

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Asn Lys Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr

20 25 30

Gly Thr Arg Asn Trp Arg Leu Ile Pro Lys Asn Ala Gly Leu Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys His Gly Glu Phe Thr Asp Ala Glu Glu Gln Thr Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu His Ser Val Val Gly Asn Arg Trp Ser Val Ile Ala Ala Gln Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Val Lys Asn His Trp Asn Thr Lys Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Gly Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ser

115 120 125

Phe Ser His Leu Met Ala Glu Ile Ala Thr Thr Leu Ala Pro Pro Gln

130 135 140

Val Ala His Leu Ala Glu Ala Ala Leu Gly Cys Phe Lys Asp Glu Met

145 150 155 160

Leu His Leu Leu Thr Lys Lys Arg Pro Thr Asp Phe Pro Ser Pro Ala

165 170 175

Val Pro Pro Asn Ile Ser Met Asp Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ile Gly

180 185 190

Ala Pro Cys Gly Phe Pro Ala Ala Pro Pro Gln Gln Ala Asp Asp Thr

195 200 205

Ile Glu Arg Ile Lys Leu Gly Leu Ser Arg Ala Ile Met Ser Glu Pro

210 215 220

Gly Ala Gly Ala Cys Ala Pro Thr Asp Lys Gln Gln Gln Gln Pro Trp

225 230 235 240

Ala Pro Ala Asp Met Pro Glu Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ala Ala Phe

245 250 255

Asn Pro Ala Ala His Gly Gln Asp Glu Phe Arg Tyr Asp Thr Gly Ala

260 265 270

Val Pro Asp Tyr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Asp Gln Gly

275 280 285

Thr Ser Met Trp Ser His Gln Ser Leu Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Thr

290 295 300

Asp Ala Ala Ala Arg Pro Ala Thr Ala Leu Pro Glu Lys Gly Asn Asp

305 310 315 320

Ser Val Gly Ser Ser Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala Asp Asn Val Lys

325 330 335

Asp Gly Gly Lys Gly Asp Gly Ser Asp Met Ser Gly Leu Phe Gly Ser

340 345 350

Asp Cys Val Leu Trp Asp Leu Pro Asp Glu Leu Thr Asn His Met Val

355 360 365

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

acggacaacg acgtgaagaa cc 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gcgagaagga cttgtgcgtg ac 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

gctatgtacg tcgccatcca 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

ggacagtgtg gctgacacca t 21

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

ccatgattac gaattcggta gctactacat gctcatgttc 40

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

ggccagtgcc aagcttgtgt ctgctgatga catggatg 38

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 30

agaaggacaa cgtgaagcgc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 31

agggatcgct catgatggcg 20

<210> 32

<211> 6388

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza　Sativa ssp.indica）

<400> 32

ggtagctact acatgctcat gttcgggcgc ggcgcagctg ttcctctcct tcataccgga 60

cttccacgac atggcgtggc tgtcggtcct cgccgcggtc atgtcgttct cctactcgtt 120

catcggcctc ggcctcggcc tcgccaacac aattggtact ctttgctttg gtttcagaat 180

ccaatctgtt catcctttga ggctttgagc tgctcagtcg tagtactagt gcatttacat 240

gttctgtgag actagatggt ctgataaatt ggttctgaac gatgcgcact gcaactaaac 300

atgtagtatg tgaacattga gattatgtaa agttgacaaa cctgttgctg ttcttcagct 360

aatggaacga tcaaaggaag cataacaggt gctccaacga gaacccctgt gcagaaggtc 420

tggcacgtct cgcaggccat cggcgacatc gcattcgcgt acccgtactc attaatcctc 480

ttggaaattc aggtgcacac ataggagtac atctcatcga tctgaaagtc tgaagcctga 540

agtacaacag tacagtcgct gacgaatttc ttccgttacg gtctgtgttt gtgcaggaca 600

cactgaaggc tccaccggcc gagaacaaga cgatgaagaa ggcgtccatc atctcgatcg 660

tcgtcaccac cttcttctac ctctgctgcg gctgcttcgg ctacgccgcc ttcgggagcg 720

acgcccctgg caacctcctc accggcttcg gcttctacga gccctactgg ctcatcgact 780

tcgccaacgc ctgcatcatc ctccacctgc tcggcggcta ccaggtacac agcaccaaga 840

aaccatttca gtgtgcactg atagaactga aaataatcct gaaacacaat cagtcactga 900

tcgacattgc cggatgatga tgaatgaaaa aaaacttggt ttgatcaggt gtacagccag 960

ccgatatacc agttcgcgga caggttcttc gcggagaggt acccggcgag ccggttcgtg 1020

aacgacttcc acacggtgaa gctgccgctg ctgccgccgt gtcgggtgaa cctcctgcgg 1080

gtgtgcttcc ggacggtgta cgtggcgagc accacggcgg tggcgctcgc cttcccctac 1140

ttcaacgagg tgctcgcgct gctcggcgcc ctcaacttct ggccgctcgc catctacttc 1200

cccgtggaga tgtacttcat ccagcgccat gtcccgcggt ggtcgccccg gtgggtcgtg 1260

ctgcagtcgt tcagcgtcct ctgcctcctc gtcagcgcct tcgcgctcgt cggctccatc 1320

cagggcctca tcagccagaa gctaggctaa agatttagcc tagcatcctg aatttcggat 1380

ttgctttttc tttgtgtaac cgtaatggga tgagaatgca tttggtggtc gtgtgttgtt 1440

tgtaacaact ggggagcgga gctttgtccc tggtgaatgg cgcgatgaac tcatgaacaa 1500

tagcatagtg gtggtggtac attgtgtctg caggggtcag agggtggtgg cactctgttt 1560

ttcagtgcct ttcctcctgt gctgcagaga aactgctcct atatatgtac agaatgtcgt 1620

catattattg ccatgatact tggaacggtg aaaggaacct gctcttgaat gatgtataaa 1680

tcagagagag aaaaaaagac tgctcagtac tgtgtttatc tatcagcttc gtagagctcg 1740

gtatgcatcg attaattggt ttcaggtcgc gttggcattg agcatgcgta agccatgtat 1800

ctgcgtggtt gattttactg aaatggtggg aaaagaacat gattcagggt gttcttggaa 1860

ctggcagccg ctggcctttg tgttcttgat gataaggata ggggaataaa atagcatcct 1920

catatcaaga gtgtaatcaa ctaatcatag tgctgcagcc catagaaata tgcattcccc 1980

ttgcttgtaa agatcctact aggataaaac tgtgtgcaga aatgaatcgt ttatctttga 2040

cagttttttt tttctttttg agtctatcct cctgaaccta aggctgtaaa tttgttcgga 2100

caaaggatca ttactcatag cctgctatgt tcacaaggtt ttatattact gaatagtggt 2160

gtttcatcaa gcagcattag tgaatagttg cagtggcaga gtggtgcagg gcgtcagtga 2220

gcgagatggc gaggcgagaa cgcgagcggc gccgggagcg cgcggggctt ggaccgtggc 2280

cgtgaggggg gttgacccgg cgctgcgcgg gtgggcaacc tgtcccgccc ccccgggggg 2340

aggctcacgc gttgcgcggg cgttgaattc tttatgccgc ccatgccgcc ttcgcccccc 2400

gtgcgcgcgc gcgcgcgccc actcgccggc gcggcagcgc gcgcgcgcgc gcgcgggcgg 2460

tcgcgaggcc gcgagcctat ttataacacg cggcgcggcc gtgtgagcgc cgcacgcacg 2520

cagcagcagc ggaatctcga cggcggcgac atcatggggc gggtgccgtg ctgcgagaag 2580

gacaacgtga agcgcgggca gtggacgccc gaggaggaca acaagctgct ctcctacatc 2640

acccagtacg gcacccgcaa ctggcgcctc atccccaaga acgccggtac gttggcgcgc 2700

gcgccgccac cggcgaacgc gtggttgcag cagcggcggc gctctgaccg gggtgtttgt 2760

tgctggaacg ttggcagggt tgcagcggtg cgggaagagc tgccggctgc ggtggaccaa 2820

ctacctccgg cccgacctca agcacggcga gttcaccgac gccgaggagc agaccatcat 2880

caagctccac tccgtcgtcg gcaacaggta ggcatcaacg agtggtctcg ctacaccgtc 2940

ttgtgatctt gggtcatttt tggaggaatg tattgagcaa tgcgggatgg ggctgtgtgt 3000

ggcaaggtgg tcggtgatcg cggcgcagct tccggggcgg acggacaacg acgtgaagaa 3060

ccactggaac acgaagctga agaagaagct gtccgggatg ggcatcgacc ccgtcacgca 3120

caagtccttc tcgcacctca tggccgagat cgccaccacg ctggcgccgc cgcaggtggc 3180

gcacctcgcc gaggccgcgc tggggtgctt caaggacgag atgctccacc tcctcaccaa 3240

gaagcgcccc tccgacttcc cctcgcccgc cgtgcacgac ggcgccggcg ccggcgccag 3300

cgcgtccgcg ctcgccgcgc cctgtttccc cgccgcgccg ccgcaccacc cgcaggccga 3360

cgacaccatc gagcgcatca agctcggcct gtcccgcgcc atcatgagcg atccctccac 3420

cgcctccgcc gccgccgccg ccgccgcgcc ctccgccccc gcggaggaca agccgtggcc 3480

gcccggcgac atgtccgagg ggctcgccgg gatgtacgcc acgtacaacc cggcggcgca 3540

cgcgcacgcg caggcccagg ccgagttccg gtacgacggg gcctccgcgg cgcagggcta 3600

cgtcctcggc ggcgacggcg accagggcac gtcgatgtgg agccaccaga gcctgtacag 3660

cgggagctcc ggcaccgagg aggccaggcg ggagttgccg gagaagggca acgacagcgt 3720

cggcagcagc ggcggcgacg acgacgccgc ggacgacggc aaggacagcg ggaagggggc 3780

agcctccgac atgtcgggcc tgttcgcctc cgactgcgtg ctctgggact tgcccgacga 3840

gctcacgaat cacatggtgt agctaagcta taaaacgcgg gaaaacttag cacggcgaag 3900

cacgccatga tccacatcac ttgcagttgc aggtggtgag aattggatag agcgaaaaat 3960

tgctaccaat aatattgctg aaagagtgac agaaaaagtg aaaaactata gtatgtagct 4020

ggcaagaaaa atggggattc tttttgcttg gaaaagagaa aaaaaagtga gatgtgaata 4080

gttttaccga gaagcactga ttgattgagt gattgagccg gaggccaagg tatttttcca 4140

gtcctctgct tcagtcgcac tccatgagca atggataatt caattcagtt cagacagatt 4200

gtttacttct tccatggatc atattgtctg atgatgaggt tgatgggaaa acgtcaatat 4260

gcaactctag catgttatat aaatggtcat gaaaattcag agaaaaaaaa atctataaca 4320

acgctgcacc caaaaagatt gtgtgctgtc taaacttcag aaaatcatgt gaaatttctg 4380

aattttaacc atgagttgca caactgtacc aaagaaggct agaacccaga aataaaacct 4440

gtggatctga cattttgata gattatagaa ctgtagatca atattctcag ttaagactcc 4500

acgagaacac gaagttacat caaatggtgt tatgtgtttg catcagtaaa gaaatttgtt 4560

gtttgataca gcaaaagtag cagtggtata aaaatcatga atgcaactat tgatgtccat 4620

ataggatcta tttgatctaa caggctgaat actcagtatt accatgttag caattcccag 4680

tgctaaaata aatgccatct accttatcaa cctcgcggta gctggtatta cagtattaat 4740

gatgccacat ttcccaccta taaattggca tgaaaacaaa ctgttccgtt cagtccagac 4800

tgaaccacca atcagtagcc gtggaacacc aatacaagcg gcgtcaaatt aaagtgaggg 4860

attgtcatca aggaggttag gctaatggtt tcacggaaga caagaaaacc gttttcagat 4920

tctcatcctc ccatactagc ttgttccacc atgtctgtgt acactggagt tctttcaggc 4980

atcctgccac aagattaagc ttcttaagcc tgctgcatct gactactttg aggctcgcca 5040

agcttgggaa attcactgct atggattcag ggcctatgct tctcatgttt ggcaagtcgt 5100

gcaactctaa ctccttgagg cttggaaaga ccgtctccgc aggcgatcca tggctcaatc 5160

cttctgtgtc gtaggatata agatgctcaa gaacactgca ggatgaaatg ctcaaggagg 5220

ataaatactc caggctgcca ccctgccaaa caatcttggc ctttgggagc ttgcgaagga 5280

tgatactttg gagagaaggc agcaggggta ccagcttgcg gcaatccatg tccaatgact 5340

ggctagtctg tggacgatac acgctgtcaa cgtccaaagg cttatcgggc accctgtaac 5400

gcatcatgct gacagtccga tcaagtgacc atggttgctc gcccttgtat tcacctccgg 5460

taataatgac attctccagg ttgcagcagc cactgatgat gatgcccttc aatctgctca 5520

tgtgcctcca gaggctggaa ggcgaaaact ggatgctcgg caagtcgctg cagtcctgga 5580

catgcaaatt ccgcaagtgc tctgcgagat gaggagactg cgagagcttc tccagagagt 5640

ggagcgtttg cacggatatg tcaagcatct gcaagctttt caggctctcg agttcgcgca 5700

ggttgacgcg ttgccggagg tcgtgccgcc ttcgttttct tgagtcaccg gactcaggct 5760

cacagcttcc gacgtccatc caactgctcc agcagtggtc catgcacagg acctgcagcg 5820

ccgtgagcgg gtttagcacg ccggcggcaa tggtttggac gggcacattg gacagcaaca 5880

agaatcgcaa gttcaccagg gctcctattc cagcgggcaa ggaccggata gtcgtgttgt 5940

tgagacgaag gtactgcagg gtgacaagga ggttgatctc ggagggcaat gcggtgatca 6000

gcgtgtccga taggtccagc aacctgagac aaggcatgaa gctgaagaag tcgtggcata 6060

tcctccccag cagccggttg ctctggagca gcaacgtttt cagaacagag cacgtcggtg 6120

catcattcag ctcgttgatg ccagtccgca tcagtgacac cctctcagcg cctgtccatt 6180

tatccgcccg tggcgcggcg cttgtcacaa gacctgctcg gactagccac ttgttgtcaa 6240

tcctgccgca atctgcaacc acccacaagg ccatggctcg caccatggga tgcatggtga 6300

catggtagtc accggctgct tccagcagag aggaggtcac taggatacca agcatgtagt 6360

ggcctttgtt gtagagatca tccatgtc 6388

Claims

1.一种调控植物育性的方法，通过调控育性相关基因的表达进而调控该植株的育性，其特征在于，所述育性相关基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、3、6、7、11、13、17、18或19所示。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的育性相关基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

1、2、4、5、9、10、12、14、15或32；

在严格条件下能够与（a）中任一所述序列的DNA杂交的DNA序列；或

与（a）-（b）之任一所述序列互补的DNA序列。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过突变育性调控基因SEQ ID NO: 1、2、4、5、9、10、12、14、15或32获得雄性不育材料。

4.权利要求3所述的方法，其中所述的突变包括在育性调控基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。

5.权利要求1-4之任一所述的方法，其特征在于还包括用权利要求1所述的DNA序列恢复由相应的SEQ ID NO: 1、2、4、5、9、10、12、14、15或32所示基因突变所导致的雄性不育，使雄性不育突变体恢复成可育。

6.一种获得雄性不育突变体材料的方法，所述突变体材料通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入等，影响植株体内的育性相关基因的表达，其特征在于所述育性相关基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、3、6、7、11、13、17、18或19所示。

7.权利要求6所述的方法，其中所述的育性相关基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1、2、4、5、9、10、12、14、15或32所示。

8.权利要求6或7所述的方法，其中所述的突变包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，还可以是通过RNAi、基因定点突变等手段产生，基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等基因编辑方法。

9.权利要求8所述的方法，其中所述的突变后的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

10.权利要求6-9之任一所述方法所获得的雄性不育突变体在育种中的应用。

11.权利要求10所述的应用，其中所述的育种是指将突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。

12.一种核雄性不育系的繁殖方法，所述方法包括：

（a）提供一种核雄性不育系作为第一植株，所述核雄性不育系的雄性不育性状由5763基因突变导致；

（b）往上述第一植株中转入下述构建体形成第二植株，所述构建体包含：

i）育性恢复基因表达盒，其包含5763基因的基因组DNA序列，当其在上述核雄性不育系中表达时可以恢复所述植株的雄性生育力；

ii）花粉失活基因表达盒，当其表达时，可以抑制所转入植株的可育雄性配子的形成或功能；以及

（c）用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，使第一植株的核雄性不育系得到繁殖；或是使第二植株自花授粉，按1:1的比例繁殖出雄性不育的第一植株和作为保持系的第二植株。