CN114685639A - 一种蛋白及其在影响植株雄性生育力中的用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋白和其突变体以及它们的用途。本申请还涉及编码它们的核酸分子，以及包含所述核酸分子的载体、宿主细胞和植株或植株种子。影响编码所述蛋白的表达(例如，改变编码所述蛋白的核苷酸序列，使所述蛋白降低表达或不表达)，能够使植株表现为雄性不育。

Description

一种蛋白及其在影响植株雄性生育力中的用途

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋白和其突变体以及它们的用途。本申请还涉及编码所述蛋白和其突变体的核酸分子，以及包含所述核酸分子的载体、宿主细胞和植株或植株种子。

背景技术

雄性不育技术在作物不育系创制和杂种优势利用中具有重要的应用价值。玉米细胞核不育(maize male sterility)是指在玉米进行有性生殖的过程中，其雄花发育异常，不能产生具有正常生殖功能的配子体，导致花粉败育，花药不开裂。但玉米雌配子体发育正常，能够受精结实的遗传现象。

玉米(Zea mays)是雌雄同株异花授粉作物，其杂种优势的利用是我国粮食增产的主要动力。杂种优势是指两个亲本组合，其杂交后代在一种或多种性状上优与双亲的现象。利用雄性不育材料培育高产杂交种是国际玉米育种主要趋势。玉米雄性不育在自然界中可以分为细胞质雄性不育和细胞核雄性不育。细胞质雄性不育主要应用于三系配套(不育系、保持系和恢复系)生产杂交种，包括T型、C型和S型三种类型。T型细胞质雄性不育易被T小种侵染，诱发小斑病，在实际生产中已被淘汰。C型细胞质雄性不育由于恢复系创制困难，生产上很难被利用。S型不育系，其育性受环境影响较大，育性不稳定，利用价值较小。细胞核雄性不育是由细胞核基因突变导致的花粉完全败育的现象。分为显性核不育和隐性核不育，目前研究表明，细胞核雄性不育主要由隐性核基因控制。细胞核雄性不育克服了细胞质不育的缺点，具有以下优点。一是细胞核雄性不育由于只受核基因控制，遗传特性简单，利于进行遗传转育。二是不受恢复系的限制，任何自交系都可以作为恢复系，具有广谱性。三是核不育具有完全正常的细胞质，避免病原菌对特定细胞质进行侵染。四是核不育育性稳定，不育彻底。但核不育材料在使用中，难以找到相应的保持系，不易维持和大量生产不育系种子，难以进行商业化利用。杜邦先锋首次利用核不育基因开发了一种新型“玉米基因工程不育制种技术”(Seed Production Technology，SPT)，利用转基因技术生产非转基因种子。该技术主要将不育恢复基因、花粉败育基因和荧光蛋白基因组合在一起，构建遗传转化载体，转化到玉米隐性核不育系中，恢复其育性，并可以大量繁殖。SPT技术的开发，为细胞核雄性不育在杂种优势的利用提供了技术支持。

花药主要由四层细胞组成：表皮、内层、中间层以及绒毡层组成，绒毡层内侧包含许多凸起的颗粒状物质即乌氏体。在配子体发育过程中，绒毡层通过分泌大量的营养物质供给雄配子体的发育，而乌氏体则通过分泌孢粉素，作为花粉外壁的合成原料。研究表明绒毡层、乌氏体以及花粉外壁的发育异常，可以引起雄性不育。克隆并解析细胞核雄性不育基因对杂种优势的利用具有重要的意义。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，提供了一种新的蛋白及其突变体，以及编码所述蛋白和其突变体的核酸分子。这些序列对于植株雄性生育力非常关键，通过影响所述蛋白或编码其的基因的表达，能够使植株表现为雄性不育。

所述基因是通过调控植物花药绒毡层、乌氏体以及花粉外壁的发育，影响植物雄穗的育性。本发明所述基因是花粉特异表达的基因，该基因的功能缺失，造成雄穗完全败育。

因此，在第一方面，本申请提供了一种蛋白，其具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在第二方面，本申请提供了如前所述的蛋白的突变体，所述突变体包含：

(1)与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或者，

(2)与SEQ ID NO:3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在某些实施方案中，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3所示的序列的第120位位置上具有突变。

在某些实施方案中，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3所示的序列的第120位位置上的氨基酸突变为K。

在某些实施方案中，所述突变体具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

本领域技术人员可以理解，在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列基础上经过1个至几个氨基酸的置换、缺失或添加后，能够影响该氨基酸的功能，以影响植物雄穗或花粉发育的活性。

在某些实施方案中，所述置换为保守置换。

在第三方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1的蛋白或权利要求2的突变体的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有DRP1-W基因的DNA序列，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有DRP1-W基因的cDNA序列，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有DRP1-M基因的DNA序列，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有DRP1-M基因的cDNA序列，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

本领域技术人员可以理解，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列基础上，经过1至几个碱基的置换、缺失或添加形成的新的序列，能够影响植物花粉发育，SEQ ID NO:2所示的序列的异常能够导致植物雄穗发育异常。

在第四方面，本申请提供了一种载体，其包含如前所述的核酸分子。

在第五方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含如前所述的核酸分子或如前所述的载体。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是农杆菌细胞。在此类实施方案中，所述农杆菌细胞能够侵染植株的细胞或分生组织，以将农杆菌细胞含有的如前所述的核酸分子或如前所述的载体转化入植株细胞中。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是植株细胞。

在某些实施方案中，所述宿主细胞选自玉米细胞，高粱细胞，小麦细胞，短柄草细胞，大麦细胞或水稻细胞。

在第五方面，本申请提供了一种植株或植株种子，所述植株或植株种子在基因组中包含如前所述的核酸分子。

在某些实施方案中，所述植株或植株种子在基因组中包含：如SEQ ID NO:5所示的纯合的隐性基因，且所述植株或植株种子为雄性不育。

在某些实施方案中，所述植株或植株种子在基因组中包含：如SEQ ID NO:2所示的纯合的显性基因，且所述植株或植株种子为雄性能育。

在某些实施方案中，所述植株或植株种子在基因组中包含：如SEQ ID NO:2和SEQID NO:5所示的杂合基因，且所述植株或植株种子为雄性能育。

在某些实施方案中，所述植株选自玉米，高粱，小麦，短柄草，大麦或水稻。

在第六方面，本申请提供了一种获得植株的方法，所述方法包括：(1)将如前所述的核酸分子或如前所述的载体导入植株细胞，以及，(2)将所述植株细胞培养成植株。

在某些实施方案中，在步骤(1)中，使用农杆菌将所述核酸分子或载体导入植株细胞。在此类实施方案中，所述农杆菌能够侵染植株的细胞或分生组织，以将农杆菌含有的如前所述的核酸分子或如前所述的载体转化入植株细胞中。

在第七方面，本申请提供了一种获得雄性不育植株或植株种子的方法，所述方法包括影响植株或植株种子基因组中如前所述的核酸分子或其片段的表达。

在某些实施方案中，所述核酸分子或其片段的表达通过选自下列的方法而被影响：改变所述核酸分子或其片段的核苷酸序列(例如，使所述核酸分子或其片段的序列具有一个或几个核苷酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个核苷酸的置换、缺失或添加))，诱变，共抑制，引入编码发夹结构形成的序列。

在某些实施方案中，影响植株或植株种子基因组中如SEQ ID NO:2所示的核酸分子或其片段的表达，以获得雄性不育植株或植株种子。

在某些实施方案中，使如SEQ ID NO:2所示的核酸分子的序列具有一个核苷酸的置换，以获得雄性不育植株或植株种子。

在某些实施方案中，使如SEQ ID NO:2所示的核酸分子的核苷酸序列的第358位核苷酸置换为核苷酸A，获得雄性不育植株或植株种子。

在某些实施方案中，所述雄性不育植株或植株种子的基因组中具有如SEQ ID NO:5所示的纯合的隐性基因。

在某些实施方案中，所述植株选自玉米，高粱，小麦，短柄草，大麦或水稻。

在某些实施方案中，所述置换为保守置换。

在第八方面，本申请提供了一种获得杂交种子或植株的方法，所述方法包括：将通过如前所述的方法获得的植株作为母本，与作为父本的雄性能育植株杂交，收获杂交种子或植株。

在某些实施方案中，所述方法包括：将通过如前所述的方法获得的雄性不育植株作为母本，用来自作为父本的雄性能育植株的花粉异化授粉所述雄性不育植株，收获来自所述雄性不育植株的种子F1。

在第九方面，本申请提供了一种获得具有父本遗传背景的雄性不育种子或植株的方法，所述方法包括：

(1)筛选如前所述的获得的植株中具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株；

(2)将所述植株作为母本，与作为父本的所述雄性能育植株回交，以收获后代种子或植株；

(3)筛选步骤(2)中获得的后代植株中具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株，并将所述植株进行自交，以获得具有父本遗传背景的雄性不育种子或植株。

在某些实施方案中，在步骤(2)完成之后，筛选步骤(2)中获得的后代植株中具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株，继续与作为父本的所述雄性能育植株回交2-10次(例如，2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次，10次)。

在某些实施方案中，通过PCR扩增，以筛选出具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株。

在第十方面，本申请提供了一种如前所述的蛋白或如前所述的核酸分子或如前所述的载体或如前所述的宿主细胞或如前所述的植株在恢复植株雄性生育力或者产生雄性能育植株中的用途。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在某些实施方案中，如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸分子的序列改变，会缺失造成花粉绒毡层、乌氏体和花粉外壁的发育缺陷，最终引起花粉完全败育。

在第十一方面，本申请提供了一种如前所述的突变体或如前所述的核酸分子或如前所述的载体或如前所述的宿主细胞或如前所述的植株在使植株丧失雄性生育力或产生雄性不育植株中的用途。

在某些实施方案中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

在第十二方面，本申请提供了一种获得雄性可育植株或植株种子的方法，所述方法包括将如前所述的核酸分子或载体或宿主细胞转化入植株中，使所述植株的基因组中表达如前所述的核酸分子

在某些实施方案中，所述植株选自玉米，高粱，小麦，短柄草，大麦或水稻。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“野生型”用于描述植株时，其表示该植株在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何改造(例如，突变，修饰)或加工。

如本文中所使用的，术语“drp1”或“突变体drp1”或“drp1突变体”是指突变体植株，所述突变体植株表现为雄性不育。其中，drp1(desiccation-related protein 1)是指脱水(干燥)相关的蛋白。

如本文中所使用的，术语“DRP1-M”是指雄性不育基因，在多数情况下，控制雄性不育的基因为隐性基因，其仅在纯合时，植株才会表现为雄性不育。在某些实施方案中，当所述DRP1-M基因在植株中为纯和(例如，DRP1-M/DRP1-M)时，所述植株表现为雄性不育。在某些实施方案中，当所述DRP1-M基因在植株中为杂合(例如，DRP1-W/DRP1-M)时，所述植株表现为雄性可育。

如本文中所使用的，术语“DRP1-W”是指雄性可育基因，当植株中含有的所述雄性可育基因的序列发生改变，影响了该基因的表达，则植株表现为雄性不育。在某些实施方案中，DRP1-W与DRP1-M是等位基因。在某些实施方案中，当所述DRP1-W基因在植株中为纯和(例如，DRP1-W/DRP1-W)时，所述植株表现为雄性可育。在某些实施方案中，当所述DRP1-W基因在植株中为杂合(例如，DRP1-W/DRP1-M)时，所述植株表现为雄性可育。

如本文中所使用的，术语“雄性不育”是指植株的雄性细胞或组织丧失生理机能的现象。通常，在有性繁殖的植株中(例如，玉米)，雄性不育表现为雄性组织(例如，雄蕊)发育不正常，不能产生有正常功能的花粉，但雌性组织(例如，雌蕊)发育正常，能接受正常花粉而受精结实。

如本文中所使用的，当表述“对应于SEQ ID NO:3所示的序列的第120位位置上”是指，SEQ ID NO：3所示的蛋白的第120位氨基酸残基。本领域技术人员理解，不同的野生型植株(例如，玉米，水稻，小麦，大麦)中的DRP1蛋白可具有多种版本，它们具有基本上相同的一级结构(即，氨基酸序列)和高级结构(即，空间结构)，以及基本上相同的生物学功能，但是它们彼此之间在氨基酸序列上仍然可以存在微小差异。因此，在本申请中，野生型植株中的DRP1蛋白并不局限于SEQ ID NO：3所示的蛋白，而意欲涵盖所有已知的野生型植株中的DRP1蛋白。

进一步的，当描述野生型植株中的DRP1蛋白的氨基酸位置时，其不仅包括SEQ IDNO：3中的特定氨基酸位置，还包括其天然变体中与所述特定氨基酸位置对应的氨基酸位置。根据本申请，表述“相应氨基酸位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的氨基酸位置。类似地，表述“对应于SEQ ID NO:3所示的序列的第120位位置上”是指，当对某一序列与SEQ ID NO:3进行最优比对时，即当某一序列与SEQ ID NO:3进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的该序列中位于与SEQ ID NO:3的第120位等同位置的氨基酸位置。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

如本文中所使用的，术语“分离的”是指经人工手段获得的状态，其不同于天然状态。例如，对于某一种从自然界“分离”的物质或成分，可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“杂交”是指通过不同的父本植株与母本植株产生后代，再通过对后代进行筛选，以获得具有父本和/或母本性状的育种方法。

如本文中所使用的，术语“回交”是指杂交获得的子一代和两个亲本的任意一个(父本或母本)进行杂交的一种方法。在遗传学研究中，常利用回交的方法来加强杂种个体的性状表现，特别是与隐性亲本的回交。

如本文中所使用的，术语“自交”是指来自同一个体的雌雄配子的结合或具有相同基因型个体间的交配或来自同一无性繁殖系的个体间的交配。

发明的有益效果

本申请提供了一种新的蛋白及其突变体，以及编码它们的核酸分子，这些序列能够影响植株雄性生育力。具体来说，影响编码所述蛋白的表达(例如，改变编码所述蛋白的核苷酸序列，使所述蛋白降低表达或不表达)，能够使植株表现为雄性不育。

进一步的，通过上述方法获得雄性不育植株，再利用本申请的方法能够进一步制备具有父本遗传背景的雄性不育系。因此，本申请在作物杂种优势的利用以及不育化杂交种生产中具有重要的应用价值

杂种优势是提高作物单位面积产量和改善作物品质最有效的方式。玉米是杂种优势利用最早，并在世界范围内普及推广取得最有成效的作物。雄性不育的运用不仅使大规模生产杂交种成为可能，而且可以降低劳动成本、提高种子纯度和育种效率。

与现有技术相比，本发明提供的玉米雄性不育调控基因DRP1直接参与小孢子形成早期的花药发育调控，该基因的功能丧失后，花药绒毡层细胞发育异常。乌氏体后期体积膨胀、稠密且大小形态不均。花粉外壁龟裂，过度积累细胞壁物质。最终导致小孢子发育后期的细胞凋亡和雄穗完全不育的现象。通过转基因技术，本发明在作物杂种优势的利用以及不育化杂交种生产中具有重要的应用价值。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了是玉米野生型植株(WT)和突变体植株(drp1)表型分析的结果图，左边为野生型，右边为突变体。

图2显示了玉米野生型(WT)和突变体(drp1)雄穗、花药表型，其中，图2A为野生型成熟期雄穗，表现为完全可育；图2B为突变体雄穗成熟期，表现为花药不开裂，不散粉，完全不育；图2C为去掉外稃和內浮的野生型花药；图2D为去掉外稃和內浮的突变体花药；对比发现，突变体花药相比野生型，花药长度变小，稍微有皱缩的现象。图2E为用碘碘化钾试剂对野生型花粉进行染色，野生型花粉被染成黑色，表明具有花粉活力；图2F为用碘碘化钾试剂对突变体花粉进行染色，突变体花粉不能被染色，表明花粉不育。

图3显示了玉米野生型(WT)和突变体(drp1)的扫描电镜观察结果，其中，图3A显示了野生型花药外壁的观察结果，发现其三维针织状结构排布整齐，规则；图3B显示了突变体花药外壁观察结果，和野生型相比，突变体外壁凹陷，三维针织状结构排列不规则；图3C显示了野生型绒毡层内壁光滑，乌氏体均匀分布，大小均一；图3D显示了突变体绒毡层表面粗糙，乌氏体体积变大，大小不均一；图3E显示了野生型可育的花粉粒；图3F显示了突变体花粉粒，和野生型相比，突变体花粉外壁龟裂，花粉塌陷，完全不育。

图4显示了利用BSA的方法对DRP1-M进行定位分析结果，利用BSA结合DNA二代测序的方法，将DRP1-M定位在6号染色体上1.27Mb的区间。图4A显示了利用BSA结合DNA二代测序的方法对突变体进行定位，发现在6号染色体上存在一个显著的peak，将DRP1-M定位在1.27Mb的区间内；图4B显示了A图6号染色体的放大图；图4C显示了在该区间内包含11个基因。

图5显示了定位区间内基因表达分析结果，其中，6号染色1.27Mb的区间内包含11个基因，通过Maize GDB(www.maizegdb.org/)对其表达量分析发现，只有DRP1-M在花药中表达，所以将DRP1-M确定为候选基因。

图6显示了DRP1-W在不同的物种中同源性的比较结果，各物种序列来源于NCBI；其中，XP_021302465.1高粱中DRP1-W的同源性序列。XP_044439785.1小麦中DRP1-W的同源性序列。XP_014754384.1短柄草DRP1-W的同源性序列。XP_044965196.1大麦中DRP1-W的同源性序列。KAF2929193.1水稻中DRP1-W的同源性序列。不同序列比对说明DRP1-W在不同物种中同源性较高。

图7显示了利用qPCR分析DRP1-W在不同的组织中的表达模式结果。对B73自交系70天的根、茎、叶、雌穗、雄穗、1-1.5mm的花药、1.5-2mm的花药、2-2.5mm的花药、2.3-3mm花药以及大于3mm的花药进行表达量分析，发现DRP1-W只在花药中表达，且在2-2.5mm的花药中表达量最高。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.玉米雄性不育突变体drp1的获得

本专利申请人利用EMS技术诱变常规自交系郑58，得到玉米雄性不育突变体drp1，drp1突变体表现为完全败育。具体诱变方法如下：a)母液配制：在通风橱内制备诱变剂，EMS：液体石蜡(比例：1:100)配制，搅拌过夜。将母液稀释15倍即为工作液(工作液新鲜配置)。b)选择生长良好的植株，在其雌穗开始吐丝之时，将其剪掉，待明日只用。c)第二天收集新鲜的花粉浸泡在新鲜配制的诱变工作液中45min，10min搅拌一次。d)将新鲜配制的带有花粉的诱变工作液，用毛笔蘸在花丝上。套小袋。e)将得到的诱变种子，种植后观察表型。

实施例2.玉米雄性不育突变体drp1的表型鉴定

与正常的野生型郑58(WT)相比，drp1突变体在营养生长阶段完全正常(图1)，成熟的雄穗花药不开裂，表现为完全不育(图2A，2B)。取成熟的雄穗小花，去掉外稃内稃后，对花药进行拍照，发现drp1突变体在花药发育后期表现为花药长度变小(图2C，2D)。在喇叭口时期，用刀片划开玉米胞叶，取出小花，用FAA试剂(冰乙酸5ml+37％甲醛10ml+无水乙醇50ml+水35ml)进行固定，利用碘-碘化钾溶液(0.03％碘+0.06％碘化钾)分别对野生型和突变体花粉进行染色。结果显示野生型呈现黑色圆形具有活力的花粉颗粒，而突变体不能被染色，说明突变体花粉粒后期没有填充淀粉，表现为花粉粒空瘪，花粉外壁龟裂，完全败育(图2E，2F)。

取成熟的野生型和突变体花药用2.5％的戊二醛固定，利用扫面电镜进行观察发现，突变体花药外壁凹陷，针织状的角质层发育异常(图3A，3B)。野生型乌氏体排列规则，大小均一，而突变体乌氏体体积变大、稠密、大小形态各异(图3C，3D)，野生型花粉外壁光滑，而突变体花粉外壁龟裂，花粉粒空瘪，细胞核和细胞质等物质完全降解，从而导致drp1突变体完全不育(图3E，3F)。

其中，扫描电镜的观察方法如下：扫面电镜：1：样品固定在戊二醛溶液(2.5％)中，真空泵抽气30min。2：二甲砷酸钠洗涤2到3次，每次8到10分钟。3：:使用1.2％的四氧化锇(OsO4)固定1到1.5小时。4：二甲砷酸钠洗涤3到4次。5：30％、50％、70％、80％、90％、100％酒精进行梯度脱水。6：乙酸异戊酯置换1到2次。7：用双面胶粘在铜片上，表面喷金，即可放在扫描点进行观察。

实施例3.DRP1-M基因的克隆

以郑58为背景的drp1突变体为母本，郑58为父本，进行杂交，形成F1代植株。2017年在北京中国农业大学上庄试验站进行种植，可育植株和不育植株符合3:1的分离比例(χ²＝1.1<χ² _0.05＝3.84)，表明该突变体的不育性状是由一对主效单基因控制的，属于隐性遗传。为进一步克隆该基因，利用BSA-seq(bulked-segregantanalysis sequencing)的方法进行快速的定位。选取30株可育的野生型构建可育混合池和30株表现为雄性不育的单株构建不育混池，并构建DNA文库，进行高深度的测序，利用Δ(SNP-index)方法进行关联分析。将DRP1-M定位在6号染色体1.27-Mb的物理区间内(图4A-C)。

本实例中涉及到的方法如下：一、DNA的提取：1)将花药放入2ml的离心管中。2)加入钢珠并盖紧盖子，并编号。3)将离心管放入液氮，取出后立刻放入磨样机磨成粉末。4)加入800μl CTAB裂解液至离心管，迅速摇晃均匀。5)放置在65℃的烘箱中孵育30min，期间每隔10min上下颠倒混匀1次。6)取出后代冷却至室温后，加入800μl的氯仿：异戊醇(24:1)，手动缓慢抽提10min至30分钟，直至管底呈墨绿色。7)抽提结束后，将离心管放置于离心机中，转速12,000rpm，离心10min。8)取出离心管，缓慢小心吸取上清600μl至新的1.5ml离心管中(注意不要吸到杂质)，加入等体积的放入-20度预冷过的异丙醇，缓慢上下颠倒混匀后静置10min；可见白色絮状沉淀，即为DNA。

二、DNA文库的构建：方法如下(使用诺唯赞DNA文库构建试剂盒，按照说明进行操作)：1)DNA片段化：利用超声波将DNA打断成200-300bp的片段。取适量的DNA，加入90μL提前取出至室温的VAHTSTM DNA Clean Beads,混匀后室温静置10min。2)将离心管置于磁力架上5min,小心去除上清。3)加入200μL 80％乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。4)重复上一步,之后开盖干燥磁珠10min。5)将离心管从磁力架上取下,加入32.5μL的Nuclear free水,用移液器吹打混匀,静置2min后,再次放于磁力架上静置5min。6)取30μL上清,加入20μL End Prep Mix,混匀后在PCR仪中30℃反应30min。7)取出离心管,加入80μL(1.6×)提前取出至室温的VAHTSTM DNA Clean Beads,混匀后室温静置10min。8)将离心管置于磁力架上5min,小心去除上清。9)加入200μL 80％乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。10)重复上一步,之后开盖干燥磁珠10min。11)将离心管从磁力架上取下,加入20μL的Nuclear free水,用移液器吹打混匀,静置2min后,再次放于磁力架上静置5min。12)待溶液澄清后,小心吸取17.5μL上清至一个新的Nuclease free离心管中,加入10μL dA-Tailing Buffer Mix和2.5μL dA-Tailing Enzyme Mix,混匀。13)在PCR仪中按37℃30min,70℃5min进行反应。14)取出,加入2.5μL Ligation Mix和2.5μL RNA Adapter,混匀。15)在PCR仪中30℃反应10min,取出加入5μL Stop Ligation Mix以终止反应。16)取出离心管,加入40μL(1×)提前取出至室温的VAHTSTM DNA Clean Beads,混匀后室温静置10min。17)将离心管置于磁力架上5min,小心去除上清。18)保持离心管始终处于磁力架上,加入200μL80％乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。19)重复上一步,之后开盖干燥磁珠10min。20)将离心管从磁力架上取下,加入52.5μL的Nuclear free水,用移液器吹打混匀,静置2min后,再次放于磁力架上静置5min。21)待溶液澄清后,小心吸取50μL上清至一个新的Nuclease free离心管中,加入35μL(0.6×)提前取出至室温的VAHTSTM DNA CleanBeads,混匀后室温静置10min。22)将离心管置于磁力架上5min,待溶液澄清后,吸取80μL上清至一个新的Nuclease free离心管中。23)加入5μL(0.1×)VAHTSTM DNA Clean Beads,混匀后室温静置10min。24)将离心管置于磁力架上5min,小心去除上清。25)保持离心管始终处于磁力架上,加入200μL 80％乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。26)重复上一步,之后在磁力架上开盖干燥磁珠5min。27)将离心管取下磁力架,加入22.5μL Nuclearfree水,用移液器吹打混匀,室温孵育2min。28)将离心管放于磁力架上静置5min,待溶液澄清后,吸取20μL上清到新的Nuclease free离心管中。29)加入5μL PCR Primer Mix和25μLAmplification Mix 1,混匀。将离心管放入PCR仪中,按表2中的程序进行反应。

表2.PCR程序

30)将样品从PCR仪中取出,加入50μL(1×)提前取出至室温的VAHTSTM DNA CleanBeads,混匀后室温静置10min。31)将离心管置于磁力架上静置5min,之后在磁力架上移除上清。32)加入200μL80％乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。33)重复上一步,之后在磁力架上开盖干燥磁珠10min。34)将离心管从磁力架中取出,加入25μL Nuclear free水,用移液器吹打混匀,室温孵育2min。35)将离心管放于磁力架上静置5min,待溶液澄清后,吸取22.5μL上清到新的Nuclease free离心管中。36)取1μL纯化后的PCR产物,通过琼脂糖凝胶电泳检测文库质量,余下的样品放于-20℃保存。

将准备好的文库在北京贝瑞和康公司的Illumina Hiseq2500测序平台,采用100bp双末端方式进行上机测序,每个文库测序数据量为20Gb。

实施例4.DRP1-M基因以及编码的氨基酸序列的获得与分析由上述获得的测序数据，根据Maize GDB(https://www.maizegdb.org/)上B73的基因组注释信息，在1.27-Mb的范围内共包含11个预测的编码基因，经过在Maize GDB上对11预测的基因进行表达量分析，发现只有一个编码干燥脱水蛋白的基因Zm00001d035791在花粉中特异表达(图5)，其余基因在花粉中不表达。所以将Zm00001d035791确定为雄性不育基因，命名为DRP1-M。根据Maize GDB上对DRP1的序列信息，该基因的序列全长为2199bp，利用该序列在Maize GDB数据库中进行blast分析，发现该基因在玉米基因组上只有一个拷贝，表明该基因为单拷贝基因。利用DRP1-M的基因组序列和cDNA序列进行比对分析，发现DRP1-M基因组序列结构如下：该基因由2199个核苷酸组成(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)，-600至-1是该基因的5'非翻译区(Untranslated Regions)即5'-UTR。0至998为基因编码区，该基因只含有一个外显子。999至1598为该基因的3'非翻译区即3'-UTR。该基因的cDNA包含1160核苷酸，-600至-1是该基因的5'非翻译区即5'-UTR。0至998为基因编码区，基因编码区的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。对DRP1-M的转录本进行模拟翻译，该基因编码332个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)。利用DRP1-M编码的氨基酸序列在NCBI上进行基因保守结构域分析，发现该蛋白只含有一个Ferritin-like的结构域。综合以上的结果将DRP1-M作为候选基因进行研究。

实施例5.DRP1-M在突变体中克隆分析

根据DRP1-M基因组序列设计引物1F(序列如SEQ ID NO:9所示)和引物1R(序列如SEQ ID NO:10所示)，在野生型(郑58)和雄性不育突变体drp1中特异克隆Zm00001d035791，所有扩增过程中均使用TaKaRa公司生产的

Max DNA Polymerase(R045Q,TaKaRa)，根据产品说明书，配置反应体系和PCR程序。使用BIO-RAD S1000仪进行PCR扩增。使用琼脂糖凝胶进行凝胶电泳。PCR产物送北京英骏生物公司进行测序。对得到的测序结果，通过序列比对分析野生型和突变体中DRP1-M的序列差异，发现在编码区内，突变体和野生型相比只有一个碱基在358处发生了G-A的替换。因此，将DRP1-M对应于野生型植株中的基因命名为DRP1-W，DRP1-W的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，该基因编码332个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例6.DRP1-W基因在玉米野生型和突变体中编码氨基酸的序列差异

DRP1-W在野生型中编码一个332个氨基酸序列，突变体中单个碱基的替换没有导致翻译提前终止，经过序列比对，发现在120位氨基酸处发生了E-K的替换。该氨基酸替换的位置位于Ferritin-like的结构域的内部，说明该氨基酸的突变改变了Ferritin-like的结构域的功能。DRP1-W功能失活表现为玉米雄穗的完全不育，证明DRP1-W的基因对玉米雄配子的发育具有调控能力。当DRP1-W基因发生一个至数个碱基的插入、缺失、替换或者发生大片的插入、缺失、替换、倒位或移位时，可以造成玉米的雄性不育。

实施例7.DRP1-W蛋白在不同物种中保守性分析

利用DRP1-W基因的氨基酸序列在NCBI上进行blast分析，对DRP1-W在高粱、小麦、短柄草、大麦和水稻中进行分析。如图6所示，其中XP_021302465.1为高粱同源性序列，XP_044439785.1为小麦同源性序列，XP_014754384.1为短柄草同源性序列，XP_044965196.1为大麦同源性序列，KAF2929193.1为水稻同源性序列。同源性分析结果表明DRP1-W基因在不同的物种间高度保守。因此，可以判断，该基因在这些作物的花药发育过程中具有重要的调节作用，当DRP1-W基因序列发生变化时将，会造成这些作物的雄性不育。

实施例8.Drp1-W在不同组织中的表达模式分析

分别采集B73各个不同发育时期的雄穗，包括播种后70天的根、茎、叶、雌穗、雄穗、1-1.5mm的花药、1.5-2mm的花药、2-2.5mm的花药、2.3-3mm花药以及大于3mm的花药。分别提取RNA，进行表达水平的分析。发现DRP1-W是一个雄穗特异表达基因，且在特定的发育时期表达。实时定量荧光PCR(qPCR)分析表明，DRP1-W在2-2.5mm的花药中表达量最高，在2.5-3mm的花药中表达量显著降低，在大于3mm的花药中几乎检测不到。DRP1-W在其他组织中不表达(图7)。

其中RNA提取及qPCR方法如下：采用Trizol法提取植株总RNA：(1)将0.1g新鲜的植株样品，在研钵内用液氮研磨成粉末。(2)加入1mL Trizol提取液，旋涡震荡20s，冰浴5min。(3)4℃12000rpm 10min，吸取上清到一个新的RNA-free离心管中。(4)加200um氯仿，震荡混均，冰浴3min。(5)4℃12000rpm 10min，吸取上清到一个新的RNA-free离心管中。(6)加入等体积的异丙醇混均，冰浴15min。(7)4℃12000rpm 10min，弃上清，70％乙醇清洗。(8)晾干。

RNA反转录：1)取出RNA样品，冰上解冻，取2-4μg RNA，加入DNA消化酶DNase I 0.5μL和1μL DNase Ibuffer，并用Nuclear free水补至10μL，混匀后在37℃消化DNA 30min。2)加入2.5μL DNase I Stop buffer，混匀，70℃反应10min。3)10000g离心30sec，之后加入2μL Oligo dT，混匀，70℃反应10min，取出迅速冰浴5min。4)10000g离心30sec，之后加入反转录酶M-MLV 2μL，5×M-MLV buffer 5μL，RNase inhibitor 0.5μL，dNTP 3μL，混匀，42℃水浴1h。5)70℃失活10min，10000g离心1min，将获得的反转录产物存入-20℃备用。

按下表制备PCR反应液，进行qPCR。

表3.qPCR反应液制备

实施例9.DRP1-W功能标记drp-F和drp-R在玉米雄性不育制种中的应用

利用上述雄性不育突变体drp1在不同的遗传背景下培育优良不育系。具体方法如下：首先利用Premier 5软件设计一对功能标记引物，drp-F(SEQ ID NO:7)和drp-R(SEQ IDNO:8)。使用玉米雄性不育drp1为母本(DRP1-M/DRP1-M)，与不同背景下雄性可育的材料郑58(DRP1-W/DRP1-W)进行杂交，将得到的F1代植株(DRP1-W/DRP1-M)继续与父本材料(DRP1-W/DRP1-W)进行回交，每一次回交均使用功能标记引物drp-F和drp-R对回交材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物送英俊测序，选择含有DRP1-M基因型的植株，继续与父本材料(DRP1-W/DRP1-W)进行回交，重复4-5次。获得含有DRP1-M基因型，同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料。再自交一次，利用能标记引物drp-F和drp-R进行筛选，即获得含有轮回亲本遗传背景的新不育系。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种蛋白及其在影响植株雄性生育力中的用途

<130> IDC220143

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2199

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DRP1-W的核苷酸序列

<400> 1

cggtgtagtt ccacgatcgt atggactgtg ttgtttgatc gtgtggccta atcgattgat 60

tgttgttggt gcaggcgacc acccgagcca ccaactcatt gatttgtctt cgatgtatcg 120

tgtaaaataa gagatgcgac tatagatgat attgttaaca ttgtttgtag agttgagttt 180

gaaataaagg ataaaatagg ggaactggtt aagaaatact catacaaggg aattcgaatc 240

agtttgattg gcactgcaag ttctaacagg aaaaaataaa aaaaagggaa aaaaggaaat 300

cccgtcggcg gaaagccttt gtagttaatt tgcgttgcaa catatgaaag tgtatattga 360

ttgttaaaga aaatacgact ctgtaagtat tctgtattag atttgacgaa atttccgtcg 420

accctttggt acgtggttaa cctaaccatc tccacacaag catttcgtgg cctgccaaaa 480

ctcaatctaa ccctattttc ctcctaaatc cacgctaact aaaattaact aactgcgacc 540

tcactacaaa tgttccactc tccctagctg gtctccctcg cccaaacagc agagcaagct 600

atggcgcgcg cgcgtgacgc cgccctccac ctcctcctcc tggcagcggg cgcactccta 660

cttctagccg tggtgtctca ggccaccgtg gtgccgccga gcgttccggc gggcgccccc 720

gaggacccgc ggtgccgcgc gctggcgccg cggcgtggcg cgctggcggt gtacccgagc 780

gacatggagc aactgcagtt ccttctcaac gccaagttcg tggaggcgga gtggttcctg 840

cacgcggcgc tgggacgtgg cgtggacttc ctggaccgca acctgtccgg cggcgggcct 900

cggccgtccg gggccaggaa ggcggacctg gacttccgca caaccgaggt cgccgccgag 960

ctcgggtacc aggaggtggg ccacatccgc gccatcaggc aggccgtggg cgggttcccg 1020

cggccgccca tcgacctcgg cgccgaccgc ttcgccatgg tcatggacga cgccatgggc 1080

gtccgtctgg acccgccgtt cgacccgtac gccgggcccg tcaacttcct gctcgcctcc 1140

tacgtgttcc cgcacgtcac cgccgccgcc gccatgggca tcggccccag cctcatgggc 1200

tacgcctcca agcgcctcca ggcgagcatc ctggcggtgg aggccgggca ggacgcggtg 1260

atccggctgc tgctgtacca gcgcgccgac gatgccgtcc caccgtacca gggccacacc 1320

gtggccgact tcacgcgccg gatctccgac tggcgcaacc ggatgtccgg gtgcggcgcc 1380

aaggacgaag gggtcaaggt gctggaccgg cggcagggcg ccgagcgccg caccataagc 1440

aacatcctcg gcgccggcga ggactcgctc gggttccaac gcacgcctgc ggaggtgctc 1500

cgcatcctct acggctcgcg caacgagcag atccccggtg ggttcctccc caggggtgcc 1560

aatggaacca tcgctagagg tttcttccag ctcgcgtaga tcaaaagata ctaacaacat 1620

cctagtctat cttgagacat cacaagctga tcgatggtag taccaatcaa cttgaaatta 1680

aaggtccaag aaatgtgata aaaaaacaga aaccattatt attttgaaac ctaaaattgt 1740

atcacgtcgg cctttgttgc ctctcctctt ccgacacgac ggctctatcc aagcaatatc 1800

tgccgcgcgt gacgctatca gtacatttgc gttgagaact acgttaccac ggatcaccag 1860

atccgctttc ttccctcccg tcagcagtag aggcgtaaga agatgtagag tacccgtctc 1920

ccttcccata aacacgatag agtaaacaca cgagacacat aatatacggt tgacctctgg 1980

cctctttttc ttctctgtat tatgaggtgg tgcacaggtt ccttatatag agatgtgaga 2040

cccctcaggg gcaaatcagg gatttgccca cataacccta actagggtta cttaacactc 2100

ccccttgggc gaataccgcg accaacacat gcctcgttaa aactccgaaa aacccagtgg 2160

gaaaaaaatg tggagaaata gtgcatggtg atacaaatt 2199

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DRP1-W的CDS核苷酸序列

<400> 2

atggcgcgcg cgcgtgacgc cgccctccac ctcctcctcc tggcagcggg cgcactccta 60

cttctagccg tggtgtctca ggccaccgtg gtgccgccga gcgttccggc gggcgccccc 120

gaggacccgc ggtgccgcgc gctggcgccg cggcgtggcg cgctggcggt gtacccgagc 180

gacatggagc aactgcagtt ccttctcaac gccaagttcg tggaggcgga gtggttcctg 240

cacgcggcgc tgggacgtgg cgtggacttc ctggaccgca acctgtccgg cggcgggcct 300

cggccgtccg gggccaggaa ggcggacctg gacttccgca caaccgaggt cgccgccgag 360

ctcgggtacc aggaggtggg ccacatccgc gccatcaggc aggccgtggg cgggttcccg 420

cggccgccca tcgacctcgg cgccgaccgc ttcgccatgg tcatggacga cgccatgggc 480

gtccgtctgg acccgccgtt cgacccgtac gccgggcccg tcaacttcct gctcgcctcc 540

tacgtgttcc cgcacgtcac cgccgccgcc gccatgggca tcggccccag cctcatgggc 600

tacgcctcca agcgcctcca ggcgagcatc ctggcggtgg aggccgggca ggacgcggtg 660

atccggctgc tgctgtacca gcgcgccgac gatgccgtcc caccgtacca gggccacacc 720

gtggccgact tcacgcgccg gatctccgac tggcgcaacc ggatgtccgg gtgcggcgcc 780

aaggacgaag gggtcaaggt gctggaccgg cggcagggcg ccgagcgccg caccataagc 840

aacatcctcg gcgccggcga ggactcgctc gggttccaac gcacgcctgc ggaggtgctc 900

cgcatcctct acggctcgcg caacgagcag atccccggtg ggttcctccc caggggtgcc 960

aatggaacca tcgctagagg tttcttccag ctcgcgtag 999

<210> 3

<211> 332

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> DRP1-W的氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Arg Ala Arg Asp Ala Ala Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Gln Ala Thr Val Val Pro

20 25 30

Pro Ser Val Pro Ala Gly Ala Pro Glu Asp Pro Arg Cys Arg Ala Leu

35 40 45

Ala Pro Arg Arg Gly Ala Leu Ala Val Tyr Pro Ser Asp Met Glu Gln

50 55 60

Leu Gln Phe Leu Leu Asn Ala Lys Phe Val Glu Ala Glu Trp Phe Leu

65 70 75 80

His Ala Ala Leu Gly Arg Gly Val Asp Phe Leu Asp Arg Asn Leu Ser

85 90 95

Gly Gly Gly Pro Arg Pro Ser Gly Ala Arg Lys Ala Asp Leu Asp Phe

100 105 110

Arg Thr Thr Glu Val Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Gln Glu Val Gly His

115 120 125

Ile Arg Ala Ile Arg Gln Ala Val Gly Gly Phe Pro Arg Pro Pro Ile

130 135 140

Asp Leu Gly Ala Asp Arg Phe Ala Met Val Met Asp Asp Ala Met Gly

145 150 155 160

Val Arg Leu Asp Pro Pro Phe Asp Pro Tyr Ala Gly Pro Val Asn Phe

165 170 175

Leu Leu Ala Ser Tyr Val Phe Pro His Val Thr Ala Ala Ala Ala Met

180 185 190

Gly Ile Gly Pro Ser Leu Met Gly Tyr Ala Ser Lys Arg Leu Gln Ala

195 200 205

Ser Ile Leu Ala Val Glu Ala Gly Gln Asp Ala Val Ile Arg Leu Leu

210 215 220

Leu Tyr Gln Arg Ala Asp Asp Ala Val Pro Pro Tyr Gln Gly His Thr

225 230 235 240

Val Ala Asp Phe Thr Arg Arg Ile Ser Asp Trp Arg Asn Arg Met Ser

245 250 255

Gly Cys Gly Ala Lys Asp Glu Gly Val Lys Val Leu Asp Arg Arg Gln

260 265 270

Gly Ala Glu Arg Arg Thr Ile Ser Asn Ile Leu Gly Ala Gly Glu Asp

275 280 285

Ser Leu Gly Phe Gln Arg Thr Pro Ala Glu Val Leu Arg Ile Leu Tyr

290 295 300

Gly Ser Arg Asn Glu Gln Ile Pro Gly Gly Phe Leu Pro Arg Gly Ala

305 310 315 320

Asn Gly Thr Ile Ala Arg Gly Phe Phe Gln Leu Ala

325 330

<210> 4

<211> 2199

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DRP1-M的核苷酸序列

<400> 4

cggtgtagtt ccacgatcgt atggactgtg ttgtttgatc gtgtggccta atcgattgat 60

tgttgttggt gcaggcgacc acccgagcca ccaactcatt gatttgtctt cgatgtatcg 120

tgtaaaataa gagatgcgac tatagatgat attgttaaca ttgtttgtag agttgagttt 180

gaaataaagg ataaaatagg ggaactggtt aagaaatact catacaaggg aattcgaatc 240

agtttgattg gcactgcaag ttctaacagg aaaaaataaa aaaaagggaa aaaaggaaat 300

cccgtcggcg gaaagccttt gtagttaatt tgcgttgcaa catatgaaag tgtatattga 360

ttgttaaaga aaatacgact ctgtaagtat tctgtattag atttgacgaa atttccgtcg 420

accctttggt acgtggttaa cctaaccatc tccacacaag catttcgtgg cctgccaaaa 480

ctcaatctaa ccctattttc ctcctaaatc cacgctaact aaaattaact aactgcgacc 540

tcactacaaa tgttccactc tccctagctg gtctccctcg cccaaacagc agagcaagct 600

atggcgcgcg cgcgtgacgc cgccctccac ctcctcctcc tggcagcggg cgcactccta 660

cttctagccg tggtgtctca ggccaccgtg gtgccgccga gcgttccggc gggcgccccc 720

gaggacccgc ggtgccgcgc gctggcgccg cggcgtggcg cgctggcggt gtacccgagc 780

gacatggagc aactgcagtt ccttctcaac gccaagttcg tggaggcgga gtggttcctg 840

cacgcggcgc tgggacgtgg cgtggacttc ctggaccgca acctgtccgg cggcgggcct 900

cggccgtccg gggccaggaa ggcggacctg gacttccgca caaccgaggt cgccgccaag 960

ctcgggtacc aggaggtggg ccacatccgc gccatcaggc aggccgtggg cgggttcccg 1020

cggccgccca tcgacctcgg cgccgaccgc ttcgccatgg tcatggacga cgccatgggc 1080

gtccgtctgg acccgccgtt cgacccgtac gccgggcccg tcaacttcct gctcgcctcc 1140

tacgtgttcc cgcacgtcac cgccgccgcc gccatgggca tcggccccag cctcatgggc 1200

tacgcctcca agcgcctcca ggcgagcatc ctggcggtgg aggccgggca ggacgcggtg 1260

atccggctgc tgctgtacca gcgcgccgac gatgccgtcc caccgtacca gggccacacc 1320

gtggccgact tcacgcgccg gatctccgac tggcgcaacc ggatgtccgg gtgcggcgcc 1380

aaggacgaag gggtcaaggt gctggaccgg cggcagggcg ccgagcgccg caccataagc 1440

aacatcctcg gcgccggcga ggactcgctc gggttccaac gcacgcctgc ggaggtgctc 1500

cgcatcctct acggctcgcg caacgagcag atccccggtg ggttcctccc caggggtgcc 1560

aatggaacca tcgctagagg tttcttccag ctcgcgtaga tcaaaagata ctaacaacat 1620

cctagtctat cttgagacat cacaagctga tcgatggtag taccaatcaa cttgaaatta 1680

aaggtccaag aaatgtgata aaaaaacaga aaccattatt attttgaaac ctaaaattgt 1740

atcacgtcgg cctttgttgc ctctcctctt ccgacacgac ggctctatcc aagcaatatc 1800

tgccgcgcgt gacgctatca gtacatttgc gttgagaact acgttaccac ggatcaccag 1860

atccgctttc ttccctcccg tcagcagtag aggcgtaaga agatgtagag tacccgtctc 1920

ccttcccata aacacgatag agtaaacaca cgagacacat aatatacggt tgacctctgg 1980

cctctttttc ttctctgtat tatgaggtgg tgcacaggtt ccttatatag agatgtgaga 2040

cccctcaggg gcaaatcagg gatttgccca cataacccta actagggtta cttaacactc 2100

ccccttgggc gaataccgcg accaacacat gcctcgttaa aactccgaaa aacccagtgg 2160

gaaaaaaatg tggagaaata gtgcatggtg atacaaatt 2199

<210> 5

<211> 999

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> DRP1-M的CDS核苷酸序列

<400> 5

atggcgcgcg cgcgtgacgc cgccctccac ctcctcctcc tggcagcggg cgcactccta 60

cttctagccg tggtgtctca ggccaccgtg gtgccgccga gcgttccggc gggcgccccc 120

gaggacccgc ggtgccgcgc gctggcgccg cggcgtggcg cgctggcggt gtacccgagc 180

gacatggagc aactgcagtt ccttctcaac gccaagttcg tggaggcgga gtggttcctg 240

cacgcggcgc tgggacgtgg cgtggacttc ctggaccgca acctgtccgg cggcgggcct 300

cggccgtccg gggccaggaa ggcggacctg gacttccgca caaccgaggt cgccgccaag 360

ctcgggtacc aggaggtggg ccacatccgc gccatcaggc aggccgtggg cgggttcccg 420

cggccgccca tcgacctcgg cgccgaccgc ttcgccatgg tcatggacga cgccatgggc 480

gtccgtctgg acccgccgtt cgacccgtac gccgggcccg tcaacttcct gctcgcctcc 540

tacgtgttcc cgcacgtcac cgccgccgcc gccatgggca tcggccccag cctcatgggc 600

tacgcctcca agcgcctcca ggcgagcatc ctggcggtgg aggccgggca ggacgcggtg 660

atccggctgc tgctgtacca gcgcgccgac gatgccgtcc caccgtacca gggccacacc 720

gtggccgact tcacgcgccg gatctccgac tggcgcaacc ggatgtccgg gtgcggcgcc 780

aaggacgaag gggtcaaggt gctggaccgg cggcagggcg ccgagcgccg caccataagc 840

aacatcctcg gcgccggcga ggactcgctc gggttccaac gcacgcctgc ggaggtgctc 900

cgcatcctct acggctcgcg caacgagcag atccccggtg ggttcctccc caggggtgcc 960

aatggaacca tcgctagagg tttcttccag ctcgcgtag 999

<210> 6

<211> 332

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> DRP1-M的氨基酸序列

<400> 6

Met Ala Arg Ala Arg Asp Ala Ala Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Gln Ala Thr Val Val Pro

20 25 30

Pro Ser Val Pro Ala Gly Ala Pro Glu Asp Pro Arg Cys Arg Ala Leu

35 40 45

Ala Pro Arg Arg Gly Ala Leu Ala Val Tyr Pro Ser Asp Met Glu Gln

50 55 60

Leu Gln Phe Leu Leu Asn Ala Lys Phe Val Glu Ala Glu Trp Phe Leu

65 70 75 80

His Ala Ala Leu Gly Arg Gly Val Asp Phe Leu Asp Arg Asn Leu Ser

85 90 95

Gly Gly Gly Pro Arg Pro Ser Gly Ala Arg Lys Ala Asp Leu Asp Phe

100 105 110

Arg Thr Thr Glu Val Ala Ala Lys Leu Gly Tyr Gln Glu Val Gly His

115 120 125

Ile Arg Ala Ile Arg Gln Ala Val Gly Gly Phe Pro Arg Pro Pro Ile

130 135 140

Asp Leu Gly Ala Asp Arg Phe Ala Met Val Met Asp Asp Ala Met Gly

145 150 155 160

Val Arg Leu Asp Pro Pro Phe Asp Pro Tyr Ala Gly Pro Val Asn Phe

165 170 175

Leu Leu Ala Ser Tyr Val Phe Pro His Val Thr Ala Ala Ala Ala Met

180 185 190

Gly Ile Gly Pro Ser Leu Met Gly Tyr Ala Ser Lys Arg Leu Gln Ala

195 200 205

Ser Ile Leu Ala Val Glu Ala Gly Gln Asp Ala Val Ile Arg Leu Leu

210 215 220

Leu Tyr Gln Arg Ala Asp Asp Ala Val Pro Pro Tyr Gln Gly His Thr

225 230 235 240

Val Ala Asp Phe Thr Arg Arg Ile Ser Asp Trp Arg Asn Arg Met Ser

245 250 255

Gly Cys Gly Ala Lys Asp Glu Gly Val Lys Val Leu Asp Arg Arg Gln

260 265 270

Gly Ala Glu Arg Arg Thr Ile Ser Asn Ile Leu Gly Ala Gly Glu Asp

275 280 285

Ser Leu Gly Phe Gln Arg Thr Pro Ala Glu Val Leu Arg Ile Leu Tyr

290 295 300

Gly Ser Arg Asn Glu Gln Ile Pro Gly Gly Phe Leu Pro Arg Gly Ala

305 310 315 320

Asn Gly Thr Ile Ala Arg Gly Phe Phe Gln Leu Ala

325 330

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> drp-F

<400> 7

gcagcgggcg cactcctact tcta 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> drp-R

<400> 8

tggtacggtg ggacggcatc gt 22

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物1F

<400> 9

gctccgaatt tggggaagat aagctg 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引物1R

<400> 10

cgcgagctgg aagaaacctc tagcga 26

Claims (12)

1.一种蛋白，其具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的蛋白的突变体，所述突变体包含：

(1)与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或者，

(2)与SEQ ID NO:3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

优选地，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3所示的序列的第120位位置上具有突变；

优选地，所述突变体在对应于SEQ ID NO:3所示的序列的第120位位置上的氨基酸突变为K；

优选地，所述突变体具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

3.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1的蛋白或权利要求2的突变体的核苷酸序列；

优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

4.一种载体，其包含权利要求3的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体；

优选地，所述宿主细胞是农杆菌细胞；

优选地，所述宿主细胞是植株细胞；

优选地，所述宿主细胞选自玉米细胞，高粱细胞，小麦细胞，短柄草细胞，大麦细胞或水稻细胞。

6.一种植株或植株种子，所述植株或植株种子在基因组中包含权利要求3所述的核酸分子；

优选地，所述植株或植株种子在基因组中包含：

(1)如SEQ ID NO:5所示的纯合的基因，且所述植株或植株种子为雄性不育；或者，

(2)如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5所示的杂合基因，且所述植株或植株种子为雄性能育；

优选地，所述植株选自玉米，高粱，小麦，短柄草，大麦或水稻。

7.一种获得植株的方法，所述方法包括：(1)将权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体导入植株细胞，以及，(2)将所述植株细胞培养成植株；

优选地，在步骤(1)中，使用农杆菌将所述核酸分子或载体导入植株细胞。

8.一种获得雄性不育植株或植株种子的方法，所述方法包括影响植株或植株种子基因组中权利要求3所述的核酸分子或其片段的表达；

优选地，所述核酸分子或其片段的表达通过选自下列的方法而被影响：改变所述核酸分子或其片段的核苷酸序列(例如，使所述核酸分子或其片段的序列具有一个或几个核苷酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个核苷酸的置换、缺失或添加))，诱变，共抑制，引入编码发夹结构形成的序列；

优选地，影响植株或植株种子基因组中如SEQ ID NO:2所示的核酸分子或其片段的表达，以获得雄性不育植株或植株种子；

优选地，使如SEQ ID NO:2所示的核酸分子的序列具有一个核苷酸的置换，以获得雄性不育植株或植株种子；

优选地，使如SEQ ID NO:2所示的核酸分子的核苷酸序列的第358位核苷酸置换为核苷酸A，获得雄性不育植株或植株种子；

优选地，所述雄性不育植株或植株种子的基因组中具有如SEQ ID NO:5所示的纯合的隐性基因；

优选地，所述植株选自玉米，高粱，小麦，短柄草，大麦或水稻。

9.一种获得杂交种子或植株的方法，所述方法包括：将通过权利要求8的方法获得的植株作为母本，与作为父本的雄性能育植株杂交，收获杂交种子或植株；

优选地，所述方法包括：将通过权利要求8的方法获得的雄性不育植株作为母本，用来自作为父本的雄性能育植株的花粉异化授粉所述雄性不育植株，收获来自所述雄性不育植株的种子F1。

10.一种获得具有父本遗传背景的雄性不育种子或植株的方法，所述方法包括：

(1)筛选权利要求9获得的植株中具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株；

(2)将所述植株作为母本，与作为父本的所述雄性能育植株回交，以收获后代种子或植株；

(3)筛选步骤(2)中获得的后代植株中具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株，并将所述植株进行自交，以获得具有父本遗传背景的雄性不育种子或植株；

优选地，在步骤(2)完成之后，筛选步骤(2)中获得的后代植株中具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株，继续与作为父本的所述雄性能育植株回交2-10次(例如，2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次，10次)；

优选地，回交4次或5次；

优选地，通过PCR扩增，以筛选出具有SEQ ID NO:2所示的序列的植株。

11.权利要求1的蛋白或权利要求3的核酸分子或权利要求4的载体或权利要求5的宿主细胞或权利要求6的植株在恢复植株雄性生育力或者产生雄性能育植株中的用途；

优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

12.权利要求2的突变体或权利要求3的核酸分子或权利要求4的载体或权利要求5的宿主细胞或权利要求6的植株在使植株丧失雄性生育力或产生雄性不育植株中的用途；

优选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

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