CN110734484B - Nrt2_5蛋白在调控植物苞叶宽度中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了NRT2_5蛋白在调控植物苞叶宽度中的应用，NRT2_5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。实验证明，降低玉米B104中NRT2_5蛋白的表达量和/或活性，得到转基因玉米；与玉米B104相比，转基因玉米的苞叶宽度显著减小。由此可见，NRT2_5蛋白可以调控植物苞叶宽度。本发明具有重要的应用价值。

Description

NRT2_5蛋白在调控植物苞叶宽度中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及NRT2_5蛋白在调控植物苞叶宽度中的应用。

背景技术

玉米苞叶的光合作用对果穗籽粒产量的形成有重要贡献。玉米苞叶没有C₄植物叶片的花环结构，但光合碳同化途径既有C3也有C4途径。Yakir等(1991)利用同位素标记法对玉米苞叶碳水化合物来源进行了定量分析，结果表明玉米苞叶中纤维素的合成16％来自苞叶C3途径，62％来自C4光合途径，其余22％则由其它叶片合成的蔗糖转运而来。虽然玉米苞叶面积与茎叶面积相对较小，但如果去除苞叶，玉米产量将会有一定程度的降低。Jain(1971)也证实了在一些玉米品种中，苞叶光合作用对最终果穗干物质含量有15％的贡献率。

玉米苞叶是营养物质贮存的重要器官，贮存的物质在灌浆后期转运到玉米果穗。苞叶贮存矿质营养的能力和对籽粒增重的作用仅次于茎秆，远高于穗轴和叶鞘。灌浆期开始时，苞叶的可溶性糖和氨基酸含量最高，到乳熟期两者的含量均迅速降低，导致了苞叶水势的升高，这可能是苞叶开始脱水的诱因。虽然苞叶和茎叶的净光合效率没有明显区别，但是苞叶比茎叶具有更高的转换效率来促进籽粒产物的积累。

玉米苞叶不仅是果穗营养贮存器官，也是玉米植株上果穗的保护器官，为果穗提供良好的发育环境。第一，苞叶通过包裹果穗维持了籽粒发育所需的适宜温度。尤其在玉米生育后期，收获可能遇到冻害情况下,苞叶可以防止热量的散失,有效地降低降温引起的冻害率。第二，苞叶可以降低逆境环境引起的水分亏缺从而带来的玉米生殖抑制。第三，合理的苞叶覆盖和紧密程度可以有效地降低或消除黄曲霉素的污染。第四，玉米收获时，较长和紧密的苞叶可以阻止病害虫进入到果穗内部，从而有利于降低或阻止病虫害的发生。由此可见，苞叶在玉米果穗发育中具有重要作用。

适合联合机收的玉米品种基本要求为：生育期较短，后期抗倒伏能力强；成熟期籽粒含水量要低，脱水速率快。已有研究表明，玉米苞叶形态结构特征是影响玉米果穗后期脱水速率的最直接因素。Zuber等(1950)提出苞叶宽度是影响玉米籽粒脱水速率的重要因素。苞叶总长与苞叶总宽是影响苞叶面积的决定性因素，其中苞叶总宽与苞叶总面积的相关性明显大于苞叶总长与苞叶总面积的相关性。而脱水速率与苞叶覆盖程度呈负相关，闫淑琴等(2007)对9份玉米自交系及所配杂交组合进行测定，结果表明，苞叶脱水速率、穗轴脱水速率与籽粒脱水速率正相关；苞叶数目多，面积大，含水量高，则籽粒脱水速率慢。由此可见，玉米苞叶宽度是影响玉米收获期脱水的重要性状。

发明内容

本发明的目的是减小植物苞叶宽度。

本发明首先保护NRT2_5蛋白的应用，可为S1)或S2)：

S1)调控植物苞叶宽度；

S2)培育苞叶宽度改变的转基因植物。

上述应用中，所述NRT2_5蛋白可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物苞叶宽度相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：3由520个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述NRT2_5蛋白的核酸分子的应用，可为S1)或S2)：

S1)调控植物苞叶宽度；

S2)培育苞叶宽度改变的转基因植物。

上述应用中，所述编码NRT2_5蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述NRT2_5蛋白的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述NRT2_5蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO：2由1563个核苷酸组成，SEQ ID NO：2的核苷酸编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码NRT2_5蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述NRT2_5蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述NRT2_5蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的NRT2_5蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一所述的应用中，所述调控植物苞叶宽度可为减小植物苞叶宽度或增加植物苞叶宽度。

上述任一所述的应用中，所述培育苞叶宽度改变的转基因植物可为培育苞叶宽度增加的转基因植物或培育苞叶宽度减小的转基因植物。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：降低出发植物中所述NRT2_5蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的苞叶宽度减小。

上述方法中，所述“降低出发植物中所述NRT2_5蛋白的表达量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低出发植物中所述NRT2_5蛋白的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述“降低出发植物中所述NRT2_5蛋白的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入植物基因组编辑的载体实现；

所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；

所述sgRNA在植物中识别的靶标DNA为编码所述NRT2_5蛋白的DNA片段。

上述方法中，所述植物基因组编辑的载体还可含有Cas9蛋白的编码基因。

上述方法中，所述sgRNA识别的靶点可为SEQ ID NO：1自5’末端起第760-778位所示的DNA分子。

上述方法中，所述sgRNA编码基因为SEQ ID NO：6所示的DNA分子。

上述方法中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

所述植物基因组编辑的载体具体可为重组质粒pBUE411-NRT。重组质粒pBUE411-NRT的核苷酸序列可如SEQ ID NO：4所示。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低出发植物中所述NRT2_5蛋白的表达量和/或活性，从而减小苞叶宽度。

上述任一所述植物可为如下c1)至c6)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)玉米；c5)玉米B104；c6)玉米品种B73。

上述任一所述苞叶宽度可为玉米成熟期果穗由外向内数第三片苞叶的宽度，即玉米成熟期果穗由外向内数第三片苞叶完全展开时的最大宽度。

实验证明，采用含有重组质粒pBUE411-NRT的重组农杆菌转化玉米B104，能够对NRT2_5基因进行编辑，NRT2_5基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成NRT2_5基因突变，当两条同源染色体的NRT2_5基因均发生突变时，可以导致NRT2_5蛋白活性丧失，得到NRT2_5蛋白活性丧失的转基因玉米。与玉米B104相比，转基因玉米的苞叶宽度显著减小。由此可见，NRT2_5蛋白可以调控植物苞叶宽度。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为T₀代拟转基因玉米PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

苞叶宽度为玉米成熟期果穗由外向内数第三片苞叶的宽度，即玉米成熟期果穗由外向内数第三片苞叶完全展开时的最大宽度。

pBUE411载体记载于如下文献中：Xing，H.L.，Dong，L.，Wang，Z.P.，Zhang，H.Y.，Han，C.Y.，Liu，B.，Wang，X.C.，and Chen，Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants.BMC plant biology 14，327.

玉米B104记载于如下文献中：Char，S.N.，Neelakandan，A.K.，Nahampun，H.，Frame，B.，Main，M.，Spalding，M.H.，Becraft，P.W.，Meyers，B.C.，Walbot，V.，Wang，K.，Yang，B.(2016).An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9system for high-frequencytargeted mutagenesis in maize.Plant biotechnology journal，15(2)，257-268.

实施例1、NRT2_5基因的发现

1、2017年，本发明的发明人将500份具有广泛变异的玉米自交系组成的关联群体在辽宁铁岭播种，每行播种10粒，三个地块重复。用软绳尺测量苞叶宽度。

2、完成步骤1后，采用混合线性模型(MLM)对442份材料的苞叶宽度的BLUP值进行GWAS分析，进而发现一个可能与玉米苞叶宽度相关的基因，将其命名为NRT2_5基因。

NRT2_5基因位于玉米第8号染色体上，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。NRT2_5基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码SEQ ID NO：3所示的NRT2_5蛋白。

实施例2、NRT2_5基因在调控玉米苞叶宽度中的应用

A、应用一

本实施例选择一个靶点进行实验，靶点序列为：5’-ATGTTCTCGCCGCCCAAGG-3’(即SEQ ID NO：1自5’末端起第760-778位)，对应靶基因NRT2_5基因。

一、sgRNA的合成

设计并人工合成sgRNA，sgRNA的核苷酸序列为：5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO：5)。sgRNA识别的靶点为SEQ ID NO：1自5’末端起第760-778位所示的DNA分子。

sgRNA的编码基因为：

5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC-3’(SEQ ID NO：6)。

二、重组质粒的获得

1、人工合成引物NRT2_5-F：5’-GGCGATGTTCTCGCCGCCCAAGG-3’(下划线为靶点序列)和引物NRT2_5-R：5’-AAACCCTTGGGCGGCGAGAACAT-3’(下划线为靶点序列的反向互补序列)，用去离子水分别将引物NRT2_5-F和引物NRT2_5-R稀释至100μM，得到引物NRT2_5-F稀释液和引物NRT2_5-R稀释液；然后进行退火反应，形成引物二聚体。

2、制备反应体系。反应体系由引物二聚体、限制性内切酶BSAⅠ、pBUE411载体和T4ligase酶组成。

3、取步骤2制备的反应体系，反应，得到重组质粒pBUE411-NRT。

反应程序为：37℃5h，50℃5min，80℃10min。

重组质粒pBUE411-NRT的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。SEQ ID NO：4中，自5’末端起第458-533位所示的核苷酸序列为sgRNA的编码基因。

三、T₀代拟转基因玉米植株的获得

1、将重组质粒pBUE411-NRT通过液氮冷冻法转化根癌农杆菌EHA105的感受态细胞(北京奥森鼎信生物技术有限公司)，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pBUE411-NRT。

2、将EHA105/pBUE411-NRT转化至玉米B104幼胚，经过筛选、分化和生根后，获得T₀代拟转基因玉米植株，具体方法参考如下文献：魏晓禹，邵诗迪，孙苏等，农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立，吉林农业大学学报，2017(06)640-647；黄璐，卫志明，农杆菌介导的玉米遗传转化[J]，实验生物学报，1999(04).

四、T₀代拟转基因玉米植株突变类型的分子鉴定

1、分别以T₀代拟转基因玉米植株叶片的基因组DNA为模板，采用引物crispr-nrt-F：5’-ATCATACTCCTCACCACGC-3’和引物crispr-nrt-R：5’-AGCTGTCCTTGTGCATGTCG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。

2、完成步骤1后，分别将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

3、完成步骤2后，分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果与NRT2_5基因(SEQ ID NO：2所示，编码SEQ ID NO：3的NRT2_5蛋白)Cas9目标序列进行比对，统计突变类型。

由于玉米是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的NRT2_5基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的NRT2_5基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株数指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的NRT2_5基因发生了突变、另一条同源染色体的NRT2_5基因未发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的NRT2_5基因均未发生突变。将纯合突变和双等位基因突变记为突变体。

共检测T₀代拟转基因玉米植株13株，其中纯合突变株数4株。将其中一个纯合突变株命名为crispr-nrt突变体。crispr-nrt突变体在NRT2_5基因的第1外显子中发生了“TGGGGCTGGCCAACGGCGTCGCCGG”25个核苷酸的缺失(即SEQ ID NO：2自5’末端起第518至542位缺失)，从而引起了移码并提前终止，造成NRT2_5蛋白功能缺失。即，crispr-nrt突变体的两条同源染色体中形成NRT2_5基因转录本(NRT2_5基因转录本对应的cDNA如SEQ ID NO：2所示，表达SEQ ID NO：3所示的NRT2_5蛋白)的DNA分子均突变为形成突变基因转录本(突变基因转录本对应的cDNA如SEQ ID NO：7所示，表达SEQ ID NO：8所示的突变蛋白)的DNA分子。

五、苞叶宽度性状田间调查

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

待田间的待测玉米(玉米B104或crispr-nrt突变体)籽粒完全成熟后，选取果穗从外向内数第三片苞叶，用软绳尺测量苞叶宽度。每次测量待测玉米的株数为50株，测量结果取平均值。

结果表明，玉米B104的平均苞叶宽度为11.0±0.1cm，crispr-nrt突变体的平均苞叶宽度为8.6±0.1cm。结果表明，与玉米B104相比，crispr-nrt突变体的苞叶宽度显著减小，大约降低了21.8％。

除了苞叶宽度，玉米B104和crispr-nrt突变体的其它表型无显著差异。

B、应用二

ems4-9bc4f突变体由玉米EMS诱导突变体库MEMD(网址为：http://www.elabcaas.cn/memd/index.php)提供，其为1个独立的以B73为背景的GRMZM2G455124基因(即NRT2_5基因)EMS突变体。MEMD记载，ems4-9bc4f突变体在NRT2_5基因的第1外显子中发生了1个核苷酸的替换(即SEQ ID NO：2自5’末端起第489位的G突变为A)，从而引起了移码并提前终止，造成NRT2_5蛋白功能缺失。

一、ems4-9bc4f突变体的鉴定

1、分别以ems4-9bc4f突变体叶片的基因组DNA为模板，采用引物nrt-9bc4f-F：5’-CTGCTCGTGCGCTTCTTCAC-3’和引物nrt-9bc4f-R：5’-TGTGCAGCTTGCGGTAGTTG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的约313bp的PCR扩增产物。

2、分别将PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果进行如下判断：如果PCR扩增产物的核苷酸序列自5’末端起第60位仅为G，则相应的ems4-9bc4f突变体为纯合野生型材料AA；如果PCR扩增产物的核苷酸序列自5’末端起第60位仅为A，则相应的ems4-9bc4f突变体为纯合突变体材料aa；如果PCR扩增产物的核苷酸序列自5’末端起第60位存在G和A，则相应的ems4-9bc4f突变体为杂合突变体材料Aa。

纯合野生型材料AA是指两条同源染色体中NRT2_5基因转录本对应的cDNA如SEQID NO：2所示，表达SEQ ID NO：3所示的NRT2_5蛋白的材料。

杂合突变体材料Aa是指一条染色体中形成NRT2_5基因转录本(NRT2_5基因转录本对应的cDNA如SEQ ID NO：2所示，表达SEQ ID NO：3所示的NRT2_5蛋白)的DNA分子突变为形成突变基因转录本(突变基因转录本对应的cDNA如SEQ ID NO：9所示，表达SEQ ID NO：10所示的突变蛋白)的DNA分子，另一条染色体中NRT2_5基因转录本对应的cDNA如SEQ ID NO：2所示，表达SEQ ID NO：3所示的NRT2_5蛋白，的材料。

纯合突变体材料aa是指两条同源染色体中形成NRT2_5基因转录本(NRT2_5基因转录本对应的cDNA如SEQ ID NO：2所示，表达SEQ ID NO：3所示的NRT2_5蛋白)的DNA分子均突变为形成突变基因转录本(突变基因转录本对应的cDNA如SEQ ID NO：9所示，表达SEQ IDNO：10所示的突变蛋白)的DNA分子的材料。

结果表明，部分ems4-9bc4f突变体为杂合突变体材料Aa，部分ems4-9bc4f突变体为纯合突变体材料aa。

二、苞叶宽度性状分析

1、将杂合突变体材料Aa或纯合突变体材料aa与玉米品种B73回交2代，然后自交，得到BC₂F₂突变体材料。在辽宁省铁岭市大田种植BC₂F₂突变体材料，自然生长，得到相应的幼苗。每行播种13粒，共计4行。

2、完成步骤1后，分别以幼苗叶片的基因组DNA为模板，采用引物nrt-9bc4f-F和引物nrt-9bc4f-R组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的约313bp的PCR扩增产物。

3、分别将PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果进行如下判断：如果PCR扩增产物的核苷酸序列自5’末端起第60位仅为G，则相应的幼苗为纯合野生型AA植株；如果PCR扩增产物的核苷酸序列自5’末端起第60位仅为A，则相应的幼苗为纯合突变体aa植株；如果PCR扩增产物的核苷酸序列自5’末端起第60位存在G和A，则相应的幼苗为杂合突变体Aa植株。

经检测，共获得23株纯合野生型AA植株，12株纯合突变体aa植株。

4、待23株纯合野生型AA植株和12株纯合突变体aa植株的籽粒完全成熟后，选取果穗从外向内数第三片苞叶，用软绳尺测量苞叶宽度。测量结果取平均值。

结果表明，纯合野生型AA植株的平均苞叶宽度为9.44±0.01cm，纯合突变体aa植株的平均苞叶宽度为7.76±0.01cm。结果表明，与纯合野生型AA植株相比，纯合突变体aa植株的苞叶宽度显著减小，大约降低了17.8％。

除了苞叶宽度，纯合野生型AA植株和纯合突变体aa植株的其它表型无显著差异。

上述结果表明，NRT2_5基因可以调控玉米苞叶宽度。

<110> 中国农业大学

<120> NRT2_5蛋白在调控植物苞叶宽度中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

agcaccggtg aagagcgctc cgctgccgtg cgcgcccccg cgccggcctc ccactggatc 60

gctccacctc atgctccaaa tctttattgg tttccacgtt gccccctcgc cgtccccaac 120

catcgaccgc gccgcgcccg ctgccgcctc ccagctcgct ctatataaac accacgtacg 180

cgccgaagca tcagcacagc cacgtacgta cgaccggctt ccggcaggtg agagaacagt 240

gagaagcagg cgagcggtga catggcggag ggggagttca agcccgcggc gatgcaggtg 300

gaggctcctg ccgaggcggc ggcggcgccg tccaagccgc ggttcaggat gcccgtcgac 360

tccgacaaca aggccaccga gttctggctc ttctccttcg cgaggccgca catgagcgcc 420

ttccacatgt cgtggttctc cttcttctgc tgcttcctct ccaccttcgc ggcgccgccg 480

ctgctcccgc tcatccggga cacgctgggg ctcacggcca cggacatcgg caacgccggg 540

atcgcctccg tgtccggcgc ggtcttcgcg cgcgtggcca tgggcacggc gtgcgacctg 600

gtgggcccgc gcctggcgtc cgcggccatc atactcctca ccacgcccgc cgtctactac 660

tccgccgtca tcgactccgc ctcgtcctac ctgctcgtgc gcttcttcac gggcttctcg 720

ctcgcgtcct tcgtgtccac gcagttctgg atgagctcca tgttctcgcc gcccaaggtg 780

gggctggcca acggcgtcgc cggggggtgg ggcaacctcg gcggcggcgc cgtgcagctc 840

atcatgccgc tcgtgttcga ggccatccgc aaggccgggg ccacgccgtt cacggcgtgg 900

cgcgtcgcct tcttcgtccc gggcctgctg cagacgctgt cggccgtcgc cgtgctggcg 960

ttcggccagg acatgcccga cggcaactac cgcaagctgc acaggtccgg cgacatgcac 1020

aaggacagct tcggcaacgt gctccgccac gccgtcacca actaccgcgc ctggatcctg 1080

gcgctcacct acggatactg cttcggcgtg gagctcgccg tggacaacat cgtcgcgcag 1140

tacttctacg accgcttcgg cgtcaagctc agcaccgccg gcttcatcgc cgccagcttc 1200

gggatggcca acatcgtctc ccgccccggc ggcggcctcc tgtcggactg gctctccagc 1260

cgcttcggca tgcgcggcag gctgtggggc ctgtgggtgg tgcagaccat cgggggcgtc 1320

ctctgcgtcg tgctcggcgc cgtcgactac tccttcgccg cgtccgtggc cgtcatgata 1380

ctcttctcca tgttcgtgca ggcggcctgc gggctcacct ttggcatcgt cccgttcgtc 1440

tcccgaaggt cgctggggct catctccggc atgaccggcg gcggcggcaa cgtgggcgcc 1500

gtgctcacgc agctcatctt cttccacgga tccaagtaca agacggagac ggggatcaag 1560

tacatggggt tcatgatcat cgcctgcacg ttgcccatca cgctcatcta cttcccgcag 1620

tggggcggca tgttcctggg gccgcggccc ggggcgacgg cggaggacta ctacaaccgg 1680

gagtggacag cgcacgagtg cgacaagggt ttcaacaccg cgagcgtacg ctttgcggag 1740

aacagcgtgc gggaaggggg acgctcgggc agccagtcca agcacactac tgtgcccgtc 1800

gagtcctcgc cggccgacgt gtgaaacaca cacaagcata cggtactgcc cgtataatca 1860

gcggtccctc ccgtgtcagc aaatcatatg tagtgttcct aagtcgtgat gactccgtac 1920

gtgtggtaat ttctgtgtga aggaaaaacc gggggtgaat ttcagcgagg agtgacatta 1980

taagcagggc tcgtttgcat 2000

<210> 2

<211> 1563

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

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gcggcgccgt ccaagccgcg gttcaggatg cccgtcgact ccgacaacaa ggccaccgag 120

ttctggctct tctccttcgc gaggccgcac atgagcgcct tccacatgtc gtggttctcc 180

ttcttctgct gcttcctctc caccttcgcg gcgccgccgc tgctcccgct catccgggac 240

acgctggggc tcacggccac ggacatcggc aacgccggga tcgcctccgt gtccggcgcg 300

gtcttcgcgc gcgtggccat gggcacggcg tgcgacctgg tgggcccgcg cctggcgtcc 360

gcggccatca tactcctcac cacgcccgcc gtctactact ccgccgtcat cgactccgcc 420

tcgtcctacc tgctcgtgcg cttcttcacg ggcttctcgc tcgcgtcctt cgtgtccacg 480

cagttctgga tgagctccat gttctcgccg cccaaggtgg ggctggccaa cggcgtcgcc 540

ggggggtggg gcaacctcgg cggcggcgcc gtgcagctca tcatgccgct cgtgttcgag 600

gccatccgca aggccggggc cacgccgttc acggcgtggc gcgtcgcctt cttcgtcccg 660

ggcctgctgc agacgctgtc ggccgtcgcc gtgctggcgt tcggccagga catgcccgac 720

ggcaactacc gcaagctgca caggtccggc gacatgcaca aggacagctt cggcaacgtg 780

ctccgccacg ccgtcaccaa ctaccgcgcc tggatcctgg cgctcaccta cggatactgc 840

ttcggcgtgg agctcgccgt ggacaacatc gtcgcgcagt acttctacga ccgcttcggc 900

gtcaagctca gcaccgccgg cttcatcgcc gccagcttcg ggatggccaa catcgtctcc 960

cgccccggcg gcggcctcct gtcggactgg ctctccagcc gcttcggcat gcgcggcagg 1020

ctgtggggcc tgtgggtggt gcagaccatc gggggcgtcc tctgcgtcgt gctcggcgcc 1080

gtcgactact ccttcgccgc gtccgtggcc gtcatgatac tcttctccat gttcgtgcag 1140

gcggcctgcg ggctcacctt tggcatcgtc ccgttcgtct cccgaaggtc gctggggctc 1200

atctccggca tgaccggcgg cggcggcaac gtgggcgccg tgctcacgca gctcatcttc 1260

ttccacggat ccaagtacaa gacggagacg gggatcaagt acatggggtt catgatcatc 1320

gcctgcacgt tgcccatcac gctcatctac ttcccgcagt ggggcggcat gttcctgggg 1380

ccgcggcccg gggcgacggc ggaggactac tacaaccggg agtggacagc gcacgagtgc 1440

gacaagggtt tcaacaccgc gagcgtacgc tttgcggaga acagcgtgcg ggaaggggga 1500

cgctcgggca gccagtccaa gcacactact gtgcccgtcg agtcctcgcc ggccgacgtg 1560

tga 1563

<210> 3

<211> 520

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Ala Glu Gly Glu Phe Lys Pro Ala Ala Met Gln Val Glu Ala Pro

1 5 10 15

Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ser Lys Pro Arg Phe Arg Met Pro Val

20 25 30

Asp Ser Asp Asn Lys Ala Thr Glu Phe Trp Leu Phe Ser Phe Ala Arg

35 40 45

Pro His Met Ser Ala Phe His Met Ser Trp Phe Ser Phe Phe Cys Cys

50 55 60

Phe Leu Ser Thr Phe Ala Ala Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ile Arg Asp

65 70 75 80

Thr Leu Gly Leu Thr Ala Thr Asp Ile Gly Asn Ala Gly Ile Ala Ser

85 90 95

Val Ser Gly Ala Val Phe Ala Arg Val Ala Met Gly Thr Ala Cys Asp

100 105 110

Leu Val Gly Pro Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ile Ile Leu Leu Thr Thr

115 120 125

Pro Ala Val Tyr Tyr Ser Ala Val Ile Asp Ser Ala Ser Ser Tyr Leu

130 135 140

Leu Val Arg Phe Phe Thr Gly Phe Ser Leu Ala Ser Phe Val Ser Thr

145 150 155 160

Gln Phe Trp Met Ser Ser Met Phe Ser Pro Pro Lys Val Gly Leu Ala

165 170 175

Asn Gly Val Ala Gly Gly Trp Gly Asn Leu Gly Gly Gly Ala Val Gln

180 185 190

Leu Ile Met Pro Leu Val Phe Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Thr

195 200 205

Pro Phe Thr Ala Trp Arg Val Ala Phe Phe Val Pro Gly Leu Leu Gln

210 215 220

Thr Leu Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Phe Gly Gln Asp Met Pro Asp

225 230 235 240

Gly Asn Tyr Arg Lys Leu His Arg Ser Gly Asp Met His Lys Asp Ser

245 250 255

Phe Gly Asn Val Leu Arg His Ala Val Thr Asn Tyr Arg Ala Trp Ile

260 265 270

Leu Ala Leu Thr Tyr Gly Tyr Cys Phe Gly Val Glu Leu Ala Val Asp

275 280 285

Asn Ile Val Ala Gln Tyr Phe Tyr Asp Arg Phe Gly Val Lys Leu Ser

290 295 300

Thr Ala Gly Phe Ile Ala Ala Ser Phe Gly Met Ala Asn Ile Val Ser

305 310 315 320

Arg Pro Gly Gly Gly Leu Leu Ser Asp Trp Leu Ser Ser Arg Phe Gly

325 330 335

Met Arg Gly Arg Leu Trp Gly Leu Trp Val Val Gln Thr Ile Gly Gly

340 345 350

Val Leu Cys Val Val Leu Gly Ala Val Asp Tyr Ser Phe Ala Ala Ser

355 360 365

Val Ala Val Met Ile Leu Phe Ser Met Phe Val Gln Ala Ala Cys Gly

370 375 380

Leu Thr Phe Gly Ile Val Pro Phe Val Ser Arg Arg Ser Leu Gly Leu

385 390 395 400

Ile Ser Gly Met Thr Gly Gly Gly Gly Asn Val Gly Ala Val Leu Thr

405 410 415

Gln Leu Ile Phe Phe His Gly Ser Lys Tyr Lys Thr Glu Thr Gly Ile

420 425 430

Lys Tyr Met Gly Phe Met Ile Ile Ala Cys Thr Leu Pro Ile Thr Leu

435 440 445

Ile Tyr Phe Pro Gln Trp Gly Gly Met Phe Leu Gly Pro Arg Pro Gly

450 455 460

Ala Thr Ala Glu Asp Tyr Tyr Asn Arg Glu Trp Thr Ala His Glu Cys

465 470 475 480

Asp Lys Gly Phe Asn Thr Ala Ser Val Arg Phe Ala Glu Asn Ser Val

485 490 495

Arg Glu Gly Gly Arg Ser Gly Ser Gln Ser Lys His Thr Thr Val Pro

500 505 510

Val Glu Ser Ser Pro Ala Asp Val

515 520

<210> 4

<211> 824

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

agtaattcat ccaggtctcc aagttctagg attttcagaa ctgcaactta ttttatcaag 60

gaatctttaa acatacgaac agatcactta aagttcttct gaagcaactt aaagttatca 120

ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc 180

gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga acactgggta cgttggaaac 240

cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt aggagaaaag catttcgtag tgggccatga 300

agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa 360

agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca aagctgattt aaaagagttg 420

tgcagatgat ccgtggcgat gttctcgccg cccaagggtt ttagagctag aaatagcaag 480

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 540

tttcgttttg cattgagttt tctccgtcgc atgtttgcag ttttattttc cgttttgcat 600

tgaaatttct ccgtctcatg tttgcagcgt gttcaaaaag tacgcagctg tatttcactt 660

atttacggcg ccacattttc atgccgtttg tgccaactat cccgagctag tgaatacagc 720

ttggcttcac acaacactgg tgacccgctg acctgctcgt acctcgtacc gtcgtacggc 780

acagcatttg gaattaaagg gtgtgatcga tactgcttgc tgct 824

<210> 5

<211> 76

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugc 76

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 7

<211> 1538

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atggcggagg gggagttcaa gcccgcggcg atgcaggtgg aggctcctgc cgaggcggcg 60

gcggcgccgt ccaagccgcg gttcaggatg cccgtcgact ccgacaacaa ggccaccgag 120

ttctggctct tctccttcgc gaggccgcac atgagcgcct tccacatgtc gtggttctcc 180

ttcttctgct gcttcctctc caccttcgcg gcgccgccgc tgctcccgct catccgggac 240

acgctggggc tcacggccac ggacatcggc aacgccggga tcgcctccgt gtccggcgcg 300

gtcttcgcgc gcgtggccat gggcacggcg tgcgacctgg tgggcccgcg cctggcgtcc 360

gcggccatca tactcctcac cacgcccgcc gtctactact ccgccgtcat cgactccgcc 420

tcgtcctacc tgctcgtgcg cttcttcacg ggcttctcgc tcgcgtcctt cgtgtccacg 480

cagttctgga tgagctccat gttctcgccg cccaaggggg gtggggcaac ctcggcggcg 540

gcgccgtgca gctcatcatg ccgctcgtgt tcgaggccat ccgcaaggcc ggggccacgc 600

cgttcacggc gtggcgcgtc gccttcttcg tcccgggcct gctgcagacg ctgtcggccg 660

tcgccgtgct ggcgttcggc caggacatgc ccgacggcaa ctaccgcaag ctgcacaggt 720

ccggcgacat gcacaaggac agcttcggca acgtgctccg ccacgccgtc accaactacc 780

gcgcctggat cctggcgctc acctacggat actgcttcgg cgtggagctc gccgtggaca 840

acatcgtcgc gcagtacttc tacgaccgct tcggcgtcaa gctcagcacc gccggcttca 900

tcgccgccag cttcgggatg gccaacatcg tctcccgccc cggcggcggc ctcctgtcgg 960

actggctctc cagccgcttc ggcatgcgcg gcaggctgtg gggcctgtgg gtggtgcaga 1020

ccatcggggg cgtcctctgc gtcgtgctcg gcgccgtcga ctactccttc gccgcgtccg 1080

tggccgtcat gatactcttc tccatgttcg tgcaggcggc ctgcgggctc acctttggca 1140

tcgtcccgtt cgtctcccga aggtcgctgg ggctcatctc cggcatgacc ggcggcggcg 1200

gcaacgtggg cgccgtgctc acgcagctca tcttcttcca cggatccaag tacaagacgg 1260

agacggggat caagtacatg gggttcatga tcatcgcctg cacgttgccc atcacgctca 1320

tctacttccc gcagtggggc ggcatgttcc tggggccgcg gcccggggcg acggcggagg 1380

actactacaa ccgggagtgg acagcgcacg agtgcgacaa gggtttcaac accgcgagcg 1440

tacgctttgc ggagaacagc gtgcgggaag ggggacgctc gggcagccag tccaagcaca 1500

ctactgtgcc cgtcgagtcc tcgccggccg acgtgtga 1538

<210> 8

<211> 363

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Ala Glu Gly Glu Phe Lys Pro Ala Ala Met Gln Val Glu Ala Pro

1 5 10 15

Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ser Lys Pro Arg Phe Arg Met Pro Val

20 25 30

Asp Ser Asp Asn Lys Ala Thr Glu Phe Trp Leu Phe Ser Phe Ala Arg

35 40 45

Pro His Met Ser Ala Phe His Met Ser Trp Phe Ser Phe Phe Cys Cys

50 55 60

Phe Leu Ser Thr Phe Ala Ala Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ile Arg Asp

65 70 75 80

Thr Leu Gly Leu Thr Ala Thr Asp Ile Gly Asn Ala Gly Ile Ala Ser

85 90 95

Val Ser Gly Ala Val Phe Ala Arg Val Ala Met Gly Thr Ala Cys Asp

100 105 110

Leu Val Gly Pro Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ile Ile Leu Leu Thr Thr

115 120 125

Pro Ala Val Tyr Tyr Ser Ala Val Ile Asp Ser Ala Ser Ser Tyr Leu

130 135 140

Leu Val Arg Phe Phe Thr Gly Phe Ser Leu Ala Ser Phe Val Ser Thr

145 150 155 160

Gln Phe Trp Met Ser Ser Met Phe Ser Pro Pro Lys Gly Gly Gly Ala

165 170 175

Thr Ser Ala Ala Ala Pro Cys Ser Ser Ser Cys Arg Ser Cys Ser Arg

180 185 190

Pro Ser Ala Arg Pro Gly Pro Arg Arg Ser Arg Arg Gly Ala Ser Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Arg Ala Cys Cys Arg Arg Cys Arg Pro Ser Pro Cys Trp

210 215 220

Arg Ser Ala Arg Thr Cys Pro Thr Ala Thr Thr Ala Ser Cys Thr Gly

225 230 235 240

Pro Ala Thr Cys Thr Arg Thr Ala Ser Ala Thr Cys Ser Ala Thr Pro

245 250 255

Ser Pro Thr Thr Ala Pro Gly Ser Trp Arg Ser Pro Thr Asp Thr Ala

260 265 270

Ser Ala Trp Ser Ser Pro Trp Thr Thr Ser Ser Arg Ser Thr Ser Thr

275 280 285

Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Pro Pro Ala Ser Ser Pro Pro Ala

290 295 300

Ser Gly Trp Pro Thr Ser Ser Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Cys Arg

305 310 315 320

Thr Gly Ser Pro Ala Ala Ser Ala Cys Ala Ala Gly Cys Gly Ala Cys

325 330 335

Gly Trp Cys Arg Pro Ser Gly Ala Ser Ser Ala Ser Cys Ser Ala Pro

340 345 350

Ser Thr Thr Pro Ser Pro Arg Pro Trp Pro Ser

355 360

<210> 9

<211> 489

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

atggcggagg gggagttcaa gcccgcggcg atgcaggtgg aggctcctgc cgaggcggcg 60

gcggcgccgt ccaagccgcg gttcaggatg cccgtcgact ccgacaacaa ggccaccgag 120

ttctggctct tctccttcgc gaggccgcac atgagcgcct tccacatgtc gtggttctcc 180

ttcttctgct gcttcctctc caccttcgcg gcgccgccgc tgctcccgct catccgggac 240

acgctggggc tcacggccac ggacatcggc aacgccggga tcgcctccgt gtccggcgcg 300

gtcttcgcgc gcgtggccat gggcacggcg tgcgacctgg tgggcccgcg cctggcgtcc 360

gcggccatca tactcctcac cacgcccgcc gtctactact ccgccgtcat cgactccgcc 420

tcgtcctacc tgctcgtgcg cttcttcacg ggcttctcgc tcgcgtcctt cgtgtccacg 480

cagttctga 489

<210> 10

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 10

Met Ala Glu Gly Glu Phe Lys Pro Ala Ala Met Gln Val Glu Ala Pro

1 5 10 15

Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ser Lys Pro Arg Phe Arg Met Pro Val

20 25 30

Asp Ser Asp Asn Lys Ala Thr Glu Phe Trp Leu Phe Ser Phe Ala Arg

35 40 45

Pro His Met Ser Ala Phe His Met Ser Trp Phe Ser Phe Phe Cys Cys

50 55 60

Phe Leu Ser Thr Phe Ala Ala Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ile Arg Asp

65 70 75 80

Thr Leu Gly Leu Thr Ala Thr Asp Ile Gly Asn Ala Gly Ile Ala Ser

85 90 95

Val Ser Gly Ala Val Phe Ala Arg Val Ala Met Gly Thr Ala Cys Asp

100 105 110

Leu Val Gly Pro Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ile Ile Leu Leu Thr Thr

115 120 125

Pro Ala Val Tyr Tyr Ser Ala Val Ile Asp Ser Ala Ser Ser Tyr Leu

130 135 140

Leu Val Arg Phe Phe Thr Gly Phe Ser Leu Ala Ser Phe Val Ser Thr

145 150 155 160

Gln Phe

Claims (4)

1.一种培育转基因玉米的方法，包括如下步骤：降低出发玉米中NRT2_5蛋白的表达量和/或活性，得到转基因玉米；与出发玉米相比，转基因玉米的苞叶宽度减小；

所述NRT2_5蛋白为a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

a2）在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述降低出发玉米中NRT2_5蛋白的表达量和/或活性通过向出发玉米中导入植物基因组编辑的载体实现；

所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA；

所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码所述NRT2_5蛋白的DNA片段。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶点为SEQ ID NO：1自5’末端起第760-778位所示的DNA分子。

4.一种玉米育种方法，包括如下步骤：降低出发玉米中NRT2_5蛋白的表达量和/或活性，从而减小苞叶宽度；

所述NRT2_5蛋白为a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

a2）在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

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