CN110903369B

CN110903369B - Aoc3蛋白在调控植物苞叶厚度中的应用

Info

Publication number: CN110903369B
Application number: CN201911279730.9A
Authority: CN
Inventors: 贺岩; 王岩; 夏嫒嫒; 崔震海; 王淄
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110903369A

Abstract

本发明公开了AOC3蛋白在调控植物苞叶厚度中的应用，AOC3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。实验证明，降低玉米B104中AOC3蛋白的表达量和/或活性，得到转基因玉米；与玉米B104相比，转基因玉米的苞叶厚度显著增加。由此可见，AOC3蛋白可以调控植物苞叶厚度。本发明具有重要的应用价值。

Description

AOC3蛋白在调控植物苞叶厚度中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及AOC3蛋白在调控植物苞叶厚度中的应用。

背景技术

玉米果穗属于变态的侧茎，穗柄为缩短的茎秆，苞叶就是穗柄节上着生的由叶鞘转化成的变态叶，是果穗营养贮存器官，也是玉米植株上果穗的保护器官，为果穗提供良好的发育环境。首先，苞叶通过包裹果穗维持了籽粒发育所需的适宜温度，尤其在玉米生育后期，收获可能遇到冻害的情况下，苞叶可以防止热量的散失，有效地降低降温引起的冻害率。其次，苞叶可以降低逆境环境引起的水分亏缺从而带来的玉米生殖抑制。再次，合理的苞叶覆盖和紧密程度可以有效地降低或消除黄曲霉素的污染。最后，玉米收获时，较长和紧密的苞叶可以阻止病害虫进入到果穗内部，从而有利于降低或阻止病虫害的发生。

玉米在成熟时有一个脱水的过程，会从玉米的穗轴、籽粒与苞叶中逐步脱水，从而达到一个坚硬的状态。在现代联合收割机收获时，收获越晚，玉米脱水越彻底，玉米籽粒越坚硬，越能在与收割机碰撞中保存其完整性，收益越大。但玉米成熟时又是一个高温多雨的季节，玉米籽粒很有可能会在雨水的浇灌下再次发芽，影响产量。因此，玉米快速脱水对产业化生产十分重要，培育脱水速率高的玉米品种具有重要意义。苞叶性状影响果穗脱水和籽粒水分的散失，是玉米高产、宜机收育种需优先解决的关键性状。其中，苞叶厚度决定了玉米脱水速率，因此，改良玉米苞叶厚度是一个重要的选育方向。

发明内容

本发明的目的是改良苞叶厚度。

本发明首先保护AOC3蛋白的应用，可为S1)或S2)：

S1)调控植物苞叶厚度；

S2)培育苞叶厚度改变的转基因植物。

上述应用中，所述AOC3蛋白可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID No：4所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID No：4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将SEQ ID No：4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物苞叶厚度相关的蛋白质。

其中，SEQ ID No：4由238个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No：4所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No：3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述AOC3蛋白的核酸分子的应用，可为S1)或S2)：

S1)调控植物苞叶厚度；

S2)培育苞叶厚度改变的转基因植物。

上述应用中，所述编码AOC3蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID No：3所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID No：3所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是SEQ ID No：2所示的DNA分子；

b4)核苷酸序列是SEQ ID No：1所示的DNA分子；

b5)与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述AOC3蛋白的DNA分子；

b6)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述AOC3蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID No：1由1244个核苷酸组成，SEQ ID No：2由1066个核苷酸组成，SEQID No：3由717个核苷酸组成，SEQ ID No：3的核苷酸编码SEQ ID No：4所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码AOC3蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述AOC3蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述AOC3蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No：4所示的氨基酸序列组成的AOC3蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一所述的应用中，所述调控植物苞叶厚度可为减小植物苞叶厚度或增加植物苞叶厚度。

上述任一所述的应用中，所述培育苞叶厚度改变的转基因植物可为培育苞叶厚度增加的转基因植物或培育苞叶厚度减小的转基因植物。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：降低出发植物中所述AOC3蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的苞叶厚度增加。

上述方法中，所述“降低出发植物中所述AOC3蛋白的表达量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低出发植物中所述AOC3蛋白的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述“降低出发植物中所述AOC3蛋白的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入植物基因组编辑的载体实现；

所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；

所述sgRNA在植物中识别的靶标DNA为编码所述AOC3蛋白的DNA片段。

上述方法中，所述植物基因组编辑的载体还可含有Cas9蛋白的编码基因。

上述方法中，所述sgRNA识别的靶点可为SEQ ID No：1自5’末端起第143-162位所示的DNA分子和第206-225位所示的DNA分子。

上述方法中，所述sgRNA编码基因可为SEQ ID No：6所示的DNA分子。

上述方法中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

所述植物基因组编辑的载体具体可为重组质粒pBUE411-AOC3。重组质粒pBUE411-AOC3可为将SEQ ID No：8所示的DNA分子插入pBUE411载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：降低出发植物中所述AOC3蛋白的表达量和/或活性，从而增加苞叶厚度。

上述任一所述植物可为如下c1)至c6)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)玉米；c5)玉米B104；c6)玉米W22近交系。

上述任一所述苞叶厚度可为玉米成熟期果穗由外向内数第三片苞叶的厚度。

实验证明，采用含有重组质粒pBUE411-AOC3的重组农杆菌转化玉米B104，能够对AOC3基因进行编辑，AOC3基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成AOC3基因突变，当两条同源染色体的AOC3基因均发生突变时，可以导致AOC3蛋白活性丧失，得到AOC3蛋白活性丧失的转基因玉米。与玉米B104相比，转基因玉米的苞叶厚度显著增加。由此可见，AOC3蛋白可以调控植物苞叶厚度。本发明具有重要的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pCBC-MT1T2载体(记载于如下文献中：Xing H L，Dong L，Wang Z P，et al.ACRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC PlantBiology,2014,14(1):327.)为中国农业大学转基因平台提供。

pBUE411载体记载于如下文献中：Xing，H.L.，Dong，L.，Wang，Z.P.，Zhang，H.Y.，Han，C.Y.，Liu，B.，Wang，X.C.，and Chen，Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants.BMCplantbiology 14，327.

玉米B104记载于如下文献中：Char，S.N.，Neelakandan，A.K.，Nahampun，H.，Frame，B.，Main，M.，Spalding，M.H.，Becraft，P.W.，Meyers，B.C.，Walbot，V.，Wang，K.，Yang，B.(2016).An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9system for high-frequencytargeted mutagenesis in maize.Plant biotechnology journal，15(2)，257-268.

实施例1、AOC3基因与玉米苞叶厚度相关

本发明的发明人统计了443份具有广泛变异的玉米自交系组成的关联群体的苞叶厚度表型，然后利用混合线性模型(MLM)对443份表型的BLUP值进行GWAS分析，挖掘到一个与玉米苞叶厚度呈现极显著相关的SNP位点，这个SNP位点位于AOC3基因上。

AOC3基因位于玉米第9号染色体上，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

AOC3基因mRNA的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

AOC3基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，编码SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白。

实施例2、AOC3基因在调控玉米苞叶厚度中的应用

A、应用一

本实施例选择两个靶点进行实验。靶点1的序列为：5’-GGGGCTCGAGACCTTGGCCG-3’(即SEQ ID No：1自5’末端起第143-162位)，靶点2的序列为：5’-GCGGGTTCCGGCAGCATCCG-3’(即SEQ ID No：1自5’末端起第206-225位)，均对应靶基因AOC3基因。

一、sgRNA的合成

设计并人工合成sgRNA，sgRNA的核苷酸序列为：5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAG UCGGUGC-3’(SEQ ID No：5)。sgRNA识别的靶点为SEQ ID No：1自5’末端起第143-162位所示的DNA分子和第206-225位所示的DNA分子。

sgRNA的编码基因为：5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAG TCGGTGC-3’(SEQ ID No：6)。

二、重组质粒pBUE411-AOC3的获得

1、以pCBC-MT1T2载体为模板，采用引物组合进行PCR扩增，回收约964bp的DNA片段。该DNA片段含有双靶位点。

引物组合由引物ACO3-MT1T2-F：5’-AATAATGGTCTCAGGCGCGGGTTCCGGCAGCATCCG-3’、引物ACO3-MT1T2-F0：5’-GCGGGTTCCGGCAGCATCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’、引物ACO3-MT1T2-R0：5’-CGGCCAAGGTCTCGAGCCCCGCTTCTTGGTGCC-3’和引物ACO3-MT1T2-R：5’-ATTATTGGTCTCTAAACCGGCCAAGGTCTCGAGCCC-3’组成。

2、制备反应体系。反应体系由步骤1回收的DNA片段、限制性内切酶BsaI、pBUE411载体和T4 ligase酶组成。

3、取步骤2制备的反应体系，反应，得到重组质粒pBUE411-AOC3。

将重组质粒pBUE411-AOC3进行测序。测序结果表明，重组质粒pBUE411-AOC3为将SEQ ID No：8所示的DNA分子插入pBUE411载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。

三、T0代拟转基因玉米植株的获得

1、将重组质粒pBUE411-AOC3通过液氮冷冻法转化根癌农杆菌EHA105的感受态细胞(北京奥森鼎信生物技术有限公司)，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pBUE411-AOC3。

2、将EHA105/pBUE411-AOC3转化至玉米B104幼胚，经过筛选、分化和生根后，获得T0代拟转基因玉米植株，具体方法参考如下文献：魏晓禹，邵诗迪，孙苏等，农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立，吉林农业大学学报，2017(06)640-647；黄璐，卫志明，农杆菌介导的玉米遗传转化[J]，实验生物学报，1999(04).

四、T0代拟转基因玉米植株突变类型的分子鉴定

1、分别以T0代拟转基因玉米植株叶片的基因组DNA为模板，采用引物crispr-aoc3-F：5’-TGTACTCGTGCCCAATTATGG-3’和引物crispr-aoc3-R：5’-TGCTGGATGAGCACGCAGATG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。

2、分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果与AOC3基因(SEQ ID No：2所示)Cas9目标序列进行比对，统计突变类型。

由于玉米是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的AOC3基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的AOC3基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株数指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的AOC3基因发生了突变、另一条同源染色体的AOC3基因未发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的AOC3基因均未发生突变。在本实施例中，将纯合突变记为突变体。

共检测T0代拟转基因玉米植株10株，其中纯合突变株数6株。将其中一个纯合突变株命名为crispr-aoc3突变体。

crispr-aoc3突变体在AOC3基因的第1外显子中发生了“ccaaggtctcgagccccgccgccgcctccaaggtgcgccaggcgtccagagtcgcggtgggcgggttccgg cagca”76个核苷酸的缺失(即SEQ ID No：2自5’末端起第75至150位缺失)从而引起了移码并提前终止，造成AOC3蛋白功能缺失。即，crispr-aoc3突变体的两条同源染色体中形成AOC3基因转录本(AOC3基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：3所示，表达SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白)的DNA分子均突变为形成突变基因转录本(突变基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：7所示)的DNA分子。

五、回交和后代分析

1、将crispr-aoc3突变体和玉米B104回交三代，得到回交后代。

2、分别以回交后代植株叶片的基因组DNA为模板，采用引物crispr-aoc3-F：5’-TGTACTCGTGCCCAATTATGG-3’和引物crispr-aoc3-R：5’-TGCTGGATGAGCACGCAGATG-3’组成的引物对进行PCR扩增，然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有大小为693bp的条带且不含有大小为617bp的条带，则相应的回交后代为纯合野生型材料AA；如果某PCR扩增产物中含有大小为617bp的条带且不含有大小为693bp的条带，则相应的回交后代为纯合突变体材料aa；如果某PCR扩增产物中含有两条条带且大小分别为693bp和617bp，则相应的回交后代为杂合突变体材料Aa。

纯合野生型材料AA是指两条同源染色体中AOC3基因转录本对应的cDNA如SEQ IDNo：3所示，表达SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白的材料。

纯合突变体材料aa是指两条同源染色体中形成AOC3基因转录本(AOC3基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：3所示，表达SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白)的DNA分子均突变为形成突变基因转录本(突变基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：7所示)的DNA分子的材料。

杂合突变体材料Aa是指一条染色体中形成AOC3基因转录本(AOC3基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：3所示，表达SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白)的DNA分子突变为形成突变基因转录本(突变基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：7所示)的DNA分子，另一条染色体中AOC3基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：3所示，表达SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白的材料。

六、玉米苞叶厚度性状田间调查

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：待田间的待测玉米(纯合野生型材料AA、纯合突变体材料aa或杂合突变体材料Aa)籽粒完全成熟后，选取果穗从外向内数第三片苞叶，测量苞叶厚度。每次测量待测玉米的株数为50株，测量结果取平均值。

部分待测玉米的苞叶厚度见表2。统计结果表明，纯合野生型材料AA、纯合突变体材料aa和杂合突变体材料Aa的平均苞叶厚度依次为0.107±0.030cm、0.117±0.019cm和0.104±0.034cm。与纯合野生型材料AA相比，纯合突变体材料aa的玉米苞叶厚度显著增加，大约提高了9.3％。杂合突变体材料Aa与纯合野生型玉米苞叶厚度无明显差异。纯合野生型材料AA、纯合突变体材料aa和杂合突变体材料Aa的其它表型无显著差异。

表2

B、应用二

UFMu-08846突变体由B73基因组公共数据库(网址为：www.maizeGDB.org)提供，其为以玉米W22近交系为背景的位于AOC3基因第一外显子的UnifromMu插入突变体。

一、UFMu-08846突变体的鉴定

1、分别以UFMu-08846突变体叶片的基因组DNA为模板，采用引物aoc3-Mu08846-F：5’-TGGACGAGGCGACTCAGATCT-3’、引物aoc3-Mu08846-R：5’-CTTGTCCAGGCTGCCGTTGT-3’和引物MuTIR：5’-AGAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。

2、分别以UFMu-08846突变体叶片的基因组DNA为模板，采用引物aoc3-Mu08846-F和引物aoc3-Mu08846-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。

3、进行如下判断：如果PCR扩增产物甲中含有大小为476bp的条带且PCR扩增产物乙中不含有大小为753bp的条带，则相应的UFMu-08846突变体为纯合突变体材料bb；如果PCR扩增产物甲中含有大小为476bp的条带且PCR扩增产物乙中含有大小为753bp的条带，则相应的UFMu-08846突变体为杂合突变体材料Bb；如果PCR扩增产物甲中不含有大小为476bp的条带且PCR扩增产物乙中含有大小为753bp的条带，则相应的UFMu-08846突变体为纯合野生型材料BB。

纯合野生型材料BB是指两条同源染色体中AOC3基因转录本对应的cDNA如SEQ IDNo：3所示，表达SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白的材料。

杂合突变体材料Bb是指一条染色体中AOC3基因第1外显子的“GCGGCGGC”碱基处插入了转座子(即SEQ ID No：2自5’末端起第209位开始停止转录)，另一条染色体中AOC3基因转录本对应的cDNA如SEQ ID No：3所示，表达SEQ ID No：4所示的AOC3蛋白的材料。

纯合突变体材料bb是指两条同源染色体中AOC3基因第1外显子的“GCGGCGGC”碱基处均插入了转座子(即SEQ ID No：2自5’末端起第209位开始停止转录)从而引起了提前终止，造成AOC3蛋白功能缺失。

结果表明，UFMu-08846突变体为纯合突变体材料bb。即UFMu-08846突变体两条同源染色体中在AOC3基因第1外显子的“GCGGCGGC”碱基处均插入了转座子(即SEQ ID No：2自5’末端起第209起开始停止转录)从而引起了提前终止，造成AOC3蛋白功能缺失。

二、玉米苞叶厚度性状田间调查

1、将UFMu-08846突变体和玉米W22近交系回交三代，然后自交，得到后代。

2、分别以后代植株叶片的基因组DNA为模板，采用引物aoc3-Mu08846-F、引物aoc3-Mu08846-R和引物MuTIR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。

3、分别以后代植株叶片的基因组DNA为模板，采用引物aoc3-Mu08846-F和引物aoc3-Mu08846-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。

4、进行如下判断：如果PCR扩增产物甲中含有大小为476bp的条带且PCR扩增产物乙中不含有大小为753bp的条带，则相应的后代为纯合突变体材料bb；如果PCR扩增产物甲中含有大小为476bp的条带且PCR扩增产物乙中含有大小为753bp的条带，则相应的后代为杂合突变体材料Bb；如果PCR扩增产物甲中不含有大小为476bp的条带且PCR扩增产物乙中含有大小为753bp的条带，则相应的后代为纯合野生型材料BB。

5、完成步骤4后，待田间的待测玉米(纯合突变体材料bb、杂合突变体材料Bb或纯合野生型材料BB)籽粒完全成熟后，选取果穗从外向内数第三片苞叶，测量苞叶厚度。每次测量待测玉米的株数为50株，测量结果取平均值。

部分待测玉米的苞叶厚度见表3。统计结果表明，纯合野生型材料BB、纯合突变体材料bb和杂合突变体材料Bb的平均苞叶厚度依次为0.109±0.19cm、0.126±0.017cm和0.110±0.027cm。与纯合野生型材料BB相比，纯合突变体材料bb的玉米苞叶厚度显著增加，大约提高了15.6％。纯合突变体材料bb、杂合突变体材料Bb和纯合野生型材料BB的其它表型无显著差异。

表3

上述结果表明，AOC3基因可以调控玉米苞叶厚度。

<110> 中国农业大学

<120> AOC3蛋白在调控植物苞叶厚度中的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1244

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ggtcacccac ttaaataaga gaaacacacc accaccaatt cactcacgaa ttccccattc 60

ccttccccca tcgcatcgag agccaggcca gccagccacc tctgctaggt ctccatggcc 120

gccgcgctca ggtccccggc ctcggccaag gtctcgagcc ccgccgccgc ctccaaggtg 180

cgccaggcgt ccagagtcgc ggtgggcggg ttccggcagc atccgcggag ccgtgtcggc 240

cccgtggccg tgcgggcgtc gctgttctcg cccaagcccg cggcggccaa ggacgcgcgg 300

ccgaccaagg tgcaggagct gtacgtgtac gagatgaacg agcgggaccg cgagagcccc 360

gcgtacctgc gcctcagcgc caagcagacg gagaacgcgc tgggcgacct ggtccccttc 420

acaaacaagg tccgtcgtcg ttgtgttcct tgctttgctt ttgcttttgc ttttgctttt 480

gcttgatcgg tgcctccgct tagccgctct tcctccccac ccacccatgc acccaggttt 540

acaacggcag cctggacaag cggctgggca tcaccgccgg catctgcgtg ctcatccagc 600

acgtccccga ccgcaacggc gaccggtacg aggccatcta cagcttctac ttcggcgact 660

acggccacat ctcggtgcag ggcgcgtacc tgacctacga ggagtcgtac ctggccgtca 720

cgggcggctc cggcgtcttc gagggcgcct acggccaggt caagctccac cagatcgtct 780

tccccttcaa gatcttctac accttctacc tccggggcat cccggacctg cccagggacc 840

tgctctgcac gcccgtcccg ccctccccca ccgtcgagcc cacgcccgcc gccagggccg 900

ccgagccgca cgcctgcgtc aacaactaca ccaactgact gatcaactcc agcccaggaa 960

ccatctctgc ctgccatgcc tgtccctcac tcgatttgta tgtttgtatg gcttaggtcc 1020

ttcgattcgt acgttcgtgc gtggtagcac caataaacat gcgatcgatt gagttgtgtg 1080

tgcttctcca ttcattcact tgctctttct gcagctcgtg atcgagttgt gtgtgctcca 1140

ttcccaaatt atgtatgatc gattagtagc gttaggggtt aaccagtagc cgctgtgtac 1200

ttgtgtcacc cttggacaaa caatgagata tttctttgtc gtcg 1244

<210> 2

<211> 1066

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

cgcatcgaga gccaggccag ccagccacct ctgctaggtc tccatggccg ccgcgctcag 60

gtccccggcc tcggccaagg tctcgagccc cgccgccgcc tccaaggtgc gccaggcgtc 120

cagagtcgcg gtgggcgggt tccggcagca tccgcggagc cgtgtcggcc ccgtggccgt 180

gcgggcgtcg ctgttctcgc ccaagcccgc ggcggccaag gacgcgcggc cgaccaaggt 240

gcaggagctg tacgtgtacg agatgaacga gcgggaccgc gagagccccg cgtacctgcg 300

cctcagcgcc aagcagacgg agaacgcgct gggcgacctg gtccccttca caaacaaggt 360

ttacaacggc agcctggaca agcggctggg catcaccgcc ggcatctgcg tgctcatcca 420

gcacgtcccc gaccgcaacg gcgaccggta cgaggccatc tacagcttct acttcggcga 480

ctacggccac atctcggtgc agggcgcgta cctgacctac gaggagtcgt acctggccgt 540

cacgggcggc tccggcgtct tcgagggcgc ctacggccag gtcaagctcc accagatcgt 600

cttccccttc aagatcttct acaccttcta cctccggggc atcccggacc tgcccaggga 660

cctgctctgc acgcccgtcc cgccctcccc caccgtcgag cccacgcccg ccgccagggc 720

cgccgagccg cacgcctgcg tcaacaacta caccaactga ctgatcaact ccagcccagg 780

aaccatctct gcctgccatg cctgtccctc actcgatttg tatgtttgta tggcttaggt 840

ccttcgattc gtacgttcgt gcgtggtagc accaataaac atgcgatcga ttgagttgtg 900

tgtgcttctc cattcattca cttgctcttt ctgcagctcg tgatcgagtt gtgtgtgctc 960

cattcccaaa ttatgtatga tcgattagta gcgttagggg ttaaccagta gccgctgtgt 1020

acttgtgtca cccttggaca aacaatgaga tatttctttg tcgtcg 1066

<210> 3

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggccgccg cgctcaggtc cccggcctcg gccaaggtct cgagccccgc cgccgcctcc 60

aaggtgcgcc aggcgtccag agtcgcggtg ggcgggttcc ggcagcatcc gcggagccgt 120

gtcggccccg tggccgtgcg ggcgtcgctg ttctcgccca agcccgcggc ggccaaggac 180

gcgcggccga ccaaggtgca ggagctgtac gtgtacgaga tgaacgagcg ggaccgcgag 240

agccccgcgt acctgcgcct cagcgccaag cagacggaga acgcgctggg cgacctggtc 300

cccttcacaa acaaggttta caacggcagc ctggacaagc ggctgggcat caccgccggc 360

atctgcgtgc tcatccagca cgtccccgac cgcaacggcg accggtacga ggccatctac 420

agcttctact tcggcgacta cggccacatc tcggtgcagg gcgcgtacct gacctacgag 480

gagtcgtacc tggccgtcac gggcggctcc ggcgtcttcg agggcgccta cggccaggtc 540

aagctccacc agatcgtctt ccccttcaag atcttctaca ccttctacct ccggggcatc 600

ccggacctgc ccagggacct gctctgcacg cccgtcccgc cctcccccac cgtcgagccc 660

acgcccgccg ccagggccgc cgagccgcac gcctgcgtca acaactacac caactga 717

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Ala Ala Ala Leu Arg Ser Pro Ala Ser Ala Lys Val Ser Ser Pro

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Lys Val Arg Gln Ala Ser Arg Val Ala Val Gly Gly

20 25 30

Phe Arg Gln His Pro Arg Ser Arg Val Gly Pro Val Ala Val Arg Ala

35 40 45

Ser Leu Phe Ser Pro Lys Pro Ala Ala Ala Lys Asp Ala Arg Pro Thr

50 55 60

Lys Val Gln Glu Leu Tyr Val Tyr Glu Met Asn Glu Arg Asp Arg Glu

65 70 75 80

Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Leu Ser Ala Lys Gln Thr Glu Asn Ala Leu

85 90 95

Gly Asp Leu Val Pro Phe Thr Asn Lys Val Tyr Asn Gly Ser Leu Asp

100 105 110

Lys Arg Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ile Cys Val Leu Ile Gln His Val

115 120 125

Pro Asp Arg Asn Gly Asp Arg Tyr Glu Ala Ile Tyr Ser Phe Tyr Phe

130 135 140

Gly Asp Tyr Gly His Ile Ser Val Gln Gly Ala Tyr Leu Thr Tyr Glu

145 150 155 160

Glu Ser Tyr Leu Ala Val Thr Gly Gly Ser Gly Val Phe Glu Gly Ala

165 170 175

Tyr Gly Gln Val Lys Leu His Gln Ile Val Phe Pro Phe Lys Ile Phe

180 185 190

Tyr Thr Phe Tyr Leu Arg Gly Ile Pro Asp Leu Pro Arg Asp Leu Leu

195 200 205

Cys Thr Pro Val Pro Pro Ser Pro Thr Val Glu Pro Thr Pro Ala Ala

210 215 220

Arg Ala Ala Glu Pro His Ala Cys Val Asn Asn Tyr Thr Asn

225 230 235

<210> 5

<211> 76

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugc 76

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 7

<211> 990

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cgcatcgaga gccaggccag ccagccacct ctgctaggtc tccatggccg ccgcgctcag 60

gtccccggcc tcggtccgcg gagccgtgtc ggccccgtgg ccgtgcgggc gtcgctgttc 120

tcgcccaagc ccgcggcggc caaggacgcg cggccgacca aggtgcagga gctgtacgtg 180

tacgagatga acgagcggga ccgcgagagc cccgcgtacc tgcgcctcag cgccaagcag 240

acggagaacg cgctgggcga cctggtcccc ttcacaaaca aggtttacaa cggcagcctg 300

gacaagcggc tgggcatcac cgccggcatc tgcgtgctca tccagcacgt ccccgaccgc 360

aacggcgacc ggtacgaggc catctacagc ttctacttcg gcgactacgg ccacatctcg 420

gtgcagggcg cgtacctgac ctacgaggag tcgtacctgg ccgtcacggg cggctccggc 480

gtcttcgagg gcgcctacgg ccaggtcaag ctccaccaga tcgtcttccc cttcaagatc 540

ttctacacct tctacctccg gggcatcccg gacctgccca gggacctgct ctgcacgccc 600

gtcccgccct cccccaccgt cgagcccacg cccgccgcca gggccgccga gccgcacgcc 660

tgcgtcaaca actacaccaa ctgactgatc aactccagcc caggaaccat ctctgcctgc 720

catgcctgtc cctcactcga tttgtatgtt tgtatggctt aggtccttcg attcgtacgt 780

tcgtgcgtgg tagcaccaat aaacatgcga tcgattgagt tgtgtgtgct tctccattca 840

ttcacttgct ctttctgcag ctcgtgatcg agttgtgtgt gctccattcc caaattatgt 900

atgatcgatt agtagcgtta ggggttaacc agtagccgct gtgtacttgt gtcacccttg 960

gacaaacaat gagatatttc tttgtcgtcg 990

<210> 8

<211> 952

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ggtctctggc gcgggttccg gcagcatccg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 60

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttttttcgtt 120

ttgcattgag ttttctccgt cgcatgtttg cagttttatt ttccgttttg cattgaaatt 180

tctccgtctc atgtttgcag cgtgttcaaa aagtacgcag ctgtatttca cttatttacg 240

gcgccacatt ttcatgccgt ttgtgccaac tatcccgagc tagtgaatac agcttggctt 300

cacacaacac tggtgacccg ctgacctgct cgtacctcgt accgtcgtac ggcacagcat 360

ttggaattaa agggtgtgat cgatactgct tgctgctcat gaatccaaac cacacggagt 420

tcaaattccc acagattaag gctcgtccgt cgcacaaggt aatgtgtgaa tattatatct 480

gtcgtgcaaa attgcctggc ctgcacaatt gctgttatag ttggcggcag ggagagtttt 540

aacattgact agcgtgctga taatttgtga gaaataataa ttgacaagta gatactgaca 600

tttgagaaga gcttctgaac tgttattagt aacaaaaatg gaaagctgat gcacggaaaa 660

aggaaagaaa aagccatact tttttttagg taggaaaaga aaaagccata cgagactgat 720

gtctctcaga tgggccggga tctgtctatc tagcaggcag cagcccacca acctcacggg 780

ccagcaatta cgagtccttc taaaagctcc cgccgagggg cgctggcgct gctgtgcagc 840

agcacgtcta acattagtcc cacctcgcca gtttacaggg agcagaacca gcttataagc 900

ggaggcgcgg caccaagaag cggggctcga gaccttggcc ggtttagaga cc 952

Claims

1.一种培育转基因玉米的方法，包括如下步骤：降低出发玉米中AOC3蛋白的表达量和/或活性，得到转基因玉米；与出发玉米相比，转基因玉米的苞叶厚度增加；

所述AOC3蛋白为a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID No：4所示的蛋白质；

a2）在SEQ ID No：4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述降低出发玉米中AOC3蛋白的表达量和/或活性通过向出发玉米中导入植物基因组编辑的载体实现；

所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA；

所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码所述AOC3蛋白的DNA片段。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶点为SEQ ID No：1自5’末端起第143-162位所示的DNA分子和第206-225位所示的DNA分子。

4.一种玉米育种方法，包括如下步骤：降低出发玉米中AOC3蛋白的表达量和/或活性，从而增加苞叶厚度；

所述AOC3蛋白为a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID No：4所示的蛋白质；