CN115925850A - 蛋白质ZmRLK9在调控玉米籽粒胚发育和油分含量中的应用 - Google Patents

蛋白质ZmRLK9在调控玉米籽粒胚发育和油分含量中的应用 Download PDF

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CN115925850A CN202211180147.4A CN202211180147A CN115925850A CN 115925850 A CN115925850 A CN 115925850A CN 202211180147 A CN202211180147 A CN 202211180147A CN 115925850 A CN115925850 A CN 115925850A
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黄伟
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Abstract

本发明公开了蛋白质ZmRLK9在调控玉米籽粒胚发育和油分含量中的应用。蛋白质ZmRLK9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验证明，在玉米中过表达ZmRLK9基因，得到转基因玉米；与出发玉米相比，转基因玉米的胚面积和成熟籽粒的油分含量均显著增加。在玉米中抑制ZmRLK9基因，得到敲除ZmRLK9基因水稻；与出发玉米相比，敲除ZmRLK9基因水稻的胚面积和成熟籽粒的油分含量均显著降低。因此，蛋白质ZmRLK9可以调控玉米籽粒胚发育和油分含量。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质ZmRLK9在调控玉米籽粒胚发育和油分含量中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质ZmRLK9在调控玉米籽粒胚发育和油分含量中的应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)属禾本科玉蜀黍属，是我国第一大粮食作物以及饲料作物。随着中国经济的发展和人口的不断增加、生活水平的逐步提高，对玉米的需求也呈现刚性增长。
玉米籽粒中富含丰富的淀粉、蛋白质和油脂等营养物质，其中油分约占玉米籽粒的4-5％并且主要在胚中积累。由于玉米总产量大，因此世界上玉米油总量仅次于豆油。在典型的玉米自交系中，胚的重量在籽粒的占比约为9％，却含有籽粒总油分的约85％。玉米油富含丰富的不饱和脂肪酸(约85％)且不含胆固醇，因此食用玉米油可以减少动脉硬化等疾病的发生。此外，玉米油含有大量的抗氧化剂(如植物甾醇、维生素E)，具有较高的营养价值。因此，鉴定玉米籽粒胚发育与油分积累调控因子，这对玉米籽粒品质改良及其优良品种的选育具有重要应用价值。
发明内容
本发明的目的是提高玉米胚油分含量。
本发明首先保护蛋白质ZmRLK9，可为如下b1)或b2)或b3)或b4)：
b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；
b2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于玉米且与玉米籽粒中胚发育和/或油分含量相关的蛋白质；
b4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于玉米且与玉米籽粒中胚发育和/或油分含量相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:1由677个氨基酸残基组成。
为了使b1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述b3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述b3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码所述蛋白质ZmRLK9的核酸分子。
所述核酸分子可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：
c1)编码区为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
c2)核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
c3)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmRLK9的DNA分子；
c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmRLK9的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:2由2832个核苷酸组成，SEQ ID NO:3由2034个核苷酸组成。SEQID NO:3或SEQ ID NO:2的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ZmRLK9的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述蛋白质ZmRLK9的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ZmRLK9，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质ZmRLK9的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
所述重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:3所示的ZmRLK9基因，得到的重组质粒。
所述重组载体具体可为重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9。重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9可为向植物表达载体pBCXUN-UbiP的限制性内切酶XcmI的识别位点插入核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的ZmRLK9基因，得到重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9。
所述重组微生物可为将上述任一所述重组载体导入出发微生物，得到重组微生物。所述出发微生物为大肠杆菌或农杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA105。
所述重组微生物具体可为将重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9导入根癌农杆菌EHA105，得到的重组农杆菌。
本发明还保护上述任一所述蛋白质ZmRLK9、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物的应用，可为如下A1)-A4)中的至少一种：
A1)促进玉米胚发育；
A2)促进玉米胚油分积累；
A3)培育玉米胚发育加快的转基因玉米；
A4)培育玉米胚油分积累增加的转基因玉米。
上述应用中，所述玉米胚发育加快或促进玉米胚发育可表现为胚面积增加。所述胚油分积累增加或促进玉米胚油分积累可表现为胚油分含量增加。所述胚发育减慢可表现为胚面积减少。所述胚油分积累减少可表现为表现为胚油分含量降低。
本发明还保护一种培育转基因玉米甲的方法，包括如下步骤：提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性，得到转基因玉米甲；与受体玉米相比，转基因玉米甲的胚发育加快和/或胚油分积累增加。
上述方法中，所述“提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述提高受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性可通过向受体玉米中导入编码所述蛋白质ZmRLK9的核酸分子实现。
上述方法中，编码所述蛋白质ZmRLK9的核酸分子可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：
c1)编码区为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
c2)核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
c3)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmRLK9的DNA分子；
c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmRLK9的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:2由2832个核苷酸组成，SEQ ID NO:3由2034个核苷酸组成。SEQID NO:3或SEQ ID NO:2的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
上述方法中，所述向受体玉米中导入编码所述蛋白质ZmRLK9的核酸分子具体可通过向受体玉米导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。所述重组载体具体可为所述重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9。
本发明还保护一种玉米育种方法，包括如下步骤：增加玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性，从而促进玉米胚发育和/或促进玉米胚油分积累。
上述任一所述的方法中，所述玉米胚发育加快或促进玉米胚发育可表现为胚面积增加。所述胚油分积累增加或促进玉米胚油分积累可表现为胚油分含量增加。
本发明还保护一种培育转基因玉米乙的方法，可包括如下步骤：抑制受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性，得到转基因玉米乙；与受体玉米相比，转基因玉米乙的胚发育减慢和/或胚油分积累减少。
上述方法中，所述抑制受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性的目的。
上述方法中，所述抑制受体玉米中上述任一所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性可通过向受体玉米中导入抑制受体玉米中所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性的物质实现。
上述方法中，所述抑制受体玉米中所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性的物质可为实施例提及的重组质粒pBUE411-ZmRLK9。所述重组质粒pBUE411-ZmRLK9可为将SEQ IDNo：4所示的DNA双链分子插入pBUE411-BG载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。
上述任一所述的方法中，所述胚发育减慢可表现为胚面积减少。所述胚油分积累减少可表现为表现为胚油分含量降低。
实验证明，在玉米中过表达ZmRLK9基因，得到转基因玉米；与出发玉米相比，转基因玉米的胚面积和成熟籽粒的油分含量均显著增加。在玉米中抑制ZmRLK9基因，得到敲除ZmRLK9基因水稻；与出发玉米相比，敲除ZmRLK9基因水稻的胚面积和成熟籽粒的油分含量均显著降低。因此，蛋白质ZmRLK9可以调控玉米籽粒胚发育和油分含量。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米的鉴定。A为ZmRLK9基因的结构以及3个ZmRLK9纯合突变株的突变类型。B为T2代纯合转ZmRLK9基因玉米中ZmRLK9基因的相对表达量。数值显示为平均值±标准差，3个生物学技术重复，采用双尾t检验分析显著性差异(**P<0.01)。
图2为ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米的胚面积比较。A为ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米的胚表型，Bar＝1mm。B为ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米授粉后第9天胚面积统计结果。数值显示为平均值±标准差，每个系至少30个样品参与统计，采用双尾t检验分析显著性差异(**P<0.01)。C为ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米胚面积的动态曲线，插入图表为授粉后9天的胚面积统计图；每个系至少30个样品参与统计，采用双尾t检验分析显著性差异(**P<0.01)。
图3为ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米中成熟籽粒油分含量比较。A为2020年海南收获的玉米自交系B73-329和ZmRLK9纯合突变株每粒种子的平均含油量。B为2020年北京收获的玉米自交系B73-329、T2代纯合转ZmRLK9基因玉米和ZmRLK9纯合突变株每粒种子的平均含油量。数值显示为平均值±标准差，每个系至少90个样品参与统计，采用双尾t检验分析显著性差异(**P<0.01，*P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pBUE411-BG载体记载于如下文献中：Xing，H.L.，Dong，L.，Wang，Z.P.，Zhang，H.Y.，Han，C.Y.，Liu,B.，Wang,X.C.，and Chen，Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing inplants.Bmc Plant Biology 14.pBUE411-BG载体具有抗膦丝菌素抗性(又称草胺磷抗性)。
玉米自交系B73-329记载于如下文献中：Zhang M，Cao Y，Wang Z，et al.Aretrotransposon in an HKT1 family sodium transporter causes variationofleafNa+exclusion and salt tolerance in maize[J].New Phytologist，2017.在文献中的名称为玉米B73-329。
实施例1、蛋白质ZmRLK9及其编码基因的发现
本发明的发明人经过大量实验，从玉米自交系B73(以下简称玉米B73)中发现了ZmRLK9基因。
玉米B73的基因组DNA中，ZmRLK9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
玉米B73的cDNA中，ZmRLK9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
ZmRLK9基因编码蛋白质ZmRLK9。蛋白质ZmRLK9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2、蛋白质ZmRLK9在调控玉米籽粒胚发育和油分含量中的应用
一、ZmRLK9纯合突变株的获得及鉴定
本实施例选择一个靶点进行实验。靶点序列为：5’-TGTCGTGGAACTCGTCCCA-3’(即SEQ ID No：2自5’末端起第420-438位)，对应靶基因为ZmRLK9基因。
1、重组质粒pBUE411-ZmRLK9的获得
(1)根据靶点设计并合成引物RLK9-CAS9-F：5’-GGCGTGGGACGAGTTCCACGACA-3’和引物RLK9-CAS9-R：5’-AAACTGTCGTGGAACTCGTCCCA-3’，用去离子水分别将引物RLK9-CAS9-F和引物RLK9-CAS9-R稀释至100μM，得到引物RLK9-CAS9-F稀释液和引物RLK9-CAS9-R稀释液；然后进行退火反应，形成退火靶点片段。
退火程序为：95℃10min，89℃7-8min，83℃7-8min，77℃7-8min，71℃7-8min，16℃保存。
(2)将pBUE411-BG载体和退火靶点片段连接，得到重组质粒pBUE411-ZmRLK9。
连接体系为15μL，由2μL退火靶点片段、2μL pBUE411-BG载体、1.5μL 10×NEBT4Buffer、1.5μL 10×BSA、1μL限制性内切酶BsaI、1μL T4 Ligase和6μL ddH2O组成。
连接程序为：37℃5h；50℃5min；80℃10min。
将重组质粒pBUE411-ZmRLK9进行测序。测序结果表明，重组质粒pBUE411-ZmRLK9为将SEQ ID No：4所示的DNA双链分子插入pBUE411-BG载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。
SEQ ID No：4：5’-GCACAGTACGCGATCCTCT-3’。
2、ZmRLK9纯合突变株的获得及鉴定
由于玉米是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的ZmRLK9基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的ZmRLK9基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株数指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的ZmRLK9基因发生了突变、另一条同源染色体的ZmRLK9基因未发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的ZmRLK9基因均未发生突变。
(1)将重组质粒pBUE411-ZmRLK9通过液氮冷冻法转至根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
(2)将重组农杆菌转化至玉米自交系B73-329，经过筛选、分化和生根后，获得T0代拟转基因玉米。具体转化方法参考如下文献：魏晓禹，邵诗迪，孙苏等，农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立，吉林农业大学学报，2017(06)640-647；黄璐，卫志明，农杆菌介导的玉米遗传转化[J]，实验生物学报，1999(04).
(3)分别以T0代拟转基因玉米叶片的基因组DNA为模板，采用引物F：5’-TGGTGTGATCAGGCCATCTG-3’和引物R：5’-ATGCTGACGTTCGGTAGCTC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果与ZmRLK9基因(SEQ ID No：2所示)Cas9目标序列进行比对，统计突变类型。获得若干杂合突变株。
(4)分别将步骤(3)获得的杂合突变株进行自交，得到的种子即为T1代种子，T1代种子长成的植株即为T1代植株；将T1代植株自交，得到的种子即为T2代种子，T2代种子长成的植株即为T2代植株。
(5)分别以T2代植株叶片的基因组DNA为模板，采用引物F：5’-TGGTGTGATCAGGCCATCTG-3’和引物R：5’-ATGCTGACGTTCGGTAGCTC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。分别将PCR扩增产物进行Sanger测序。测序结果与ZmRLK9基因(SEQ ID No：2所示)Cas9目标序列进行比对，统计突变类型。
检测结果见图1中A(WT为玉米自交系B73-329)。获得3株ZmRLK9纯合突变株，分别命名为KO-1、KO-2和KO-3。
KO-1的两条同源染色体的ZmRLK9基因发生了相同的突变，具体为两条同源染色体上在ZmRLK9基因均发生了“TCGGATCCGCGACCGTGTCGTGGAACTCG”29个核苷酸的缺失(即SEQID No：2自5’末端起第405至433位缺失)，从而引起了移码，导致蛋白质ZmRLK9的功能缺失。
KO-2的两条同源染色体的ZmRLK9基因发生了相同的突变，具体为两条同源染色体上在ZmRLK9基因均发生了“GT”2个核苷酸的缺失(即SEQ ID No：2自5’末端起第421至422位缺失)和“GTGGAA”6个核苷酸的缺失(即SEQ ID No：2自5’末端起第424至429位缺失)，从而引起了移码，导致蛋白质ZmRLK9的功能缺失。
KO-3的两条同源染色体的ZmRLK9基因发生了相同的突变，具体为两条同源染色体上在ZmRLK9基因均发生了“TGTCGTG”7个核苷酸的缺失(即SEQ ID No：2自5’末端起第420至426位缺失)，从而引起了移码，导致蛋白质ZmRLK9的功能缺失。
二、T2代纯合转ZmRLK9基因玉米的获得及鉴定
植物表达载体pBCXUN-UbiP为将pBCXUN载体(记载于如下文献中：Chen Songbiao，SongkumarnPattavipha，Liu Jianli，et al.A versatile zero background T-vectorsystem for gene cloning and functional genomics.[J].Plant Physiol.，2009，150:1111-21.)中的HYG基因更换为Bar基因得到的重组质粒。Bar基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。植物表达载体pBCXUN-UbiP中，启动子为Ubiquitin启动子，终止子为T-nos终止子。植物表达载体pBCXUN-UbiP具有抗膦丝菌素抗性(又称草胺磷抗性)。
1、向植物表达载体pBCXUN-UbiP的限制性内切酶XcmI的识别位点插入核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的ZmRLK9基因，得到重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9。
重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9表达SEQ ID NO:1所示的蛋白质ZmRLK9。
2、重组农杆菌的获得
(1)将重组质粒pBCXUN-UbiP-ZmRLK9导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pBCXUN-UbiP-ZmRLK9。
(2)将植物表达载体pBCXUN-UbiP导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pBCXUN-UbiP。
3、T2代纯合转ZmRLK9基因玉米的获得
(1)采用农杆菌侵染玉米幼胚的方法将EHA105/pBCXUN-UbiP-ZmRLK9转化玉米自交系B73-329，获得T0代拟转ZmRLK9基因玉米。
(2)分别提取T0代拟转ZmRLK9基因玉米叶片的基因组DNA并以其作为模板，以5’-ATCGACCACCCAAATGTCGT-3’和5’-CGGCTCAAGAGGATGTTGGA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果能够获得257bp的PCR扩增产物，则相应的T0代拟转ZmRLK9基因玉米为T0代转ZmRLK9基因玉米；如果不能获得257bp的PCR扩增产物，则相应的T0代拟转ZmRLK9基因玉米不为T0代转ZmRLK9基因玉米。
(3)将T0代转ZmRLK9基因玉米自交，获得T1代转ZmRLK9基因玉米；将T1代转ZmRLK9基因玉米自交，获得T2代纯合转ZmRLK9基因玉米。
将其中3个T2代纯合转ZmRLK9基因玉米株系分别命名为OE-1、OE-2和OE-3。
参照上述步骤，将EHA105/pBCXUN-UbiP转化玉米自交系B73-329，获得T2代纯合转空载体玉米。
4、实时定量PCR检测T2代纯合转ZmRLK9基因玉米中ZmRLK9基因的相对表达量
待测玉米为T2代纯合转空载体玉米、玉米自交系B73-329、OE-1、OE-2或OE-3。
(1)提取待测玉米生长至9DAP的籽粒胚的总RNA，之后用逆转录酶进行反转录，得到待测玉米的cDNA。
(2)实时定量PCR检测待测玉米籽粒的cDNA中ZmRLK9基因的相对表达量(以Zm00001d010159基因为内参基因)。
检测ZmRLK9基因的引物为5’-TTCTCCCCTCCTCTCCGGCTCT-3'和5’-GCGTCCGATGCCAGGTCGTC-3'。
检测Zm00001d010159基因的引物为5’-TCACCCTGTGCTGCTGACCG-3'和5’-GAACCGTGTGGCTCACACCA-3'。
以玉米自交系B73-329中ZmRLK9基因的相对表达量作为1，部分待测玉米中ZmRLK9基因的相对表达量见图1中B(WT为玉米自交系B73-329)。
结果表明，T2代纯合转空载体玉米和玉米自交系B73-329中ZmRLK9基因的相对表达量无显著差异；与玉米自交系B73-329相比，OE-1、OE-2和OE-3中ZmRLK9基因的相对表达量均显著增加(约20至30倍)。
三、ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米中籽粒胚的表型观察
1、种植待测玉米(玉米自交系B73-329、OE-1、OE-2、OE-3、KO-1、KO-2或KO-3)，自交；授粉后第9天取果穗，剥取每穗中段三分之一处的30个籽粒，将其胚剥离出来。
2、完成步骤1后，随机选取10个胚，在解剖镜下拍照。
结果见图2中A(WT为玉米自交系B73-329)。
3、完成步骤1后，使用ImageJ软件计算胚面积并进行显著性分析。
分析结果见图2中B(WT为玉米自交系B73-329)。结果表明，与玉米自交系B73-329相比，ZmRLK9纯合突变株(如KO-1、KO-2、KO-3)的胚面积显著减小，T2代纯合转ZmRLK9基因玉米(如OE-1、OE-2、OE-3)的胚面积显著增加。
4、为了更详细的观察蛋白质ZmRLK9对玉米籽粒胚发育过程的影响，对授粉后的胚的大小进行了动态统计。具体如下：种植待测玉米(玉米自交系B73-329、OE-1或KO-1)，自交；分别在授粉后第9天、第13天、第16天和第23天取果穗，剥取每穗中段三分之一处的30个籽粒，将其胚剥离出来，使用ImageJ软件计算胚面积并进行显著性分析。
分析结果见图2中C(WT为玉米自交系B73-329)。结果表明，与玉米自交系B73-329相比，ZmRLK9纯合突变株(如KO-1)授粉后第9天、第13天、第16天和第23天胚面积显著减小；T2代纯合转ZmRLK9基因玉米(如OE-1)授粉后第9天、第13天、第16天和第23天胚面积显著增加。
由此可见，蛋白质ZmRLK9正向调控玉米籽粒胚发育(表现为胚面积的显著增加)。四、ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米中成熟籽粒油分含量的测定
玉米籽粒约80％的油分在胚里，由于蛋白质ZmRLK9正向调控玉米籽粒胚发育，因此进一步检测了ZmRLK9纯合突变株和T2代纯合转ZmRLK9基因玉米中籽粒油分含量。具体步骤如下：
1、2020年在海南种植待测玉米(玉米自交系B73-329、KO-1、KO-2或KO-3)，自交，收获成熟籽粒。采用核磁共振含油量检测仪(纽迈科技公司的产品，型号为NMI20-015V-I)检测每粒成熟籽粒的油分含量。
部分检测结果见图3中A(WT为玉米自交系B73-329)。结果表明，与玉米自交系B73-329相比，ZmRLK9纯合突变株(如KO-1、KO-2、KO-3)成熟籽粒的油分含量显著降低。
2、2020年在北京种植待测玉米(玉米自交系B73-329、OE-1、OE-2、KO-1、KO-2)，自交，收获成熟籽粒。采用核磁共振含油量检测仪检测成熟籽粒的油分含量。
部分检测结果见图3中B(WT为玉米自交系B73-329)结果表明，与玉米自交系B73-329相比，ZmRLK9纯合突变株(如KO-1、KO-2)成熟籽粒的油分含量显著降低，T2代纯合转ZmRLK9基因玉米(如OE-1、OE-2)成熟籽粒的油分含量显著增加。可见，蛋白质ZmRLK9通过调控胚发育来改变籽粒油分。
由此可见，蛋白质ZmRLK9正向调控玉米籽粒胚的油分积累(表现为成熟籽粒油分含量的显著增加)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质ZmRLK9，为如下b1)或b2)或b3)或b4)：
b1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；
b2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于玉米且与玉米籽粒中胚发育和/或油分含量相关的蛋白质；
b4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于玉米且与玉米籽粒中胚发育和/或油分含量相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质ZmRLK9的核酸分子。
3.根据权利要求2所述核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：
c1)编码区为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
c2)核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的DNA分子；
c3)核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的DNA分子；
c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码权利要求1中所述蛋白质ZmRLK9的DNA分子；
c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码权利要求1中所述蛋白质ZmRLK9的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
5.权利要求1所述蛋白质ZmRLK9、权利要求2或3所述核酸分子或含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物的应用，为如下A1)-A4)中的至少一种：
A1)促进玉米胚发育；
A2)促进玉米胚油分积累；
A3)培育玉米胚发育加快的转基因玉米；
A4)培育玉米胚油分积累增加的转基因玉米。
6.一种培育转基因玉米甲的方法，包括如下步骤：提高受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性，得到转基因玉米甲；与受体玉米相比，转基因玉米甲的胚发育加快和/或胚油分积累增加。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性通过向受体玉米中导入编码所述蛋白质ZmRLK9的核酸分子实现。
8.一种培育转基因玉米乙的方法，包括如下步骤：抑制受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性，得到转基因玉米乙；与受体玉米相比，转基因玉米乙的胚发育减慢和/或胚油分积累减少。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制受体玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性通过向受体玉米中导入抑制受体玉米中权利要求1所述蛋白质ZmRLK9的表达量和/或活性的物质实现。
10.根据权利要求5所述的应用或权利要求6至9任一所述的方法，其特征在于：
所述玉米胚发育加快或促进玉米胚发育表现为胚面积增加；
所述胚油分积累增加或促进玉米胚油分积累表现为胚油分含量增加；
所述胚发育减慢表现为胚面积减少；
所述胚油分积累减少表现为表现为胚油分含量降低。
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