CN113846120B - 蛋白质TaTIN103在调控小麦分蘖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蛋白质TaTIN103在调控小麦分蘖中的应用，蛋白质TaTIN103的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。实验证明，降低小麦Fielder中蛋白质TaTIN103的表达量和/或活性，得到转基因小麦；与小麦Fielder相比，转基因小麦的有效分蘖数显著减少。由此可见，蛋白质TaTIN103可以调控小麦分蘖。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质TaTIN103在调控小麦分蘖中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质TaTIN103在调控小麦分蘖中的应用。
背景技术
小麦产量构成的三要素为单位面积穗数、穗粒数和粒重，三者关系的相互协调，在提高小麦产量方面有重要的意义。其中，单位面积穗数直接受控于分蘖的发生量，分蘖是反映小麦生长发育和田间管理的重要指标之一，作为影响小麦产量的重要因素而备受育种家关注，并且随着“理想株型”概念的发展与兴起，分蘖更是作为其中一个重要的方面而被广泛关注与研究。
分蘖是禾本科植物小麦、水稻等特有的分枝形式，分蘖与双子叶植物分枝的本质区别在于其生于茎秆基部不伸长节间，并且生有不定根，可以与主茎分离而单独存活。分蘖的形成过程分为两个主要步骤，即分蘖芽的形成和分蘖芽的伸长。其形成过程受到遗传因素、环境条件(温度、光照、水分、养分等)以及植物激素(独脚金内酯、生长素、细胞分裂素等)共同调控。目前在水稻中已经克隆出如MOC1、MOC3、IPA1等等诸多调控分蘖的基因，但是在小麦中，由于其巨大的基因组(17Gb)、多倍体特性、大量的重复序列(85％)已及低效率的遗传转化，尽管报道了大量的调控分蘖的QTL位点，但是克隆的调控分蘖的基因比较少，对其分子机制的研究更是鲜见报道。
因此，挖掘和克隆调控小麦分蘖的基因，阐释其分子机制，对于研究小麦株型的遗传基础、改良小麦株型进而提高小麦产量具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的是调控小麦分蘖。
本发明首先保护蛋白质TaTIN103的应用，可为S1)或S2)：
S1)调控小麦分蘖；
S2)培育分蘖改变的转基因小麦。
上述应用中，所述蛋白质TaTIN103可为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID No：3所示的蛋白质；
a2)在SEQ ID No：3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将SEQ ID No：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与小麦分蘖相关的蛋白质。
其中，SEQ ID No：3由568个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No：3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No：2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码所述蛋白质TaTIN103的核酸分子的应用，可为S1)或S2)：
S1)调控小麦分蘖；
S2)培育分蘖改变的转基因小麦。
上述应用中，所述编码蛋白质TaTIN103的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3) 或b4)或b5)所示的DNA分子：
b1)编码区是SEQ ID No：2所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID No：2所示的DNA分子；
b3)核苷酸序列是SEQ ID No：1所示的DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质TaTIN103的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质TaTIN103的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID No：1由2015个核苷酸组成，SEQ ID No：2由1707个核苷酸组成。SEQID No：2的核苷酸编码SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质TaTIN103的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质TaTIN103的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质TaTIN103，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质TaTIN103的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述任一所述的应用中，所述调控小麦分蘖可为增加小麦分蘖或减少小麦分蘖。
上述任一所述的应用中，所述培育分蘖改变的转基因小麦可为培育分蘖增加的转基因小麦或培育分蘖减少的转基因小麦。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：降低出发小麦中所述蛋白质TaTIN103的表达量和/或活性，得到转基因小麦；与出发小麦相比，转基因小麦的分蘖减少。
上述方法中，所述降低出发小麦中所述蛋白质TaTIN103的表达量和/或活性通过向出发小麦中导入植物基因组编辑的载体实现；
所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；
所述sgRNA在小麦中识别的靶标DNA为编码所述蛋白质TaTIN103的DNA分子的一部分。
上述方法中，所述植物基因组编辑的载体还可含有Cas9蛋白的编码基因。
上述方法中，所述sgRNA识别的靶点可为SEQ ID No：1自5’末端起第39-57 位所示的DNA分子和第156-174位所示的DNA分子。
所述植物基因组编辑的载体具体可为重组质粒pBUE411-TaTIN103。
所述重组质粒pBUE411-TaTIN103的构建过程如下：
(1)以中间载体pCBC-MT1T2为模板，采用引物tin103-MT1T2-F：5' -aataatggtctctggcgAAGCTAGATAGGAACAGGAgttttagagctagaaatagc-3'和引物 tin103-MT1T2-R：5'-attattggtctctaaacCATGGGAACACCGCGCTGCTcgcttcttggtgcc-3' 组成的引物对进行PCR扩增，回收约964bp的DNA片段。
(2)制备反应体系。反应体系为15μL，由2μLDNA片段、2μL pBUE411-TaU3p 载体、1.5μL10×NEB T4 Buffer、1.5μL10×BSA、1μL限制性内切酶BsaI、1μLT4 DNA连接酶和6μLddH2O组成。
(3)取步骤(2)制备的反应体系，连接(反应程序为：37℃5h，50℃5min， 80℃10min)，然后将5μL连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆测序。选择靶位点序列均正确构建在pBUE411-TaU3p载体上的阳性克隆，使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取质粒，得到重组质粒pBUE411-TaTIN103。
本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：降低出发小麦中所述蛋白质TaTIN103的表达量和/或活性，从而减少分蘖。
上述任一所述小麦可为c2)或c3)：c2)小麦Fielder；c3)小麦偃展4110。
上述任一所述分蘖可为分蘖数。
上述任一所述分蘖数可为有效分蘖数。
实验证明，采用含有重组质粒pBUE411-TaTIN103的重组农杆菌转化小麦Fielder，能够对TaTIN103基因进行编辑，TaTIN103基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成TaTIN103基因突变，当两条同源染色体的TaTIN103基因均发生突变时，可以导致蛋白质TaTIN103活性丧失，得到蛋白质TaTIN103活性丧失的转基因小麦。与小麦Fielder相比，转基因小麦的有效分蘖数显著减少。由此可见，蛋白质TaTIN103 可以调控小麦分蘖。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为YZ4110与m103-1的表型分析。其中，a为蜡熟期YZ4110和m103-1表型， Bar＝5cm；b为YZ4110和m103-1籽粒表型，Bar＝1cm；c为三叶期YZ4110和m103-1茎基部分蘖芽生长状态，Bar＝0.5cm。
图2为YZ4110和m103-1农艺性状统计。
图3为TaTIN103基因在小麦6B染色体上的精细定位。
图4为T0代双等位基因突变株和野生型的分子鉴定和分蘖表型，Bar＝10cm。
图5为T1代转基因小麦的分子鉴定和分蘖表型，Bar＝10cm。
图6为T1代转基因小麦的有效分蘖数统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
2×TSINGKE Master Mix(blue)为北京擎科新业生物技术有限公司的产品，产品目录号为TSE004。DNA marker(pBR322/MspI)为北京百奥莱博科技有限公司的产品，产品目录号为BTN90602G。高保真性PCR酶(即KOD FX Neo)为TOYOBO公司的产品，产品目录号为KFX-201。AxyPrep质粒DNA小量试剂盒为Axygen公司的产品，产品目录号为AP-MN-P-250。限制性内切酶BsaI和T4 DNA连接酶购为NEB公司的产品，产品目录号分别为#R0535V和#M0202V。大肠杆菌TOP10感受态细胞和农杆菌EHA105感受态细胞均为北京庄盟生物技术有限公司的产品，产品目录号分别为ZC104-2和ZC142。
中间载体pCBC-MT1T2在文献“Hui-Li Xing，Li Dong，Zhi-Ping Wang，Hai-YanZhang，Chun-Yan Han，Bing Liu，Xue-Chen Wang，Qi-Jun Chen.A CRISPR/Cas9 toolkitfor multiplex genome editing in plants.BMC Plant Biology，2014，14:327.”中公开过，由中国农业科学院作物科学研究所保存。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
pBUE411-TaU3p载体在文献“王志平(2017)博士论文，《植物基因组和碱基编辑工具箱的创制及功能验证》”中公开过，由中国农业科学院作物科学研究所保存。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
小麦偃展4110(简称为YZ4110)记载于如下文献中：曹廷杰,赵虹,王西成,杨辉.国审小麦新品种偃展4110的综合表现及利用前景分析.中国农学通报，2004， 20(5):77-78.由中国农业科学院作物科学研究所保存。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
小麦济麦20记载于如下文献中：罗继春，焦建国，任德昌，刘建军.高产优质广适小麦新品种——济麦20.麦类作物学报，2006，26(1)：159.由中国农业科学院作物科学研究所保存。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
小麦Fielder记载于如下文献中：Yuji Ishida，Masako Tsunashima，YukohHiei，Toshihiko Komari.Wheat(Triticumaestivum L.)Transformation Using ImmatureEmbryos.Methods in Molecular Biology，2015，1223，189-198.由中国农业科学院作物科学研究所保存。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
实施例1、小麦少分蘖突变体m103-1的表型鉴定与TaTIN103基因的获得
一、小麦少分蘖突变体m103-1的表型
在YZ4110EMS诱变构建的突变体库中，筛选到一个少分蘖突变体，少分蘖表型能够稳定遗传，突变体命名为m103-1。
与YZ4110相比，m103-1植株分蘖数目显著减少(见图1中a)，籽粒充实不饱满 (见图1中b)。三叶期对m103-1茎基部进行解剖分析发现，其基部不伸长节间有分蘖芽形成，但是后期却并不能形成分蘖，初步说明分蘖数目减少的原因是分蘖芽的伸长受到抑制(见图1中c)。
大田条件下，m103-1只能产生1-3个有效分蘖，极显著低于YZ4110。农艺性状调查表明，除了有效分蘖数外，m103-1在株高、穗长、小穗数、穗粒数和千粒重等方面均极显著低于YZ4110(见图2)。
二、m103-1的遗传分析与TaTIN103基因的获得
1、对431株YZ4110×m103-1衍生的F2群体分析表明，后代少分蘖单株(有效分蘖不大于4)为116株，多分蘖单株(有效分蘖大于4)为315株，符合一对隐性基因的遗传模式(χ2＝0.842<χ2 0.05＝3.84；P＝0.36>0.05)，m103-1的有效分蘖数目突变由一对隐性等位基因控制。
2、为了获得m103-1中调控分蘖的基因，选择分蘖力强、成穗率高、株型较好的小麦济麦20为母本，m103-1为父本杂交获得F1，最后自交得到F2分离群体(11155 株，其中2013-2014年新乡种植4246株，2015-2016年新乡种植6909株)，在该F2分离群体中选择分蘖数目极端少(有效分蘖数不大于2)和分蘖数目极端多(有效分蘖数不少于20)各约30个单株，构建混合池，2个生物学重复，交由北京博奥晶典生物技术有限公司利用小麦660K SNP芯片进行基因分型检测。
结果表明，染色体6B上有差异的探针数目最多，并且大多集中在染色体6B短臂靠近端粒的区段，设计SSR引物进行连锁分析，初步发现调控小麦分蘖的基因在标记 m336和m148之间，完成了初步定位。
3、根据初步定位的结果，根据网上公布的中国春参考基因组序列 (https://urgi.versailles.inra.fr/blast/)，在突变基因所在的区域附近进一步设计SSR标记，利用济麦20×m103-1杂交组合获得的F2分离群体进行突变基因的精细定位。
最终将候选基因定位在m509和m74分子标记之间，并与m446标记共分离。根据中国春参考基因组序列预测，候选区段约340Kb，共有6个候选基因，通过对目标区段候选基因测序验证，发现TraesCS6B02G013100.1(命名为TaTIN103)基因在编码区第373位和392位碱基均由G突变为A，造成了两个氨基酸的改变(A突变为T，S 突变为N)(见图3)。
上述SSR标记开发过程如下：根据与候选基因连锁的分子标记在染色体上的位置，以及网上公布的中国春参考基因组序列，下载候选基因附近的参考序列，用 BatchPrimer3(https://wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/)搜索序列中潜在的SSR序列，并将网站推荐的引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用于定位的分子标记m74、m148、m336、m446、m483、m509的核苷酸序列见表2。
表2
分子标记名称 上游引物的核苷酸序列(5'-3') 下游引物的核苷酸序列(5'-3')
m74 CAAGCGATGGAATTGATCT TAATACAGTCTGGCTGGGATA
m148 TCAACGAGTACTTCCACTGAC ATTAAGCGTTACTTCCCTTTG
m336 AAGAGAAAGGAGTTGGTCCTA AGGTTACCTAAGCATCATCATC
m446 GAGTTTCAAGCATCAGAAGTG ATACCCCATTGAAATGAATCT
m483 TAGGAGCAGTATGATGCATTT ACAAAGAGTTGATTGGGACTT
m509 ACTGGTGAGATAAGTGAGCTG TTTATTCTCTTTTCCCTCCTC
上述SSR标记分析的方法如下：
(1)分别提取相关小麦单株的基因组DNA，稀释，得到浓度为30ng/μL的小麦基因组DNA。
(2)完成步骤(1)后，以小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。
反应体系为15μL，由模板2μL、上游引物(浓度为10μM)0.6μL、下游引物(浓度为10μM)0.6μL、2×TSINGKE Master Mix(blue)7.5μL和ddH2O 4.3μL组成。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35 个循环；72℃延伸5min；10℃保存。
(3)完成步骤(2)后，用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物。以DNAmarker(pBR322/MspI)为对照比较扩增产物分子量大小，银染显色。
获得上述调控小麦分蘖的TaTIN103基因的方法如下：
(1)根据网上公布的中国春参考基因组序列设计引物TaTIN-CDS-F1：5' -ATGGACCCAGCGTTGCATAAG-3'和引物TaTIN-CDS-R1：5'-CTACATCTCTTCCCAAAGGGTGA-3'。
(2)完成步骤(1)后，以YZ4110的cDNA为模板，采用引物TaTIN-CDS-F1和引物TaTIN-CDS-R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。该PCR扩增产物包含了TaTIN103基因的全部编码区。
反应体系为20μL，由cDNA模板2μL、上游引物(10μM)0.6μL、下游引物(10μM) 0.6μL、2×PCR Buffer10μL、2mM dNTPs 4μL、KOD FX Neo 0.4μL和ddH2O组成。2×PCR Buffer为KOD FX Neo中的组件。
反应程序为：95℃预变性5min；98℃变性5s，62℃退火30s，68℃延伸1min，35 个循环；68℃延伸5min；10℃保存。
(3)完成步骤(2)后，将所述PCR扩增产物进行纯化，之后由北京擎科新业生物技术有限公司测序。
结果表明，TaTIN103基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码SEQ ID NO：3 所示蛋白质TaTIN103。
TaTIN103基因的cDNA全长的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2、蛋白质TaTIN103在调控小麦分蘖中的应用
一、重组质粒pBUE411-TaTIN103的构建
本实施例选择两个靶点(分别为Target1和Target2)进行实验。Target1的序列为：5'-AAGCTAGATAGGAACAGGA-3'(即SEQ ID No：1自5’末端起第39-57位)，Target2 的序列为：5'-CATGGGAACACCGCGCTGC-3'(即SEQ ID No：1自5’末端起第156-174位)，均对应靶基因TaTIN103基因。
1、以中间载体pCBC-MT1T2为模板，采用引物tin103-MT1T2-F：5' -aataatggtctctggcgAAGCTAGATAGGAACAGGAgttttagagctagaaatagc-3'和引物 tin103-MT1T2-R：5'-attattggtctctaaacCATGGGAACACCGCGCTGCTcgcttcttggtgcc-3' 组成的引物对进行PCR扩增，回收约964bp的DNA片段。
2、制备反应体系。反应体系为15μL，由2μLDNA片段、2μL pBUE411-TaU3p载体、1.5μL10×NEB T4 Buffer、1.5μL10×BSA、1μL限制性内切酶BsaI、1μLT4 DNA 连接酶和6μLddH2O组成。
10×NEB T4 Buffer为T4 DNA连接酶中的组件。
10×BSA为限制性内切酶BsaI中的组件。
3、取步骤2制备的反应体系，反应(反应程序为：37℃5h，50℃5min，80℃10min)，然后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序引物为pBUE411-TaU3p-SeqF1：5'-TTTCCCAGTCACGACGTTGT-3'和 pBUE411-TaU3p-SeqR1：5'-ATCTCTAGAGAGGGGCACGA-3'。
选择靶位点序列均正确构建在pBUE411-TaU3p载体上的阳性克隆，使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取质粒，得到重组质粒pBUE411-TaTIN103。
二、重组农杆菌的获得
将重组质粒pBUE411-TaTIN103转化农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pBUE411-TaTIN103。
三、T0代转基因小麦的获得
1、将EHA105/pBUE411-TaTIN103接种至含利福平50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基，37℃培养过夜，得到OD600nm值为0.6-0.8的菌液。
2、取3mL菌液，4000rmp离心3min，收集沉淀；之后将沉淀用20mL含100μmol/L乙酰丁香酮的AMM液体培养基重悬，28℃、150rpm培养2h，得到侵染液。
3、取小麦Fielder的种子，去壳灭菌，平铺到愈伤诱导培养基诱导两周，挑出愈伤继代培养两周至长出直径2mm左右的愈伤颗粒。
4、将愈伤颗粒在侵染液中浸泡20min，再放到有一层滤纸的共培养基上；3天以后将愈伤用灭菌蒸馏水洗三次，每次20min；再用含500mg/L羧苄的灭菌水洗两次(可重复多次直到洗液清亮)，每次30min；将愈伤放在无菌滤纸上晾干，再将其放到一筛培养基上；两周后将愈伤转到二筛培养基上，再两周后转到三筛培养基，得到抗性愈伤。
5、将抗性愈伤转到分化培养基上，得到分化小苗。
6、将分化小苗转移到1/2MS培养基上生根，然后转到培养箱花盆内，得到22 株T0代转基因小麦，依次命名为TW153-1和TW153-22。
上述浸染的方法具体参考如下文献：Yuji Ishida，Masako Tsunashima，YukohHiei， Toshihiko Komari.Wheat(Triticumaestivum L.)Transformation UsingImmature Embryos.Methods in Molecular Biology，2015，1223，189-198.
四、T0代转基因小麦突变类型的分子鉴定与表型鉴定
1、分别以T0代转基因小麦的基因组DNA(gDNA)为模板，采用引物 tin103-CRISPR-F1：5'-TGCTTGGTTGAACCATTTACGTT-3'和引物tin103-CRISPR-R1： 5'-ATCTTGGCCACAACGTCGGT-3'组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。
反应体系为20μL，由模板2μL、引物tin103-CRISPR-F1水溶液(10μM)0.6μL、引物tin103-CRISPR-R1水溶液(10μM)0.6μL、2×PCR Buffer10μL、2mM dNTPs 4μL、 KOD FX Neo0.4μL和ddH2O组成。
反应程序为：95℃预变性5min；98℃变性5s，62℃退火30s，68℃延伸1min，35 个循环；68℃延伸5min；10℃保存。
2、分别将PCR扩增产物回收纯化，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。
3、使用DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)分析测序结果，统计突变类型。
小麦是异源六倍体植物，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的TaTIN103基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的TaTIN103基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的TaTIN103基因发生了突变、另一条同源染色体的TaTIN103基因未发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的TaTIN103基因均未发生突变。
共检测T0代转基因小麦植株22株：2株为双等位基因突变株(分别为TW153-17 和TW153-19)，3株为杂合突变株，17株为野生型(其中两株为TW153-15和TW153-21)。
观察TW153-15、TW153-21、TW153-17和TW153-19的分蘖情况。
分子鉴定与分蘖表型鉴定结果见图4。结果表明，TW153-17和TW153-19在TaTIN103基因中均发生了缺失、突变和/或插入，造成蛋白质TaTIN103功能缺失；与未发生基因编辑株系TW153-15或TW153-21相比，TW153-17和TW153-19的有效分蘖数均显著减少。
五、T1代转基因小麦突变类型的分子鉴定和表型鉴定
1、将TW153-17进行自交，得到自交一代，将其中两株命名为17-T1-1和17-T1-2。将TW153-19进行自交，得到自交一代，将其中两株命名为19-T1-1和19-T1-2。将 TW153-15进行自交，得到自交一代，将其中两株命名为15-T1-1和15-T1-2。将TW153-21 进行自交，得到自交一代，将其中两株命名为21-T1-1和21-T1-2。
2、分别以T1代转基因小麦(15-T1-1、15-T1-2、21-T1-1、21-T1-2、17-T1-1、17-T1-2、19-T1-1或19-T1-2)的gDNA为模板，采用引物tin103-CRISPR-F1：5' -TGCTTGGTTGAACCATTTACGTT-3'和引物tin103-CRISPR-R1： 5'-ATCTTGGCCACAACGTCGGT-3'组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。
3、分别将PCR扩增产物回收纯化，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。
4、使用DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)分析测序结果，统计突变类型。
结果表明，15-T1-1、15-T1-2、21-T1-1和21-T1-2在TaTIN103基因中未发生缺失、突变或插入。17-T1-1、17-T1-2、19-T1-1和19-T1-2的突变情况见图5中下图。17-T1-2 和19-T1-2在TaTIN103基因中均发生了缺失，造成蛋白质TaTIN103功能缺失。17-T1-1 在TaTIN103基因中发生了缺失、突变和/或插入，造成蛋白质TaTIN103功能缺失。 19-T1-1在TaTIN103基因中发生了插入，造成蛋白质TaTIN103功能缺失。17-T1-1、 17-T1-2、19-T1-1和19-T1-2均为纯合突变株。
5、T1代转基因小麦的分蘖表型鉴定
观察Fielder、17-T1-1、17-T1-2、19-T1-1和19-T1-2的分蘖情况并统计有效分蘖数。
分蘖情况见图5中上图。结果表明，与未发生基因编辑株系(如小麦Fielder) 相比，17-T1-1、17-T1-2、19-T1-1和19-T1-2的有效分蘖数显著减少。
有效分蘖数统计结果见图6(编辑株系为17-T1-1、17-T1-2、19-T1-1和19-T1-2 的有效分蘖数平均值，未编辑株系为15-T1-1、15-T1-2、21-T1-1、21-T1-2和小麦 Fielder的有效分蘖数平均值)。结果表明，与未编辑株系相比，编辑株系的有效分蘖数显著减少。上述结果表明，蛋白质TaTIN103可以调控小麦有效分蘖数。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 蛋白质TaTIN103在调控小麦分蘖中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2015
<212> DNA
<213> Triticum aestivum L.
<400> 1
aaggtagcag agaagaggaa ggagggagtg aggagtagaa gctagatagg aacaggatgg 60
acccagcgtt gcataaggcg gcggtgcaag ggagcgtggc aagcctgagg aagctggtgg 120
ccgagcggcc cggcatcctt ggttccaaga cgccccatgg gaacaccgcg ctgcacatcg 180
cggccgaaat cggccatgcc ggcttcgcgg aggaggtcct cggtgcggac tacaagctgc 240
tcgccacaag gaacgccgat ggcgacacgc cgctgcacct ggcggccagg gtaggtaagg 300
tggacgtggt ggagctgcta ctcagccgcg ccagagcatg gtctgcagag cagccgcagg 360
actcccatgg gagcgagcag gggccggtgc tcatggccaa caaggccggc gacaccccgc 420
tgcatgaggc ggtgaagcac ggcaggagcg ccgtggcgct cttgctgttg gccgcccagc 480
ccagcctagg ccacgcgctc aacgtgaagc agcagtcgcc gctgcacatc gccgccgggg 540
agggcctcac cgacgttgtg gccaagatca tcggccagcc ctgggtccac gagaggtttg 600
tcccatctga ctccatgagc agcaccgcct tgcaccaggc cgtcctcggc ggccacatcc 660
gtgtggtgga gatgttgctt gacgcgacgc cgcatgagca gatcgggctg acggactcgt 720
ccgagaacaa cgcgctgcac tacgcggcgc agaagaacaa cggccgcatg gtgaagctgc 780
tgctgaaccg gaagatggac ctggcctaca agcgcaaccg cgacctgcag tcgccgctgc 840
acgtcgccgc ctcctacggc tcgacggagg ccatggtgga gctgctgaag cagtgccctg 900
acgtggcgga gatggtggac agcaacggca ggacagcttt ccacgtcgcc gtcaccagcg 960
gcaaggtgga cgccctcaag tgcctgctca agcaagtccg ccccgaggag atcgtcaatc 1020
gcgtcgacca ccaaggcaac acgccgctgc acctagccgc tgcgctgtcg agcataaagt 1080
cggcgctgct cctgctcaag gaccgccggg tcagcccctg cgtcctcaac cgggacggcc 1140
agtccgcgcg cagtctcatc gagaagcgcg ccaccactga ggagttggac acctacgaga 1200
tgtacctgtg gaagaagctc aagaagtccg agggttccag gtgcaagaac gtgccgctgc 1260
cgcctcctcc cgcgtcttac cggtcgcggc gtagtcaggg ccaggcggct ggccacgacg 1320
agttcaacgt cacaatgctg gtggccacac tgatcgccac tgtcagcttt gccgccacct 1380
tcaccatgcc ggggggttac aaccagaccg agggcacggc catccacggc cacaaggcgg 1440
cattcaagat cttcgtcgtc accaacactg tcgccatgtg cagctccatc gtcgtcgtct 1500
tctgtccaac catgtgggca tggcgagagc gggagtggga gcggagccca gtcgagcaca 1560
aggtctacca gctcagctgg agccgcaggc tcatgtggag ccgcaggctc acaaatgtcg 1620
ccttcctcgc catgctcgcc tccttcatga cggccgtcta catcaccgtt gcgcccaccg 1680
cgaggtggcc tgcgtacctt gtgatcgcca tcgtagccag tactcccatt gtggtgttcc 1740
tcaccctttg ggaagagatg taggatttta cggagatatg tttacaatac ccaacaccca 1800
atcgtccggc accaacacat ggtaaatcga acattttaga taaaaagttt agtgacgtga 1860
ggattttgta actttagttg acaaacatga tagtgcctaa cacacggcgc gctaaaaaac 1920
agtttgcaat gccggaatcg ccagcttttg cgcggtcgcc gcaaaataaa gcatgcccga 1980
gtcgtttcag caggcacatt atattgcatc tttgt 2015
<210> 2
<211> 1707
<212> DNA
<213> Triticum aestivum L.
<400> 2
atggacccag cgttgcataa ggcggcggtg caagggagcg tggcaagcct gaggaagctg 60
gtggccgagc ggcccggcat ccttggttcc aagacgcccc atgggaacac cgcgctgcac 120
atcgcggccg aaatcggcca tgccggcttc gcggaggagg tcctcggtgc ggactacaag 180
ctgctcgcca caaggaacgc cgatggcgac acgccgctgc acctggcggc cagggtaggt 240
aaggtggacg tggtggagct gctactcagc cgcgccagag catggtctgc agagcagccg 300
caggactccc atgggagcga gcaggggccg gtgctcatgg ccaacaaggc cggcgacacc 360
ccgctgcatg aggcggtgaa gcacggcagg agcgccgtgg cgctcttgct gttggccgcc 420
cagcccagcc taggccacgc gctcaacgtg aagcagcagt cgccgctgca catcgccgcc 480
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tcgtccgaga acaacgcgct gcactacgcg gcgcagaaga acaacggccg catggtgaag 720
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gtcgccttcc tcgccatgct cgcctccttc atgacggccg tctacatcac cgttgcgccc 1620
accgcgaggt ggcctgcgta ccttgtgatc gccatcgtag ccagtactcc cattgtggtg 1680
ttcctcaccc tttgggaaga gatgtag 1707
<210> 3
<211> 568
<212> PRT
<213> Triticum aestivum L.
<400> 3
Met Asp Pro Ala Leu His Lys Ala Ala Val Gln Gly Ser Val Ala Ser
1 5 10 15
Leu Arg Lys Leu Val Ala Glu Arg Pro Gly Ile Leu Gly Ser Lys Thr
20 25 30
Pro His Gly Asn Thr Ala Leu His Ile Ala Ala Glu Ile Gly His Ala
35 40 45
Gly Phe Ala Glu Glu Val Leu Gly Ala Asp Tyr Lys Leu Leu Ala Thr
50 55 60
Arg Asn Ala Asp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Val Gly
65 70 75 80
Lys Val Asp Val Val Glu Leu Leu Leu Ser Arg Ala Arg Ala Trp Ser
85 90 95
Ala Glu Gln Pro Gln Asp Ser His Gly Ser Glu Gln Gly Pro Val Leu
100 105 110
Met Ala Asn Lys Ala Gly Asp Thr Pro Leu His Glu Ala Val Lys His
115 120 125
Gly Arg Ser Ala Val Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ser Leu
130 135 140
Gly His Ala Leu Asn Val Lys Gln Gln Ser Pro Leu His Ile Ala Ala
145 150 155 160
Gly Glu Gly Leu Thr Asp Val Val Ala Lys Ile Ile Gly Gln Pro Trp
165 170 175
Val His Glu Arg Phe Val Pro Ser Asp Ser Met Ser Ser Thr Ala Leu
180 185 190
His Gln Ala Val Leu Gly Gly His Ile Arg Val Val Glu Met Leu Leu
195 200 205
Asp Ala Thr Pro His Glu Gln Ile Gly Leu Thr Asp Ser Ser Glu Asn
210 215 220
Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Gln Lys Asn Asn Gly Arg Met Val Lys
225 230 235 240
Leu Leu Leu Asn Arg Lys Met Asp Leu Ala Tyr Lys Arg Asn Arg Asp
245 250 255
Leu Gln Ser Pro Leu His Val Ala Ala Ser Tyr Gly Ser Thr Glu Ala
260 265 270
Met Val Glu Leu Leu Lys Gln Cys Pro Asp Val Ala Glu Met Val Asp
275 280 285
Ser Asn Gly Arg Thr Ala Phe His Val Ala Val Thr Ser Gly Lys Val
290 295 300
Asp Ala Leu Lys Cys Leu Leu Lys Gln Val Arg Pro Glu Glu Ile Val
305 310 315 320
Asn Arg Val Asp His Gln Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala
325 330 335
Leu Ser Ser Ile Lys Ser Ala Leu Leu Leu Leu Lys Asp Arg Arg Val
340 345 350
Ser Pro Cys Val Leu Asn Arg Asp Gly Gln Ser Ala Arg Ser Leu Ile
355 360 365
Glu Lys Arg Ala Thr Thr Glu Glu Leu Asp Thr Tyr Glu Met Tyr Leu
370 375 380
Trp Lys Lys Leu Lys Lys Ser Glu Gly Ser Arg Cys Lys Asn Val Pro
385 390 395 400
Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ser Tyr Arg Ser Arg Arg Ser Gln Gly Gln
405 410 415
Ala Ala Gly His Asp Glu Phe Asn Val Thr Met Leu Val Ala Thr Leu
420 425 430
Ile Ala Thr Val Ser Phe Ala Ala Thr Phe Thr Met Pro Gly Gly Tyr
435 440 445
Asn Gln Thr Glu Gly Thr Ala Ile His Gly His Lys Ala Ala Phe Lys
450 455 460
Ile Phe Val Val Thr Asn Thr Val Ala Met Cys Ser Ser Ile Val Val
465 470 475 480
Val Phe Cys Pro Thr Met Trp Ala Trp Arg Glu Arg Glu Trp Glu Arg
485 490 495
Ser Pro Val Glu His Lys Val Tyr Gln Leu Ser Trp Ser Arg Arg Leu
500 505 510
Met Trp Ser Arg Arg Leu Thr Asn Val Ala Phe Leu Ala Met Leu Ala
515 520 525
Ser Phe Met Thr Ala Val Tyr Ile Thr Val Ala Pro Thr Ala Arg Trp
530 535 540
Pro Ala Tyr Leu Val Ile Ala Ile Val Ala Ser Thr Pro Ile Val Val
545 550 555 560
Phe Leu Thr Leu Trp Glu Glu Met
565

Claims (8)

1.蛋白质TaTIN103的应用，为S1）或S2）：
S1）调控小麦分蘖；所述调控小麦分蘖为增加小麦分蘖或减少小麦分蘖；
S2）培育分蘖改变的转基因小麦；所述培育分蘖改变的转基因小麦为培育分蘖增加的转基因小麦或培育分蘖减少的转基因小麦；
所述蛋白质TaTIN103为a1）或a2）：
a1）氨基酸序列是SEQ ID No：3所示的蛋白质；
a2）在SEQ ID No：3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.编码权利要求1中所述蛋白质TaTIN103的核酸分子的应用，为S1）或S2）：
S1）调控小麦分蘖；所述调控小麦分蘖为增加小麦分蘖或减少小麦分蘖；
S2）培育分蘖改变的转基因小麦；所述培育分蘖改变的转基因小麦为培育分蘖增加的转基因小麦或培育分蘖减少的转基因小麦。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码蛋白质TaTIN103的核酸分子为如下b1）或b2）所示的DNA分子：
b1）编码区是SEQ ID No：2所示的DNA分子；
b2）核苷酸序列是SEQ ID No：1所示的DNA分子。
4.一种培育转基因小麦的方法，包括如下步骤：降低出发小麦中权利要求1中所述蛋白质TaTIN103的表达量和/或活性，得到转基因小麦；与出发小麦相比，转基因小麦的分蘖减少。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述降低出发小麦中权利要求1中所述蛋白质TaTIN103的表达量和/或活性通过向出发小麦中导入植物基因组编辑的载体实现；
所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；
所述sgRNA在小麦中识别的靶标DNA为编码所述蛋白质TaTIN103的DNA分子的一部分。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶点为SEQ ID No：1自5’末端起第39-57位所示的DNA分子和第156-174位所示的DNA分子。
7.一种小麦育种方法，包括如下步骤：降低出发小麦中权利要求1中所述蛋白质TaTIN103的表达量和/或活性，从而减少分蘖。
8.如权利要求1至3任一所述的应用或权利要求4至7任一所述的方法，其特征在于：所述小麦为c2）或c3）：c2）小麦Fielder；c3）小麦偃展4110。
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CN110139872A (zh) * 2016-12-21 2019-08-16 中国农业科学院作物科学研究所 植物籽粒性状相关蛋白、基因、启动子和snp以及单倍型

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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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