CN102260338A

CN102260338A - 植物雄性育性相关蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102260338A
Application number: CN2010101836775A
Authority: CN
Inventors: 王东辉; 白书农; 许智宏
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2011-11-30

Abstract

本发明公开了一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。抑制目的植物中所述蛋白的编码基因的表达，可以得到雄性不育转基因植物。所述蛋白的编码基因可以用于培育各种雄性不育的转基因植物，对农业具有重大意义和价值。

Description

植物雄性育性相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

从上世纪70年代以来，杂种优势利用为我国水稻生产做出了重大的贡献。面临我国经济发展对农业生产所提出“高产、优质、高效、安全、生态”的新的重大需求，能否进一步发掘杂种优势的应用潜力以应对，就成为摆在当代科学家面前的一个严峻挑战。

杂种优势的形成基于两个不同亲本的组合。要在现有应用的基础上进一步发掘其潜力，除了需要加强杂种优势形成机制的研究之外，还急需建立有效的方法来创造雄性不育性状，以便有效扩大杂交组合的筛选和优秀组合在生产上的应用。

目前，在育种工作和生产上广泛应用的雄性不育性状多来自于自然突变及其性状转育株系。雄性不育性状的来源十分有限，是扩大杂交组合筛选特别是应用的严重制约因子。虽然在20世纪90年代初美国科学家就已经证明通过生物技术的方法可以创制人工控制的雄性不育性状，但是，按照目前国际通行的规则，所有具有应用潜力的创新都受到知识产权保护。因此，寻找新的、具有自主知识产权的创制人工控制雄性不育性状的思路和方法，已经成为希望把握发掘杂种优势应用潜力主动权的国家和地区所面临的无法回避、亟待解决的关键问题之一。

长期以来，人们一直利用常规育种的方法选育不育系，或者把不育性从一个品种转育到另一个品种中，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。目前，也有许多控制植物雄性不育性的基因被克隆，但是由于植物的不育性受核基因、线粒体基因、叶绿体基因和环境因素的影响，作用机理比较复杂，人们对其认识还不足，所以难在短期内获得明显的效果，基因工程雄性不育与用常规方法选育雄性不育相比具有一些特点：选育周期缩短，育性相对稳定，受环境影响小，对基因型依赖少，环境污染少。Mariani等人在1990年开创了一个创造植物雄性不育的新途径。他们应用来自于烟草的花药绒毡层特异启动子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)嵌合后转化烟草和油菜，由于核糖核酸酶的作用，转基因烟草和油菜的花药绒毡层被破坏，形成花粉败育，而转基因烟草的其他器官发育正常。目前除了Barnase基因以外，还有许多其他功能基因被应用于基因工程雄性不育的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的植物雄性育性相关蛋白(CaETR1)，来源于黄瓜(Cucumis sativusL.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的CaETR1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的CaETR1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的CaETR1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述植物雄性育性相关蛋白的基因(CaETR1)或其反义基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；

所述反义基因是与序列表中序列2所示的DNA分子反向互补的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因或其反义基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因或其反义基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因或其反义基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因或其反义基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在Pcambia1302载体的多克隆位点中插入权利要求2或3所述反义基因得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为在Pcambia1302载体的多克隆位点中插入序列3所示的启动子和所述反义基因，且由序列3所示的启动子启动所述反义基因表达，得到的重组质粒。所述重组表达载体优选为在Pcambia1302载体的BamH I和Nco I酶切位点间插入序列3所示的启动子，Nco I和Spe I酶切位点间插入序列2所示的DNA片段，得到的重组质粒。

含有以上任一所述基因(CaETR1)或其反义基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(CaETR1)或其反义基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育雄性不育转基因植物的方法，是抑制雄性可育植物中所述基因的表达，得到雄性不育转基因植物；所述雄性可育植物为携带所述基因的植物。所述方法具体可通过将所述反义基因导入所述雄性可育植物中，从而抑制所述雄性可育植物中所述基因的表达。所述反义基因具体可通过将含有所述反义基因的重组表达载体导入所述雄性可育植物中。

所述蛋白、所述基因或其反义基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于植物育种。

利用任何一种可以引导外源基因或其反义基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因或其反义基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因或其反义基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如拟南芥(如哥伦比亚生态型拟南芥)等。

本发明的发明人发现，在黄瓜单性花的发育过程中，CsETR1表达水平的时空特异性下调是导致雌花雄蕊发育早期停滞的关键环节。根据这该发现，利用器官特异性启动子抑制CsETR1在拟南芥雄蕊中的表达，结果造成类似黄瓜雌花的雄蕊发育早期停滞，转反义基因的拟南芥雄性不育，不结实。这一发现的启示：第一，既然黄瓜单性花发育中雌花雄蕊滞育的机制可以成功地应用于拟南芥，就有可能应用于水稻等其他作物；第二，上述机制能通过生物技术的方法应用于水稻而创制新的雄性不育性状，可建立应用这种性状于杂种配制的技术体系；第三，通过揭示导致黄瓜雌花雄蕊CsETR1表达水平时空特异性调控机制，找出了更简单的创制雄性不育性状的思路和方法。

附图说明

图1为AP3启动子的获得；1：Marker；2-3：PCR产物(AP3启动子部分序列；约700bp)。

图2为CsETR1基因的获得；1：DNA 15000marker；2：PCR产物(CsETR1；约2200bp)。

图3为Pcambia1302、AP31302和AP31302-anti-CaETR1的结构示意图。

图4为AP31302-anti-CaETR1质粒的鉴定；1：DL15000 DNA marker；2、3：AP31302-anti-CaETR1质粒。

图5为转基因拟南芥苗期的鉴定；1：萌发5天在筛选培养基上的拟南芥苗；2：具有抗性拟南芥苗转入土后生长15天；3-4：具有抗性拟南芥苗转入土后生长24天；5：30天的野生型拟南芥。

图6为部分抗生素阳性拟南芥苗期的PCR鉴定电泳图；1：DL2000 DNA marker；2-6：抗生素阳性拟南芥；7：野生型拟南芥。

图7为转基因拟南芥的表型观察；第一排为实体解剖图片；第二排为扫描电镜照片；第三排为石蜡切片。第一列(1)至第五列(5)：五种表型的拟南芥。

图8为转基因苗的雄蕊和雌蕊育性的检测；A：野生型拟南芥的花粉授到野生型拟南芥的雌蕊；B、C：野生型拟南芥的花粉授到转基因拟南芥的雌蕊；D：转基因拟南芥的花粉授到转基因拟南芥的雌蕊；E：转基因拟南芥自花授粉。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

黄瓜品种中农5号：2002年购自于中国农业科学院蔬菜花卉研究所；品种来源：中国农业科学院蔬菜花卉研究所以雌性系371G为母本，高抗自交系476为父本育成的杂交种。

实施例1、CsETR1的发现

从中农5号中发现一个新蛋白CsETR1，由序列表的序列1所示的氨基酸残基组成。将CsETR1的编码基因命名为CsETR1，其编码区如序列表的序列2所示。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

为了将CsETR1基因的反义基因定位地转入拟南芥的雄蕊而不影响其它器官的功能，采用B类基因特异的启动子AP3，将目的基因连到AP3启动子的下游。拟南芥中具有CsETR1基因的同源基因，所以CsETR1基因的反义基因可以抑制拟南芥中同源基因的表达，从而影响拟南芥中花药的雄性育性。

一、转基因植物的获得

(一)重组表达载体的构建

1、启动子的制备

利用NCBI上的拟南芥AP3启动子序列，设计一对引物如下：

上游引物：5’-AGGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA-3’；

下游引物：5’-CACCATGGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC-3’。

以拟南芥(Arabidopsis ecotype Col-0；购自Arabidopsis Biological ResourceCenter，USA)的基因组DNA为模板，采用上述引物对，通过RT-PCR方法获得有AP3启动子功能的部分序列，PCR产物的电泳图见图1。经测序鉴定正确。除去引入的酶切位点，PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列3。

2、CsETR1基因的制备

利用CsETR1基因的核苷酸序列，设计一对引物如下：

上游引物：5’-GTACTAGTATGGAGACTTGTTATTGC-3’；

下游引物：5’-GTCCATGGAGATGTTTCAAATAGAAC-3’。

以中农5号为模板，采用上述引物对，通过RT-PCR方法获得CsETR1基因，PCR产物的电泳图见图2。经测序鉴定正确。

3、重组表达载体的构建

Pcambia1302、AP31302和AP31302-anti-CaETR1的结构示意图见图3。

(1)用BamH I和Nco I酶切步骤1的PCR产物，回收700bp左右的DNA片段；用BamHI和Nco I酶切Pcambia1302载体(pCAMBIA1302；CAMBIA)，回收骨架载体片段；将700bp左右的DNA片段和骨架载体片段连接，得到重组质粒AP31302。

(2)用Nco I和Spe I酶切步骤2的PCR产物，回收2200bp左右的DNA片段；用Nco I和Spe I酶切重组质粒AP31302，回收骨架载体片段；将2200bp左右的DNA片段和骨架载体片段连接，得到连接产物。将连接产物进行PCR鉴定和测序。PCR鉴定的电泳图见图4。结果表明得到了目的质粒AP31302-anti-CaETR1(在Pcambia1302载体的BamH I和Nco I酶切位点间插入序列3所示的AP3启动子部分序列，Nco I和Spe I酶切位点间插入序列2所示的CsETR1基因的反义基因)。

(二)转基因植物的获得

将AP31302-anti-CaETR1利用floral tip法转入拟南芥(Arabidopsis ecotypeCol-0)：将AP31302-anti-CaETR1转入农杆菌GV3101(购自北京天为时代科技有限公司)，得到重组农杆菌；发育中的花组织直接浸入含5％蔗糖和150μl/L Silwet L-77(活性剂)的重组农杆菌菌液中，然后经过带有卡那霉素(50mg/L)的平板筛选，将具有卡那霉素抗性的再生植株转移到温室中生长。拟南芥苗期的鉴定图见图5。图5中，1：萌发5天在筛选培养基上的拟南芥苗，箭头所指为生长良好的含有抗性的拟南芥苗；2：具有抗性拟南芥苗转入土后生长15天，其中28.6％出现叶片翻卷；3-4：具有抗性拟南芥苗转入土后生长24天，其中28.6％出现叶片翻卷；5：30天的野生型拟南芥。共获得46株具有卡那霉素抗性的再生植株(T1代)。

对具有卡那霉素抗性的再生植株进行PCR检测。根据CsETR1基因的cDNA序列特点设计特异性引物：上游引物：5’-ACCTTGGCTTTGGAAGAGTGT-3’；下游引物：5’-ATGTCCAGTTGTAGGCTGCC-3’。以拟南芥的基因组为模板的扩增反应中，只有整合有CsETR1 cDNA片段的基因组DNA才会有对应的特异大小的条带出现。检测结果见图6。结果表明，所有筛选培养基继续成活的抗性植株均有预期的特异条带扩增，而野生型对照均无相应片段的扩增。说明这些抗性植株为转基因植株。

将Pcambia1302转入拟南芥，方法同上，得到转空载体对照拟南芥。

二、转基因植物的鉴定

1、T1代转基因植株的表型分析

46株T1代转基因植株均出现雄蕊发育异常的表型。结合表型的形态观察，将转基因植株根据表型分成五类。见图7和见表2。

图7中：第一排为实体解剖图片；第二排为扫描电镜照片；第三排为石蜡切片。第一列(1)；有花丝和花药的分化，花丝缩短，心皮正常或弯曲，比率为14.3％：第二列(2)：有花丝和花药的分化，花药部分有乳突，心皮正常，比率为21.4％；第三列(3)：雄蕊花丝化，心皮正常或弯曲，比率为14.3％：第四列(4)：有花丝和花药的分化，花药特化成乳突，心皮正常，比率为42.9％；第五列(5)：没有花丝和花药，心皮发育不正常，比率为7.1％。

表2 转基因表型分析统计

表型	特点	比率
			1	有花丝和花药的分化，花丝缩短，心皮正常或弯曲	14.3％
2	有花丝和花药的分化，花药部分有乳突，心皮正常	21.4％
			3	雄蕊花丝化，心皮正常或弯曲	14.3％
4	有花丝和花药的分化，花药特化成心皮状结构，心皮正常	42.9％
			5	没有花丝和花药，心皮发育不正常	7.1％

从表型上可以看出，转入到拟南芥中的反义CsETR1确实能够导致雄蕊发育异常。但从各种表型的比率上看，反义CsETR1主要是导致了转基因拟南芥的雄蕊向心皮的方向转变，其中比率高达42.9％。这个结果说明在拟南芥中改变CsETR1基因的表达，除了导致花药发育本身受抑制(表型3和5)外，还出现了该轮器官发生特征的改变(表型2和4)，这是黄瓜雌花中所未曾观察到的。从拟南芥转基因表型上再次确证了如下观点：对在黄瓜雌花雄蕊原位上检测到的CsETR1特异性下调导致黄瓜雄蕊滞育。

2、T1代转基因植株的育性分析

对46株T1代转基因植株(Anti-ETR1)、野生型植株(WT)和转空载体对照植株的雄蕊和雌蕊的育性进行检测：将野生型拟南芥的花粉授到转基因拟南芥(或野生型拟南芥或转空载体拟南芥)的雌蕊上来检测转基因拟南芥心皮的育性，结果发现转基因植株、野生型植株和转空载体植株的雌蕊是可育的；将转基因拟南芥(或野生型拟南芥或转空载体拟南芥)的花粉授到转基因拟南芥的雌蕊上来检测转基因拟南芥花药的育性，结果发现野生型植株和转空载体植株雄蕊中的花药是可育的，46株转基因植株雄蕊中的花药是不育的。见图8。结果说明，转入拟南芥中的反义CsETR1只是通过乙烯信号系统改变了拟南芥的雄蕊的发育命运，却没有改变雌蕊的功能。

序列表

<110>北京大学

<120>植物雄性育性相关蛋白及其编码基因和应用

<130>CGGNARY102359

<160>3

<210>1

<211>740

<212>PRT

<213>黄瓜(Cucumis sativus L.)

<400>1

Met Glu Thr Cys Tyr Cys Ile Glu Pro Gln Trp Pro Ala Asp Glu Leu

1 5 10 15

Leu Met Lys Tyr Gln Tyr Ile Ser Asp Phe Phe Ile Ala Leu Ala Tyr

20 25 30

Phe Ser Ile Pro Leu Glu Leu Ile Tyr Phe Val Lys Lys Ser Ala Val

35 40 45

Phe Pro Tyr Arg Trp Val Leu Val Gln Phe Gly Ala Phe Ile Val Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Thr His Leu Ile Asn Leu Trp Thr Phe Thr Met His Ser

65 70 75 80

Arg Thr Val Ala Val Val Met Thr Thr Ala Lys Val Leu Thr Ala Val

85 90 95

Val Ser Cys Ala Thr Ala Leu Met Leu Val His Ile Ile Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ser Val Lys Thr Arg Glu Leu Phe Leu Lys Asn Lys Ala Ala Glu

115 120 125

Leu Asp Arg Glu Met Gly Leu Ile Arg Thr Gln Glu Glu Thr Gly Arg

130 135 140

His Val Arg Met Leu Thr His Glu Ile Arg Ser Thr Leu Asp Arg His

145 150 155 160

Thr Ile Leu Lys Thr Thr Leu Val Glu Leu Gly Arg Thr Leu Ala Leu

165 170 175

Glu Glu Cys Ala Leu Trp Met Pro Thr Arg Thr Gly Leu Glu Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Tyr Thr Leu His Gln Gln Asn Pro Val Gly Tyr Thr Val Pro

195 200 205

Ile Asn Leu Pro Val Ile Ser Gln Val Phe Ser Ser Asn Arg Ala Val

210 215 220

Lys Ile Ser Pro Asn Ser Pro Val Ala Ser Leu Arg Pro Arg Ala Gly

225 230 235 240

Arg Tyr Val Ala Gly Glu Val Val Ala Val Arg Val Pro Leu Leu His

245 250 255

Leu Ser Asn Phe Gln Ile Asn Asp Trp Pro Glu Leu Ser Thr Lys Arg

260 265 270

Tyr Ala Leu Met Val Leu Met Leu Pro Ser Asp Ser Ala Arg Gln Trp

275 280 285

Arg Val His Glu Leu Glu Leu Val Glu Val Val Ala Asp Gln Val Ala

290 295 300

Val Ala Leu Ser His Ala Ala Ile Leu Glu Glu Ser Met Arg Ala Arg

305 310 315 320

Asp Pro Leu Met Glu Gln Asn Val Ala Leu Asp Leu Ala Arg Arg Glu

325 330 335

Ala Glu Thr Ala Asn His Ala Arg Asn Asp Phe Leu Ala Val Met Asn

340 345 350

His Glu Met Arg Thr Pro Met His Ala Ile Ile Ala Leu Ser Ser Leu

355 360 365

Leu Gln Glu Thr Glu Leu Thr Pro Glu Gln Arg Leu Met Val Glu Thr

370 375 380

Ile Leu Lys Ser Ser Asn Leu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Asp Val Leu

385 390 395 400

Asp Leu Ser Arg Leu Glu Asp Gly Ser Leu Gln Leu Asp Ile Gly Thr

405 410 415

Phe Asn Leu His Ala Val Phe Lys Glu Val Leu Asn Leu Ile Lys Pro

420 425 430

ValThr Leu Val Lys Lys Leu Ser Leu Thr Leu His Leu Gly Leu Asp

435 440 445

Leu Pro Val Phe Ala Val Gly Asp Glu Lys Arg Leu Met Gln Ala Ile

450 455 460

Leu Asn Val Val Gly Asn Ala Val Lys Phe Ser Lys Glu Gly Ser Ile

465 470 475 480

Ser Ile Ser Ala Ile Val Ala Lys Ala Glu Thr Phe Arg Glu Ile Arg

485 490 495

Val Pro Asp Phe His Pro Val Pro Ser Asp Ser His Phe Tyr Leu Arg

500 505 510

Val Gln Val Lys Asp Thr Gly Ser Gly Ile Ser Pro Gln Asp Ile Pro

515 520 525

Lys Leu Phe Thr Lys Phe Ala Gln Thr Thr Val Gly Pro Arg Asn Ser

530 535 540

Cys Gly Ser Gly Leu Gly Leu Ala Ile Cys Lys Arg Phe Val Asn Leu

545 550 555 560

Met Glu Gly His Ile Trp Leu Glu Ser Glu Gly Leu Gly Lys Gly Cys

565 570 575

Thr Ala Thr Phe Ile Val Lys Leu Gly Ile Ala Glu Gln Ser Asn Glu

580 585 590

Ser Lys Leu Pro Phe Thr Ser Lys Ile His Glu Asn Ser Ile His Thr

595 600 605

Ser Phe Pro Gly Leu Lys Val Leu Val Met Asp Asp Asn Gly Val Ser

610 615 620

Arg Ser Val Thr Lys Gly Leu Leu Val His Leu Gly Cys Glu Val Thr

625 630 635 640

Thr Ala Gly Ser Ile Glu Glu Phe Leu Arg Val Val Ser Gln Glu His

645 650 655

Lys Val Val Phe Met Asp Ile Cys Thr Pro Gly Val Asp Gly Tyr Glu

660 665 670

Leu Ala Ile Arg Ile Arg Glu Lys Phe Ala Lys Cys His Glu Arg Pro

675 680 685

Phe Met Val Val Leu Thr Gly Asn Ser Asp Lys Val Thr Lys Glu Ser

690 695 700

Cys Leu Arg Ala Gly Met Asp Gly Leu Ile Leu Lys Pro Val Ser Ile

705 710 715 720

Asp Lys Met Arg Ser Val Leu Ser Glu Leu Ile Glu Arg Arg Val Leu

725 730 735

Phe Glu Thr Ser

740

<210>2

<211>2223

<212>DNA

<213>黄瓜(Cucumis sativus L.)

<400>2

atggagactt gttattgcat tgagccacaa tggccagctg atgagctgtt gatgaagtat 60

cagtatatct ctgatttctt catcgcactt gcatacttct cgatcccatt ggagctcatc 120

tactttgtaa agaaatctgc agtgtttccc tacagatggg ttcttgttca gtttggtgct 180

ttcattgttc tttgtggtgc aacacatctt attaacctat ggacctttac catgcattca 240

agaacggtag cagtagtaat gaccactgca aaggttttaa ctgctgtggt atcatgtgca 300

actgccctta tgcttgtaca tattataccc gatttattaa gtgttaaaac tagagagctc 360

tttttgaaga ataaggctgc tgaattggat agggaaatgg gactcattcg tacccaagaa 420

gaaactggtc gacacgtaag gatgcttact catgaaatta ggagtactct tgatagacat 480

actatactaa aaaccactct tgttgagctg ggaagaacct tggctttgga agagtgtgca 540

ctttggatgc caactcgaac tggattagaa cttcaactat cctatactct tcatcagcag 600

aatccagtgg gatatactgt ccccatcaat ctccctgtga tcagtcaagt ttttagtagt 660

aatcgggccg taaaaatatc cccaaattcc ccagtggcga gcctacgacc tcgtgctggg 720

agatatgtgg ctggagaggt tgttgctgtc cgtgttcctc tattgcatct ttctaatttt 780

caaataaatg attggccaga gctttcgact aagcgatatg cgcttatggt tttgatgctt 840

ccgtcagata gtgctagaca atggcgtgtt catgagttgg agctggttga agttgttgct 900

gatcaggtag cagtagctct ttctcatgct gcaatcttag aagagtcaat gagggctaga 960

gatcccttaa tggagcagaa cgttgccctt gatctagccc gaagagaagc agagacagcg 1020

aatcatgctc gtaatgattt cctggctgtc atgaaccatg agatgagaac tccgatgcat 1080

gcgattattg ccctctcttc attattacaa gagactgaac ttacaccaga gcaacgtctg 1140

atggttgaaa caatattaaa aagcagtaac cttttagcta ctctaatcaa tgatgttctg 1200

gatctttcaa ggcttgaaga cggcagccta caactggaca ttggcacatt taatcttcat 1260

gccgttttca aagaggtgct taacttgatc aagcctgtta cgctagtaaa aaagttgtca 1320

ttgaccttac atttgggcct tgatttgcca gtatttgccg ttggtgatga gaaacgtctc 1380

atgcaagcta ttcttaatgt tgtgggtaat gctgtaaaat tttcaaaaga aggtagtata 1440

tcaatctcag ccattgttgc aaaagcagaa accttcagag aaattcgagt gccagatttt 1500

caccctgtgc caagtgatag ccatttttat ttacgtgtcc aggtaaaaga tactggatct 1560

ggaattagtc ctcaagatat tccaaagttg ttcaccaaat ttgcacaaac tacagtggga 1620

ccaagaaact cttgtggcag tggtcttggg cttgcaattt gtaaaaggtt tgtgaatctt 1680

atggaaggac atatatggct tgaaagtgaa ggtcttggaa agggatgcac ggctactttt 1740

attgtaaaac ttggaattgc tgaacaatca aatgaatcaa agcttccctt tacatcaaaa 1800

attcatgaaa acagcatcca tacaagtttt cctggactca aagtccttgt tatggacgat 1860

aatggagtta gtcgttcggt gacaaaagga cttcttgtac atcttggatg cgaagtaaca 1920

acagcaggct caattgagga gttcttacga gtcgtctccc aggaacacaa ggtggttttc 1980

atggatatct gcactcctgg tgttgatggt tatgaactag ctatacgtat ccgcgaaaaa 2040

tttgcaaagt gccatgaaag accattcatg gtagtactga ctggaaactc agacaaagta 2100

acaaaggaga gctgcctcag agctggcatg gatgggctaa tactaaaacc ggtttcgatt 2160

gataaaatga ggagcgtgtt gtcggaactt atagagcgtc gggttctatt tgaaacatct 2220

tga 2223

<210>3

<211>727

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aacttgtgat tccttcttaa accctagggg taatattcta ttttccaagg atctttagtt 60

aaaggcaaat ccgggaaatt attgtaatca tttggggcca catataaaag atttgagtta 120

gatggaagtg acgattaatc caaacatata tatctctttc ttcttatttc ccaaattaac 180

agacaaaagt agaatattgg cttttaacac caatataaaa acttgcttca cacctaaaca 240

cttttgttta ctttagggta agtgcaaaaa gccaaccaaa tccacctgca ctgatttgac 300

gtttacaaac gccgttaagt ttgtcaccgt ctaaacaaaa acaaagtaga agctaacgga 360

gctccgttaa taaattgacg aaaagcaaac caagttttta gctttggtcc ccctctttta 420

ccaagtgaca attgatttaa gcagtgtctt gtaattatac aaccatcgat gtccgttgat 480

ttaaacagtg tcttgtaatt aaaaaaatca gtttacataa atggaaaatt tatcacttag 540

ttttcatcaa cttctgaact tacctttcat ggattaggca atactttcca tttttagtaa 600

ctcaagtgga ccctttactt cttcaactcc atctctctct ttctatttca cttctttctt 660

ctcattatat ctcttgtcct ctccaccaaa tctcttcaac aaaaagatta aacaaagaga 720

gaagaat 727

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白的基因或其反义基因。

3.如权利要求2所述的基因或其反义基因，其特征在于：

所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因或其反义基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在Pcambia1302载体的多克隆位点中插入权利要求2或3所述反义基因得到的重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在Pcambia1302载体的多克隆位点中插入序列3所示的启动子和所述反义基因，且由序列3所示的启动子启动所述反义基因表达，得到的重组质粒；所述重组表达载体优选为在Pcambia1302载体的BamH I和Nco I酶切位点间插入序列3所示的启动子，Nco I和Spe I酶切位点间插入所述反义基因，得到的重组质粒。

7.扩增权利要求2或3所述基因或其反义基因的全长及其任意片段的引物对。

8.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因或其反义基因，权利要求4至6中任一所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

9.一种培育雄性不育转基因植物的方法，是抑制雄性可育植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到雄性不育转基因植物；所述雄性可育植物为携带权利要求2或3所述基因的植物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法是将权利要求2或3所述反义基因通过权利要求4至6中任一所述重组表达载体导入所述雄性可育植物中；所述雄性可育植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物优选为拟南芥。