CN112626050B

CN112626050B - 在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体及其应用

Info

Publication number: CN112626050B
Application number: CN202011481714.0A
Authority: CN
Inventors: 李娟�; 许蓉芳; 秦瑞英; 刘小双; 周桂林; 范家萌; 单调风; 魏鹏程
Original assignee: Hefei Fengle Seed Co ltd; Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Hefei Fengle Seed Co ltd; Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112626050A

Abstract

本发明提供了一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9‑NRCH突变体及其应用。本发明在水稻基因打靶实验过程中，意外获得了一种新的SpCas9‑NRCH突变体，发现利用该SpCas9‑NRCH基因进行水稻剪切，能够识别特异位点。并且本发明提供一种基于该基因构建的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用所获得的SpCas9‑NRCH构建植物表达载体，构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切，实现了水稻基因打靶，并且以高突变效率获得转基因水稻植株。

Description

在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种在基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体及其在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

CRISPR/Cas基因编辑系统已成为植物功能基因研究和分子育种的重要手段。CRISPR/Cas在进行基因编辑过程中除了需要单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)与基因组上的靶序列碱基互补配对外，还需要基因组上的靶序列附近必须存在几个称之为前间区序列邻近基序(Protospacer asjacent motif,PAM)特异碱基。传统的CRISPR/Cas系统多使用Cas9蛋白作为核酸内切酶在植物基因组目标靶点造成定点切割，从而引入位点特异性突变。但Cas9(SpCas9)识别PAM主要为NGG，这限制了基因组编辑范围。为了扩展其识别位点，许多科学家考虑通过改变PAM-interacting(PI)结构域的序列，使其可以识别更多种类的PAM类型。到目前为止，已经获得了几种识别不同PAM序列的SpCas9变体，如SpCas9-NG，可以有效识别NG PAM；SpCas9-VQR变体可以有效识别NGCG PAM、SpCas9-VRER变体NGAG PAM等。

但是，目前还没有一种通用可行的提高SpCas9可编辑位点数量并且能够保证SpCas9基因在作物基因打靶中的突变效率的方法，而且现有的高突变效率的SpCas9基因数量有限，大部分突变体是依赖于含有G的PAM序列。因此，能够提供更多的在作物基因打靶中提供更多编辑位点的SpCas9基因是人们迫切希望的。目前虽然存在个别SpCas9蛋白的可用突变体，但是数量极其有限并且能否在水稻中仍保持核酸酶活性，依然是未知数。

发明内容

本发明要解决的技术问题是获得有效的在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体，扩大CRISPR/SpCas9系统在植物基因组中的编辑范围。

针对上述问题，本发明希望提供一种在水稻基因打靶中识别NRCH的PAM序列，且具有高效切割的SpCas9突变体。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体，其特征在于，所述SpCas9-NRCH突变体为a1)、a2)或a3)：

a1)其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质；

a2)在a1)所示蛋白质的N末端添加一个甲硫氨酸残基，得到的蛋白质；

a3)在a1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

另一个方面，本发明提供一种SpCas9-NRCH突变体基因，其特征在于，所述SpCas9-NRCH突变体基因的序列为：

b1)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述SpCas9-NRCH突变体的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码SpCas9-NRCH突变体的DNA分子。

另一个方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求2所述的SpCas9-NRCH突变体基因。

优选地，所述表达盒具有式I结构：P-A-B-C-D(I)；

其中，

(a)P为启动子；

(b)A为无或核定位信号序列NLS；

(c)B为SpCas9-NRCH基因序列；

(d)C为无或核定位信号序列NLS；

(e)D为终止子，

并且，该式的附加条件为A和C中至多1个为无。

优选地，所述启动子包括但不限于Ubi、Actin、35S启动子，优选为Ubi启动子。

另一个方面，本发明提供一种表达载体，包含上述的SpCas9-NRCH突变体或上述表达盒，还包含了一个sgRNA转录单元，所述sgRNA靶向所述靶点序列；sgRNA识别靶点序列的PAM序列为NRCH，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C。

该植物表达载体的构建方法是利用NotI/SacI酶切位点，用NotI/SacI酶切pHUN600载体并回收，由于合成的SpCas9-NRCH序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将SpCas9-NRCH连接到pHUN600载体，得到植物表达载体pHUNCH。

另一方面，本发明在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述SpCas9-NRCH突变体基因完成水稻体内DNA双链的剪切，并在水稻自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。

在另一个方面，本发明提供一种获得打靶载体并将其导入水稻细胞的方法，该方法利用基于SpCas9-NRCH突变体(pHUNCH)的表达载体(其含有所述SpCas9-NRCH突变体基因)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体，所述方法包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带SpCas9-NRCH突变体的打靶载体的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；以及

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“N6 majors”指的是，该N6 majors中[NO₃ ^-]/[NH₄ ⁺]＝40mM/10mM。

在优选的实施方案中，所述SpCas9-NRCH突变体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，具体为：

atggacaagaagtactccatcggcctcgacatcggcaccaattctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccgtccaagaagttcaaggtcctcggcaacaccgaccgccactccatcaagaagaatctcatcggcgccctgctgttcgactctggcgagacagccgaggctacaaggctcaagaggaccgctagacgcaggtacaccaggcgcaagaaccgcatctgctacctccaagagatcttctccaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacaggctcgaggagagcttcctcgtcgaggaggacaagaagcacgagcgccatccgatcttcggcaacatcgtggatgaggtggcctaccacgagaagtacccgaccatctaccacctccgcaagaagctcgtcgactccaccgataaggccgacctcaggctcatctacctcgccctcgcccacatgatcaagttcaggggccacttcctcatcgagggcgacctcaacccggacaactccgatgtggacaagctgttcatccagctcgtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaacccgatcaacgcctctggcgttgacgccaaggctattctctctgccaggctctctaagtcccgcaggctcgagaatctgatcgcccaacttccgggcgagaagaagaatggcctcttcggcaacctgatcgccctctctcttggcctcaccccgaacttcaagtccaacttcgacctcgccgaggacgccaagctccagctttccaaggacacctacgacgacgacctcgacaatctcctcgcccagattggcgatcagtacgccgatctgttcctcgccgccaagaatctctccgacgccatcctcctcagcgacatcctcagggtgaacaccgagatcaccaaggccccactctccgcctccatgGTGaagaggtacgacgagcaccaccaggacctcacactcctcaaggccctcgtgagacagcagctcccagagaagtacaaggagatcttcttcgaccagtccaagaacggctacgccggctacatcgatggcggcgcttctcaagaggagttctacaagttcatcaagccgatcctcgagaagatggacggcaccgaggagctgctcgtgaagctcaatagagaggacctcctccgcaagcagcgcaccttcgataatggcATTatcccgcaccagatccacctcggcgagcttcatgctatcctccgcaggcaaGGCgacttctacccgttcctcaaggacaaccgcgagaagattgagaagatcctcaccttccgcatcccgtactacgtgggcccgctcgccaggggcaactccaggttcgcctggatgaccagaaagtccgaggagacaatcaccccctggaacttcgaggaggtggtggataagggcgcctctgcccagtctttcatcgagcgcatgaccaacttcgacaagaacctcccgaacgagaaggtgctcccgaagcactcactcctctacgagtacttcaccgtgtacaacgagctgaccaaggtgaagtacgtgaccgaggggatgaggaagccagctttccttagcggcgagcaaaagaaggccatcgtcgacctgctgttcaagaccaaccgcaaggtgaccgtgaagcagctcaaggaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtcgagatctccggcgtcgaggataggttcaatgcctccctcgggacctaccacgacctcctcaagattatcaaggacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtgctcaccctcaccctcttcgaggaccgcgagatgatcgaggagcgcctcaagacatacgcccacctcttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagcgcCTGcgctataccggctggggcaggctctctaggaagctcatcaacggcatccgcgacaagcagtccggcaagacgatcctcgacttcctcaagtccgacggcttcgccaaccgcaacttcatgcagctcatccacgacgactccctcaccttcaaggaggacatccaaaaggcccaggtgtccggccaaggcgattccctccatgaacatatcgccaatctcgccggctccccggctatcaagaagggcattctccagaccgtgaaggtggtggacgagctggtgaaggtgatgggcGGCcacaagccagagaacatcgtgatcgagatggcccgcgagaaccagaccacacagaagggccaaaagaactcccgcgagcgcatgaagaggatcgaggagggcattaaggagctgggctcccagatcctcaaggagcacccagtcgagaacacccagctccagaacgagaagctctacctctactacctccagaacggccgcgacatgtacgtggaccaagagctggacatcaaccgcctctccgactacgacgtggaccatattgtgccgcagtccttcctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctcacccgctccgacaagaacaggggcaagtccgataacgtgccgtccgaagaggtcgtcaagaagatgaagaactactggcgccagctcctcaacgccaagctcatcacccagaggaagttcgacaacctcaccaaggccgagagaggcggcctttccgagcttgataaggccggcttcatcaagcgccagctcgtcgagacacgccagatcacaaagcacgtggcccagatcctcgactcccgcatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctcatccgcgaggtgaaggtcatcaccctcaagtccaagctcgtgtccgacttccgcaaggacttccagttctacaaggtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctcaatgccgtggtgggcacagccctcatcaagaagtacccaaagctcgagtccgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcgcaagatgatcgccaagtccgagcaagagatcggcaaggcgaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaatttcttcaagaccgagatcacgctcgccaacggcgagattaggaagaggccgctcatcgagacaaacggcgagacaggcgagatcgtgtgggacaagggcagggatttcgccacagtgcgcaaggtgctctccatgccgcaagtgaacatcgtgaagaagaccgaggttcagaccggcggcttctccaaggagtccatcctcccaaagGGCaactccgacaagctgatcgcccgcaagaaggactgggacccgaagaagtatggcggcttcAACtctccgaccgtggcctactctgtgctcgtggttgccaaggtcgagaagggcaagagcaagaagctcaagtccgtcaaggagctgctgggcatcacgatcatggagcgcagcagcttcgagaagaacccaatcgacttcctcgaggccaagggctacaaggaggtgaagaaggacctcatcatcaagctcccgaagtacagcctcttcgagcttgagaacggccgcaagagaatgctcgcctctgctggcGTGcttcagaagggcaacgagcttgctctcccgtccaagtacgtgaacttcctctacctcgcctcccactacgagaagctcaagggctccccagaggacaacgagcaaaagcagctgttcgtcgagcagcacaagcactacctcgacgagatcatcgagcagatctccgagttctccaagcgcgtgatcctcgccgatgccaacctcgataaggtgctcagcgcctacaacaagcaccgcgataagccaattcgcgagcaggccgagaacatcatccacctcttcaccctcaccaacctcggcgctccagccgccttcaagtacttcgacaccaccatcAACcgcaagCAAtacAACACGaccaaggaggttctcgacgccaccctcatcCGTcagtctatcacaggcctctacgagacacgcatcgacctctcacaactcggcggcgattga

本发明的发明人针对NRCH这个PAM序列，以PDS为基因为靶基因，构建了12个系列靶向载体，并利用农杆菌转化方法将载体导入水稻愈伤中，利用SpCas9-NRCH突变体成功获得了目的基因敲除的愈伤材料。SpCas9-NRCH突变体与蛋白质SpCas9的不同在于：第322位的氨基酸由I变为V，第409位的氨基酸由S变为I，第427位的氨基酸由E变为G，第654位的氨基酸由R变为L，第753位的氨基酸由R变为G，第1114位的氨基酸由R变为G，第1135位的氨基酸由D变为N，第1219位的氨基酸由E变为V，第1332位的氨基酸由D变为N，第1335位的氨基酸由R变为Q，第1337位的氨基酸由T变为N，第1338位的氨基酸由SR变为T，第1349位的氨基酸由H变为R。

此外，本申请的发明人基于突变后的氨基酸序列进行对应的不同核苷酸序列的水稻应用尝试，但是大部分序列在水稻应用过程中编辑效率低下，很多突变率不足5％，仅个别序列可以应用于水稻，申请人经过大量实验找到了可以对多个PAM进行有效编辑的一条，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。其可以在10个PAM上具有高编辑能力。

本发明提供的SpCas9-NRCH突变体及其核苷酸序列能够对NRCH的PAM序列附近的靶标序列进行编辑，由于其扩充了SpCas9识别的PAM位点序列，所以扩大了CRISPR/Cas9系统在水稻基因组中的编辑范围，对于推进此系统在植物基因组编辑领域中的应用有重要意义。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为pHUNCH载体质粒示意图。

图2为SpCas9-NRCH编辑系统的突变效率统计。

图3为转基因愈伤中部分位点的突变形式示例。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1—SpCas9-NRCH突变体基因的获得

本申请的发明人通过尝试利用各种不同的方式对来自大肠杆菌的SpCas9-NRCH基因进行改造，意外获得一条新的DNA序列，并给这个DNA序列末端加上水稻偏好的终止密码子TGA，形成一个新基因，该基因被命名为SpCas9-NRCH，序列如SEQ ID NO:2所示。

将设计好的SpCas9-NRCH基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-SpCas9-NRCH载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

实施例2——含有SpCas9-NRCH基因植物打靶载体的构建

从上面含有PUC57-AMP-SpCas9-NRCH载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收SpCas9-NRCH片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUN600进行线性化处理，回收pHUN600，将上述的SpCas9-NRCH片段和pHUN600片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，pHUN600-SpCas9-NRCH，随后将SpCas9匹配的SgRNA表达框连在pHUN600-SpCas9-NRCH载体，得到植物表达载体，命名为pHUNCH(图1)。

选择水稻PDS基因不同PAM的3’端的20bp序列，作为打靶位点，如表2所示。将靶位点序列与pHUNCH融合形成不同的pHUNCH打靶载体共12个。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

表2 sgRNA靶向序列及相应的PAM序列

实施例3——pHUNCH打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUNCH打靶载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分子鉴定

以筛选15天新长出的一粒愈伤为检测样品。每个靶标载体取108粒愈伤，平均36粒愈伤为一个样品，一共三个重复。用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。设计PCR引物用于扩增靶点附近的DNA序列，长度约为180～500bp。引物序列如表3所示。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃30秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物用于高通量的扩增子测序。所测结果与野生型序列进行比对。突变效率计算为：含有靶标突变的reads/总的reads数*100％，当计算的突变率>5％时，才定义为该系统具有编辑能力。

表3用于扩增T0苗中靶位点的PCR引物

在SpCas9-NRCH和获得的转基因愈伤中的突变效率见图2。结果表明，SpCas9-NRCH编辑系统在PAM为TACA和TACT的编辑能力较低，突变效率<5％，而在其他的10个PAM的编辑能力较高，最高可达82.3％。特别是在GACH的PAM序列，编辑效率最高，平均编辑效率超过50％。综上所述，本发明提供了一种在水稻基因打靶中识别NRCH的PAM序列，其为具有高效切割能力的SpCas9-NRCH突变体，扩大了CRISPR/SpCas9系统在植物基因组中的编辑范围。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

合肥丰乐种业股份有限公司

<120> 在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1367

<212> PRT

<213> SpCas9-NRCH-P

<400> 1

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

305 310 315 320

Val Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ile Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

595 600 605

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

610 615 620

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Leu Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Gly

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

945 950 955 960

Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

995 1000 1005

Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser

1010 1015 1020

Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn

1025 1030 1035 1040

Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile

1045 1050 1055

Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val

1060 1065 1070

Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met

1075 1080 1085

Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe

1090 1095 1100

Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Gly Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala

1105 1110 1115 1120

Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asn Ser Pro

1125 1130 1135

Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys

1140 1145 1150

Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met

1155 1160 1165

Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys

1170 1175 1180

Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala

1205 1210 1215

Gly Val Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro

1235 1240 1245

Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr

1250 1255 1260

Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile

1265 1270 1275 1280

Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His

1285 1290 1295

Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe

1300 1305 1310

Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr

1315 1320 1325

Thr Ile Asn Arg Lys Gln Tyr Asn Thr Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala

1330 1335 1340

Thr Leu Ile Arg Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp

1345 1350 1355 1360

Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 2

<211> 4107

<212> DNA

<213> SpCas9-NRCH

<400> 2

atggacaaga agtactccat cggcctcgac atcggcacca attctgttgg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gccgtccaag aagttcaagg tcctcggcaa caccgaccgc 120

cactccatca agaagaatct catcggcgcc ctgctgttcg actctggcga gacagccgag 180

gctacaaggc tcaagaggac cgctagacgc aggtacacca ggcgcaagaa ccgcatctgc 240

tacctccaag agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacagg 300

ctcgaggaga gcttcctcgt cgaggaggac aagaagcacg agcgccatcc gatcttcggc 360

aacatcgtgg atgaggtggc ctaccacgag aagtacccga ccatctacca cctccgcaag 420

aagctcgtcg actccaccga taaggccgac ctcaggctca tctacctcgc cctcgcccac 480

atgatcaagt tcaggggcca cttcctcatc gagggcgacc tcaacccgga caactccgat 540

gtggacaagc tgttcatcca gctcgtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccg 600

atcaacgcct ctggcgttga cgccaaggct attctctctg ccaggctctc taagtcccgc 660

aggctcgaga atctgatcgc ccaacttccg ggcgagaaga agaatggcct cttcggcaac 720

ctgatcgccc tctctcttgg cctcaccccg aacttcaagt ccaacttcga cctcgccgag 780

gacgccaagc tccagctttc caaggacacc tacgacgacg acctcgacaa tctcctcgcc 840

cagattggcg atcagtacgc cgatctgttc ctcgccgcca agaatctctc cgacgccatc 900

ctcctcagcg acatcctcag ggtgaacacc gagatcacca aggccccact ctccgcctcc 960

atggtgaaga ggtacgacga gcaccaccag gacctcacac tcctcaaggc cctcgtgaga 1020

cagcagctcc cagagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080

ggctacatcg atggcggcgc ttctcaagag gagttctaca agttcatcaa gccgatcctc 1140

gagaagatgg acggcaccga ggagctgctc gtgaagctca atagagagga cctcctccgc 1200

aagcagcgca ccttcgataa tggcattatc ccgcaccaga tccacctcgg cgagcttcat 1260

gctatcctcc gcaggcaagg cgacttctac ccgttcctca aggacaaccg cgagaagatt 1320

gagaagatcc tcaccttccg catcccgtac tacgtgggcc cgctcgccag gggcaactcc 1380

aggttcgcct ggatgaccag aaagtccgag gagacaatca ccccctggaa cttcgaggag 1440

gtggtggata agggcgcctc tgcccagtct ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500

aacctcccga acgagaaggt gctcccgaag cactcactcc tctacgagta cttcaccgtg 1560

tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggga tgaggaagcc agctttcctt 1620

agcggcgagc aaaagaaggc catcgtcgac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680

gtgaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtcgagatc 1740

tccggcgtcg aggataggtt caatgcctcc ctcgggacct accacgacct cctcaagatt 1800

atcaaggaca aggacttcct cgacaacgag gagaacgagg acatcctcga ggacatcgtg 1860

ctcaccctca ccctcttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctcaa gacatacgcc 1920

cacctcttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgcc tgcgctatac cggctggggc 1980

aggctctcta ggaagctcat caacggcatc cgcgacaagc agtccggcaa gacgatcctc 2040

gacttcctca agtccgacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctcat ccacgacgac 2100

tccctcacct tcaaggagga catccaaaag gcccaggtgt ccggccaagg cgattccctc 2160

catgaacata tcgccaatct cgccggctcc ccggctatca agaagggcat tctccagacc 2220

gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggcggcc acaagccaga gaacatcgtg 2280

atcgagatgg cccgcgagaa ccagaccaca cagaagggcc aaaagaactc ccgcgagcgc 2340

atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag ctgggctccc agatcctcaa ggagcaccca 2400

gtcgagaaca cccagctcca gaacgagaag ctctacctct actacctcca gaacggccgc 2460

gacatgtacg tggaccaaga gctggacatc aaccgcctct ccgactacga cgtggaccat 2520

attgtgccgc agtccttcct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct cacccgctcc 2580

gacaagaaca ggggcaagtc cgataacgtg ccgtccgaag aggtcgtcaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctcct caacgccaag ctcatcaccc agaggaagtt cgacaacctc 2700

accaaggccg agagaggcgg cctttccgag cttgataagg ccggcttcat caagcgccag 2760

ctcgtcgaga cacgccagat cacaaagcac gtggcccaga tcctcgactc ccgcatgaac 2820

accaagtacg acgagaacga caagctcatc cgcgaggtga aggtcatcac cctcaagtcc 2880

aagctcgtgt ccgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctcaat gccgtggtgg gcacagccct catcaagaag 3000

tacccaaagc tcgagtccga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060

atgatcgcca agtccgagca agagatcggc aaggcgaccg ccaagtactt cttctactcc 3120

aacatcatga atttcttcaa gaccgagatc acgctcgcca acggcgagat taggaagagg 3180

ccgctcatcg agacaaacgg cgagacaggc gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc 3240

gccacagtgc gcaaggtgct ctccatgccg caagtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtt 3300

cagaccggcg gcttctccaa ggagtccatc ctcccaaagg gcaactccga caagctgatc 3360

gcccgcaaga aggactggga cccgaagaag tatggcggct tcaactctcc gaccgtggcc 3420

tactctgtgc tcgtggttgc caaggtcgag aagggcaaga gcaagaagct caagtccgtc 3480

aaggagctgc tgggcatcac gatcatggag cgcagcagct tcgagaagaa cccaatcgac 3540

ttcctcgagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tcatcatcaa gctcccgaag 3600

tacagcctct tcgagcttga gaacggccgc aagagaatgc tcgcctctgc tggcgtgctt 3660

cagaagggca acgagcttgc tctcccgtcc aagtacgtga acttcctcta cctcgcctcc 3720

cactacgaga agctcaaggg ctccccagag gacaacgagc aaaagcagct gttcgtcgag 3780

cagcacaagc actacctcga cgagatcatc gagcagatct ccgagttctc caagcgcgtg 3840

atcctcgccg atgccaacct cgataaggtg ctcagcgcct acaacaagca ccgcgataag 3900

ccaattcgcg agcaggccga gaacatcatc cacctcttca ccctcaccaa cctcggcgct 3960

ccagccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcaaccgca agcaatacaa cacgaccaag 4020

gaggttctcg acgccaccct catccgtcag tctatcacag gcctctacga gacacgcatc 4080

gacctctcac aactcggcgg cgattga 4107

Claims

1.一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体，其特征在于，所述SpCas9-NRCH突变体为a1)、a2)或a3)：

a1)其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质；

2.一种在水稻基因打靶中识别特异位点的SpCas9-NRCH突变体基因，其特征在于，所述SpCas9-NRCH突变体基因为：

b1)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求2所述的SpCas9-NRCH突变体基因。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒具有式I结构：P-A-B-C-D(I)；

其中，

(a)P为启动子；

(b)A为无或有核定位信号序列NLS；

(c)B为SpCas9-NRCH突变体基因序列；

(d)C为无或有核定位信号序列NLS；

(e)D为终止子，

并且，该式的附加条件为A和C中至多1个为无。

5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述启动子包括Ubi、Actin和35S启动子。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的SpCas9-NRCH突变体或权利要求3所述的表达盒，还包含了一个sgRNA转录单元，所述sgRNA转录单元靶向目标靶点序列；sgRNA识别目标靶点序列的PAM序列为NRCH，N为A、T、C或G；R为A或T；H为A，T或C。

7.一种权利要求1所述SpCas9-NRCH突变体用于CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述SpCas9-NRCH突变体实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

8.一种利用含有权利要求2中所述的SpCas9-NRCH突变体基因的表达载体构建特异基因打靶载体、将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述打靶载体，所述打靶载体中携带所述SpCas9-NRCH突变体基因；

(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)中所获得的苗转移到生根培养基中生根。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述水稻是粳稻。