CN110684795A - 紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法，包括菌种培养、过表达载体构建、过表达质粒转化等步骤。本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp50904_c4基因，验证其存在，并将该基因与过表达质粒pBC‑Hygro连接，导入红曲菌M1菌株中，成功构建了过表达工程菌株C6。通过对比过表达comp50904_c4基因的C6菌株和M1菌株的次级代谢产物产量、菌体干重、菌丝体形态等相关生理指标发现，下调基因comp50904_c4基因的过表达会降低红曲菌中Monacolin K的产量，并在一定程度上改变了菌丝体的形态，但对于红曲色素和菌体生物量的影响不大。

Description

紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法

技术领域：

本发明涉及一种紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，Monacolin K又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，Monacolin K具有抑制胆固醇合成中关键酶HMG-CoA活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，Monacolin K被国内外视为降胆固醇的理想药。

本发明的申请人实验室前期利用高通量测序技术对紫色红曲菌M1的转录组进行分析，发现了52个转录因子和27个靶基因，对其中的10个转录因子和靶基因进行了基因功能的预测并获得了相关的基因信息。由于红曲菌Monacolin K具体调控机制还未完全清晰，可对上述转录因子和靶基因进行基因克隆、功能验证等工作，以期获得红曲菌次级代谢产物合成过程中关键调控因子。

本发明选取转录组测序所得到的一个下调基因comp50904_c4进行基因克隆，并构建该基因过表达工程菌株，探究目的基因的过表达对红曲菌Monacolin K的合成、红曲色素的合成、菌丝体形态、生物量及相关基因表达量的影响。。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：

(一)菌种培养

将紫色红曲菌菌株在PDA固体培养基上培养，活化2代，每代3-4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养至种子液培养基呈浅粉色，需48h，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度改为25℃继续培养至第15d；

分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要吸除剩余水分，置于-80℃冰箱中保存；

(二)红曲菌总RNA的提取

具体步骤如下：

1.在2mL离心管中加入475μL的SL和25μL的β-巯基乙醇，取2管于-80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，12000rpm离心2min；

2.吸取500μL上清液至过滤柱CS中，离心，取400μL滤液至空离心管中；

3.加入160μL的无水乙醇，将混合液移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；

4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；

5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；

6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；

8.重复一次步骤7；

9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase-FreeddH₂O加到CR3吸附柱膜的中央，静置2min，12000rpm离心1min，滤液即为所提RNA；

(三)RNA质量检测

1.利用核酸定量仪进行RNA浓度检测，具体步骤如下：取1μL RNA，点样于检测孔，得到RNA浓度；

2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：

(1)于封口膜上点1μL的10X Loading Buffer载样缓冲液，吸取3μLRNA样品与缓冲液混合，吸打混匀后点样；

(2)电泳仪电压为150V，时间为15min；通过凝胶成像仪检测RNA完整性；

(四)cDNA的反转录

(1)根据下表的去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，3min；取出放于冰上备用；

gDNA去除反应体系

(2)根据下表的体系配制混合液，吸打混匀，待用；

反转录反应体系

(3)取步骤2中配制的混合液10μL，加到步骤1的反应体系中，短暂离心；

(4)42℃孵育15min，然后再95℃孵育3min，得到的cDNA溶液于-20℃保存；

(五)引物设计

根据红曲菌comp50904_c4基因序列，comp50904_c4基因序列进行比对并找出起始密码子和终止密码子的位置，依据保守区域设计引物；使用的引物及序列如下：

comp50904_c4Xba I-F：5’-GCTCTAGACAACACGAACGGAAGGAGTA-3’；

comp50904_c4Cla I-R：5’-GGTAGCTATCCCTTCTTTATTTTCTTCATTGT-3’；

(六)过表达载体构建

以pBC-hygro为过表达载体，选出两个该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp50904_c4目的基因进行连接，构建过表达pBC-hygro-comp50904_c4质粒；

(1)comp50904_c4基因的扩增

根据红曲菌转录组所得comp50904_c4基因序列设计PCR引物，以紫色红曲菌的cDNA为模板进行扩增comp50904_c4基因；comp50904_c4基因的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：

comp50904_c4基因的PCR反应体系

PCR反应条件如下：

1)95℃for 5min，

2)94℃for 30sec，

3)55℃for 30sec，

4)72℃for 10sec，

5)GOTO2，30more times，

6)72℃for 10min，

7)4℃，forever，

(2)PCR产物纯化回收

具体步骤如下：

1.每100μL PCR体系加入500μL DB，充分混匀；(若体系小于100μL，可用双蒸水补足到100μL)；

2.将上述步骤中所得溶液转移到吸附柱AC中，室温静置1min，后12,000rpm离心30-60sec，弃滤液；

3.加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液；

4.加入500μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液；

5.空柱离心2min；

6.将吸附柱AC放入新的离心管中，向吸附膜中央滴加40μL提前于65℃水浴中加热的洗脱缓冲液EB，室温静置2min，12,000rpm离心1min；

(3)comp50904_c4基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的双酶切

双酶切体系

酶切反应条件：37℃，2h；将酶切产物纯化回收；

(4)comp50904_c4基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的连接

步骤如下：

1.将comp50904_c4片段和pBC-Hygro质粒按3:1的比例制成4.5μL的溶液，置于65℃水浴2-3min，后放冰上备用；

2.向上述混合液中加入4.5μLSolutionI，16℃反应30min；

3.向反应液中加入1μLSolutionII，于-20℃冰箱保存；

(5)重组质粒的转化

1.取5μL连接产物轻柔打入50μL感受态细胞中，用手轻弹混匀，冰浴30min；

2. 42℃水浴中热激90sec，立即于冰上冷却5min；

3.加入1mL LB液体培养基，200rpm，37℃振荡培养60min，使菌体复苏；

4.培养后得菌液适当浓缩，取200μL涂布于含34μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，200rpm，37℃震荡培养14h后提取重组质粒；

(6)重组质粒验证

1.电泳检测：取5μL重组质粒于1％琼脂糖凝胶电泳检测；

2.双酶切验证：用QuickCutXbaI和QuickCutClaI对条带大小与预期相符的重组质粒做双酶切验证；若双酶切后的酶切产物有两条条带，条带大小分别与质粒酶切以及目的片段基因酶切后的片段大小相符，则证明重组质粒构建成功；

(七)过表达质粒转化

(1)红曲菌原生质体制备

1.将红曲菌M1接种于4个PDA平板培养基上，30℃恒温培养箱中培养4d；

2.每个平板上加10mL灭菌水，用接种环轻刮菌体表面，释放出孢子，制备孢子悬液；

3.取200μL孢子悬液，涂布于铺有经灭菌、烘干后的玻璃纸PDA平板上，涂至干涩，30℃培养30-40h；

4.用接种环刮取玻璃纸上的淡粉色菌丝体置于mira cloth单层上，用50mL MgSO₄溶液滤洗；

5.将菌丝体转移至经过滤除菌的50mL裂解酶液中，于30℃，60rpm酶解2.5-3h，然后用mira cloth单层过滤；

6.滤液于4℃，7000rpm离心5min，弃上清；

7.然后用1.2mol/L的山梨醇溶液过滤2次(离心，去上清)，再加入山梨醇溶液重悬原生质体，置于冰上备用；

(2)红曲菌潮霉素耐受浓度筛选

吸取100μL的红曲菌M1感受态细胞悬液涂布于PDA平板，潮霉素B的梯度浓度为：0、5、10、15、20、25μg/mL，于30℃恒温培养，以确定潮霉素B对M1生长的最佳抑制浓度；

(3)原生质体的电击转化

1.将重悬于山梨醇溶液中的原生质体于7000rpm离心5min，尽量吸净上清，加1mL电击转化液，吸打混匀，离心去上清；再加入220μL电击转化液，吸打混匀；

2.取两个灭菌的新1.5mL离心管，各加入70μL电击转化细胞，一管加入1μg质粒，吸打混匀，冰浴15min；

3.将上一步离心管中的溶液全部转移至预冷的电击转化杯中，电击后立即加入900μL预冷的复苏液体培养基，吸打混匀；

4.将电击转化杯中的液体转至1.5mL无菌离心管中，冰浴10min；

5.将离心管放入空培养皿中，于30℃，100rpm培养2h；

6.涂布100μL至PDA平板上，于30℃恒温培养6-7d。

本发明中的comp50904_c4基因的序列如下：

GATCCTTCAACACGAACGGAAGGAGTAAATAAACCACCGCTGTGATGGAGGCCAGCGAGCCCGCGATCACAGCGAAAACGCATTTATCGTGGATCGTGTCAGTATCGTGCTTGACGTCTTGTCCGTAGAGGCCTATGACTGTTACGCCGAGGACGAACTGGAAGAAGCGCAGGATTGTCTCGACCAGGACCTTGATCGGGTGTCTTGCTGCGGCATCTGGGGAGGTACTACCGGTTCCGGAGCCGGTTTTGTAGGCAGAGAGGACACTCATTTGGATGTTGGTTTTGGATTTGTTCTGGTTCGGGTGGTTGAATTGGAATTGAGGGTCGACTTGGAATCCTGCAGCTTGTGCTTGGGCTTGGGCTTTCTTTCCTTTGCGTTTCTTCGCTATCGCGCGGAGGAGTCTGAAGACGGCAAAGTACATGAGGAATAGATAGGATGGCAGGTGAAAGAAAGAGAGAGAGAGAGGGGGGGGAGAGAGAGAGAGAGGTTACTATAGGTCTCTTGCTCGGGAATAGGAAACCGCAACGAGTGTAGAAGATGCAAGGAAAGAGTAGGCGCAGTATGGCGTAGATATATCAACCAGGATGTTTCTGGATCCTGAATAAATGAAAGACAGAAGCAGCAGCAGCAGCAAGAGATGGTATATACTTTGCAGCTTTCTCCTCTCACACTCCTTTATGGATGACCAGCACCACAAAGGACGAAGAAGGAATGAAATGGAAGAAAAGAAAAGAAAAAGGAAACAGACCAAAACAATGCGAAATTAAAAGCTCTCAATTCTTAGACAATGAAGAAAATAAAGAAGGGA

本发明的有益效果：

本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp50904_c4基因，验证其存在，并将该基因与过表达质粒pBC-Hygro连接，导入红曲菌M1菌株中，成功构建了过表达工程菌株C6。

通过对比过表达comp50904_c4基因的C6菌株和M1菌株的次级代谢产物产量、菌体干重、菌丝体形态等相关生理指标发现，下调基因comp50904_c4基因的过表达会降低红曲菌中Monacolin K的产量，并在一定程度上改变了菌丝体的形态，但对于红曲色素和菌体生物量的影响不大。

利用RT-qPCR技术检测两菌株的基因表达变化情况发现，comp50904_c4基因的过表达改变了部分Monacolin K合成基因簇上基因的表达情况，其中mokA、mokB、mokE、mokF和mokH基因在发酵后期明显被抑制，mok A、mokC、mokD、mokE、mokF和mokH基因在发酵第15d的表达量下降十分明显，进而导致了Moncolin K产量的下降。因此下调基因comp50904_c4基因对与Monacolin K合成相关的基因有一定程度的调控作用。

附图说明：

图1是pBC-hygro-comp50904_c4质粒构建示意图。

图2是comp50904_c4基因PCR产物电泳图。图中泳道1：DL 2,000DNA Marker；泳道2,3,4：comp50904_c4基因PCR扩增产物。

图3是重组质粒与comp50904_c4基因序列的比对。

图4是pBC-hygro-comp50904_c4重组质粒的验证。泳道1：超螺旋Marker；泳道2：pBC-hygro质粒；泳道3：pBC-hygro-comp50904_c4质粒

图5是重组质粒的PCR验证。泳道1：DL2000 DNA Marker；泳道2：pBC-Hygro质粒PCR产物；泳道3：重组质粒PCR产物

图6是导入质粒菌株的筛选结果。第一行：导入质粒的M1菌株；第二行：M1菌株

图7是导入重组质粒的红曲菌发酵第12d Monacolin K产量分析。

图8是F5菌株潮霉素基因组的PCR电泳图。泳道1：DL2000 DNA Marker；泳道2：空白对照；泳道3：M1菌株；泳道4：F5菌株

图9是导入重组质粒的F5菌株和M1菌株Monacolin K产量。

图10是F5菌株红曲色素色价检测。A：红曲红色素；B：红曲橙色素；C：红曲黄色素

图11是F5菌株生物量检测。

图12是F5菌株与普通M1菌株在不同倍率下扫描电镜图。A：M1菌株10000×；B：F5菌株10000×；C：M1菌株5000×；D：F5菌株5000×

图13是F5和M1菌株相关基因转录量分析。

具体实施方式：

实施例1

本实施例具体提供一种紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法，按照下列实验方法进行。

1.实验材料

1.1实验菌株及质粒载体

由实验室保藏的野生型紫色红曲菌Monascus purpureus M1菌株；购自天根生化(北京)有限公司的Escherichia coli DH5α大肠杆菌感受态细胞；购自武汉淼灵生物公司的pBC-Hygro质粒。

1.2试剂及材料

PDA、PDB、LB肉汤培养基、10×TAE、1×PBS、葡萄糖、豆粕粉、NaNO₃、MgSO₄.7H₂O、Lysozyme、Snailase、Cellulase、潮霉素、氯霉素、独立滤器、0.22μm滤器、一次性注射器、蛋白胨、KH₂PO₄、ZnSO₄.7H₂O等购于北京半夏科技发展有限公司；SuperRealPreMix Plus(SYBRGreen)试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；QuickCutClaⅠ、QuickCutXbaⅠ、PrimeSTAR MaxDNA Polymerase、DNA marker购于TaKaRa公司；甲醇、乙醇、丙三醇等购于北京化工厂；高纯质粒小量制备试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司。

1.3仪器

表1主要仪器表

1.4培养基与抗生素

平板培养基(g/L)：PDA37 g，琼脂7.5g。

液体种子培养基(g/L)：葡萄糖30g，甘油70g，豆粕粉15g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 2g，NaNO₃ 2g，MgSO₄.7H₂O 1g。

液体发酵培养基(g/L)：甘油90g，ZnSO₄.7H₂O 2g，大米粉20g，KH₂PO₄ 2.5g，蛋白胨10g，NaNO₃5 g，MgSO₄.7H₂O 1g。

表2抗生素及使用浓度

2实验方法

2.1菌种培养

将紫色红曲菌M1菌株在PDA固体培养基上培养，活化2代，每代3-4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养至种子液培养基呈浅粉色，约需48h，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度改为25℃继续培养至第15d。

分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要尽量吸除剩余水分，置于-80℃冰箱中保存。

2.2红曲菌总RNA的提取

参照天根生化科技(北京)有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，按照流程提取红曲菌菌株的RNA。具体步骤如下：

1.在2mL离心管中加入475μL的SL和25μL的β-巯基乙醇，取2管于-80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，12000rpm离心2min；

2.吸取500μL上清液至过滤柱CS中，离心，取400μL滤液至空离心管中；

3.加入160μL的无水乙醇，将混合液移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；

4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；

5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；

6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；

8.重复一次步骤7；

9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase-FreeddH₂O加到CR3吸附柱膜的中央，静置2min，12000rpm离心1min，滤液即为所提RNA。

2.3 RNA质量检测

1.利用核酸定量仪进行RNA浓度检测，具体步骤如下：取1μL RNA，点样于检测孔，得到RNA浓度。

2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：

(1)于封口膜上点1μL的10X Loading Buffer载样缓冲液，吸取3μLRNA样品与缓冲液混合，吸打混匀后点样。

(2)电泳仪电压为150V，时间为15min。通过凝胶成像仪检测RNA完整性。

2.4 cDNA的反转录

参照天根生化科技(北京)有限公司的Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒说明书进行反转录，实验步骤如下：

1.根据表3的去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，3min。取出放于冰上备用。

表3 gDNA去除反应体系

(2)根据表4的体系配制混合液，吸打混匀，待用。

表4反转录反应体系

3.取步骤2中配制的混合液10μL，加到步骤1的反应体系中，短暂离心。

4. 42℃孵育15min，然后再95℃孵育3min，得到的cDNA溶液于-20℃保存。

2.5目的基因引物设计

根据红曲菌转录组所得comp50904_c4基因序列，对comp50904_c4基因序列进行比对并找出起始密码子和终止密码子的位置，依据保守区域设计引物。预计基因目标片段大小约为804bp。设计的引物于华大基因公司合成，本发明使用的引物及序列见表5。

表5 comp50904_c4基因扩增引物

2.6过表达载体构建

2.6.1过表达质粒构建示意图

以pBC-hygro为过表达载体，通过DNAman软件选出两个该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp50904_c4目的基因进行连接，构建过表达pBC-hygro-comp50904_c4质粒。具体示意图见图1。

2.6.2 comp50904_c4基因的扩增

根据红曲菌转录组所得comp50904_c4基因序列设计PCR引物，以紫色红曲菌M1的cDNA为模板进行扩增comp50904_c4基因。comp50904_c4基因的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：

表6 comp50904_c4基因的PCR反应体系

PCR反应条件如下：

1)95℃for 5min，

2)94℃for 30sec，

3)55℃for 30sec，

4)72℃for 10sec，

5)GOTO2，30more times，

6)72℃for 10min，

7)4℃，forever，

2.6.3 PCR产物纯化回收

参照多功能DNA纯化回收试剂盒说明书对目的条带纯化回收，具体步骤如下：

1.每100μL PCR体系加入500μL DB，充分混匀。(若体系小于100μL，可用双蒸水补足到100μL)。

2.将上述步骤中所得溶液转移到吸附柱AC中，室温静置1min，后12,000rpm离心30-60sec，弃滤液。

3.加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液。

4.加入500μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液。

5.空柱离心2min。

6.将吸附柱AC放入新的离心管中，向吸附膜中央滴加40μL提前于65℃水浴中加热的洗脱缓冲液EB，室温静置2min，12,000rpm离心1min。

2.6.4 comp50904_c4基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的双酶切

表7双酶切体系

酶切反应条件：37℃，2h；

将酶切产物纯化回收，步骤与2.6.2相同。

2.6.5 comp50904_c4基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的连接

参照TaKaRa的DNA Ligation Kit说明书进行，实验步骤如下：

1.将comp50904_c4片段和pBC-Hygro质粒按3:1(或5:1)的比例制成4.5μL的溶液，置于65℃水浴2-3min，后放冰上备用。

2.向上述混合液中加入4.5μLSolutionI，16℃反应30min。

3.向反应液中加入1μLSolutionII，于-20℃冰箱保存。

2.6.6重组质粒的转化

参照天根生化科技有限公司的pGM-T克隆试剂盒说明书将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，实验方法如下：

1.取5μL连接产物轻柔打入50μL感受态细胞中，用手轻弹混匀，冰浴30min。

2. 42℃水浴中热激90sec，立即于冰上冷却5min。

3.加入1mL LB液体培养基，200rpm，37℃振荡培养60min，使菌体复苏。

4.培养后得菌液适当浓缩，取200μL涂布于含34μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，200rpm，37℃震荡培养14h后提取重组质粒。

2.6.7重组质粒验证

1.电泳检测：取5μL重组质粒于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.双酶切验证：用QuickCutXbaI和QuickCutClaI对条带大小与预期相符的重组质粒做双酶切验证；若双酶切后的酶切产物有两条条带，条带大小分别与质粒酶切以及目的片段基因酶切后的片段大小相符，则证明重组质粒构建成功。

2.7过表达质粒转化

2.7.1红曲菌原生质体制备

1.将红曲菌M1接种于4个PDA平板培养基上，30℃恒温培养箱中培养4d。

2.每个平板上加10mL灭菌水，用接种环轻刮菌体表面，释放出孢子，制备孢子悬液。

3.取200μL孢子悬液，涂布于铺有经灭菌、烘干后的玻璃纸PDA平板上，涂至干涩，30℃培养30-40h。

4.用接种环刮取玻璃纸上的淡粉色菌丝体置于mira cloth单层上，用50mL MgSO₄溶液滤洗。

5.将菌丝体转移至经过滤除菌的50mL裂解酶液中，于30℃，60rpm酶解2.5-3h，然后用mira cloth单层过滤。

6.滤液于4℃，7000rpm离心5min，弃上清。

7.然后用1.2mol/L的山梨醇溶液过滤2次(离心，去上清)，再加入山梨醇溶液重悬原生质体，置于冰上备用。

2.7.2红曲菌潮霉素耐受浓度筛选

吸取100μL的红曲菌M1感受态细胞悬液涂布于PDA平板，潮霉素B的梯度浓度为：0、5、10、15、20、25μg/mL，于30℃恒温培养，以确定潮霉素B对M1生长的最佳抑制浓度。

2.7.3原生质体的电击转化

1.将重悬于山梨醇溶液中的原生质体于7000rpm离心5min，尽量吸净上清，加1mL电击转化液，吸打混匀，离心去上清；再加入220μL电击转化液，吸打混匀。

2.取两个灭菌的新1.5mL离心管，各加入70μL电击转化细胞，一管加入1μg质粒，吸打混匀，冰浴15min。

3.将上一步离心管中的溶液全部转移至预冷的电击转化杯中，电击后立即加入900μL预冷的复苏液体培养基，吸打混匀。

4.将电击转化杯中的液体转至1.5mL无菌离心管中，冰浴10min。

5.将离心管放入空培养皿中，于30℃，100rpm培养2h。

6.涂布100μL至PDA平板上，于30℃恒温培养6-7d。

2.8过表达菌株验证

将筛选得到的转化子连续传代，旨在筛选稳定遗传的转化子。过表达菌株的验证方式如下：

1.次级代谢产物验证，通过检测红曲霉转化子中Monacolin K产量、红曲色素色价。

2.基因水平验证，即以转化子的cDNA为模板，扩增hygro基因。如果目的菌株能扩增出来hygro基因，而对照菌株M1不能扩增出，则证明过表达质粒导入了红曲菌，进而初步证明comp50904_c4基因过表达菌株构建成功。潮霉素基因扩增的PCR反应体系和条件如下所示：

表8潮霉素基因的PCR反应体系

PCR反应条件如下：

1)96℃for 5min

2)96℃for 20sec

3)54-64℃for 30sec

4)72℃for 1min

5)GOTO 1，10more times

6)96℃for 20sec

7)54℃for 30sec

8)72℃for 1min

9)GOTO 6，30moretimes

10)72℃for 10min

11)4℃，forever

2.9 Monacolin K合成相关基因的转录量分析

1.菌体的收集及处理：分别取第2d、5d、8d、12d、15d的红曲菌发酵液置于2mL离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，用灭菌水洗涤重悬四次，吸净水分，根据上述2.3.2的方法提取其RNA，再将其反转录成cDNA备用。

2.引物的设计与合成：利用Beacon Designer8软件设计引物，根据NCBI网站的红曲菌合成Monacolin K关键基因组序列，选取mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH、mokI九段基因组、内参基因GAPDH以及comp50904_c4基因序列，设计特异性引物见表9，并由华大基因公司合成。

表9关键基因的引物序列

3.荧光定量分析

按照天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBRGreen)试剂盒说明书设计反应体系并进行扩增。操作方法如下：

(1)于冰上进行Realtime PCR反应体系配制，反应体系见表10：

表10荧光定量PCR反应体系

(2)采用三步法PCR程序反应，Real time PCR反应条件如下：

1)95℃for 15min

2)95℃for 10sec

3)52℃for 20sec

4)72℃for 30sec

5)GOTO2，40more times

6)Melt Curve 65℃to 95℃:Increment 0.5℃5sec

(3)盖上反应管，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，按照设定程序开始反应。

2.10 Monacolin K的检测

样品预处理：取5mL发酵液，向其中加入15mL 75％的甲醇，超声波萃取30min，静置4-5h。

Monacolin K的检测：利用HPLC检测发酵液中Monacolin K的含量，色谱柱：InertsilODS-3 C18(150mm×4.6mm×5μm)，流动相：甲醇：0.1％磷酸＝3：1，总流速1mL/min，检测器为紫外检测器(PDA)，检测温度30℃，检测波长为237nm，进样量10μL。

2.11红曲色素色价检测

样品预处理：取5mL发酵液，向其中加入15mL 70％的乙醇，于60℃恒温水浴1h，4000rpm离心15min。

色价的检测：用紫外分光光度计测定505、448、410nm处的吸光值。

定量公式：红曲色素色价(U/mL)＝吸光值×稀释倍数

2.12生物量的测定

菌体生物量的测定：采用干重法测菌体的生物量。取5mL发酵液置于双层擦镜纸上过滤，用灭菌水洗3次，烘干至恒重，即为菌丝体干重^[69]。

生物量(g/L)＝干物质质量/发酵液体积

2.13菌丝体形态检测

培养8天的红曲菌发酵液于12000rpm离心5min，弃上清，加入2.5％戊二醛溶液(用1×PBS缓冲溶液稀释)，吹打混匀，常温静置12h。用0.1M磷酸盐缓冲液漂洗细胞两次，两次重悬离心，弃上清。依次用不同浓度的乙醇溶液(30％，50％，70％，80％，90％，100％)重悬，每种浓度静置10min后12000rpm离心5min，弃上清，每种浓度重复两次。分别用醋酸异戊酯与乙醇(v：v＝1:1)、纯醋酸异戊酯溶液对细胞进行乙醇置换，在每种溶剂中分别静置10min后12000rpm离心5min，弃上清。最后向离心管中加入六甲基二硅胺，用量稍超过样品即可。用脱脂棉将管口堵上，置于60℃烘箱干燥直至样品成粉末状，常温干燥处保藏。

3结果与分析

3.1 comp50904_c4基因的扩增

以红曲菌M1的cDNA为模板，以上下游引物通过PCR扩增comp50904_c4基因片段，结果如图2所示。PCR扩增后得到一条大小为804bp左右的单一条带，与预期大小一致。

3.2重组质粒的验证

构建重组质粒后，将重组质粒测序结果与comp50904_c4基因原始序列完全比对，比对结果如图3所示，相似度达100％，证明Pbc-hygro质粒中成功插入了目的基因。

通过电泳对重组质粒进行初步验证，结果如图4所示，pBC-hygro质粒大小约为6800bp，重组质粒大小约为7600bp，结果与预期相符。

对重组质粒进行PCR验证，分别以pBC-Hygro质粒和重组质粒为模板进行PCR验证，结果如图5所示，pBC-Hygro质粒未能扩增出目的基因；重组质粒可以扩增出目的基因，可验证重组质粒成功。

3.3重组质粒的导入及转化子的筛选

利用电击转化的方法将构建成功的过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，再根据2.3潮霉素B浓度筛选的结果，挑选转化子。结果如图6所示，随机挑取潮霉素B浓度为20μg/mL和25μg/mL抗性板上的菌落，获得了具有潮霉素B抗性的转化子。将转化子在具有潮霉素B抗性的PDA平板上传5代，随后发酵培养至12d，检测转化子Monacolin K的产量及潮霉素B基因组，以筛选出目的转化子。

3.4转化子菌株Monacolin K产量检测

将重组质粒导入红曲菌感受态细胞后，对菌体进行复苏培养，并用潮霉素平板进行筛选，在潮霉素平板上随机选取14株单菌落，将选取的转化子分别命名为F1至F14，进行传代培养，得到11株遗传稳定的转化子，随后进行摇瓶发酵，检测第12d Monacolin K产量(图7)，结果显示，F5菌株Monacolin K产量最低，与原始M1菌株相比下降了30％。选取F5菌株为目的菌株，进行潮霉素B基因组的PCR验证。

3.5过表达菌株F5潮霉素基因的PCR验证

对D5菌株进行潮霉素基因的PCR验证。分别提取红曲菌M1菌株和F5菌株的RNA，再将其反转录成cDNA。以cDNA为模板，Hygro-F和Hygro-R为引物扩增潮霉素基因。结果如图8所示，对照菌株红曲菌M1菌株未能扩增出明显条带，而F5菌株能扩增出明显条带，说明F5菌株中成功的导入了过表达质粒，过表达菌株构建成功。

3.6过表达菌株F5的Monacolin K产量检测

对导入重组质粒的红曲菌通过HPLC进行Monacolin K产量检测。对F5菌株进行发酵培养，检测第5、8、12、15d的Monacolin K产量，如图9所示，F5菌株第12d的Monacolin K产量较M1菌株降低了30.4％，第15d的产量较M1菌株有所降低，减少了39.4％。

3.7过表达菌株F5的红曲色素色价检测

对导入重组质粒的红曲菌进行红曲红色素、橙色素、黄色素色价检测。对F5菌株进行发酵培养，检测第2、5、8、12、15d红曲色素色价，如图10所示，F5菌株第2、5、8、12d产量均与M1菌株变化并不明显，第15d色素色价低于M1菌株，三种色素的色价分别较M1菌株下降了61.0％、60.9％、60.9％。

3.8过表达菌株F5生物量的检测

通过比较F5菌株和M1菌株在发酵不同天数的菌丝体干重的差异，研究comp50904_c4基因的过表达对红曲菌菌丝体干重的影响。结果如图11所示，由图可知，F5菌株和M1菌株菌丝体变化趋势一致，差异并不明显。

3.9过表达菌株F5微观菌体形态的检测

通过扫描电镜检测F5菌株和M1菌株菌丝体的形态差异，结果如图12所示，对比图A和图B可知，F5菌株的孢子头表面颗粒数要明显多于M1菌株，更为粗糙。对比图C和图D可知，F5菌株的菌丝体与M1菌株相比褶皱程度相似，未发生明显改变。

3.10基因转录量的检测

利用RT-qPCR技术检测过表达F5菌株和野生型M1菌株中comp50904_c4基因和Monacolin K合成基因簇上9段基因(即mokA-mokI基因)的表达量，实验结果如图13所示，F5菌株的comp50904_c4基因在发酵第8d表达量是M1菌株的2.5倍。另外RT-qPCR的结果也显示，comp50904_c4基因的过表达也影响了Monacolin K合成基因簇上部分基因的表达量。其中，F5菌株中mokA、mokB和mokI基因的表达量较M1菌株有明显的下降，而mokC、mokG和mokH基因的表达在发酵第2d时较M1菌株有所增强。mokH基因表达量没有显著的变化。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctctagaca acacgaacgg aaggagta 28

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtagctatc ccttctttat tttcttcatt gt 32

Claims (1)

1.紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)菌种培养

将紫色红曲菌菌株在PDA固体培养基上培养，活化2代，每代3-4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养至种子液培养基呈浅粉色，需48h，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度改为25℃继续培养至第15d；

分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要吸除剩余水分，置于-80℃冰箱中保存；

(二)红曲菌总RNA的提取

具体步骤如下：

1.在2mL离心管中加入475μL的SL和25μL的β-巯基乙醇，取2管于-80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，12000rpm离心2min；

2.吸取500μL上清液至过滤柱CS中，离心，取400μL滤液至空离心管中；

3.加入160μL的无水乙醇，将混合液移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；

4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；

5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；

6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；

8.重复一次步骤7；

9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase-Free ddH₂O加到CR3吸附柱膜的中央，静置2min，12000rpm离心1min，滤液即为所提RNA；

(三)RNA质量检测

1.利用核酸定量仪进行RNA浓度检测，具体步骤如下：取1μL RNA，点样于检测孔，得到RNA浓度；

2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：

(1)于封口膜上点1μL的10X Loading Buffer载样缓冲液，吸取3μLRNA样品与缓冲液混合，吸打混匀后点样；

(2)电泳仪电压为150V，时间为15min；通过凝胶成像仪检测RNA完整性；

(四)cDNA的反转录

(1)根据下表的去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，3min；取出放于冰上备用；

表gDNA去除反应体系

(2)根据下表的体系配制混合液，吸打混匀，待用；

反转录反应体系

(3)取步骤2中配制的混合液10μL，加到步骤1的反应体系中，短暂离心；

(4)42℃孵育15min，然后再95℃孵育3min，得到的cDNA溶液于-20℃保存；

(五)引物设计

根据红曲菌comp50904_c4基因序列，comp50904_c4基因序列进行比对并找出起始密码子和终止密码子的位置，依据保守区域设计引物；使用的引物及序列如下：

comp50904_c4 Xba I-F：5’-GCTCTAGACAACACGAACGGAAGGAGTA-3’；

comp50904_c4 Cla I-R：5’-GGTAGCTATCCCTTCTTTATTTTCTTCATTGT-3’；

(六)过表达载体构建

以pBC-hygro为过表达载体，选出两个该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp50904_c4目的基因进行连接，构建过表达pBC-hygro-comp50904_c4质粒；

(1)comp50904_c4基因的扩增

根据红曲菌转录组所得comp50904_c4基因序列设计PCR引物，以紫色红曲菌的cDNA为模板进行扩增comp50904_c4基因；comp50904_c4基因的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：

comp50904_c4基因的PCR反应体系

PCR反应条件如下：

1)95℃for 5min，

2)94℃for 30sec，

3)55℃for 30sec，

4)72℃for 10sec，

5)GOTO2，30more times，

6)72℃for 10min，

7)4℃，forever，

(2)PCR产物纯化回收

具体步骤如下：

1.每100μL PCR体系加入500μL DB，充分混匀；(若体系小于100μL，可用双蒸水补足到100μL)；

2.将上述步骤中所得溶液转移到吸附柱AC中，室温静置1min，后12,000rpm离心30-60sec，弃滤液；

3.加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液；

4.加入500μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液；

5.空柱离心2min；

6.将吸附柱AC放入新的离心管中，向吸附膜中央滴加40μL提前于65℃水浴中加热的洗脱缓冲液EB，室温静置2min，12,000rpm离心1min；

(3)comp50904_c4基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的双酶切

双酶切体系

酶切反应条件：37℃，2h；将酶切产物纯化回收；

(4)comp50904_c4基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的连接

步骤如下：

1.将comp50904_c4片段和pBC-Hygro质粒按3:1的比例制成4.5μL的溶液，置于65℃水浴2-3min，后放冰上备用；

2.向上述混合液中加入4.5μLSolutionI，16℃反应30min；

3.向反应液中加入1μLSolutionII，于-20℃冰箱保存；

(5)重组质粒的转化

1.取5μL连接产物轻柔打入50μL感受态细胞中，用手轻弹混匀，冰浴30min；

2.42℃水浴中热激90sec，立即于冰上冷却5min；

3.加入1mL LB液体培养基，200rpm，37℃振荡培养60min，使菌体复苏；

4.培养后得菌液适当浓缩，取200μL涂布于含34μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，200rpm，37℃震荡培养14h后提取重组质粒；

(6)重组质粒验证

1.电泳检测：取5μL重组质粒于1％琼脂糖凝胶电泳检测；

2.双酶切验证：用QuickCutXbaI和QuickCutClaI对条带大小与预期相符的重组质粒做双酶切验证；若双酶切后的酶切产物有两条条带，条带大小分别与质粒酶切以及目的片段基因酶切后的片段大小相符，则证明重组质粒构建成功；

(七)过表达质粒转化

(1)红曲菌原生质体制备

1.将红曲菌M1接种于4个PDA平板培养基上，30℃恒温培养箱中培养4d；

2.每个平板上加10mL灭菌水，用接种环轻刮菌体表面，释放出孢子，制备孢子悬液；

3.取200μL孢子悬液，涂布于铺有经灭菌、烘干后的玻璃纸PDA平板上，涂至干涩，30℃培养30-40h；

4.用接种环刮取玻璃纸上的淡粉色菌丝体置于mira cloth单层上，用50mL MgSO₄溶液滤洗；

5.将菌丝体转移至经过滤除菌的50mL裂解酶液中，于30℃，60rpm酶解2.5-3h，然后用mira cloth单层过滤；

6.滤液于4℃，7000rpm离心5min，弃上清；

7.然后用1.2mol/L的山梨醇溶液过滤2次(离心，去上清)，再加入山梨醇溶液重悬原生质体，置于冰上备用；

(2)红曲菌潮霉素耐受浓度筛选

吸取100μL的红曲菌M1感受态细胞悬液涂布于PDA平板，潮霉素B的梯度浓度为：0、5、10、15、20、25μg/mL，于30℃恒温培养，以确定潮霉素B对M1生长的最佳抑制浓度；

(3)原生质体的电击转化

1.将重悬于山梨醇溶液中的原生质体于7000rpm离心5min，尽量吸净上清，加1mL电击转化液，吸打混匀，离心去上清；再加入220μL电击转化液，吸打混匀；

2.取两个灭菌的新1.5mL离心管，各加入70μL电击转化细胞，一管加入1μg质粒，吸打混匀，冰浴15min；

3.将上一步离心管中的溶液全部转移至预冷的电击转化杯中，电击后立即加入900μL预冷的复苏液体培养基，吸打混匀；

4.将电击转化杯中的液体转至1.5mL无菌离心管中，冰浴10min；

5.将离心管放入空培养皿中，于30℃，100rpm培养2h；

6.涂布100μL至PDA平板上，于30℃恒温培养6-7d。

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