CN113151338B

CN113151338B - 紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株构建方法及其应用

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Publication number: CN113151338B
Application number: CN202110150855.2A
Authority: CN
Inventors: 张婵; 王成涛; 孙宝国
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2021-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2041-06-09
Also published as: CN113151338A

Abstract

本发明公开了紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株的构建方法，包括菌种培养、过表达载体构建、过表达质粒转化等步骤。本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp54338_c3基因，验证其存在，并将该基因与过表达质粒pBARGPE1‑Hygro连接，导入红曲菌M1菌株中，成功构建了过表达工程菌株c3‑7。通过对比过表达comp54338_c3基因的c3‑7菌株和M1菌株的次级代谢产物产量、菌丝生物量、菌丝体形态等相关生理指标发现，下调基因comp54338_c3基因的过表达会降低红曲菌中Monacolin K和三种红曲色素的产量，抑制红曲菌菌丝体的生长发育导致菌丝生物量也相应降低，并在一定程度上改变了菌丝体的形态。

Description

紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

背景技术

红曲菌又称“红曲霉”，是一种腐生真菌，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌作为重要的食用和药用真菌之一，可产生多种次级代谢产物，包括Monacolin K、红曲色素、桔霉素、γ-氨基丁酸以及麦角固醇等，其中大部分被广泛应用于食品、医药等领域。Monacolin K又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，Monacolin K具有抑制胆固醇合成途径中的关键酶HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶)活性的作用，进而能够有效的抑制胆固醇合成，因此，Monacolin K被国内外视为降胆固醇的理想药。

本发明的申请人实验室前期利用高通量测序技术对紫色红曲菌M1的转录组进行分析，发现了52个转录因子和27个靶基因，对其中的5个转录因子和5个靶基因进行了基因功能的预测并获得了相关的基因信息。由于红曲菌生物合成及分解代谢过程繁杂，Monacolin K具体调控机制还未完全清晰，可对上述转录因子和靶基因进行基因克隆、功能验证等工作，以期获得红曲菌次级代谢产物合成过程中的关键调控因子。

本发明选取转录组测序所得到的一个下调基因comp54338_c3进行基因克隆，并构建该基因过表达工程菌株，探究目的基因的过表达对红曲菌Monacolin K的合成、红曲色素的合成、菌丝体形态、生物量及相关基因表达量的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株的构建方法。

comp54338_c3基因序列如下：

TGTGCCTTTTCAGATCGTGGTGTCGTCGGAAGCGCGACTGGCAAGTTTGGCACACGAATGGTTTCTCTTGGCTGTGGGTGAGAAGATGACTCTTGAGGTTATGATGTCGTGTAAATTCCGTGGGGCAGTACGGGCATCGATGCTTCTTGGCCGATGGAGATCGCAGGCTACCCTTGTGAAAGCCAGAGTTCGGTAGACTATGACCACGGCGAGGGTCGCTCATACTAGGAGTTGGTAATGGGTAGGAGAATGATTTGCTAGTATGTTCTTGTGGAATGTCGCCATCGTCCCTATGATGCGGATGATCTCCGTCCTGGGAGACTGTGTCTTCAATCGGACCGGGGCTTGCTACAGTCGAGGTGTTGACGAGTGAGGTCGTGCTGTTTTCGGTGGTCCCAAAGGTTTCCGTCACATTACCTGAACCTGCATGCGGGTCAACCTGCATGTGGTCAGGCGGCATGTGCATTGTATCGTTGATGACGCCAGTGTGAGACTTCTCACTGGCGCCTAGGGCTTCCCTGGCAACCTGAGAGCTCCTCTGTTGCGAGTCGTGCTCATGTTCCAGTGGCCGATCTGTCGGCCCAGTCGGTTTGGAAGTGTTCATTTGTGGCAATTGGTCTCGAGATGACCTTGAAACGTGCAGGCCAGCGCTCGCGATCGAGCTCAAATTCGTTTCCGAGTTTGGCTGTTGCTTCAGGAAGATGATGGATTCGGAAGGGTTCGACACAACAGAGCTCGATACAGCGGACAACGAATTGGTAATGGAAGCCGGATCGTTAGAAGATTGCATCAGTGCGGCCATGGATGACCTGGAGACGACGCCAGTTTGGTACAATTGAGGGAGTAATGCGGGAGGAGCGGCGTCGCGTGGGGCGCTCACCCGAGCGTGGCGCAAGCTGACCGGGGATCCTTCCGCCTCGCAGCTCGTCAAGGCTCAGAGGTGACAAAGAGAGAGGGAGTCAGCCTAGCAAGCGCGAGAGGAGTAAGGCAGTGTCGTATGGACGATTAAACAGGTTGGAACCGGGACAAGGACAGGGAGGACTGGGGCATCTGGCGTTGTGGAGGAGTGGACGGGTACGAGAGGATAGAAAGGGATTGGATCTCTCTCTGGACTGCGATGAGGAAAACGAGGAAGCGGAAAAACCGAGTGGCGGGTGAGGAAAGGAGATTATTAAGGAGGGATTAGAAAGACGAAGATATTATTCCAGCGTAATAACAATGAATGACAATGCCAATGGCGATGGCCAAAACAACGACCAAGACGGACTGGAAGAAAATGAACAGAGCAGAAAAGGCCTTGACAGGAGGATAATAATGATGAGAAAGACAGACAGAGCCGGGGTATCTGCGGACGAGGCAGAGCCGCCAAAGTTTGACAGCAGAGGAAGACAGTAATAATAGAGACTCCGCAGAACTGGGAGTGAGGATGAGTAACAACGGGCAGACTACAGTTCTTCTGGGCCGCAGTGGCACAGCAGCCGCATGCTATGATGTTGATGATTATGGATATGGATATGCTGGAACTGGGAAACGAGGCAAAAGTCCACTGTTTT

本发明提供的紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：

(一)菌种培养

将紫色红曲菌M1菌株在PDA培养基上培养，活化2代后接种，每代3-4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养48h至种子液培养基呈浅粉色，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度调整为25℃继续培养13d。

分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要尽量吸除剩余水分，置于-80℃冰箱中保存。

(二)红曲菌总RNA的提取

具体步骤如下：

1.在2mL离心管中，加入475μL SL和25μL的β-巯基乙醇，取于-80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取100mg粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，以12000rpm的转速离心2min；

2.在CS过滤柱内加入适量的上清液，12000rpm离心2min后吸取上清液至新的离心管中；

3.取160μL无水乙醇加入上清液中混匀，将混合液转移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；

4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；

5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；

6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；

8.重复一次步骤7；

9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase-FreeddH₂O加到CR3吸附柱膜的中央，静置2min，12000rpm离心1min，滤液即为所提RNA；

(三)RNA质量检测

1.利用NanoDrop 2000核酸定量仪进行RNA浓度、纯度检测，具体步骤如下：准确吸取1μL的RNase-Free ddH₂O，点样于NanoDrop核酸定量仪的检测孔中作为空白对照。取1μLRNA，点样于检测孔，得到RNA浓度及用于衡量蛋白质污染程度的OD值；

2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：

(1)于封口膜上点1μL的10X Loading Buffer载样缓冲液，吸取5μLRNA样品与缓冲液混合，吸打混匀后点样；

(2)电泳仪电压为150V，时间为15min；通过凝胶成像仪检测RNA完整性；

(四)cDNA的反转录

(1)根据下表的去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，3min；取出放于冰上备用；

gDNA去除反应体系

组成成分	使用量
		5×gDNA Buffer	2μL
Total RNA	2μL
		RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	6μL

(2)根据下表的体系配制混合液，吸打混匀，待用；

反转录反应体系

(3)取步骤(2)配制好的混合液10μL加到步骤(1)的溶液中，短暂离心；

(4)混合液42℃孵育15min，然后再于95℃孵育3min，则完成反转录，得到cDNA溶液于-20℃保存。

(五)引物设计

根据红曲菌comp54338_c3基因序列设计引物；引物及序列如下：

实验引物

(六)过表达载体构建

以pBARGPE1-Hygro为过表达载体，选出该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp54338_c3目的基因进行连接，构建过表达pBARGPE1-Hygro-c3质粒；

(1)comp54338_c3基因的扩增

根据红曲菌转录组所得comp54338_c3基因序列设计PCR引物，以紫色红曲菌的cDNA为模板进行扩增comp54338_c3基因；comp54338_c3基因的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：

comp54338_c3基因的PCR反应体系

PCR反应体系	体积(μL)
		PrimeSTAR Max Premix(2X)	12.5
c3-F	1
		c3-R	1
cDNA	1
		ddH<sub>2</sub>O	9.5
总体积	25

PCR反应条件：

1)95℃for 5min

2)94℃for 30sec

3)62℃for 30sec

4)72℃for 10sec

5)GOTO 2,30more times

6)72℃for 10min

7)4℃,forever

(2)PCR产物纯化回收

具体步骤如下：

1.每100μL PCR体系加入500μL DB，充分混匀；(若体系小于100μL，可用双蒸水补足到100μL)；

2.将上述混合溶液全部转移到吸附柱AC中，室温静置1min，12000rpm离心30-60sec，弃滤液；

3.加入700μL WB漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；

4.加入500μLWB漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；

5.空柱离心2min；

6.将吸附柱AC放入新的离心管中，向吸附膜中央滴加预热的40μL EB缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心1min。

(3)comp54338_c3基因PCR产物与pBARGPE1-Hygro的双酶切体系：

37℃，2h；将酶切反应产物纯化回收。

(3)comp54338_c3基因PCR产物与pBARGPE1-Hygro质粒的连接

步骤如下：

1.将comp54338_c3片段和pBARGPE1-Hygro质粒按3:1的比例制成4.5μL的溶液，置于65℃水浴2-3min，后放冰上备用；

2.向上述混合液中加入4.5μLSolutionI，16℃反应30min；

3.向反应液中加入1μLSolutionII，于-20℃冰箱保存；

(5)重组质粒的转化

1.50μL感受态细胞中轻柔加入5μL连接产物，用手轻弹混匀，置于冰上30min。

2.42℃水浴中热激90sec，迅速于冰上冷却5min。

3.取1mL LB液体培养基加入到离心管，转速200rpm，温度37℃，培养60min，促进菌体复苏。

4.根据菌液浑浊程度进行适当处理，在LB抗性培养基上(含100μg/mL氨苄青霉素)加入200μL培养的菌液进行涂布，37℃倒置培养14h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，200rpm，37℃震荡培养12-14h后提取重组质粒。

(6)重组质粒提取

具体操作如下：

1.取2mL菌液，9000rpm离心30sec，弃上清；

2.重复一次，收集菌体；

3.加入250μLP1溶液漩涡振荡，重悬菌体沉淀并彻底混匀；

4.为了促进菌体裂解，向上述溶液中加入250μL P2溶液，温和颠倒6-10次，加入400μL的P3溶液，温和翻转6-10次，室温静置5min，离心10min；

5.吸取上清液转移到新的吸附柱AC中，13000rpm离心1min，弃滤液；

6.上述离心管内加入500μL去蛋白液PE，13000rpm离心30sec，弃滤液，加入500μLWB漂洗液，13000rpm离心30sec，弃滤液；

7.重复一次，空柱离心2min，静置5min，挥发乙醇；

8.将吸附柱转移到新的离心管内，吸附柱膜上滴加60μL EB缓冲液，室温静置1min，13000rpm离心1min对质粒进行洗脱，后置于冰上保存备用。

(7)重组质粒验证

1.电泳检测：取重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，若大小与空载和目的基因的长度之和一致，可初步认为重组质粒构建成功；

2.酶切验证：利用Quick Cut KpnI和Quick Cut EcoRI对其进行双酶切验证；若双酶切后的产物有两条条带，且大小分别与原质粒以及目的片段基因酶切后的片段大小相符，则证明重组质粒构建成功；

3.PCR验证：分别以重组质粒和原质粒为模板，以c3-F、c3-R为引物进行PCR扩增；若成功，重组质粒能成功扩增出c3基因片段，而原质粒中无法扩增出c3基因。

(七)过表达质粒转化

(1)红曲菌原生质体制备

1.将紫色红曲菌M1接种于PDA平板培养基上，于30℃恒温培养箱中培养4d；

2.向平板上加入10mL灭菌水制备孢子悬液；

3.吸取200μL孢子悬液，在铺有玻璃纸的培养基上进行培养活化，30℃培养35h左右至长出淡粉色菌体；

4.用接种环刮取菌体置于灭菌后的滤布单层上，用0.6mol/L的MgSO₄溶液滤洗；

5.将菌丝体转移至经过滤除菌的裂解酶液中，在30℃、60rpm条件下酶解2.5-3h，酶解后的溶液用滤布过滤后进行除菌操作；

6.滤液于4℃，7000rpm离心5min，弃上清直至滤液全部转移至一个离心管内；

7.用1.2mol/L的山梨醇溶液对得到的沉淀进行过滤洗涤2次，然后重悬原生质体，冰浴备用。

(2)红曲菌潮霉素耐受浓度筛选

吸取100μL的红曲菌感受态细胞悬液涂布于PDA再生培养基上，对潮霉素B的浓度进行梯度划分，分别为：0、2、4、6、8、10μg/mL，于30℃恒温培养6-7天，以确定红曲菌菌体生长能够耐受潮霉素B的最大浓度。

(3)原生质体的电击转化

1.将重悬于山梨糖醇溶液中的原生质体以7000rpm的转速离心5min，弃上清；加入1mL电击转化液，吸打混匀，7000rpm离心5min弃上清；再次添加220μL电击转化液，吸打混匀；

2.分别吸取70μL步骤1得到的电击转化细胞于两个新离心管中，一管加入1μg重组质粒，吸打混匀，另一管作为对照不加质粒，冰浴15min；

3.分别将上述离心管中的溶液全部转移至到电击转化杯中，在提前预热并设定好程序的电转化仪上进行电击后，迅速加入900μL预冷的复苏培养基，吸打混匀；

4.将混合液分别转移至新的无菌离心管中，冰上放置10min；

5.将离心管放入空培养皿中，于30℃，100rpm培养2h；

6.取100μL在PDA平板上进行涂布，于30℃恒温箱中培养6-7d。

本发明的有益效果：

本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp54338_c3基因，验证其存在，并将该基因与过表达质粒pBARGPE1-Hygro连接，导入红曲菌M1菌株中，成功构建了过表达工程菌株c3-7。

通过对比过表达comp54338_c3基因的c3-7菌株和M1菌株的次级代谢产物产量、菌丝生物量、菌丝体形态等相关生理指标发现，下调基因comp54338_c3基因的过表达会降低红曲菌中Monacolin K和三种红曲色素的产量，抑制红曲菌菌丝体的生长发育导致菌丝生物量也相应降低，并在一定程度上改变了菌丝体的形态。

利用RT-qPCR技术检测两菌株的基因表达变化情况发现，comp54338_c3基因的过表达改变了部分Monacolin K合成基因簇上基因的表达情况，其中mok I基因的表达量在发酵第5天和第12天与M1菌株相比下降程度较大；发酵第8天，大多数基因的表达量较M1菌株下调，包括mok A、mok B、mok D、mok F、mok G和mok H基因；mok A、mokD、mokH和mokI基因在发酵第15d的表达量下降十分明显。因此下调基因comp54338_c3基因对与Monacolin K合成相关的基因有一定程度的调控作用，其通过抑制基因簇中关键基因的表达情况进而抑制Monacolin K的合成。

附图说明：

图1是pBARGPE1-Hygro-comp54338_c3质粒构建示意图。

图2是comp54338_c3基因PCR产物电泳图。泳道1：DL2,000DNA Marker；泳道2,3：comp54338_c3基因PCR扩增产物。

图3是重组质粒的双酶切。泳道1：DL10,000DNA Marker；泳道2：pBARGPE1-Hygro-c3/Quick Cut KpnI+Quick Cut EcoRI；泳道3：pBARGPE1-Hygro/Quick Cut KpnI+QuickCut EcoRI。

图4是重组质粒电泳验证。泳道1：超螺旋Marker；泳道2：pBARGPE1-Hygro质粒；泳道3：pBARGPE1-Hygro-c3质粒。

图5是红曲菌M1菌株对潮霉素B的耐受浓度。

图6是导入质粒菌株的筛选结果。第一行：M1菌株；第二行：导入重组质粒的M1菌株。

图7是导入pBARGPE1-Hygro-c3质粒的红曲菌转化子Monacolin K产量检测。

图8是c3-7菌株潮霉素转录组的PCR电泳图。泳道1：DL2000 DNA Marker；泳道2：M1菌株；泳道3：c3-7菌株。

图9是c3-7和M1菌株Monacolin K产量检测。

图10是两种菌株红曲色素产量检测。A：红曲红色素；B：红曲橙色素；C：红曲黄色素。

图11是c3-7和M1菌株生物量检测。

图12是c3-7与M1菌株在不同倍率下扫描电镜图。A：M1菌株10000×；B：c3-7菌株10000×；C：M1菌株2000×；D：c3-7菌株2000×。

图13是c3-7和M1菌株c3基因的转录量分析。

图14是c3-7和M1菌株mok A-mok I基因的转录量分析。

具体实施方式：

实施例1

本实施例具体提供一种紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株的构建方法，具体按照下列实验方法进行。

1.实验材料

1.1实验菌株及质粒载体

由实验室保藏的来源于中国普通微生物培养中心的紫色红曲菌菌株M1，菌株编号为：CGMCC 3.0568；购于天根生化(北京)有限公司的Escherichia coli DH 5α感受态细胞；购于武汉淼灵生物公司的pBARGPE1-Hygro质粒。

1.2试剂及材料

RNA prepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)购于天根生化科技(北京)有限公司；高纯质粒小量制备试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司；Quick Cut KpnI、Quick Cut EcoRI、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNAmarker、DNA Ligation Kit购于TaKaRa公司；PDA、葡萄糖、大豆粉、甘油、蛋白胨、KH2PO4、NaNO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、潮霉素、10×TAE、10×TBE购于北京半夏科技发展有限公司；色谱级甲醇、无水乙醇、无菌滤器、0.45μm滤器等购于北京奥博星生物技术责任有限公司。

1.3仪器

主要仪器表

1.4培养基与抗生素

平板培养基(g/L)：PDA37 g，琼脂7.5g。

液体种子培养基(g/L)：甘油70g，葡萄糖30g，豆粕粉15g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 2g，NaNO₃ 2g，MgSO4·7H2O 1g。115℃高压灭菌20min；

液体发酵培养基(g/L)：甘油90g，大米粉20g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 2.5g，NaNO₃ 5g，MgSO4·7H2O 1g，ZnSO4·7H2O 2g。121℃高压灭菌15min；

LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g。121℃高压灭菌15min；

LB固体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，琼脂25g。121℃高压灭菌15min。

抗生素使用及浓度

抗生素	缩写	分子式	母液(mg/mL)	使用浓度(μg/mL)
					潮霉素B	Hygromycin	C<sub>20</sub>H<sub>37</sub>N<sub>3</sub>O<sub>13</sub>	50	8
氨苄青霉素	Amp	C<sub>16</sub>H<sub>18</sub>N<sub>3</sub>O<sub>4</sub>S	100	100

2实验方法

2.1菌种培养

2.2红曲菌总RNA的提取

具体步骤如下：

6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；

8.重复一次步骤7；

2.3RNA质量检测

2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：

2.4cDNA的反转录

(1)根据去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，3min；取出放于冰上备用；

gDNA去除反应体系

(2)根据下表体系配制混合液，吸打混匀，待用；

反转录反应体系

组成成分	使用量
		10×Fast RT Buffer	2μL
RT Enzyme Mix	1μL
		FQ-RT Primer Mix	2μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	5μL

2.5目的基因引物设计

根据红曲菌转录组所得comp54338_c3基因序列,依照序列信息设计相应引物,引物由华大基因科技有限公司合成。引物及序列如下：

2.6过表达载体构建

2.6.1过表达质粒构建示意图

本实施例以pBARGPE1-Hygro为过表达载体，选出该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp54338_c3目的基因进行连接，构建过表达pBARGPE1-Hygro-c3质粒，质粒构建示意图如图1所示。

2.6.2comp54338_c3基因的扩增

PCR反应条件如下：

1)95℃for 5min

2)94℃for 30sec

3)62℃for 30sec

4)72℃for 10sec

5)GOTO 2,30more times

6)72℃for 10min

7)4℃,forever

2.6.3PCR产物纯化回收

具体步骤如下：

3.加入700μL WB漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；

4.加入500μLWB漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；

5.空柱离心2min；

2.6.4comp54338_c3基因PCR产物与pBARGPE1-Hygro的双酶切

37℃，2h；将酶切反应产物纯化回收。

2.6.5comp54338_c3基因PCR产物与pBARGPE1-Hygro质粒的连接

步骤如下：

2.向上述混合液中加入4.5μLSolutionI，16℃反应30min；

3.向反应液中加入1μLSolutionII，于-20℃冰箱保存；

2.6.6重组质粒的转化

2.42℃水浴中热激90sec，迅速于冰上冷却5min。

2.6.7重组质粒提取

具体操作如下：

3.取2mL菌液，9000rpm离心30sec，弃上清；

4.重复一次，收集菌体；

3.加入250μLP1溶液漩涡振荡，重悬菌体沉淀并彻底混匀；

7.重复一次，空柱离心2min，静置5min，挥发乙醇；

2.6.8重组质粒验证

2.7过表达质粒转化

2.7.1红曲菌原生质体制备

2.向平板上加入10mL灭菌水制备孢子悬液；

2.7.2红曲菌潮霉素耐受浓度筛选

2.7.3原生质体的电击转化

4.将混合液分别转移至新的无菌离心管中，冰上放置10min；

5.将离心管放入空培养皿中，于30℃，100rpm培养2h；

6.取100μL在PDA平板上进行涂布，于30℃恒温箱中培养6-7d。

2.8过表达菌株验证

将在潮霉素B抗性平板上得筛选到的转化子连续传5代，以便筛选得到能够稳定遗传的转化子。过表达菌株的验证方式如下：

(1)次级代谢产物验证，通过检测红曲霉转化子中的Monacolin K产量、红曲色素色价。Monacolin K的产量验证：利用HPLC对红曲菌的阳性转化子中的Monacolin K进行分析，如果转化子中Monacolin K产量产生一定程度的变化，则初步证明c3基因过表达菌株构建成功。

(2)基因水平验证：分别以不同菌株的cDNA作为PCR模板扩增潮霉素基因。如果转化子能扩增得到Hygromycin基因，而野生型菌株未能扩增出Hygromycin基因，则说明过表达载体在红曲菌中表达，进而证明过表达载体成功导入红曲菌体内，过表达菌株构建成功。潮霉素基因扩增的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：

PCR反应体系	体积(μL)
		PrimeSTAR Max Premix(2X)	12.5
Hygromycin-F	1
		Hygromycin-R	1
cDNA	1
		ddH<sub>2</sub>O	9.5
总体积	25

PCR反应条件：

1)95℃for 5min

2)94℃for 30sec

3)48.7℃for 30sec

4)72℃for 6sec

5)GOTO 2,30more times

6)72℃for 10min

7)4℃,forever

2.9Monacolin K合成相关基因的转录量分析

1.菌体的收集及处理

分别取第2d、5d、8d、12d、15d的红曲菌发酵液置于2mL离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，用无菌水洗涤重悬直至上清液不再呈红色，吸除离心管中残余水分。根据上述2.2的方法进行红曲菌RNA的提取，再根据2.4的方法将其反转录成cDNA以用于荧光定量分析。

2.引物的设计与合成

用Olige7.37软件，根据NCBI网站的红曲菌合成Monacolin K关键基因组序列，选取mok A、mok B、mok C、mok D、mok E、mok F、mok G、mok H、mok I九段基因组、内参基因GAPDH以及c3基因序列，设计得到的RT-qPCR的引物序列如下，由华大基因科技有限公司制备合成。

3.荧光定量分析

根据天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBRGreen)试剂盒说明书设计反应体系并进行扩增。操作方法如下：

(1)于冰上进行RT-qPCR反应体系配制，反应体系如下表所示。

荧光定量PCR反应体系

组成成分	20μL体系
		2×SuperReal PreMix Plus	10μL
正向引物(10μM)	0.6μL
		反向引物(10μM)	0.6μL
cDNA模板	1μL
		RNase-free ddH<sub>2</sub>O	7.8μL

(2)RT-qPCR反应条件如下：

1)95℃for 15min

2)95℃for 10sec

3)52℃for 20sec

4)72℃for 30sec

5)GOTO2，40more times

6)Melt Curve 65℃to 95℃:Increment 0.5℃5sec

(3)提前设置好反应程序，在荧光定量PCR仪中放入样品，开始反应。

2.10Monacolin K的检测

发酵液的预处理：取紫色红曲菌发酵液5mL，使用75％的色谱级甲醇稀释4倍，于超声清洗机内萃取30min，静置避光过夜。

Monacolin K的检测：采用HPLC法检测发酵液中Monacolin K的含量，色谱柱：InertsilODS-3C18(150mm×4.6mm×5μm)；流动相为0.1％磷酸和甲醇，比例为1：3，流速为1mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长为237nm；柱温箱温度为30℃；进样量为10μL。

2.11红曲色素检测

样品预处理：取1mL紫色红曲菌发酵液，使用70％的乙醇溶液稀释9倍，于60℃恒温水浴锅中浸提1h，放置冷却后，4000rpm离心15min，避光静置以待检测。

色价的检测：红曲色素主要分为三种，分别为红曲黄、红曲橙和红曲红色素，分别在410、448、505nm波长处有特征吸收峰，因此利用紫外分光光度法进行测定。

定量公式：红曲色素色价(U/mL)＝吸光值×稀释倍数

2.12生物量的测定

菌丝体生物量的检测：采用干重法，枪头吸取5mL发酵液用灭菌后的滤纸过滤，再用蒸馏水洗涤3次后进行烘干至达到恒重，即得到菌丝体干物质重量。

生物量(g/L)＝干物质质量/发酵液体积

2.13菌丝体形态检测

为了收集菌体细胞，选择发酵第8天的发酵液进行处理，取2mL的发酵液于12000rpm离心5min，弃废液。加入2.5％戊二醛溶液对菌体进行重悬和固定，常温静置12h。使用0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)漂洗细胞两次。依次使用不同浓度梯度的乙醇溶液对细胞进行脱水操作(30％，50％，70％，80％，90％，100％)，每次添加后需静置10min后再于12000rpm离心5min，弃去上清液，同种浓度重复两次。用体积比为1:1的醋酸异戊酯和乙醇重悬菌体，再加入醋酸异戊酯溶液对细胞进行乙醇置换，每种溶剂中分别静置10min后12000rpm离心5min，弃上清。最后加入溶剂六甲基二硅胺(HMDS)，使其用量稍没过样品即可。使用脱脂棉塞住离心管顶部以提高吸水性，置于60℃烘箱干燥直至样品成粉末状，常温干燥处保藏。

3结果与分析

3.1comp54338_c3基因的扩增

以紫色红曲菌M1反转录得到的cDNA为PCR模板，以c3-F和c3-R分别为上下游引物扩增comp54338_c3基因片段，电泳分析结果结果如图2所示。在1500bp左右可以得到一条清晰的单一条带，与目的条带大小相符。

3.2重组质粒的验证

为了验证重组质粒是否构建成功，首先进行双酶切验证，并以原质粒做对照。结果如图3所示，重组质粒在经过双酶切后得到两段大小分别在6000bp左右和1500bp左右的清晰条带，分别与空载体和comp54338_c3基因的片段大小一致。

对重组质粒进行电泳验证，电泳图如4所示，发现重组质粒长度约在7500bp左右，符合目的基因片段与原质粒长度之和。

重组质粒通过双酶切验证和电泳验证后，初步证明目的片段与过表达载体连接成功，为了进一步验证是否构建成功，将重组质粒与目的片段进行序列比对。结果显示两段序列的相似度达99.55％，证明目的基因成功导入pBARGPE1-Hygro质粒，过表达质粒构建成功。

3.3红曲菌M1菌株潮霉素B浓度筛选

为了确定最佳抑制浓度，取100μL红曲菌孢子悬液分别涂布于0、2、4、6、8、10μg/mL不同浓度梯度的潮霉素B抗性平板上。结果如图5所示，潮霉素浓度增长的同时，红曲菌M1菌株的菌落数逐渐减少，而在8μg/mL浓度的平板上无菌落生长。因此，潮霉素B的筛选抑制浓度为8μg/mL。

3.4重组质粒的导入及转化子的筛选

红曲菌原生质体的制备依据2.7.1，过表达菌株的构建采用电转化法，结合3.3中潮霉素浓度的筛选结果，筛选阳性转化子，其中以未导入重组质粒的原生质体作为对照。结果如图6所示，随着潮霉素浓度的增加，两种菌株的菌落数都呈现减少趋势；当浓度为6μg/mL时，平板上两种菌株的菌落数出现了明显差异，导入重组质粒的平板上菌落数量较多；而当潮霉素B浓度为8μg/mL时，对照组M1菌株的平板上无菌落生长，而导入重组质粒的菌株有菌落生长，说明野生型菌株的潮霉素B最大耐受浓度为8μg/mL，这也与3.3的结果一致。因此，从8μg/mL的培养基上挑取单菌落获取具潮霉素B抗性的转化子。将转化子在潮霉素抗性的平板上进行传代培养至遗传稳定，然后进行发酵培养，检测转化子的Monacolin K产量，并对潮霉素B基因进行PCR验证，以筛选得到过表达效果最好的转化子。

3.5红曲菌转化子菌株筛选Monacolin K产量检测

挑取的转化子传代培养后，得到10个遗传稳定的转化子，分别命名为c3-1至c3-10。对这10个转化子及M1菌株共11株菌株进行液态发酵检测次级代谢产物Monacolin K的产量。HPLC检测结果如图7所示，c3-7菌株的Monacolin K产量最低，仅为60.58mg/L，较野生型菌株降低了25.8％。所以，初步将c3-7菌株选为目的菌株，进行潮霉素B基因组的PCR验证。

3.6过表达菌株c3-7潮霉素基因的PCR验证

对阳性转化子c3-7进行PCR验证，分别提取紫色红曲菌M1和c3-7菌株的总RNA，将反转录得到的cDNA为模板对Hygromycin基因进行PCR扩增。结果如图8所示，对照菌株M1中未能扩增出条带，说明野生型红曲菌中不存在潮霉素基因，而c3-7菌株则在约1000bp处有一条清晰的条带，且与预期大小一致，说明c3-7菌株中成功导入了过表达质粒，过表达菌株构建成功。

3.7过表达菌株c3-7的Monacolin K产量检测

将c3-7菌株和M1菌株再次进行摇瓶发酵培养，进一步分析这两株菌株在次级代谢产物及生长状况方面的差异。通过HPLC进行Monacolin K产量检测，检测第5、8、12、15d的Monacolin K产量。结果如图9所示，不同发酵天数的c3-7菌株的Monacolin K产量均低于野生型菌株，结果与c3基因为下调基因的情况符合。在发酵第12d时过表达菌株较M1菌株的Monacolin K产量降低了27.0％，达到了92.56mg/L；15d的产量为133.23mg/L，与野生型菌株相比降低了28.7％。

3.8过表达菌株c3-7的红曲色素产量检测

本实验中采用紫外分光光度计对发酵第5、8、12、15d的c3-7菌株和M1菌株的三种红曲色素进行检测。结果如图10所示，三种色素的产量变化趋势总体上保持一致，峰值点在发酵的第12d时达到，在15d呈现下降趋势。通过对比两种菌株发现，过表达菌株的红、橙、黄三种色素产量均低于M1菌株，在发酵第12d的红曲色素产量较M1分别下降了21.5％，19.4％和13.4％，分别为58.1U/mL，36.6U/mL和46.7U/mL。

3.9过表达菌株c3-7生物量的检测

采用恒重法对c3-7菌株和M1菌株的菌丝体干重量的差异进行比较，结果如图11所示。c3-7菌株和M1菌株菌丝体变化趋势一致，发酵前期，红曲菌生长发育增速较快，两种菌株的生物量值均在第5d达到最大；后期菌体干重下降。在整个发酵周期内，c3-7菌株的生物量均低于M1菌株。

3.10过表达菌株c3-7微观菌体形态的检测

采用扫描电镜对c3-7菌株和M1菌株菌丝体的微观形态进行检测，主要观察红曲菌孢子头和菌丝体的区别。结果如图12所示，对比图A和图B可知，与M1菌株相比，c3-7菌株的孢子头更饱满，表面几乎没有褶皱；对比图C和图D，c3-7菌株的菌丝体凹陷及褶皱程度明显少于M1菌株。因此推测，comp54338_c3基因的过表达可能会使红曲菌菌丝体的形态发生改变，进而影响次级代谢产物在发酵液中的产量。

3.11Monacolin K合成相关基因的转录量分析

利用RT-qPCR技术检测过表达c3-7菌株和野生型M1菌株中comp54338_c3基因和Monacolin K合成基因簇上9段基因(即mokA-mokI基因)的表达量，实验结果如图13所示。在红曲菌发酵的第8d和第12d时，与M1菌株相比，c3-7菌株的c3基因表达量分别提高了5.09和1.32倍。另外RT-qPCR的结果也显示，comp54338_c3基因的过表达也影响了Monacolin K合成基因簇上部分基因的表达量，结果如图14所示。mok I基因的表达量在发酵第5天较M1菌株下降了52.3％，在第12天下降了44.6％。在发酵第8天，c3-7菌株的大多数基因的表达量较M1菌株下调，包括mok A,mok B,mok D,mok F,mok G和mok H基因等。其中mok H基因表达量下降了73.0％，而mok C基因的表达量则提高了61.4％。

本发明成功从紫色红曲菌M1中克隆出目的基因comp54338_c3，进而证明了comp54338_c3基因的存在。为了验证该基因的功能，利用双酶切与pBARGPE1-Hygro质粒连接，将成功构建得到的过表达载体导入红曲菌体内，成功构建了过表达菌株c3-7。

为了研究comp54338_c3基因过表达对红曲菌生长发育及次级代谢产物合成的影响，通过对比过表达菌株c3-7和野生型菌株M1的次级代谢产物及菌体形态特征发现，comp54338_c3基因的过表达能够降低Monacolin K的产量，在一定程度上对菌丝体的形态也有影响，能够抑制红曲菌菌丝体的生长发育。由此可推测，紫色红曲菌中的comp54338_c3基因对红曲菌的生长发育具有一定程度的负调控作用。

两种菌株中Monacolin K生物合成相关基因的表达水平主要是利用RT-qPCR技术进行检测，检测结果发现comp54338_c3基因的过表达会使mok A-mok I基因簇中部分基因的表达量发生变化，其中mok A，mok B，mok D，mok F，mok G和mok H基因的表达量较M1菌株呈现下调趋势。因此，下调基因comp54338_c3主要通过调控Monacolin K合成相关的基因进而达到降低Monacolin K产量的效果。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 紫色红曲菌comp54338_c3基因过表达菌株构建方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggaattct gtgccttttc agatcg 26

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggggtacca acagtggact tttgcctc 28

Claims

1.comp54338_c3基因在抑制紫色红曲菌产生Monacolin K和三种红曲色素上的应用，三种红曲色素是红曲黄、红曲橙和红曲红色素。